CN105199969B

CN105199969B - 一株高产酸性蛋白酶的黑曲霉菌株及其液体发酵产酶方法

Info

Publication number: CN105199969B
Application number: CN201510677600.6A
Authority: CN
Inventors: 王兴吉; 韩龙; 张�杰
Original assignee: Shandong Lonct Enzymes Co ltd
Current assignee: Shandong Lonct Enzymes Co ltd
Priority date: 2015-10-19
Filing date: 2015-10-19
Publication date: 2019-05-14
Anticipated expiration: 2035-10-19
Also published as: CN105199969A

Abstract

本发明公布了一株高产酸性蛋白酶的黑曲霉突变株及其液体发酵方法，所述黑曲霉突变菌株为黑曲霉(Aspergillus niger)TP‑235，保藏编号为CGMCC 10789，该菌株通过液体深层发酵在50L发酵罐上经补料发酵培养100‑120h，产酶水平为21852u/mL。本发明建立的液态发酵酸性蛋白酶的方法，生产的酸性蛋白酶最适最适pH范围为2.5‑3.5，最适作用温度范围为55℃‑65℃，在60℃保温1h后剩余酶活为78％，80℃保温2h后剩余酶活为58.4％，具有良好的耐酸性和耐热性，可广泛应用于酿酒、食品、饲料以及皮革加工等行业。

Description

一株高产酸性蛋白酶的黑曲霉菌株及其液体发酵产酶方法

技术领域：

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一株高产酸性蛋白酶的黑曲霉突变菌株及其液体发酵技术。

背景技术：

酸性蛋白酶(acidic protease)在1954年首先由吉田在黑曲酶中发现。该酶广泛存在于霉菌、和担子菌中，细菌中极少发现，其最适pH3～4，相对分子质量30000～40000，等电点(pH3～5)。酸性蛋白酶主要是一种羧基蛋白酶，大多数在其活动中心含有2个天冬氨酸残基。酶蛋白中酸性氨基酸含量高，而碱性氨基酸含量低。

目前已经用于生产酸性蛋白酶的微生物菌株有：黑曲霉、米曲霉、拟青霉、啤酒酵母、乳酸杆菌、枯草杆菌等，其中以黑曲霉为主，所产的蛋白酶具有一定的耐酸性和耐热性，可广泛应用于酿酒、食品、饲料以及皮革加工等行业。

如CN 101638647 A公布了一种产自黑曲霉的酸性蛋白酶，该酶最适pH2.5-3.5，最适作用温度40-50℃，采用固体发酵工艺的发酵产酶酶为47000U/g(以干曲计)。CN101948820 A公布了一种酸性蛋白酶及其制备方法，以黑曲霉CICC2238为产酶菌种，麦麸为主要原料生从的酸性蛋白酶最适pH2.5-3.5，最适作用温度40-50℃，采用固体发酵工艺制备的酸性蛋白酶酶活≥47000U/g，液体酶收率≥85％，固体酶收率≥80％。

但是由于受酶活及酶适用条件的制约，目前现有技术中酸性蛋白酶满足工业生产的需求，所以选育一株高产酸性蛋白酶的黑曲霉菌株，其发酵产品具有良好的耐酸性和耐热性，生产成本低廉，对大规模推进各行业的机械化具有重大意义。

发明内容：

本发明的目的是提供一株高产酸性蛋白酶的黑曲霉突变株及其液体发酵产酶方法。

本发明中所述的高产酸性蛋白酶的黑曲霉菌株具体为黑曲霉(Aspergillusniger)TP-235,该菌株已于2015年5月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为CGMCC No.10789。

所述菌株是由黑曲霉H43经常温常压等离子体诱变选育获得，菌株形态特征如下：镜检该菌所产菌丝体由具有横隔的分支菌丝构成，菌丛白色，顶囊大球形，小梗双层，孢子量少。

黑曲霉H43通过液态发酵后最高酶活为15856u/mL，发酵过程中孢子量多，菌丝结球，发酵液较为粘稠不利于传质，经诱变后孢子产量减少，菌丝不宜结球，种子罐培养周期由56h缩短至48h，发酵液最高酶活为19247u/mL。发酵方法经过优化后黑曲霉突变菌株CGMCC No.10789的最高平均发酵液酶活达到21800u/mL至21900u/ml之间。

本发明所述的液体发酵技术主要包括以下步骤：

1)斜面培养基如下：蔗糖25g，NaNO₃2g，MgSO₄0.5g，KCl 0.5g，FeSO₄0.01g，K₂HPO₄1g，琼脂20g，将上述各组分溶于1000mL水中，调节pH至4.5，121℃灭菌20min，备用；

2)种子培养基配制如下：麦芽汁150mL，琼脂3g，调节pH至4.5，121℃灭菌20min，备用；

3)种子罐培养基质量体积比为：麸皮5％，KH₂PO₄0.15％，CaCl₂0.005％，调节pH至4.5，121-123℃灭菌30-40min；

4)发酵罐培养基质量体积比为：玉米粉5％，豆饼粉4％，硫酸铵1％，KH₂PO₄0.3％，玉米浆0.6％，CaCl₂0.5％，调节pH至4.5，121-123℃灭菌30-40min；

5)补料瓶培养基质量体积比为：玉米淀粉10％，硫酸铵1％，KH₂PO₄0.1％，玉米浆0.6％，CaCl₂0.5％，调节pH至4.5，121-123℃灭菌30-40min；

6)培养条件与方法：

斜面培养：将所述黑曲霉突变株取一接种环菌苔接种于PDA固体斜面，30℃下恒温培养72h；

摇瓶培养：将斜面培养得到的菌株取一接种环菌苔接入种子培养基中，在初始pH4.5-5.5、30℃、摇床转速200rpm条件下培养72h；

种子罐培养：将摇瓶发酵后的种子液按照接种量5％的比例接入种子罐，在初始pH4.5-5.5、30℃、转速200-800rpm条件下培养48h；

发酵罐培养：将种子罐中的种子液按照接种量5％的比例接入发酵罐，培养条件为初始pH 4.5-5.5、30℃、风量0-24h 0.25vvm、24-48h 0.5vvm、48h-放罐1.0vvm、转速200-800rpm，发酵期间pH低于4.5，补料控制pH4.5-5.5，至酶活增长缓慢，菌体自溶严重时结束发酵，发酵周期为100-120h。

所述酸性蛋白酶的提取与精制方法如下：

向上述发酵液中加入3％珍珠岩助滤剂，进行板框压滤；用超滤膜对澄清压滤酶液进行超滤浓缩；在浓缩液中加入稳定剂、防腐剂，然后用硅藻土进行过滤除菌，即得到酸性蛋白酶成品酶制剂。

有益效果：

1、本发明通过对黑曲霉原始菌株H43进行常温常压等离子体诱变选育了一株高产酸性蛋白酶的突变菌株，并对突变株CGMCC No.10789发酵过程进行补料条件优化使其酶活达到21800u/mL至21900u/ml之间。

2、该突变菌株发酵得到的酸性蛋白酶最适pH范围为2.5-3.5，最适作用温度范围为55℃-65℃，在60℃保温1h后剩余酶活为78％，80℃保温2h后剩余酶活为58.4％，具有良好的耐酸性和耐热性，可应用于酿酒、食品、饲料以及皮革加工等行业。

附图说明：

图1 不同pH下的相对酶活

图2 不同温度下的相对酶活

图3 80℃下保温0-3h后的相对酶活

具体实施方式：

以下通过具体实施例对本发明做更详细的说明，具体实施案例仅为举例说明，不作为对本发明实施范围的限定。

实施例1 菌株的诱变选育

取两株出发菌株的新鲜斜面，用无菌水洗脱菌体，在有玻璃珠的试管振荡使菌体分散，离心收集菌体，以5％甘油重悬菌体，以血球计数板计数直至菌浓为10⁷-10⁸个/mL，以此作为出发菌悬液。

开启常温常压等离子系统，以酒精棉擦拭操作室内外，并开启紫外灯灭菌30min。灭菌结束后取10μL菌悬液点于载片的粗糙面，并在无菌条件下将载片以镊子转移至操作室台面上。开启氦气阀门，设定气流量和诱变时间进行诱变。诱变时间分别设定为90s、120s、150s、180s、210s。每次诱变结束后均将载片置于含990μL无菌生理盐水的EP管中，漩涡震荡1min。稀释涂布后置于30℃培养箱内培养。

筛选培养基：酐酪素0.4％、KH₂PO₄0.03％、MgSO₄·7H₂O 0.05％、FeSO₄·7H₂O0.0002％、NaCl 0.1％、ZnSO₄0.003％、无水CaCl₂0.0002％、琼脂2％、pH4.5-5.5。

平板初筛：

初筛方法：将诱变后长出的菌落点种在筛选平板上，30℃培养48h后，观察其周围透明圈大小，选取酪蛋白透明圈直径与菌落直径比值较大的菌落进行摇瓶复筛。

摇瓶复筛：

复筛方法：将诱变菌株接入发酵摇瓶进行发酵，30℃，220rpm，培养62h后以分光光度法测定各突变株发酵酶活。

发酵培养基：豆饼粉3.75％,玉米粉0.65％，鱼粉0.65％，氯化铵1.0％，氯化钙0.5％，磷酸二氢钠0.2％，pH 5.5。

通过摇瓶复筛选出5株具有较高酶活的突变株列表如下：

菌株	原始菌	TP-98	TP-146	TP-152	TP-231	TP-235
							酶活(u/mL)	15832	18507	17952	18165	18321	19208

经再次的摇瓶发酵后选育出TP-235为稳定的最高酶活菌株。

形态特征观察：

突变菌株TP-235的形态特征为：镜检该菌所产菌丝体由具有横隔的分支菌丝构成，菌丛白色，顶囊大球形，小梗双层，孢子量少。

实施例2 液体发酵生产酸性蛋白酶及其提取精制

斜面培养：将所述黑曲霉突变株TP-235取一接种环菌苔接种于PDA固体斜面，30℃下恒温培养72h；

摇瓶培养：将斜面培养得到的菌株取一接种环菌苔接入发酵种子培养基中，在初始pH5.0、30℃、摇床转速200rpm条件下培养72h。

种子罐培养：将摇瓶发酵后的种子液按照接种量5％的比例接入种子罐，在初始pH5.0、30℃、转速400rpm条件下培养48h。

发酵罐培养：将种子罐中的种子液按照接种量5％的比例接入发酵罐，培养条件为初始pH 5.0、30℃、风量0-24h 0.25vvm、24-48h 0.5vvm、48-放罐1.0vvm、转速400rpm，发酵期间pH低于4.5，补料控制pH5.0，至酶活增长缓慢，菌体自溶严重时结束发酵，发酵周期为100h。下表是50L发酵罐6批次的发酵产酶情况，平均产酶水平为21396u/mL。

批次	发酵周期(h)	发酵活力(u/mL)
			1	123	21317
2	108	21430
			3	117	21256
4	121	20987
			5	115	21852
6	119	21532

酸性蛋白酶的提取与精制：

加入3％珍珠岩助滤剂，进行板框压滤；用超滤膜对澄清压滤酶液进行超滤浓缩；在浓缩液中加入稳定剂、防腐剂，然后用硅藻土进行过滤除菌，即得到酸性蛋白酶成品酶制剂。

5)补料瓶培养基质量体积比为：玉米淀粉10％，硫酸铵1％，KH₂PO₄0.1％，玉米浆0.6％，CaCl₂0.5％，调节pH至4.5，121-123℃灭菌30-40min.

实施例3 酸性蛋白酶的酶活测定方法

(1)酶活单位定义：1mL液体酶在40℃，pH值为3.0的条件下，1min水解酪素产生1μg酪氨酸为一个酶活力单位，以u/mL计。

(2)原理：蛋白酶在一定温度和pH条件下，水解酪素(哺乳类为幼子生长提供氮源的一种蛋白质)底物，产生含有酚基的氨基酸[如：酪氨酸(α-氨基-β-对羟苯基丙酸)，色氨酸(α氨基-β-吲哚基丙酸)等]，在碱性条件下，将福林试剂还原，生成鉬蓝和钨蓝，用分光光度计测定吸光度，计算其酶活力。

(3)试剂和溶液

福林试剂的制备：于2000mL磨口回流装置中加入钨酸钠(Na₂WO₄·2H₂O)100g，钼酸钠(Na₂M0O₄·2H₂O)25g，水700mL，85％磷酸50mL，浓盐酸100mL，小火沸腾10h，取下回流冷却器，在通风橱中加入硫酸锂(LiSO4)50g，水50mL和数滴浓溴水(99％)，再微沸15min，以除去多余的溴(冷后仍有绿色再加溴水，再微沸除去过量的溴)，冷却，加水定容至1000mL，混匀，过滤。制得的试剂应呈金黄色，贮存于棕色瓶中。

使用溶液：一份福林试剂与二份水混合，摇匀。

碳酸钠溶液[c(Na₂CO₃)＝0.4mol/L]：取无水碳酸钠42.4g，用水溶解并定容至1000mL。

三氯乙酸[c(CCL₃·COOH)]＝0.4mol/L：取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000mL。

氢氧化钠溶液[c＝0.5mol/L]：按GB601配制。

盐酸溶液[c＝1mol/L及0.1mol/L]

GB601：量取90mL盐酸，注入1000mL水中，摇匀，即得1mol/L盐酸。

量取9mL盐酸，注入1000mL水中，摇匀，即得0.1mol/L盐酸。

磷酸缓冲液(pH＝7.5)：称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)6.02g和磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)0.5g，加水溶解并定容至1000mL，须用pH计校正。

10g/L酪素(酪蛋白)溶液：称取酪素1.000g，精确至0.001g，用浓乳酸2～3滴湿润后，加入pH7.5的缓冲液约80mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转入100mL的容量瓶中，用缓冲液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存，有效期3天。

L-酪氨酸标准溶液：

a.称取预先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g，精确至0.0002g，用1mol/

L盐酸60mL溶解后定容至100mL，即为1mg/mL酪氨酸标准溶液。

b.吸取1mg/mL酪氨酸标准溶液10.00mL，用0.1mol/L盐酸定容至100mL，即得到100ug/mL-酪氨酸标准溶液。

(4)仪器和设备

恒温水浴锅：40±0.2℃

分光光度计：应符合GB9721的规定

(5)分析步骤

标准曲线的绘制

分别吸取100mg/ml L－酪氨酸标准液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml于10ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，制成每ml分别含L－酪氨酸0、10、20、30、40、50、60mg的稀标准液。各取上述溶液1.00ml(须做平行试验)于试管中，加入0.4mol/L碳酸钠溶液5.00ml，稀福林试剂1.00ml，置于40℃水浴中显色20min，取出用10mm比色皿，在波长660nm处用分光光度计分别测定其吸光度，其中不含酪氨酸的管为空白对照。以吸光度为纵坐标，相应的酪氨酸浓度为横坐标，绘制标准曲线或计算回归方程。当吸光度为1时的酪氨酸量(mg)即为比色常数K值。

(6)待测酶液的制备

比色测定：精确吸取待测酶液1.0ml(每个样品3支平行试管)，40℃水浴预热2min。同时取适量1％酪素溶液在40℃水浴预热3～5min，然后取其1.0ml，加入到经预热的上述酶液中，立即开始计时，于40℃水浴精确反应10min，立即加入2.0ml0.4mol/L三氯乙酸，摇匀，取出静置10min，过滤，取滤液1.0ml。加入0.4mol/L碳酸钠溶液5.0ml，以后按标准曲线绘制步骤测定样品吸光度。

同时进行空白对照测定，其步骤为吸取待测酶液1.0ml，40℃水浴2min后加入2.0ml 0.4mol/L三氯乙酸，40℃水浴10min，然后加入1％酪素溶液1.0ml，取出静置10min，过滤，取滤液1.0ml，以后步骤同于样品测定。

(7)计算

X＝(A×K×4×n)/(1×10)

式中：X－样品的酶活力，u/g；

A－样品平行试验的平均吸光度；

K－比色常数；

4－反应试剂体积(ml)；

n－样品稀释倍数；

1－参与反应的酶液量，ml；

10－反应时间，min

实施例4 酶的最适作用pH范围

以本发明所产的酶活力20000u/mL的酸性蛋白酶为基准，在40℃条件下，分别在不同pH值(2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5)下，测定酶活力，测定的相对酶活力变化曲线如图1所示，酶的最适作用pH范围为2.5-3.5。

实施例5 酶的最适作用温度范围

以酶活力20000u/mL的酸性蛋白酶为基准，在pH值为3.0条件下，分别在不同温度(45、50、55、60、65、70、75)下，测定酶活力，测定的相对酶活力变化曲线如图2所示，酶的最适作用温度范围为55℃-65℃。

实施例6 酶的热稳定性

以酶活力20000u/mL的酸性蛋白酶为基准，在pH值为3.0条件下，80℃下保温0-3h测定剩余酶活力，如图3所示，80℃保温2h后剩余酶活为58.4％，具有良好的耐热保存活性。

Claims

1.一株高产酸性蛋白酶的黑曲霉突变菌株，其特征在于，所述菌株具体为黑曲霉(Aspergillus niger)TP-235，菌株保藏号为CGMCC 10789。

2.如权利要求1所述的一株高产酸性蛋白酶的黑曲霉突变菌株，其特征在于，所述菌株液体发酵平均产酸性蛋白酶活为21800u/mL-21900u/ml。

3.如权利要求1所述的一株高产酸性蛋白酶的黑曲霉突变菌株，其特征在于，所述菌株液体发酵产酸性蛋白酶最适作用pH范围为2.5-3.5，最适作用温度范围为55℃-65℃。

4.如权利要求1所述的一株高产酸性蛋白酶的黑曲霉突变菌株，其特征在于，所述菌株液体发酵产酸性蛋白酶在60℃保温1h后剩余酶活为78％，80℃保温2h后剩余酶活为58.4％。

5.利用权利要求1所述黑曲霉突变菌株液体发酵产酸性蛋白酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：

斜面培养：将所述黑曲霉突变株TP-235取一接种环菌苔接种于PDA斜面培养基，30℃下恒温培养72h；

种子罐培养：将摇瓶发酵后的种子液按照接种量5％的比例接入种子罐培养基，在初始pH4.5-5.5、30℃、转速200-800rpm条件下培养48h；

发酵罐培养：将种子罐中的种子液按照接种量5％的比例接入发酵罐培养基，培养条件为初始pH 4.5-5.5、30℃、风量0-24h 0.25vvm、24-48h 0.5vvm、48h-放罐1.0vvm、转速200-800rpm，发酵期间当pH低于4.5时，开始不断添加补料培养基来控制pH在4.5-5.5的范围内，当酶活增长缓慢，菌体自溶严重时结束发酵，发酵周期为100-120h；

所述酸性蛋白酶的提取与精制方法如下：

6.如权利要求5所述的黑曲霉突变菌株液体发酵产酸性蛋白酶的方法，其特征在于，

所述斜面培养基如下：蔗糖25g，NaNO₃ 2g，MgSO₄ 0.5g，KCl 0.5g，FeSO₄0.01g，K₂HPO₄1g，琼脂20g，将上述各组分溶于1000mL水中，调节pH至4.5,121℃灭菌20min，备用；

所述种子培养基如下：麦芽汁150mL，琼脂3g，调节pH至4.5,121℃灭菌20min，备用；

所述种子罐培养基质量体积比组成为：麸皮5％，KH₂PO₄ 0.15％，CaCl₂ 0.005％，调节pH至4.5,121-123℃灭菌30-40min；

所述发酵罐培养基质量体积比组成为：玉米粉5％，豆饼粉4％，硫酸铵1％，KH₂PO₄0.3％，玉米浆0.6％，CaCl₂ 0.5％，调节pH至4.5,121-123℃灭菌30-40min；

所述补料瓶培养基质量体积比为：玉米淀粉10％，硫酸铵1％，KH₂PO₄ 0.1％，玉米浆0.6％，CaCl₂ 0.5％，调节pH至4.5,121-123℃灭菌30-40min。