CN112940943B - 一种液态发酵生产酸性蛋白酶的菌株及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种黑曲霉菌株及其在发酵生产酸性蛋白酶中的应用。本发明提供一种黑曲霉ESP1023菌株(Aspergillus niger ESP1023)，其特征在于，所述黑曲霉ESP1023菌株(Aspergillus niger ESP1023)保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2018829。利用本发明提供的黑曲霉ESP1023菌株及液态发酵生产酸性蛋白酶的方法，得到的发酵液中酶蛋白纯度高，酶活高。

Description

一种液态发酵生产酸性蛋白酶的菌株及应用

技术领域

本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种黑曲霉菌株及其液态发酵生产酸性蛋白酶的方法。

背景技术

酸性蛋白酶(acid proteinase)是一类最适pH在2.5-5.5左右的天冬氨酸蛋白酶，在1945年首次由吉田在黑曲霉中发现。酸性蛋白酶广泛存在于霉菌和担子菌中，相对分子量在30KDa-40KDa左右。酸性蛋白酶的来源主要有动物内脏和特有微生物的分泌，包括有胃蛋白酶、凝乳酶和一些微生物蛋白酶等。

产酸性蛋白酶的菌株种类很多。目前用于酸性蛋白酶生产的菌株主要有黑曲霉、米曲霉、啤酒酵母、枯草芽孢杆菌等，其中以黑曲霉为主。所产的酸性蛋白酶均有较好的耐酸性和温度耐受性，可广泛应用在酿酒、食品、饲料和皮革等加工领域。

酸性蛋白酶发酵有固态发酵和液态发酵等多种方式。专利CN101638647 A公布了一种黑曲霉固态发酵生产酸性蛋白酶工艺，该工艺以麦麸为主要原料，发酵产酶能力≧47000U/g(以干曲计)，液态酶提取收率≧85％。该种方式成本低廉，但受限于发酵酶活和产量要求。专利CN105316239 A公开一种经过紫外线复合氯化锂诱变、亚硝基胍诱变、硫酸二乙脂等诱变方式诱变后得到的一株宇佐美曲霉菌株，液态发酵酶活达到13000-14000U/mL，较出发菌株酶活提高了7倍。CN105199969A公开一种经诱变得到的一株黑曲霉菌株，在50L的发酵罐中验证深层液态发酵工艺，补料发酵100-120h左右，发酵酶活达到21852U/mL。专利CN107586789 A公开了一种技术基因工程方法，通过基因技术手段，构建了酸性蛋白酶表达盒，并将其导入黑曲霉表达宿主，实现了酸性蛋白酶的分泌表达，液态发酵工艺优化后发酵酶活能达到25000-26000U/mL。中国农科院饲料所姚滨、罗会颖等人从基因角度出发，在毕赤酵母GS115宿主里面实现真菌来源(Talaromyces leycettanus JCM12802)的酸性蛋白酶基因的表达，在酵母发酵培养基中实现诱导发酵产酶并对酶蛋白进行纯化和性质研究，该酸性蛋白酶pH耐受性和温度稳定性均有良好性能。罗晓春、邓俊劲等人在毕赤酵母中实现了哈茨木莓中酸性蛋白酶基因的表达，甲醇诱导发酵酶活达到320U/mL。

目前市面上的酸性蛋白酶产品主要都是通过固态发酵或者浊料液态发酵进行。发酵酶活相对偏低。生产产量也受固态发酵生产场所限制，加之产物纯度不够，提取步骤上收率偏低，总体成本偏高，一定程度上限制了酸性蛋白酶的广泛应用。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种高产酸性蛋白酶的黑曲霉菌株。

本发明还提供所述高产酸性蛋白酶的黑曲霉菌株在发酵生产酸性蛋白酶中的应用。

本发明还提供一种利用所述高产酸性蛋白酶的黑曲霉菌株发酵生产酸性蛋白酶的方法。

第一方面，本发明提供一种黑曲霉ESP1023菌株(Aspergillus niger ESP1023)，所述黑曲霉ESP1023菌株(Aspergillus niger ESP1023)保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，地址：中国.武汉.武汉大学，邮政编码：430072；电话：027-68754052)，保藏日期为2018年11月26日，保藏编号为CCTCC NO：M 2018829。黑曲霉ESP1023菌株(Aspergillusniger ESP1023)CCTCC NO：M 2018829简称为黑曲霉ESP1023菌株。

所述高产酸性蛋白酶的黑曲霉ESP1023菌株，是发明人以一株从土壤中筛选出的产酸性蛋白酶的黑曲霉菌株(Aspergillus niger)为原始菌株，利用紫外诱变技术与常压室温等离子体(ARTP)诱变技术相结合的方式进行诱变和驯化得到的高产酸性蛋白酶的黑曲霉ESP1023菌株。

所述黑曲霉ESP1023菌株的28S rRNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。

第二方面，本发明提供所述的黑曲霉ESP1023菌株在发酵生产酸性蛋白酶中的应用。

第三方面，本发明提供一种发酵生产酸性蛋白酶的方法，包括如下步骤：培养所述的黑曲霉ESP1023菌株。

具体的，本发明提供一种液态发酵生产酸性蛋白酶的方法，包括如下步骤：

(1)将所述的黑曲霉ESP1023菌株放大培养，得到所需量的黑曲霉ESP1023菌液；

(2)将所述所需量的黑曲霉ESP1023菌液加入到发酵罐中，在26-32℃条件下发酵，初始不调节pH，当pH持续下降到3.0-3.5后用碱溶液调节pH至4.0-4.2，23-25h后调节pH至4.5-4.8，加入补料培养基控制还原糖量值为1‰-2‰。

优选地，步骤(1)中的黑曲霉ESP1023菌株经过一次放大培养和二次放大培养，其中，所述的一次放大培养的接种量为重量比0.1-1％，优选地，所述的一次放大培养的接种量为重量比0.2-0.4％，所述的二次放大培养的接种量为重量比10-25％，优选地，所述的二次放大培养的接种量为重量比15-20％。

优选地，步骤(1)中黑曲霉ESP1023菌株放大培养的pH值为5.0-5.6，更优选地，所述的放大培养的pH值为5.2-5.5，培养温度为28-32℃，优选地，所述的培养温度为29-30℃，罐压为0.02-0.06MPa，优选地，所述的罐压为0.03-0.05MPa，发酵通风比为1：(0.8-1.2)的条件下进行，优选地，所述的发酵通风比为1：1。

优选地，步骤(1)中所述的一次放大培养所用的培养基以重量体积比(g/ml)计，组分含有葡萄糖0.1-8％，玉米浆0.1-10％，硫酸铵0.05-2％，硫酸镁0.01-1％，磷酸二氢钾0.05-5％，氯化钙0.01-1％的混合水溶液；

优选地，步骤(1)中所述的一次放大培养所用的培养基以重量体积比(g/ml)计，组分含有葡萄糖0.5-4％，玉米浆1-5％，硫酸铵0.2-1.2％，硫酸镁0.05-0.25％，磷酸二氢钾0.5-3％，氯化钙0.05-0.5％的混合水溶液；

优选地，步骤(1)中所述的二次放大培养所用的培养基以重量体积比(g/ml)计，组分含有葡萄糖0.1-8％，乳糖0.1-8％，玉米浆0.1-10％，硫酸铵0.05-2％，硫酸镁0.01-1％，磷酸二氢钾0.05-5％，氯化钙0.01-1％的混合水溶液；

优选地，步骤(1)中所述的二次放大培养所用的培养基以重量体积比(g/ml)计，组分含有葡萄糖0.5-4％，乳糖0.5-5％，玉米浆1-5％，硫酸铵0.2-1.2％，硫酸镁0.05-0.25％，磷酸二氢钾0.5-3％，氯化钙0.05-0.5％的混合水溶液。

优选地，步骤(1)中还包括种子摇瓶发酵，所述的种子摇瓶发酵温度为27℃-31℃，优选地，所述的种子摇瓶发酵温度为29℃。

优选地，所述的种子摇瓶发酵转速为100rpm-300rpm，更优选地，所述的种子摇瓶发酵转速为180rpm。

优选地，所述的种子摇瓶发酵时间为20-50h，更优选地，所述的种子摇瓶发酵时间为30h。

所述的种子摇瓶发酵培养基以重量体积比(g/ml)计，含有葡萄糖0.1-8％，玉米浆0.1-10％，硫酸铵0.05-2％，硫酸镁0.01-1％，磷酸二氢钾0.05-5％，氯化钙0.01-1％，微量元素A母液0.01％-0.08％的混合水溶液。

优选地，所述的种子摇瓶发酵培养基以重量体积比(g/ml)计，含有葡萄糖0.5-4％，玉米浆1-5％，硫酸铵0.2-1.2％，硫酸镁0.05-0.25％，磷酸二氢钾0.5-3％，氯化钙0.05-0.5％，微量元素A母液0.04％，pH值为5.0-5.5，在28-32℃条件下，100-300rpm摇瓶培养25-35h。

优选地，所述的微量元素A母液中含有质量体积比(g/ml)为0.3-0.9％柠檬酸铁、质量体积比(g/ml)为0.05-0.1％乙酸锌和质量体积比(g/ml)为0.05-0.1％EDTA，其余组分为水。

优选地，步骤(2)中发酵罐培养基以重量体积比(g/ml)计，含有葡萄糖0.1-3％，乳糖0.1-10％，玉米浆0.1-5％，硫酸铵0.01-1％，硫酸镁0.01-0.5％，磷酸二氢钾0.1-2％，氯化钙0.01-8％的混合水溶液。

更优选地，步骤(2)中发酵罐培养基以重量体积比(g/ml)计，含有葡萄糖0.24-1.68％，乳糖1-5％，玉米浆0.68-3.2％，硫酸铵0.15-0.29％，硫酸镁0.05-0.19％，磷酸二氢钾0.3-0.9％，氯化钙0.05-5％的混合水溶液。

优选地，步骤(2)中初始不调节pH，当pH持续下降到3.0-3.5后用碱溶液调节pH至4.0-4.2，23-25h后调节pH至4.5-4.8，优选地，用氨水调节pH。

优选地，步骤(2)中发酵23-25h后开始加入补料。

步骤(2)中接种量为重量比5-15％，优选地，所述的接种量为重量比10％。

优选地，步骤(2)中发酵通风比为1：(0.8-1.2)，更优选地，所述的发酵通风比为1：1。

优选地，罐压为0.02-0.06MPa，更优选地，所述的罐压为0.03-0.05MPa；补料发酵120-140h。

优选地，步骤(2)中补料培养基以重量体积比(g/ml)计，包含葡萄糖20-80％，玉米浆0.01-3％，硫酸镁0.01-1％，磷酸二氢钾0.1-1％，氯化钙0.01-8％的混合水溶液。

更优选地，步骤(2)中补料培养基以重量体积比(g/ml)计，包含葡萄糖30-70％，玉米浆0.1-1.5％，硫酸镁0.1-0.5％，磷酸二氢钾0.34-0.68％，氯化钙0.05-5％的混合水溶液。

优选地，步骤(2)中通过流加的方式加入补料培养基。

发酵结束后，对发酵液进行压滤、浓缩、除菌和干燥获得酸性蛋白酶制剂。

优选地，对发酵液进行压滤，采用板框压滤。

更优选地，加入3％左右的珍珠岩助滤剂搅拌均匀后进行板框压滤。

优选地，用超滤膜对压滤液进行超滤浓缩。

优选地，用硅藻土进行过滤除菌。

更优选地，在浓缩液中加入稳定剂后用硅藻土进行过滤除菌。

本发明提供的高产酸性蛋白酶的黑曲霉ESP1023菌株，更适用于液态发酵，通过对所述菌株进行液态发酵生产得到酸性蛋白酶。利用本发明提供的黑曲霉ESP1023菌株及液态发酵生产酸性蛋白酶的方法，得到的发酵液中酶蛋白纯度高，发酵酶活高达48000-55000U/ml，远高于目前报道酶活。发酵所用培养基均使用常规、可溶性的原料，生产染菌风险小，产品易于分离，更容易实现工业化生产。

菌种保藏信息

该黑曲霉属菌株ESP1023(Aspergillus niger ESP1023)于2018年11月26日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2018829，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，邮政编码：430072；电话：027-68754052。

附图说明

图1是本发明提供的黑曲霉ESP1023菌株的菌丝显微镜照片；

图2是实施例4的发酵过程图；

图3是实施例4提供的酸性蛋白酶的最适反应pH曲线；

图4是实施例4提供的酸性蛋白酶的最适反应温度曲线；

图5是实施例4提供的酸性蛋白酶的温度稳定性实验结果图。

具体实施方式

为了使本领域技术人员更好的理解本发明，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。本领域技术人员应当理解的是，这不应被理解为对本发明权利要求范围的限定。同时需要注意的是，本发明中的试剂或仪器无特别说明的均可通过市售购买得到。

以下实施例中所用的PDA培养基的配方为：每1000ml水中，含土豆(去皮)200g，葡萄糖20g和琼脂20g，pH自然。

本发明所用试剂具体来源列于下面的表1中。

表1本发明所用试剂厂商

试剂	纯度	生产厂商
			葡萄糖	99％	沂水大地药业有限公司
玉米浆	固含物≥42	宜昌华城生物发酵原料有限公司
			硫酸铵	99％	江苏科伦多食品配料有限公司
硫酸镁	99％	莱州市莱玉化工有限公司
			磷酸二氢钾	99％	达州瓮福化工有限责任公司
氯化钙	99％	山东海化集团有限公司
			乳糖	99％	戴维林国际贸易(上海)有限公司
酪蛋白	99％	上海国药集团化学试剂有限公司

仪器生产厂商如下：

紫外灯，东海县明瑞照明电器厂；

ARTP-ⅡS，无锡源清天木生物科技有限公司；

高压蒸汽灭菌锅，重庆市科发实验仪器有限公司。

实施例1黑曲霉ESP1023的获得和诱变

将一株从湖北省宜昌市腐乳厂周边的土壤中分离的黑曲霉菌株，利用紫外诱变技术与ARTP诱变技术相结合的方式进行诱变和驯化后获得本发明提供的产酸性蛋白酶新能优良的菌株，具体方法如下。

一、将从土壤中分离得到的黑曲霉菌株进行紫外诱变：

菌悬液制备：将培养至对数期的种子茄瓶，用50mL生理盐水充分洗出孢子；震荡均匀；取15ml孢子悬液倒入无菌平板中；

在无可见光的环境中，将装有孢子液的平板垂直放在紫外灯下，距离28cm，照射时间270s，紫外灯的功率为40W；

处理后的孢子悬液梯度稀释后在新鲜的酪蛋白培养基平板中在30℃条件下培养6d，操作时用红光代替自然光，培养室将平板用报纸保住后无可见光培养。

以水解圈大小为筛子判断菌株诱变效果；选取水解圈大的菌株进行ARTP诱变。

二、紫外诱变后获得的菌株进行ARTP诱变

设备准备：按照ARTP-ⅡS设备使用说明书正常操作；

菌悬液制备：将培养至对数期的种子茄瓶，用50mL生理盐水充分洗出孢子；震荡均匀，复溶至OD在0.5左右；此时菌量在10^-6～10^-8左右；

于超净台将金属载片置于酒精灯外焰灼烧20s左右，冷却后方式无菌平板上，取10μL菌液均匀涂布在栽片上；

将装有样品载片的平板移至ARTP诱变系统操作仓,用无菌镊子将载片放对应孔位，调节载台下方旋钮，使载片处于气流端口2mm处,并关闭仓门；

功率设置100W，流量在10SLM，时间在180s；

样品处理完毕，用无菌镊子将载片放至装有1mL无菌水的离心管中；充分震荡均匀；形成新的菌悬液；

对新的菌悬液进行梯度稀释涂布获得单菌落，涂布所用培养基组成为酪蛋白10g/L、酵母粉3g/L、氯化钠5g/L、磷酸氢二钾2g/L、琼脂18g/L、其余为水，pH在7.2±0.1，在30℃条件下，培养6d，检测致死率在98.32％，致死率的计算方法为：致死率＝(未经诱变的菌落数-经诱变的菌落数)/未经诱变的菌落数×100％。

以水解圈大小为筛子判断菌株诱变效果；水解圈最大的菌株即为本发明高产酸性蛋白酶的黑曲霉ESP1023菌株。

本发明高产酸性蛋白酶的黑曲霉ESP1023菌株菌体质地呈绒状，边缘钝圆，菌落颜色为黑色，有少量渗出液。分生孢子头球形，老时分散为放射状物，孢梗茎壁光滑，溢缩，顶囊球星，表面全部可育，产孢结构双层，分生孢子球星，壁粗糙，附图1是菌丝的显微镜照片。

三、测定黑曲霉ESP1023菌株的28S rRNA基因序列

将得到的黑曲霉ESP1023菌株用DNA提取试剂盒(BIOMAGA)提取DNA，然后进行PCR，所用引物为：

ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG；

ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC，

PCR反应体系为：

PCR反应条件：

94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸90s，30个循环，最后72℃延伸10min。

将得到的产物测序，测序公司为奥科鼎盛生物科技(武汉)有限公司。测得黑曲霉ESP1023菌株的28S rRNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。

实施例2黑曲霉ESP1023菌株液体发酵生产酸性蛋白酶

菌种活化：将所述的黑曲霉ESP1023菌株甘油管种子接种至新鲜的PDA茄子瓶培养基中，29℃培养6d。

种子摇瓶发酵：将茄子瓶中成熟的种子菌苔挑取一大环至新鲜配制的种子摇瓶培养基中，29℃条件下，180rpm摇瓶培养30h，种子摇瓶培养基以重量体积比(g/ml)计，组分如下：葡萄糖1.5％、玉米浆2.0％、硫酸铵0.5％、硫酸镁0.1％、磷酸二氢钾1.5％、氯化钙0.05％、微量元素A母液0.04％；pH控制在5.5，115℃灭菌30min，微量元素A母液由下述组分制成：以质量体积比(g/ml)计，柠檬酸铁0.6％，乙酸锌0.08％，乙二胺四乙酸0.084％，其余组分为水。

一级种子罐发酵：将种子摇瓶发酵生产得到的菌种按照0.2％的接种量接入一级种子罐中，培养温度29℃；罐压0.03MPa，发酵通风比1：1，培养20h，发酵培养基以重量体积比(g/ml)计，组分如下：葡萄糖1.5％、玉米浆2.0％、硫酸铵0.5％、硫酸镁0.1％、磷酸二氢钾1.5％、氯化钙0.05％；调节pH值为5.5，121℃灭菌30min。

二级种子罐发酵：将一级种子罐成熟的种子按照20％的接种量接种到二级种子罐中，初始条件为pH5.5左右，培养温度29℃；罐压0.03MPa，发酵通风比比1：1，培养10h左右，二级种子罐培养基以重量体积比(g/ml)计，组分如下：葡萄糖1.0％、乳糖1.0％、玉米浆1.0％、硫酸铵0.3％、硫酸镁0.1％、磷酸二氢钾1.0％、氯化钙0.05％；调节pH值为5.5，121℃灭菌30min。

商品罐发酵：将成熟的二级种子按10％的接种量接入商品培养基中；初始条件为发酵温度28℃，初始通风比为1：1，罐压0.03MPa；初始不调节pH，当pH持续下降到3.0左右后用氨水调节pH至4.0左右；24h后缓慢调节pH至4.5；发酵24h左右后，底料碳源基本全部消耗，pH和DO开始反弹上升，开始流加补料，24h左右开始流加补料并控制过程中还原糖量值为DE在1-2‰；补料发酵160h左右；发酵酶活不增长或增长缓慢选择放罐。

发酵罐培养基以重量体积比(g/ml)计，组分如下：葡萄糖0.42％、乳糖3.75％、玉米浆2.6％、硫酸铵0.3％、硫酸镁0.1％、磷酸二氢钾0.6％、氯化钙0.05％，121℃灭菌30min；补料培养基以重量体积比(g/ml)计，组分如下：葡萄糖50％、玉米浆1％、硫酸镁0.1％、磷酸二氢钾0.43％、氯化钙0.05％，121℃灭菌30min。

向上述发酵结束后的发酵液中加入3％左右的珍珠岩助滤剂搅拌均匀后进行板框压滤；用超滤膜对澄清的压滤液进行超滤浓缩，过程控制料液的pH；在浓缩液中加入稳定剂后用硅藻土进行过滤除菌，除菌后的滤液进行吸附干燥制粒后调配即成酸性蛋白酶成品酶制剂。

实施例3黑曲霉ESP1023菌株液体发酵生产酸性蛋白酶

菌种活化：将所述的黑曲霉ESP1023菌株甘油管种子接种至新鲜的PDA茄子瓶培养基中，29℃培养5d。

种子摇瓶发酵：将茄子瓶中成熟的种子菌苔挑取一大环至新鲜配制的种子摇瓶培养基中，29℃条件下，180rpm摇瓶培养30h，种子摇瓶培养基以重量体积比(g/ml)计，组分如下：葡萄糖2.0％、玉米浆2.0％、硫酸铵0.8％、硫酸镁0.1％、磷酸二氢钾0.95％、氯化钙0.05％、微量元素A母液0.04％；pH控制在5.0，115℃灭菌30min，微量元素A母液由下述组分制成：以质量体积比(g/ml)计，柠檬酸铁0.6％，乙酸锌0.08％，乙二胺四乙酸0.084％，其余组分为水。

一级种子罐发酵：将种子摇瓶发酵生产得到的菌种按照0.2％的接种量接入一级种子罐中，培养温度30℃；罐压0.04MPa，发酵通风比1：1，培养20h，发酵培养基以重量体积比(g/ml)计，组分如下：葡萄糖2.0％、玉米浆2.5％、硫酸铵0.75％、硫酸镁0.15％、磷酸二氢钾1.75％、氯化钙0.75％、微量元素A母液0.04％；调节pH5.5，121℃灭菌30min。

二级种子罐发酵：将一级种子罐成熟的种子按照15％的接种量接种到二级种子罐中，初始条件为pH5.5左右，培养温度29℃；罐压0.03MPa，发酵通风比比1：1，培养8h，二级种子罐培养基以重量体积比(g/ml)计，组分如下：葡萄糖1.8％、玉米浆1.8％、硫酸铵0.8％、硫酸镁0.2％、磷酸二氢钾2.0％、氯化钙0.35％；调节pH5.5，121℃灭菌30min。

商品罐发酵：将成熟的二级种子按10％的接种量接入商品培养基中；初始条件为发酵温度28℃，初始通风比为1：1，罐压0.03MPa；初始不调节pH，当pH持续下降到3.5左右后用氨水调节pH至4.2左右；24h后缓慢调节pH至4.8；发酵24h左右后，底料碳源基本全部消耗，pH和DO开始反弹上升，开始流加补料，24h左右开始流加补料并控制过程中还原糖量值为DE在1-2‰；补料发酵160h左右；发酵酶活不增长或增长缓慢选择放罐。

发酵罐培养基以重量体积比(g/ml)计，组分如下：葡萄糖0.84％、乳糖2.25％、玉米浆2.6％、硫酸铵0.25％、硫酸镁0.12％、磷酸二氢钾0.5％、氯化钙0.45％，121℃灭菌30min；补料培养基以重量体积比(g/ml)计，组分如下：葡萄糖50％、玉米浆1.0％、硫酸镁0.25％、磷酸二氢钾0.68％、氯化钙0.25％，121℃灭菌30min。

向上述发酵结束后的发酵液中加入3％左右的珍珠岩助滤剂搅拌均匀后进行板框压滤；用超滤膜对澄清的压滤液进行超滤浓缩，过程控制料液的pH；在浓缩液中加入稳定剂后用硅藻土进行过滤除菌，除菌后的滤液进行吸附干燥制粒后调配即成酸性蛋白酶成品酶制剂。

实施例4黑曲霉ESP1023菌株液体发酵生产酸性蛋白酶

菌种活化：将本发明提供的黑曲霉ESP1023菌株甘油管种子接种至新鲜的PDA茄子瓶培养基中，29℃培养6d。

种子摇瓶发酵：将茄子瓶中成熟的种子菌苔挑取一大环至新鲜配制的种子摇瓶培养基中，29℃条件下，180rpm摇瓶培养30h，种子摇瓶培养基以重量体积比(g/ml)计，组分如下：葡萄糖1％、玉米浆1.5％、硫酸铵0.2％、硫酸镁0.1％、磷酸二氢钾1％、氯化钙0.05％、微量元素A母液0.04％；pH控制在5.2，115℃灭菌30min，微量元素A母液由下述组分制成：以质量体积比(g/ml)计，柠檬酸铁0.6％，乙酸锌0.08％，乙二胺四乙酸0.084％，其余组分为水。

一级种子罐发酵：将种子摇瓶发酵生产得到的菌种按照0.4％的接种量接入一级种子罐中，培养温度30℃；罐压0.05MPa，发酵通风比1：1，培养20h，发酵培养基以重量体积比(g/ml)计，组分如下：葡萄糖2％、玉米浆1％、硫酸铵0.5％、硫酸镁0.1％、磷酸二氢钾2％、氯化钙0.1％、其余为水，调节pH5.5，121℃灭菌30min。

二级种子罐发酵：将一级种子罐成熟的种子按照20％的接种量接种到二级种子罐中，初始条件为pH5.5左右，培养温度30℃；罐压0.05MPa，发酵通风比比1：1，培养10h左右，二级种子罐培养基以重量体积比(g/ml)计，组分如下：葡萄糖2％、玉米浆1％、硫酸铵0.5％、硫酸镁0.1％、磷酸二氢钾2％、氯化钙0.1％；其余为水，调节pH5.5，121℃灭菌30min。

商品罐发酵：将成熟的二级种子按10％的接种量接入商品培养基中；初始条件为发酵温度28℃，初始通风比为1：1，罐压0.05MPa；初始不调节pH，当pH持续下降到3.2左右后用氨水调节pH至4.1左右；24h后缓慢调节pH至4.6；发酵24h左右后，底料碳源基本全部消耗，pH和DO开始反弹上升，开始流加补料，24h左右开始流加补料并控制过程中还原糖量值为DE在1-2‰；补料发酵160h左右；发酵酶活不增长或增长缓慢选择放罐。

发酵罐培养基以重量体积比(g/ml)计，组分如下：葡萄糖0.58％、乳糖1.5％、玉米浆3.2％、硫酸铵0.15％、硫酸镁0.05％、磷酸二氢钾0.5％、氯化钙0.05％，121℃灭菌30min；补料培养基以重量体积比(g/ml)计，组分如下：葡萄糖50％、玉米浆1.0％、硫酸镁0.10％、磷酸二氢钾0.43％、氯化钙0.05％，121℃灭菌30min。

发酵过程图如图2所示，由图可知，发酵24h左右后，pH和DO反弹上升，通过流加补料控制过程中还原糖量值为DE在1-2‰，发酵到160h结束发酵。向发酵结束后得到的发酵液中加入3％左右的珍珠岩助滤剂搅拌均匀后进行板框压滤；用超滤膜对澄清的压滤液进行超滤浓缩，过程控制料液的pH；在浓缩液中加入稳定剂后用硅藻土进行过滤除菌，除菌后的滤液进行吸附干燥制粒后调配即成酸性蛋白酶成品酶制剂。

对比例1

将诱变前初始野生的黑曲霉菌株作为发酵种子，按照实施例4中的发酵工艺进行发酵生产酸性蛋白酶。

对比例2

将本发明提供的黑曲霉ESP1023菌株按照实施例4中的发酵工艺进行发酵生产酸性蛋白酶，与实施例4中的发酵工艺不同之处在于在商品罐发酵过程中，初始不调节pH，全程控制pH4.5-4.8，发酵生产酸性蛋白酶。

实施例5酸性蛋白酶酶活测定

蛋白酶活力以蛋白酶活力单位表示,定义为1g或1mL酶,在一定温度和pH条件下,1min水解酪蛋白产生1μg酪氨酸,即为1个酶活力单位,以U/g(U/mL)表示。本发明中酸性蛋白酶的酶活检测方法是按照国标GB1886.174-2016.方法(A4)进行。

在pH为3.0±0.05，温度为40℃±0.2℃条件下，测定实施例2-4、对比例1和2中得到的酸性蛋白酶的酶活，结果如表2所示。从表2中可以得出，本发明提供的黑曲霉ESP1023菌株相较于对比例1中使用的诱变前初始野生的黑曲霉菌株，酶活提高了72％。

表2酸性蛋白酶的酶活

酸性蛋白酶	发酵周期	酶活(U/mL)
			实施例2	160h	48098
实施例3	160h	49836
			实施例4	160h	55000
对比例1	160h	32008
			对比例2	160h	42164

测定实施例4中得到的酸性蛋白酶的最适反应pH、最适反应温度及酸性蛋白的温度稳定性。

最适反应pH的测定方法为，将实施例4中制备得到的酸性蛋白酶分别用pH2.0、pH3.0、pH4.0、pH5.0和pH6.0缓冲液溶解并稀释至合适倍数，并将酪蛋白用同样缓冲液配制，其余条件按照国标GB1886.174-2016.方法(A4)进行，检测各处理样品的酶活力。结果如图3所示，本发明实施例4中制备得到的酸性蛋白酶最适反应pH在pH3.0左右。

最适反应温度的测定方法为，将实施例4中制备得到的酸性蛋白酶用pH3.0的磷酸二氢钠/柠檬酸缓冲液溶解并稀释，在20℃、30℃、40℃、50℃和60℃和酪蛋白进行反应，其余条件按照国标GB1886.174-2016.方法(A4)进行，检测各处理样品的酶活力。如图4所示，本发明实施例4中制备得到的酸性蛋白酶最适反应温度范围在40℃-50℃。

酸性蛋白酶的温度稳定性的测定方法为，将实施例4中制备得到的酸性蛋白酶在pH3.0条件下稀释至500U/mL，在20℃、30℃、40℃、50℃和60℃保温2h，其余条件按照国标GB1886.174-2016.方法(A4)进行，检测各处理样品的酶活力。结果如图5所示，本发明实施例4中制备得到的酸性蛋白酶最稳定温度范围在40℃以下。

序列表

<110> 安琪酵母股份有限公司

<120> 一种液态发酵生产酸性蛋白酶的菌株及应用

<130> 20191210

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 593

<212> DNA

<213> Aspergillus niger

<400> 1

atatcaataa gcggaggaaa agaaaccaac cgggattgcc tcagtaacgg cgagtgaagc 60

ggcaagagct caaatttgaa agctggctcc ttcggagtcc gcattgtaat ttgcagagga 120

tgctttgggt gcggcccccg tctaagtgcc ctggaacggg ccgtcagaga gggtgagaat 180

cccgtcttgg gcggggtgtc cgtgcccgtg taaagctcct tcgacgagtc gagttgtttg 240

ggaatgcagc tctaaatggg tggtaaattt catctaaagc taaatactgg ccggagaccg 300

atagcgcaca agtagagtga tcgaaagatg aaaagcactt tgaaaagaga gttaaacagc 360

acgtgaaatt gttgaaaggg aagcgcttgc gaccagactc gcccgcgggg ttcagccggc 420

attcgtgccg gtgtacttcc ccgtgggcgg gccagcgtcg gtttgggcgg ccggtcaaag 480

gcccctggaa tgtagtgccc tccggggcac cttatagcca ggggtgcaat gcggccagcc 540

tggaccgagg aacgcgcttc ggcacggacg ctggcataat ggtcgtaaac gac 593

Claims (53)

1.一种黑曲霉ESP1023菌株（Aspergillus niger ESP1023），其特征在于，所述黑曲霉ESP1023菌株（Aspergillus niger ESP1023）保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2018829。

2.权利要求1所述的黑曲霉ESP1023菌株，其特征在于，所述黑曲霉ESP1023菌株的28SrRNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。

3.权利要求1或2所述的黑曲霉ESP1023菌株在发酵生产酸性蛋白酶中的应用。

4.一种发酵生产酸性蛋白酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：培养权利要求1或2所述的黑曲霉ESP1023菌株。

5.一种液态发酵生产酸性蛋白酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）将权利要求1或2所述的黑曲霉ESP1023菌株放大培养，得到所需量的黑曲霉ESP1023菌液；

（2）将所述所需量的黑曲霉ESP1023菌液加入到发酵罐中，在26-32℃条件下发酵，初始不调节pH，当pH持续下降到3.0-3.5后用碱溶液调节pH至4.0-4.2，23-25h后调节pH至4.5-4.8，加入补料培养基控制还原糖量值为1‰-2‰。

6.根据权利要求5所述的一种液态发酵生产酸性蛋白酶的方法，其特征在于，步骤（1）中所述的黑曲霉ESP1023菌株经过一次放大培养和二次放大培养。

7.根据权利要求6所述的一种液态发酵生产酸性蛋白酶的方法，其特征在于，所述的一次放大培养的接种量为重量比0.1-1%。

8.根据权利要求6所述的一种液态发酵生产酸性蛋白酶的方法，其特征在于，所述的一次放大培养的接种量为重量比0.2-0.4%。

9.根据权利要求6所述的一种液态发酵生产酸性蛋白酶的方法，其特征在于，所述的二次放大培养的接种量为重量比10-25%。

10.根据权利要求6所述的一种液态发酵生产酸性蛋白酶的方法，其特征在于，所述的二次放大培养的接种量为重量比15-20%。

11.根据权利要求5所述的一种液态发酵生产酸性蛋白酶的方法，其特征在于，放大培养的pH值为5.0-5.6。

12.根据权利要求6所述的一种液态发酵生产酸性蛋白酶的方法，其特征在于，放大培养的pH值为5.0-5.6。

13.根据权利要求5所述的一种液态发酵生产酸性蛋白酶的方法，其特征在于，所述的放大培养的pH值为5.2-5.5。

14.根据权利要求6所述的一种液态发酵生产酸性蛋白酶的方法，其特征在于，所述的放大培养的pH值为5.2-5.5。

15.根据权利要求5所述的一种液态发酵生产酸性蛋白酶的方法，其特征在于，培养温度为28-32℃。

16.根据权利要求15所述的一种液态发酵生产酸性蛋白酶的方法，其特征在于，所述的培养温度为29-30℃。

17.根据权利要求6所述的一种液态发酵生产酸性蛋白酶的方法，其特征在于，培养温度为28-32℃。

18.根据权利要求17所述的一种液态发酵生产酸性蛋白酶的方法，其特征在于，所述的培养温度为29-30℃。

19.根据权利要求5所述的一种液态发酵生产酸性蛋白酶的方法，其特征在于，罐压为0.02-0.06MPa。

20.根据权利要求5所述的一种液态发酵生产酸性蛋白酶的方法，其特征在于，罐压为0.03-0.05MPa。

21.根据权利要求5所述的一种液态发酵生产酸性蛋白酶的方法，其特征在于，发酵通风比为1：（0.8-1.2）的条件下进行。

22.根据权利要求5所述的一种液态发酵生产酸性蛋白酶的方法，其特征在于，发酵通风比为1：1。

23.根据权利要求6所述的一种液态发酵生产酸性蛋白酶的方法，其特征在于，步骤（1）中所述的一次放大培养所用的培养基以重量体积比g/ml计，组分含有葡萄糖 0.1-8%，玉米浆0.1-10%，硫酸铵 0.05-2%，硫酸镁 0.01-1%，磷酸二氢钾 0.05-5%，氯化钙 0.01-1%的混合水溶液。

24.根据权利要求6所述的一种液态发酵生产酸性蛋白酶的方法，其特征在于，步骤（1）中所述的一次放大培养所用的培养基以重量体积比g/ml计，组分含有葡萄糖 0.5-4%，玉米浆1-5%，硫酸铵 0.2-1.2%，硫酸镁 0.05-0.25%，磷酸二氢钾 0.5-3%，氯化钙 0.05-0.5%的混合水溶液。

25.根据权利要求6所述的一种液态发酵生产酸性蛋白酶的方法，其特征在于，步骤（1）中所述的二次放大培养所用的培养基以重量体积比g/ml计，组分含有葡萄糖 0.1-8%，乳糖0.1-8%，玉米浆0.1-10%，硫酸铵 0.05-2%，硫酸镁 0.01-1%，磷酸二氢钾 0.05-5%，氯化钙0.01-1%的混合水溶液。

26.根据权利要求6所述的一种液态发酵生产酸性蛋白酶的方法，其特征在于，步骤（1）中所述的二次放大培养所用的培养基以重量体积比g/ml计，组分含有葡萄糖 0.5-4%，乳糖0.5-5%，玉米浆1-5%，硫酸铵 0.2-1.2%，硫酸镁 0.05-0.25%，磷酸二氢钾 0.5-3%，氯化钙0.05-0.5%的混合水溶液。

27.根据权利要求12所述的一种液态发酵生产酸性蛋白酶的方法，其特征在于，步骤（1）中所述的一次放大培养所用的培养基以重量体积比g/ml计，组分含有葡萄糖 0.1-8%，玉米浆0.1-10%，硫酸铵 0.05-2%，硫酸镁 0.01-1%，磷酸二氢钾 0.05-5%，氯化钙 0.01-1%的混合水溶液。

28.根据权利要求17所述的一种液态发酵生产酸性蛋白酶的方法，其特征在于，步骤（1）中所述的一次放大培养所用的培养基以重量体积比g/ml计，组分含有葡萄糖 0.1-8%，玉米浆0.1-10%，硫酸铵 0.05-2%，硫酸镁 0.01-1%，磷酸二氢钾 0.05-5%，氯化钙 0.01-1%的混合水溶液。

29.根据权利要求5-28任意一项所述的一种液态发酵生产酸性蛋白酶的方法，其特征在于，步骤（1）中还包括种子摇瓶发酵。

30.根据权利要求29所述的一种液态发酵生产酸性蛋白酶的方法，其特征在于，所述的种子摇瓶发酵温度为27℃-31℃。

31.根据权利要求29所述的一种液态发酵生产酸性蛋白酶的方法，其特征在于，所述的种子摇瓶发酵温度为29℃。

32.根据权利要求29所述的一种液态发酵生产酸性蛋白酶的方法，其特征在于，所述的种子摇瓶发酵转速为100rpm-300rpm。

33.根据权利要求29所述的一种液态发酵生产酸性蛋白酶的方法，其特征在于，所述的种子摇瓶发酵转速为180rpm。

34.根据权利要求29所述的一种液态发酵生产酸性蛋白酶的方法，其特征在于，所述的种子摇瓶发酵时间为20-50h。

35.根据权利要求29所述的一种液态发酵生产酸性蛋白酶的方法，其特征在于，所述的种子摇瓶发酵时间为30h。

36.根据权利要求29所述的一种液态发酵生产酸性蛋白酶的方法，其特征在于，所述的种子摇瓶发酵培养基以重量体积比g/ml计，组分含有葡萄糖 0.1-8%，玉米浆0.1-10%，硫酸铵 0.05-2%，硫酸镁 0.01-1%，磷酸二氢钾 0.05-5%，氯化钙 0.01-1%，微量元素A母液0.01%-0.08%的混合水溶液，

所述的微量元素A母液中，以质量体积比g/ml计，含有0.3-0.9%柠檬酸铁、0.05-0.1%乙酸锌和0.05-0.1%EDTA，其余组分为水。

37.根据权利要求29所述的一种液态发酵生产酸性蛋白酶的方法，其特征在于，所述的种子摇瓶发酵培养基以重量体积比g/ml计，组分含有葡萄糖 0.5-4%，玉米浆1-5%，硫酸铵0.2-1.2%，硫酸镁 0.05-0.25%，磷酸二氢钾 0.5-3%，氯化钙 0.05-0.5%，微量元素A母液0.04%的混合水溶液，

所述的微量元素A母液中，以质量体积比g/ml计，含有0.3-0.9%柠檬酸铁、0.05-0.1%乙酸锌和0.05-0.1%EDTA，其余组分为水。

38.根据权利要求5-28任意一项所述的一种液态发酵生产酸性蛋白酶的方法，其特征在于，步骤（2）中发酵罐培养基以重量体积比g/ml计，组分含有葡萄糖 0.1-3%，乳糖 0.1-10%，玉米浆 0.1-5%，硫酸铵 0.01-1%，硫酸镁0.01-0.5%，磷酸二氢钾 0.1-2%，氯化钙0.01-8%的混合水溶液。

39.根据权利要求29所述的一种液态发酵生产酸性蛋白酶的方法，其特征在于，步骤（2）中发酵罐培养基以重量体积比g/ml计，组分含有葡萄糖 0.1-3%，乳糖 0.1-10%，玉米浆0.1-5%，硫酸铵 0.01-1%，硫酸镁0.01-0.5%，磷酸二氢钾 0.1-2%，氯化钙 0.01-8%的混合水溶液。

40.根据权利要求5-28任意一项所述的一种液态发酵生产酸性蛋白酶的方法，其特征在于，步骤（2）中发酵罐培养基以重量体积比g/ml计，组分含有葡萄糖 0.24-1.68%，乳糖1-5%，玉米浆 0.68-3.2%，硫酸铵 0.15-0.29%，硫酸镁0.05-0.19%，磷酸二氢钾 0.3-0.9%，氯化钙 0.05-5%的混合水溶液。

41.根据权利要求5-28任意一项所述的一种液态发酵生产酸性蛋白酶的方法，其特征在于，步骤（2）中用氨水调节pH。

42.根据权利要求5-28任意一项所述的一种液态发酵生产酸性蛋白酶的方法，其特征在于，步骤（2）中发酵23-25h后开始加入补料。

43.根据权利要求5-28任意一项所述的一种液态发酵生产酸性蛋白酶的方法，其特征在于，步骤（2）中接种量为重量比5-15%。

44.根据权利要求5-28任意一项所述的一种液态发酵生产酸性蛋白酶的方法，其特征在于，步骤（2）中接种量为重量比10%。

45.根据权利要求5-28任意一项所述的一种液态发酵生产酸性蛋白酶的方法，其特征在于，步骤（2）中发酵通风比为1：（0.8-1.2）。

46.根据权利要求5-28任意一项所述的一种液态发酵生产酸性蛋白酶的方法，其特征在于，步骤（2）中发酵通风比为1：1。

47.根据权利要求5-28任意一项所述的一种液态发酵生产酸性蛋白酶的方法，其特征在于，步骤（2）中罐压为0.02-0.06MPa。

48.根据权利要求5-28任意一项所述的一种液态发酵生产酸性蛋白酶的方法，其特征在于，步骤（2）中罐压为0.03-0.05MPa。

49.根据权利要求5-28任意一项所述的一种液态发酵生产酸性蛋白酶的方法，其特征在于，步骤（2）中补料发酵140-160h。

50.根据权利要求5-28任意一项所述的一种液态发酵生产酸性蛋白酶的方法，其特征在于，步骤（2）中补料培养基以重量体积比g/ml计，组分包含葡萄糖 20-80%，玉米浆 0.01-3%，硫酸镁 0.01-1%，磷酸二氢钾0.1-1%，氯化钙 0.01-8%的混合水溶液。

51.根据权利要求5-28任意一项所述的一种液态发酵生产酸性蛋白酶的方法，其特征在于，步骤（2）中补料培养基以重量体积比g/ml计，组分包含葡萄糖 30-70%，玉米浆 0.1-1.5%，硫酸镁 0.1-0.5%，磷酸二氢钾0.34-0.68%，氯化钙 0.05-5%的混合水溶液。

52.根据权利要求5-28任意一项所述的一种液态发酵生产酸性蛋白酶的方法，其特征在于，步骤（2）中通过流加的方式加入补料培养基。

53.根据权利要求5-28任意一项所述的一种液态发酵生产酸性蛋白酶的方法，其特征在于，发酵结束后，对发酵液进行压滤、浓缩、除菌和干燥获得酸性蛋白酶制剂。

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