CN109943662A - 一种曲霉菌分种检测的引物探针组合、试剂盒、检测方法及其应用 - Google Patents

一种曲霉菌分种检测的引物探针组合、试剂盒、检测方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种曲霉菌分种检测的引物探针组合、试剂盒、检测方法及其应用，所述曲霉菌分种检测的引物探针组合，包括分别针对烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉和土曲霉的特异性引物、检测探针以及互补探针，所述互补探针与检测探针不完全互补配对。本发明的引物探针组合一次检测确定是否为曲霉菌感染，能够在同一荧光通道里同时区分烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉和土曲霉。

Description

一种曲霉菌分种检测的引物探针组合、试剂盒、检测方法及其 应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种曲霉菌分种检测的引物探针组合、试剂盒、检测方法及其应用，具体涉及一种烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉和土曲霉分种检测的引物探针组合、试剂盒、检测方法及其应用。
背景技术
曲霉菌属于条件致病菌，广泛存在于生活环境中，其可产生分生孢子随呼吸进入机体，主要侵染肺部、皮肤或粘膜。常见的病原菌有烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、土曲霉等。
目前对于曲霉菌的检测方法主要为：(1)病原体培养鉴定，取患处的标本做涂片或培养，涂片可见菌丝或曲霉菌孢子，培养见曲霉菌生长，曲霉菌为常见污染菌，须反复涂片或培养，多次阳性且为同一菌种才有诊断价值，培养周期长。(2)病理组织检查，取受损组织或淋巴结活检，根据真菌形态确诊，但该方法为有创检查，患者接受度较差。(3)免疫学检查，半乳甘露聚糖为曲霉菌细胞壁中的高度特异性和保守性的多糖，可作为检测曲霉菌的分子标志物，通过ELISA方法进行检测，但该方法灵敏度不高，不能区分菌种。(4)实时荧光PCR法，通过引物和探针的组合提高检测特异性，为临床诊断提供依据。现有方法检测周期长，不利于临床诊断用药。虽然已有多种抗真菌药物，但针对各种曲霉菌的治疗方案相同，无法实现针对特定菌种的精准治疗。
CN108070675A公开了一种同时检测三种曲霉的引物探针组合和荧光定量PCR试剂盒，属于病原微生物体外分子检测技术领域。该发明提供了一种基于荧光PCR法同时检测三种曲霉的引物探针组合，所述曲霉包括烟曲霉、黄曲霉和黑曲霉。但该发明只能检测出样本中含有烟曲霉、黄曲霉或黑曲霉中的任意一种或其组合，无法检测确定具体菌种，且该方法无法诊断土曲霉的存在。
CN106755379A公开了一种基于二聚体突变引物建立的荧光定量PCR方法定量检测4中曲霉菌并同步进行基因分型的方法，该检测方法包括1)提取待检测样品及4种标准菌株中的DNA；2)制备阳性质粒标准品；3)运行荧光定量PCR；4)数据分析。该发明还提供一种烟曲霉菌、黑曲霉菌、黄曲霉菌和土曲霉菌同步定量和基因分型的检测试剂盒，该试剂盒包括标记有荧光报告基团的上游引物、淬灭基团标记的上游引物互补链及下游引物。但该发明的引物设计有荧光基团，影响荧光定量PCR的扩增；其次，该产物熔解曲线温度过高，曲霉菌的种间退火温度差异过小，曲霉菌分型鉴定的灵敏度和特异性不高；最后，仅通过普通引物无探针配合，且互补引物还设计有突变位点，导致扩增非特异性产物，方法特异性不佳。
CN101038254A公开了一种试剂盒特异性扩增曲霉菌ITS I区间的基因，产物大小为79bp，能快速准确地检测出常见的多种致病曲霉菌(如烟曲霉、黄曲霉、土曲霉、黑曲霉和构巢曲霉)。但该发明无法检测曲霉菌的种间差异。
CN102321738A公开了一种曲霉菌的荧光定量PCR检测通用引物，检测探针和检测试剂盒，通过一对通用引物以及4条特异性探针鉴别烟曲霉、黄曲霉、土曲霉和黑曲霉。虽然能检测曲霉菌的种间差异，但该方法需要四个荧光通道进行分析，增加实验周期和成本。
因此，提供一种特异性好、灵敏度高、能区分曲霉菌种的简便方法具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种曲霉菌分种检测的引物探针组合、试剂盒、检测方法及其应用，一次检测确定是否为曲霉菌感染，能够在同一荧光通道里同时区分烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉和土曲霉。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种曲霉菌分种检测的引物探针组合，包括分别针对烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉和土曲霉的特异性引物、检测探针以及互补探针，所述互补探针与检测探针不完全互补配对。
本发明中，采用多重PCR同时扩增侵袭性曲霉菌属中常见的烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、土曲霉的特异靶序列，再通过特殊设计的Taqman探针熔解曲线分析鉴定，实现对于四种常见的侵袭性曲霉菌多重检测，本发明的引物探针组合特异性好，灵敏度高，实现曲霉菌的菌种间分种检测。
本发明中，检测探针与互补探针不完全互补配对，不互补的碱基位置不位于检测引物的5’端或3’端的5个碱基序列内，不互补的位置不能是连续的。按照最邻近法的Tm值计算公式计算不完全互补的检测探针和互补探针的Tm值。公式如下：Tm＝ΔH*/(ΔS*+RlnCT)，其中ΔH*、ΔS*分别为杂交反应的标准焓变和熵变，R为气体常数1.987cal/kmol、CT为DNA分子的摩尔浓度(当DNA分子为非对称序列时，其摩尔浓度取CT/4)分别是，利用该公式设计得到设计的检测探针和互补探针的Tm值的探针，进而设计出一系列可以通过Tm值明确区分的互补探针和检测探针组合，从而实现在同一荧光通道中通过不同Tm值区分不同曲霉菌。
优选地，所述烟曲霉的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示，所述黄曲霉的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3-4所示，所述黑曲霉的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5-6所示，所述土曲霉的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7-8所示。
在同一反应体系中同存多对引物和探针，检测不同目标序列，需要平衡各种序列之间的稳定性、反应条件、扩增效率，随着检测菌种的数量递增，引物探针组合设计的难度显著提高，受到多种条件的制约，本发明中，通过针对烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、土曲霉的多重序列比对，设计特异性引物，使得多重引物能稳定存在于同一反应体系中，且扩增效率一致，提高检测特异性与灵敏度，避免引物间的交叉影响。
优选地，所述烟曲霉的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，黄曲霉的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，黑曲霉的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示和土曲霉的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
本发明中，通过ClustaX比对NCBI上大量核酸序列，比对菌种范围包括：比对的菌种范围包括烟曲霉AJ853744.1、AB197939.1、LC228654.1、LC171332.1、LN832990.1等264条序列；黄曲霉AJ853764.1、LT594458.1、LC133097.1、LC133096.1、LN832989.1等351条序列；黑曲霉AJ853742.1、AJ280006.1、LC133093.1、LN832991.1、LM653115.1等168条序列；土曲霉AB661667.1、FN645432.1、LN832993.1、HG964331.1、LC317459.1等160条序列，通过比对上述943条序列，可以最大程度获得曲霉菌种内高保守区，得到不同临床分离株的高保守区和可变区，进而指导引物设计位置，提高对不同菌种的不同分离株的敏感性，目标序列的选择对引物探针组合的设计至关重要，需要同时满足不同引物、探针之间的稳定性、扩增效率一致、检测特异性、灵敏度，同时还要满足反应条件的一致性，检测的曲霉菌种数越多，需要考虑的因素越多，同时设计真对四种曲霉菌种检测的引物探针组合并不等同于真对单一菌种的引物探针的组合。
本发明中，在待测四种曲霉菌特异靶序列的区域，优选18S rRNA、28S rRNA序列区域，分别设计并制备四条Taqman探针和四条其互补序列，以及检测探针序列外围分别设计一对引物序列，包括一条上游引物和一条下游引物。用设计的引物对特异性靶点进行单重或多重单色或多重多色实时荧光定量PCR扩增反应。
优选地，所述烟曲霉的互补探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，黄曲霉的互补探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，黑曲霉的互补探针的核苷酸序列如SEQ IDNO.15所示和土曲霉的互补探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示。
本发明中，针对四种不同曲霉菌的检测探针分别设计一条互补探针，所述互补探针与检测探针不完全互补配对可以形成双链探针，使得针对不同曲霉菌种的双链探针有不同的熔解性，可以通过其特征熔化温度(Tm)区分四种不同曲霉菌。
优选地，所述引物探针组合还包括内参系统。
优选地，所述内参系统包括内参引物和内参探针。
优选地，所述内参引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.17-18所示。
优选地，所述内参探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示。
优选地，所述烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉和土曲霉的检测探针的3’端修饰有淬灭基团，5’端修饰有荧光基团。
优选地，优选地，所述荧光基团包括ALEX-350、Alexa Fluor 488、CY3、FAM、VIC、TET、CALGold540、JOE、HEX、CALFluorOrange560、TAMRA、CALFluorRed590、ROX、CALFluorRed610、TexasRed、CALFluorRed635、Quasar670、CY5、CY5.5、LC RED640或Quasar705中的任一种或至少两种的组合。
本发明中，针对不同曲霉菌种的检测探针的5’端均修饰有荧光基团，其可以为相同的荧光基团也可以为不同的荧光基团，当修饰有相同荧光基团时，本发明设计的引物探针组合可以在同一荧光检测通道中进行检测分析，根据所述检测探针和互补探针形成的双链探针的熔解温度不同，在实时荧光定量PCR扩增反应后进行熔解曲线分析，根据Taqman探针熔点的变化来判断待检测样品中是否存在四种致病曲霉菌的一种或多种并通过Tm值-菌种标准对照表鉴定待测样品中的曲霉菌菌种，即进行多重单色实时荧光定量PCR反应；当修饰有不同荧光基团时，也可以进行多重多色实时荧光定量PCR反应；此外，单独使用针对四种曲霉菌种的某一种进行检测同样可行，即单重单色实时荧光定量PCR反应。
优选地，所述检测探针3’端修饰的淬灭基团包括TAMRA、DABCYL、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3或Eclipse中的任一种或至少两种的组合。
针对不同的曲霉菌，所用的荧光基团和淬灭基团可以是相同的，也可以是不同的，但不同的荧光基团所需要的荧光检测通道需要不同，且所选择的不同荧光基团的激发光和吸收光光谱范围需要避免干扰。优选地，检测不同曲霉菌的探针修饰的荧光基团和淬灭基团为同一组。
所述荧光基团和淬灭基团的组合典型非限定地可以是荧光基团FAM和淬灭基团TAMRA；荧光基团HEX淬灭基团BHQ-1；荧光基团ROX和淬灭基团BHQ-2；荧光基团CY5和淬灭基团BHQ-3，优选为为荧光基团FAM和淬灭基团TAMRA。
优选地，所述互补探针的3’端修饰有淬灭基团。
优选地，所述互补探针3’端修饰的淬灭基团包括TAMRA、DABCYL、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3或Eclipse中的任一种或至少两种的组合。
优选地，所述互补探针和检测探针地淬灭基团相同。探针的淬灭基团与互补序列的淬灭基团也可不同，但需要匹配荧光基团的光谱波段。
本发明中，所述互补探针的3’端可以选择性修饰淬灭基团。检测探针与靶序列互补，检测探针设计时在5’端用荧光基团标记，3’端标记淬灭基团。互补探针的3’端可以设计为包含带有淬灭基团也可以不设计带有淬灭基团。当互补探针3’端不带有淬灭基团时，温度升高时，随着检测探针和互补探针解链而荧光值减少。这种现象的原因是溶液中的线性单链双标记寡核苷酸为无规则卷曲：它的两端偶尔彼此接近，导致荧光基团的能量被淬灭基团所吸收。然而，当检测探针和互补探针结合时，标记的杂合体迫使探针的两端分开，破坏两个末端标记之间的相互作用，从而引起荧光值的变化。如果互补探针在3’端用猝灭基团标记，则探针间杂交降低荧光值，并且当温度升高以使双链体变性时，荧光值增加。这是因为探针杂合体的形成使淬灭基团和荧光基团紧密接近，有效地淬灭荧光信号。
第二方面，本发明提供一种曲霉菌分种检测的试剂盒，所述试剂盒包括如第一方面所述的引物探针组合。
优选地，所述试剂盒还包括阴性质控、阳性质控和辅助试剂。
优选地，所述阴性质控为含有拟南芥DNA片段的质粒，所述拟南芥DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示。
优选地，所述阳性质控分别为含有烟曲霉DNA片段的质粒、含有黄曲霉DNA片段的质粒、含有黑曲霉DNA片段的质粒和含有土曲霉DNA片段的质粒。
本发明中，阴性质控和阳性质控均采用本领域常用的质粒pMD19，需要说明的是，任何满足阴性质控和阳性质控质粒构建的载体均可用于替换pMD19，此处无需特殊限定。
优选地，所述烟曲霉DNA片段、黄曲霉DNA片段、黑曲霉DNA片段和土曲霉DNA片段的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24所示。
优选地，所述辅助试剂包括Taq酶、dNTP、MgCl2、DMSO和缓冲液。
优选地，所述缓冲液包括Tris-HCl和KCl。
优选地，所述Tris-HCl在缓冲液中的浓度为15-20mM，例如可以是15mM、16mM、17mM、18mM、19mM或20mM。
优选地，所述KCl在缓冲液中的浓度为100-200mM，例如可以是100mM、110mM、120mM、130mM、140mM、150mM、160mM、170mM、180mM、190mM或200mM。
第四方面，本发明提供一种利用如第二方面所述的试剂盒用于曲霉菌分种检测的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)提取样本DNA；
(2)向步骤(1)样本DNA中加入Taq酶、dNTP、MgCl2、DMSO、缓冲液、如第一方面所述的引物探针组合；
(3)实时荧光PCR反应。
优选地，步骤(2)所述DNA样本的终浓度为0.1pg-10ng，例如可以是0.1pg、0.5pg、1pg、2pg、3pg、4pg、5pg、10pg、20pg、30pg、40pg、50pg、60pg、70pg、80pg、90pg、100pg、200pg、300pg、400pg、500pg、600pg、700pg、800pg、900pg、1ng、2ng、3ng、4ng、5ng、6ng、7ng、8ng、9ng或10ng。
优选地，步骤(2)所述Taq酶的终浓度为0.5-5U，例如可以是0.5U、0.8U、1U、1.2U、1.5U、1.8U、2U、2.5U、3U、3.5U、4U、4.5U或5U。
优选地，步骤(2)所述dNTP的终浓度为0.1-5M，例如可以是0.1M、0.3M、0.5M、0.8M、1M、1.2M、1.5M、1.8M、2M、2.5M、2.8M、3M、3.5M、4M、4.5M、4.8M或5M。
优选地，步骤(2)所述dNTP的终浓度为0.1-5M，例如可以是0.1M、0.3M、0.5M、0.8M、1M、1.2M、1.5M、1.8M、2M、2.5M、2.8M、3M、3.5M、4M、4.5M、4.8M或5M。
优选地，步骤(2)所述DMSO的体积百分比为1-8％，例如可以是1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％或8％，优选为5％。
优选地，步骤(2)所述四种曲霉菌的特异性引物的终浓度为50-500nM，例如可以是50nM、60nM、70nM、80nM、90nM、100nM、120nM、150nM、180nM、200nM、250nM、300nM、350nM、400nM、450nM或500nM。
优选地，步骤(2)所述四种曲霉菌的检测探针的终浓度为50-500nM，例如可以是50nM、60nM、70nM、80nM、90nM、100nM、120nM、150nM、180nM、200nM、250nM、300nM、350nM、400nM、450nM或500nM。
优选地，步骤(2)所述四种曲霉菌的互补探针的终浓度为50-500nM，例如可以是50nM、60nM、70nM、80nM、90nM、100nM、120nM、150nM、180nM、200nM、250nM、300nM、350nM、400nM、450nM或500nM。
本发明PCR反应体系中针对每种曲霉菌的特异性引物终浓度一致，按照四对引物1:1:1:1组合配比，所述终浓度范围为所述终浓度范围为50-500nM，本发明的引物探针设计满足扩增效率一致。
本发明PCR反应体系中针对每种曲霉菌的检测探针终浓度一致，按照四种探针1:1:1:1组合配比，所述终浓度范围为所述终浓度范围为50-500nM。
本发明PCR反应体系中针对每种曲霉菌的互补探针终浓度一致，按照四种探针1:1:1:1组合配比，所述终浓度范围为所述终浓度范围为50-500nM。
优选地，步骤(3)所述实时荧光PCR反应的条件为：
(1’)90-98℃预变性，1-2min，1个循环；
(2’)90-98℃变性10s，55-60℃延伸35-45s，40-50个循环；
(3’)35-97℃升温，1个循环。
优选地，步骤(1’)之前还包括预热的过程：50℃，2min，1个循环。
优选地，步骤(1)所述实时荧光PCR反应具体包括如下步骤：
(1”)50℃预热2min，1个循环；
(2”)95℃预变性10min，1个循环；
(3”)95℃变性10s，58℃延伸40s，延伸时采集荧光信号，45个循环；
(4”)95℃5s，35℃1min；升温到97℃，0.2℃/s，连续采集荧光信号，5次/℃。
优选地，步骤(2)所述判断的标准为：
(a)若检测通道的Ct值不大于35，则为阳性结果，若检测通道的Ct值大于35，则为阴性结果；
(b)对阳性结果进一步分析，通过熔解曲线分析，比对产物与四种阳性质控的对应退火温度Tm值，Tm值相同的即判定待测样本含有对应阳性质控的曲霉菌种。
第四方面，本发明提供一种如第一方面所述的引物探针组合和/或如第二方面所述的试剂盒用于曲霉菌分种检测或制备曲霉菌分种检测的试剂中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明的引物探针组合具有高特异性和灵敏度，能同时检测烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉和土曲霉并区分具体菌种；
(2)本发明中针对烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉和土曲霉设计的引物在满足普通扩增需求的同时还满足扩增效率的一致，使检测体系更加稳定，检测特异性好，避免扩增效率不同导致菌种间的相互影响；
(3)本发明的检测方法灵敏度高，配合特定引物探针组合可以快速检测烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉和土曲霉，可在同一荧光检测通道中同时鉴别区分不同曲霉菌种，根据Taqman探针熔点的变化可在同一荧光通道来区分多种曲霉菌菌种的特异靶序列；
(4)寡核苷酸探针熔解曲线分析可以在实时荧光PCR扩增反应后直接进行，无需开管操作，也可以在普通PCR进行扩增后转移到实时荧光PCR仪进行分析；
(5)寡核苷酸探针熔解曲线分析属于非消耗性的检测，在分析结束后，样本保持PCR后的状态，并且可以多次重复分析。
附图说明
图1为分别以含有烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉和土曲霉DNA片段的质粒为模板，检测产物的熔解曲线；
图2为实施例4中不同浓度的含有烟曲霉DNA片段的标准质粒对应的扩增曲线；
图3为实施例4中不同浓度的含有烟曲霉DNA片段的标准质粒对应的熔解曲线；
图4为实施例5烟曲霉DNA不同浓度梯度的扩增曲线图；
图5为实施例5中烟曲霉DNA不同浓度与Ct值的线性关系图。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
实施例1试剂盒的组装
针对烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、土曲霉的特异性引物、检测探针以及互补探针的核苷酸序列见表1.
表1
引物名称 编号SEQ ID NO. 核苷酸序列5’-3’
烟曲霉上游引物 1 GTCGTTTACGAGCAGCCTTC
烟曲霉下游引物 2 TTTGGCTTCCGTTCTATTGG
黄曲霉上游引物 3 GGAAACCGATTGCCTTCATA
黄曲霉下游引物 4 TGATGAACAGCACCAGAAGC
黑曲霉上游引物 5 CCAGCTGGCATTCCCTTT
黑曲霉下游引物 6 TTTTATCGGTTGGAGGCAAG
土曲霉上游引物 7 CTAAGGATTCCAGGGGAAGG
土曲霉下游引物 8 TGGTGGCACAGAACTAAGCA
烟曲霉检测探针 9 AAACGCTTATTTTGCTAGTGGCCA
黄曲霉检测探针 10 ATACTCCGCCTTTCTTTCAAGCAAA
黑曲霉检测探针 11 TTTATACTCCGCCTTTCTTTCAAGCAA
土曲霉检测探针 12 TCACAGTAATGATCCTTCCGCAG
烟曲霉互补探针 13 TTTGCGAATAAAACGATCATCGG
黄曲霉互补探针 14 TATGACGCGCAATGAAAGTTCGTTT
黑曲霉互补探针 15 AATTATGAGGCGGACAGTAAGTTAGTT
土曲霉互补探针 16 AGTGTCATTACTAGGAAGGCGTC
内参引物上游引物 17 CTGTGAATGCCATTTCTC
内参引物下游引物 18 ACACCTCCTTTGGAATAG
内参探针 19 CCTAACCTACCCGCCTTGGATATT
阴性质控品：所述阴性质控为含有拟南芥DNA片段的质粒，所述拟南芥DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示，具体序列如下：
CATGATTCAGCCAACATAACCCGACCCGTACAATTCTATTACGCGTCTCCGGCGACTGACTATACTTGCCGTTCGGAGTTAGGGTTTTACTCCGAGAGAAAATTGAGTCAGCGATGAATCCGTTGACAAGGTGAAGAAGACGCAGAGCATTAACGCGAAAGAATTAGATCTAGGGATTTACGACGAAGCATCTTGGCACGCCAAGTACAAAGATTCAGCCTACGTTTACGTCGGAGAATTACCTTACGATCTCACGGAGGGTGACCTCCTCGCCGTTTTCTCACAATATGGTGAAGTTGTTGATTTGAATCTTGTTCGAGATAAAGGAACTGGGAGATCAAAAAGATTTGCGTTTGTTGCTTATGAAGATCAGAGAAGTACTAATCTTGCTGTTGGATAATAAAAGTGGAGCATTGTGGTAAATACTTAAAGAGAGAAGAGGAAGATGAAGAGACGAAGCAGAAGAAGAGAGAAGCTCCGTGGTGTTTGCAGAGCTTTTCAGAGAAAGGAGTGTACTCGTGGAGATTCTTGCAAATTTTCTCACGATGAAAATAGAGCTGCCAATACCGGGTGGGGTCACGAAGATCGTAGAAGTTCCAAGTGAGAGATCAAGTAAGTAAATACCATAATGATGTAGAGGATAAATAGGGATTGTTCATATTGATATCCAAGTGGTAATGCTCTACATTGAAGAATGGTTTCTAAGTTGTAGCTAGAATCTAATGGAAAATGTGATTTATTGACCATTAGCTTACACACCGGTGTTTTGCTCTGTATATGTCGATCTTATTTTCAGTGTTCACCTTTAC.
阳性质控品：含有烟曲霉DNA片段的质粒、含有黄曲霉DNA片段的质粒、含有黑曲霉DNA片段的质粒和含有土曲霉DNA片段的质粒。
烟曲霉DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示，具体如下：
ATATCAATAAGCGGAGGAAAAGAAACCAACAGGGATTGCCTCAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAAGAGCTCAAATTTGAAAGCTGGCCCCTTCGGGGTCCGCGTTGTAATTTGCAGAGGATGCTTCGGGTGCAGCCCCCGTCTAAGTGCCCTGGAACGGGCCGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTCTGGGACGGGGTGTCTGCGTCCGTGTGAAGCTCCTTCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAATGGGTGGTAAATTTCATCTAAAGCTAAATACTGGCCGGAGACCGATAGCGCACAAGTAGAGTGATCGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTTAAACAGCACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGCGTTTGCGACCAGACTCGCCCGCGGGGTTCAGCCGGCATTCGTGCCGGTGTACTTCCCCGTGGGCGGGCCAGCGTCGGTTTGGGCGGCCGGTCAAAGGCCCTCGGAATGTATCACCTCTCGGGGTGTCTTATAGCCGAGGGTGCAATGCGGCCTGCCTGGACCGAGGAACGCGCTTCGGCTCGGACGCTGGCGTAATGGTCGTAAATGAC.
黄曲霉DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示，具体如下：
AAACCAACCGGGATTGCCTCAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAAGAGCTCAAATTTGAAAGCTGGCTCCTTCGGGGTCCGCATTGTAATTTGCAGAGGATGCTTCGGGTGCGGCCCCTGTCTAAGTGCCCTGGAACGGGCCGTCAGAGAGGGTGAGAATCCCGTCTGGGATGGGGTGTCCGCGCCCGTGTGAAGCTCCTTCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAATGGGTGGTAAATTTCATCTAAAGCTAAATACTGGCCGGAGACCGATAGCGCACAAGTAGAGTGATCGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTTAAAAAGCACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGCGCTTGCGACCAGACTCGCCTCCAGGGTTCAGCCGGCATTCGTGCCGGTGTACTTCCCTGGGGGCGGGCCAGCGTCGGTTTGGGCGGCCGGTCAAAGGCTCCCGGAATGTAGTGCCCTCCGGGGCACCTTATAGCCGGGAGTGCAATGCGGCCAGCCTGGACCGAGGAACGCGCTTCGGCACGGACGCTGGCATAATGGTCGTAAACGAC.
黑曲霉DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示，具体如下：
ATATCAATAAGCGGAGGAAAAGAAACCAACCGGGATTGCCTCAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAAGAGCTCAAATTTGAAAGCTGGCTCCTTCGGAGTCCGCATTGTAATTTGCAGAGGATGCTTTGGGTGCGGCCCCCGTCTAAGTGCCCTGGAACGGGCCGTCAGAGAGGGTGAGAATCCCGTCTTGGGCGGGGTGTCCGTGCCCGTGTAAAGCTCCTTCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAATGGGTGGTAAATTTCATCTAAAGCTAAATACTGGCCGGAGACCGATAGCGCACAAGTAGAGTGATCGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTTAAACAGCACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGCGCTTGCGACCAGACTCGCCCGCGGGGTTCAGCCGGCATTCGTGCCGGTGTACTTCCCCGTGGGCGGGCCAGCGTCGGTTTGGGCGGCCGGTCAAAGGCCCCTGGAATGTAGTGCCCTCCGGGGCACCTTATAGCCAGGGGTGCAATGCGGCCAGCCTGGACCGAGGAACGCGCTTCGGCACGGACGCTGGCATAATGGTCGTAAACGAC.
土曲霉DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示，具体如下：
ATTGCCTCAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAAGAGCTCAAATTTGAAAGCTGGCTCCTTCGGGGTCCGCATTGTAATTTGCAGAGGATGCTTCGGGTGCAGCCCCCGTCTAAGTGCCCTGGAACGGGCCGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTATGGGGCGGGGTGTCTGCGTCCGTGTGAAGCTCCTTCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAATGGGTGGTAAATTTCATCTAAAGCTAAATACTGGCCGGAGACCGATAGCGCACAAGTAGAGTGATCGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTTAAACAGCACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGCGCTTGCAACCAGACTCGCTCGCGGGGTTCAGCCGGGCTTCGGCCCGGTGTACTTCCCCGCGGGCGGGCCAGCGTCGGTTTGGGCGGCCGGTCAAAGGCCTCCGGAATGTAGCGCCCTTCGGGGCGCCTTATAGCCGGGGGTGCAATGCGGCCAGCCTGGACCGAGGAACGCGCTTCGGCACGGACGCTGGCA.
辅助试剂：Taq酶、dNTP、MgCl2、DMSO和缓冲液。
将装有上述组分的离心管及说明书等装入试剂盒中。
实施例2曲霉菌的分种检测
采用实施例1中的试剂盒进行曲霉菌分种检测，包括如下步骤：
(1)提取样本DNA；
(2)向步骤(1)样本DNA中加入Taq酶、dNTP、MgCl2、DMSO、缓冲液、针对四种曲霉菌的特异性引物、检测探针以及互补探针，按照表2配制体系；
表2
组分 剂量
TaqPolymerase 2U
dNTP 2M
Primers 200nM
Probes 100nM
MgCl<sub>2</sub> 3mM
Template 1μL
DMSO 5％
Total 25μL
(3)将步骤(2)体系放入实时荧光PCR仪，进行PCR扩增反应，具体条件如下所示：
(1”)50℃预热2min，1个循环；
(2”)95℃预变性10min，1个循环；
(3”)95℃变性10s，58℃延伸40s，延伸时采集荧光信号，45个循环；
(4”)95℃5s，35℃1min；升温到97℃，0.2℃/s，连续采集荧光信号，5次/℃。
步骤(4”)的检测荧光通道为FAM，运行PCR反应程序，保存文件；
(4)结果判定：
1)试剂盒有效性的判定：
阴性质控组有效：阴性质控组在FAM通道下无典型扩增曲线或无Ct值，否则可能存在试剂污染，请排除污染源后重测；
阳性质控组有效：阳性质控组在FAM通道下均有典型扩增曲线，确认无误后通过调节阈值将阳性质控的Ct值调节至20，并以此作为待测样本的阈值；
2)检测样本的有效性判定：
若Ct值在，表明加入的DNA量正常；
3)曲霉菌分型判定：
PCR循环扩增产物后，不同曲霉菌种DNA序列的熔解温度不同，通过阳性质控的四种质粒进行仪器校准，本发明采用罗氏480进行检测，得到烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、土曲霉对应的产物退火温度表(表3)，需要说明的是，任何满足实时荧光PCR的仪器均可，在此无需做具体限定，校准目的在于消除不同仪器带来的具体退火温度差异。
表3不同曲霉菌种的退火温度Tm值对照表
曲霉菌菌种 熔解温度(Tm值)℃
烟曲霉 56
黑曲霉 48
黄曲霉 41
土曲霉 62
由表2可知，不同曲霉菌种的产物Tm值差异较大，均在6℃以上，便于区分，特异性好，灵敏度高，不限于PCR仪器的具体测量值可能稍有偏差，但曲霉菌种间的Tm值是相对稳定的，通过对阳性质控的检测，可以得到适用于任何机器的Tm值对照表，阳性质控对应的熔解曲线图见图1。
实施例3特异性检测分析
分别提取新生隐球菌、格特隐球菌、构巢曲霉、杂色曲霉、酿酒酵母、马尔尼菲青霉、白色念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、葡萄牙念珠菌、季也蒙念珠菌、百日咳杆菌、流感嗜血杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌的DNA，采用本发明实施例1的试剂盒，按照实施例2的方法进行检测，结果见下表4。
表4
菌种名 检测Ct值 检测Tm值
新生隐球菌 - -
格特隐球菌 - -
构巢曲霉 - -
杂色曲霉 - -
酿酒酵母 - -
马尔尼菲青霉 - -
白色念珠菌 - -
近平滑念珠菌 - -
热带念珠菌 - -
光滑念珠菌 - -
克柔念珠菌 - -
葡萄牙念珠菌 - -
季也蒙念珠菌 - -
百日咳杆菌 - -
流感嗜血杆菌 - -
绿脓杆菌 - -
金黄色葡萄球菌 - -
肺炎链球菌 - -
隐球菌、曲霉菌和念珠菌等是临床常见的引物侵袭性真菌病的真菌，上述细菌为引起呼吸道等细菌感染的常见菌种。由表4可知，本发明的检测体系在上述真菌或细菌的核酸存在的情况下，不产生扩增反应，也检测不到特异性的熔解曲线和Tm值，说明本发明具有很好的特异性。
实施例4灵敏度检测分析
通过熔解曲线法检测不同浓度四种曲霉菌靶序列的质粒标准品的灵敏度，利用人工合成的烟曲霉、黄曲霉、土曲霉和黑曲霉的靶序列质粒标准品(上海生工合成)，稀释成106copies、105copies、104copies、103copies、102copies、101copies、100copies。将其作为模板，使用实施例1中的试剂盒和实施例2中的方法，利用罗氏480II荧光定量PCR仪器进行检测，并进行熔解曲线分析。以烟曲霉为例，不同浓度的扩增曲线见图2，其中曲线1-8分别对应的是106copies、105copies、104copies、103copies、102copies、101copies、100copies和阴性对照，熔解曲线见图3。
由图扩增曲线图2可知，在106copies-102copies质粒标准品存在的情况下，本发明都能给出较好的信号，在101copies-100copies质粒标准品存在的情况下，无法检测出荧光信号，在靶序列不存在的情况下，本发明无法检测出荧光信号。由熔解曲线图3表明，在106copies-102copies质粒标准品存在的情况下，能够形成独特且一致的熔点，形成图中的单峰；在101copies-100copies质粒标准品存在的情况下，无法形成独特一致的单峰，在靶序列不存在的情况下，无单峰。因此，采用本发明进行熔解曲线法检测烟曲霉靶序列的质粒标准品的灵敏度可达102copies。
实施例5定量分析
定量检测四种曲霉菌：烟曲霉、黄曲霉、土曲霉和黑曲霉。
将本试剂盒可检测的四种曲霉菌每种浓度为1ng/μl等量均匀混合，进行10倍连续梯度稀释制备成7个浓度点的标准曲线，每个浓度进行3个复孔，使用拟南芥的基因片段做为阴性对照，扩增曲线见图4，建立起Ct值与浓度之间的线性关系见图5。
由图5可知，标准曲线在PCR反应的线性扩增区域形成线性方程y＝3.5521x+6.3457，R2＝0.9997,试剂盒扩增效率是91.2％，其线性范围是：1ng/μl～0.000001ng/μl。在测量样本时，上述标准曲线、阴性对照以及未知浓度的样本DNA进行荧光PCR反应，使用罗氏LightCycler 480II、ABI7500、StepOne Plus等荧光定量PCR仪时，其内置分析软件可以根据标准曲线和样本的Ct值，计算出样本中的靶基因的核酸浓度，进行定量分析。
实施例6稳定性检测
1)利用实施例1中的辅助试剂和烟曲霉的特异性引物、检测探针和互补探针按照下表的组分和剂量组成稳定性检测试剂盒-烟曲；利用实施例1中的辅助试剂和黄曲霉的特异性引物、检测探针和互补探针按照下表的组分和剂量组成稳定性检测试剂盒-黄曲霉；利用实施例1中的辅助试剂和土曲霉的特异性引物、检测探针和互补探针按照下表的组分和剂量组成稳定性检测试剂盒-土曲霉；利用实施例1中的辅助试剂和黑曲霉的特异性引物、检测探针和互补探针按照下表的组分和剂量组成稳定性检测试剂盒-黑曲霉，针对每种菌的单独检测体系如表5所示；
表5
组分 剂量
TaqPolymerase 2U
dNTP 2M
引物(1对) 200nM*2
探针(1条) 100nM
MgCl<sub>2</sub> 3mM
Template 1μL
DMSO 5％
Total 25μL
2)提取培养好的烟曲霉、黄曲霉、土曲霉和黑曲霉的DNA；
3)利用实施例2中的方法分别比较实施例1中的试剂盒检测上述菌种DNA的Ct值和1)中的四个稳定性检测试剂盒检测2)中对应菌种的Ct值，即利用实施例2中的实验方法分别比较实施例1中对四种曲霉菌DNA检测的Ct值和稳定性检测试剂盒对四种曲霉菌DNA检测的Ct值结果，分析比较了两组结果的标准差和CV值，结果如下表6所示；
表6
烟曲霉 黄曲菌 土曲霉 黑曲霉
检测试剂盒 24.34±0.05 22.43±0.06 21.26±0.04 25.12±0.05
稳定性试剂盒 24.35±0.03 22.44±0.08 21.25±0.05 25.13±0.04
STD 0.05 0.06 0.04 0.05
CV％ <3 <3 <3 <3
由表6可知，检测试剂盒中设计的复杂引物和探针体系具有与单独体系一致的检测效率，复杂体系下检测性能稳定。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 丹娜（天津）生物科技有限公司
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<130> 2019
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<212> DNA
<213> 人工合成序列
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ctaaggattc caggggaagg 20
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tggtggcaca gaactaagca 20
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<213> 人工合成序列
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tcacagtaat gatccttccg cag 23
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<213> 人工合成序列
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accttacgat ctcacggagg gtgacctcct cgccgttttc tcacaatatg gtgaagttgt 300
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ttatgaagat cagagaagta ctaatcttgc tgttggataa taaaagtgga gcattgtggt 420
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gtgagagatc aagtaagtaa ataccataat gatgtagagg ataaataggg attgttcata 660
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ggaatgcagc tctaaatggg tggtaaattt catctaaagc taaatactgg ccggagaccg 300
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<400> 22
aaaccaaccg ggattgcctc agtaacggcg agtgaagcgg caagagctca aatttgaaag 60
ctggctcctt cggggtccgc attgtaattt gcagaggatg cttcgggtgc ggcccctgtc 120
taagtgccct ggaacgggcc gtcagagagg gtgagaatcc cgtctgggat ggggtgtccg 180
cgcccgtgtg aagctccttc gacgagtcga gttgtttggg aatgcagctc taaatgggtg 240
gtaaatttca tctaaagcta aatactggcc ggagaccgat agcgcacaag tagagtgatc 300
gaaagatgaa aagcactttg aaaagagagt taaaaagcac gtgaaattgt tgaaagggaa 360
gcgcttgcga ccagactcgc ctccagggtt cagccggcat tcgtgccggt gtacttccct 420
gggggcgggc cagcgtcggt ttgggcggcc ggtcaaaggc tcccggaatg tagtgccctc 480
cggggcacct tatagccggg agtgcaatgc ggccagcctg gaccgaggaa cgcgcttcgg 540
cacggacgct ggcataatgg tcgtaaacga c 571
<210> 23
<211> 593
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 23
atatcaataa gcggaggaaa agaaaccaac cgggattgcc tcagtaacgg cgagtgaagc 60
ggcaagagct caaatttgaa agctggctcc ttcggagtcc gcattgtaat ttgcagagga 120
tgctttgggt gcggcccccg tctaagtgcc ctggaacggg ccgtcagaga gggtgagaat 180
cccgtcttgg gcggggtgtc cgtgcccgtg taaagctcct tcgacgagtc gagttgtttg 240
ggaatgcagc tctaaatggg tggtaaattt catctaaagc taaatactgg ccggagaccg 300
atagcgcaca agtagagtga tcgaaagatg aaaagcactt tgaaaagaga gttaaacagc 360
acgtgaaatt gttgaaaggg aagcgcttgc gaccagactc gcccgcgggg ttcagccggc 420
attcgtgccg gtgtacttcc ccgtgggcgg gccagcgtcg gtttgggcgg ccggtcaaag 480
gcccctggaa tgtagtgccc tccggggcac cttatagcca ggggtgcaat gcggccagcc 540
tggaccgagg aacgcgcttc ggcacggacg ctggcataat ggtcgtaaac gac 593
<210> 24
<211> 542
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 24
attgcctcag taacggcgag tgaagcggca agagctcaaa tttgaaagct ggctccttcg 60
gggtccgcat tgtaatttgc agaggatgct tcgggtgcag cccccgtcta agtgccctgg 120
aacgggccgt catagagggt gagaatcccg tatggggcgg ggtgtctgcg tccgtgtgaa 180
gctccttcga cgagtcgagt tgtttgggaa tgcagctcta aatgggtggt aaatttcatc 240
taaagctaaa tactggccgg agaccgatag cgcacaagta gagtgatcga aagatgaaaa 300
gcactttgaa aagagagtta aacagcacgt gaaattgttg aaagggaagc gcttgcaacc 360
agactcgctc gcggggttca gccgggcttc ggcccggtgt acttccccgc gggcgggcca 420
gcgtcggttt gggcggccgg tcaaaggcct ccggaatgta gcgcccttcg gggcgcctta 480
tagccggggg tgcaatgcgg ccagcctgga ccgaggaacg cgcttcggca cggacgctgg 540
ca 542

Claims (10)

1.一种曲霉菌分种检测的引物探针组合，其特征在于，包括分别针对烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉和土曲霉的特异性引物、检测探针以及互补探针，所述互补探针与检测探针不完全互补配对。
2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述烟曲霉的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示，所述黄曲霉的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3-4所示，所述黑曲霉的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5-6所示，所述土曲霉的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7-8所示；
优选地，所述烟曲霉的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，黄曲霉的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，黑曲霉的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，土曲霉的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；
优选地，所述烟曲霉的互补探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，黄曲霉的互补探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，黑曲霉的互补探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，土曲霉的互补探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；
优选地，所述引物探针组合还包括内参系统；
优选地，所述内参系统包括内参引物和内参探针；
优选地，所述内参引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.17-18所示；
优选地，所述内参探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示。
3.根据权利要求1或2所述的引物探针组合，其特征在于，所述烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉和土曲霉的检测探针的3’端修饰有淬灭基团，5’端修饰有荧光基团；
优选地，所述荧光基团包括ALEX-350、Alexa Fluor 488、CY3、FAM、VIC、TET、CALGold540、JOE、HEX、CALFluorOrange560、TAMRA、CALFluorRed590、ROX、CALFluorRed610、TexasRed、CALFluorRed635、Quasar670、CY5、CY5.5、LC RED640或Quasar705中的任一种或至少两种的组合；
优选地，所述检测探针3’端修饰的淬灭基团包括TAMRA、DABCYL、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3或Eclipse中的任一种或至少两种的组合；
优选地，所述互补探针的3’端修饰有淬灭基团；
优选地，所述互补探针3’端修饰的淬灭基团包括TAMRA、DABCYL、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3或Eclipse中的任一种或至少两种的组合。
4.一种曲霉菌分种检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1-3任一项所述的引物探针组合。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性质控、阳性质控和辅助试剂；
优选地，所述阴性质控为含有拟南芥DNA片段的质粒，所述拟南芥DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；
优选地，所述阳性质控分别为含有烟曲霉DNA片段的质粒、含有黄曲霉DNA片段的质粒、含有黑曲霉DNA片段的质粒和含有土曲霉DNA片段的质粒；
优选地，所述烟曲霉DNA片段、黄曲霉DNA片段、黑曲霉DNA片段和土曲霉DNA片段的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24所示；
优选地，所述辅助试剂包括Taq酶、dNTP、MgCl2、DMSO和缓冲液；
优选地，所述缓冲液包括Tris-HCl和KCl；
优选地，所述Tris-HCl在缓冲液中的浓度为15-20mM；
优选地，所述KCl在缓冲液中的浓度为100-200mM。
6.一种利用如权利要求4或5所述的试剂盒用于曲霉菌分种检测的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)提取样本DNA；
(2)向步骤(1)样本DNA中加入Taq酶、dNTP、MgCl2、DMSO、缓冲液以及如权利要求1-3任一项所述的引物探针组合；
(3)实时荧光PCR反应。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述DNA样本的终浓度为0.1pg-10ng；
优选地，步骤(2)所述Taq酶的终浓度为0.5-5U；
优选地，步骤(2)所述dNTP的终浓度为0.1-5M；
优选地，步骤(2)所述DMSO的体积百分比为1-8％，优选为5％；
优选地，步骤(2)所述四种曲霉菌的特异性引物的终浓度为50-500nM；
优选地，步骤(2)所述四种曲霉菌的检测探针的终浓度为50-500nM；
优选地，步骤(2)所述四种曲霉菌的互补探针的终浓度为50-500nM。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述实时荧光PCR反应的条件为：
(1’)90-98℃预变性，1-2min，1个循环；
(2’)90-98℃变性10s，55-60℃延伸35-45s，40-50个循环；
(3’)35-97℃升温，1个循环。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(1’)之前还包括预热的过程：50℃，2min，1个循环；
优选地，步骤(1)所述实时荧光PCR反应具体包括如下步骤：
(1”)50℃预热2min，1个循环；
(2”)95℃预变性10min，1个循环；
(3”)95℃变性10s，58℃延伸40s，延伸时采集荧光信号，45个循环；
(4”)95℃5s，35℃1min；升温到97℃，0.2℃/s，连续采集荧光信号，5次/℃；
优选地，步骤(2)所述判断的标准为：
(a)若检测通道的Ct值不大于35，则为阳性结果，若检测通道的Ct值大于35，则为阴性结果；
(b)对阳性结果进一步分析，通过熔解曲线分析，比对产物与四种阳性质控的对应退火温度Tm值，Tm值相同的即判定待测样本含有对应阳性质控的曲霉菌种。
10.一种如权利要求1-3任一项所述的引物探针组合和/或如权利要求4或5所述的试剂盒用于曲霉菌分种检测或制备曲霉菌分种检测的试剂中的应用。
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