CN106755379A - 对4种曲霉菌同步定量和基因分型的二聚体突变荧光引物定量pcr方法 - Google Patents
对4种曲霉菌同步定量和基因分型的二聚体突变荧光引物定量pcr方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106755379A CN106755379A CN201611145658.7A CN201611145658A CN106755379A CN 106755379 A CN106755379 A CN 106755379A CN 201611145658 A CN201611145658 A CN 201611145658A CN 106755379 A CN106755379 A CN 106755379A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- aspergillus
- primer
- black
- sense primer
- fluorescent
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 43
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 title claims abstract description 32
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 239000000539 dimer Substances 0.000 title claims abstract description 17
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 27
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 23
- 241000228197 Aspergillus flavus Species 0.000 claims abstract description 22
- 241001225321 Aspergillus fumigatus Species 0.000 claims abstract description 22
- 241001465318 Aspergillus terreus Species 0.000 claims abstract description 19
- 229940091771 aspergillus fumigatus Drugs 0.000 claims abstract description 19
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 15
- 238000010791 quenching Methods 0.000 claims abstract description 10
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 claims abstract description 10
- 125000006853 reporter group Chemical group 0.000 claims abstract description 8
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 claims abstract 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 18
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 15
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 14
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 14
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims description 14
- 238000013461 design Methods 0.000 claims description 10
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 5
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 5
- UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 4-[4-[[2,5-dimethoxy-4-[(4-nitrophenyl)diazenyl]phenyl]diazenyl]-n-methylanilino]butanoic acid Chemical compound COC=1C=C(N=NC=2C=CC(=CC=2)N(C)CCCC(O)=O)C(OC)=CC=1N=NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- MGIODCZGPVDROX-UHFFFAOYSA-N Cy5-bifunctional dye Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCCCCN1C2=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C2C(C)(C)C1=CC=CC=CC(C(C1=CC(=CC=C11)S([O-])(=O)=O)(C)C)=[N+]1CCCCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O MGIODCZGPVDROX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C([O-])=O ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000009395 breeding Methods 0.000 claims description 3
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 3
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 claims description 2
- 241000872198 Serjania polyphylla Species 0.000 claims 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 7
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 5
- 239000000284 extract Substances 0.000 abstract description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 abstract 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 28
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 23
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 14
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 14
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 11
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 10
- 239000002585 base Substances 0.000 description 6
- 238000011880 melting curve analysis Methods 0.000 description 6
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 5
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 201000002909 Aspergillosis Diseases 0.000 description 3
- 208000036641 Aspergillus infections Diseases 0.000 description 3
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 description 3
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 3
- 241000293871 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi Species 0.000 description 3
- 241000607764 Shigella dysenteriae Species 0.000 description 3
- 229940095731 candida albicans Drugs 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 229940007046 shigella dysenteriae Drugs 0.000 description 3
- FFRBMBIXVSCUFS-UHFFFAOYSA-N 2,4-dinitro-1-naphthol Chemical compound C1=CC=C2C(O)=C([N+]([O-])=O)C=C([N+]([O-])=O)C2=C1 FFRBMBIXVSCUFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000203233 Aspergillus versicolor Species 0.000 description 2
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 2
- 229920000926 Galactomannan Polymers 0.000 description 2
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 2
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000007622 bioinformatic analysis Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000004362 fungal culture Methods 0.000 description 2
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 2
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 2
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 2
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- 241001478240 Coccus Species 0.000 description 1
- 108020000949 Fungal DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 241000239226 Scorpiones Species 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 241000218636 Thuja Species 0.000 description 1
- 235000009754 Vitis X bourquina Nutrition 0.000 description 1
- 235000012333 Vitis X labruscana Nutrition 0.000 description 1
- 240000006365 Vitis vinifera Species 0.000 description 1
- 235000014787 Vitis vinifera Nutrition 0.000 description 1
- ULHRKLSNHXXJLO-UHFFFAOYSA-L Yo-Pro-1 Chemical compound [I-].[I-].C1=CC=C2C(C=C3N(C4=CC=CC=C4O3)C)=CC=[N+](CCC[N+](C)(C)C)C2=C1 ULHRKLSNHXXJLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000012271 agricultural production Methods 0.000 description 1
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 101150024923 da gene Proteins 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000004545 gene duplication Effects 0.000 description 1
- 238000011134 hematopoietic stem cell transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011127 radiochemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000000717 sertoli cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6851—Quantitative amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Botany (AREA)
- Mycology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
发明属于生物检测领域,提供一种基于二聚体突变引物建立的荧光定量PCR方法定量检测4中曲霉菌并同步进行基因分型的方法,该检测方法包括1)提取待检测样品及4种标准菌株中的DNA;2)制备阳性质粒标准品;3)运行荧光定量PCR;4)数据分析。本发明还提供一种烟曲霉菌、黑曲霉菌、黄曲霉菌和土曲霉菌同步定量和基因分型的检测试剂盒,该试剂盒包括标记有荧光报告基团的上游引物、淬灭基团标记的上游引物互补链及下游引物,它们的核苷酸序列如SEQ ID No.1‑3所示。是一种高通用性、高特异性和灵敏性、操作简单、价廉的新型real‑time PCR技术,具有临床应用价值,可望产生良好的社会效益和经济效益。
Description
技术领域
本发明属于生物检测领域,具体地说,是一种基于二聚体突变引物建立的荧光定量PCR方法定量检测曲霉菌并同步进行基因分型的方法。
背景技术
曲霉菌包括132个种和18个变种,占空气中真菌的12%左右,是通过空气传播的常见霉菌,早在1848年就被视为感染根源,不仅会影响人和动物的健康,,还会给农业生产带来巨大的损失。
近年来,随着在器官、骨髓和造血干细胞移植,HIV,肿瘤放化疗等所导致的免疫力低下患者增多,条件致病菌——曲霉菌引起的侵袭性真菌感染逐年升高,临床上最常见的是烟曲霉(A.fumigatus),黄曲霉(A.flavus),土曲霉,黑曲霉(A.niger),杂色曲霉(A.versicolor),等,其中黄曲霉的致病率占90%。
虽然已有大量的抗真菌药物上市,但缺乏早期的快速准确的检测曲霉菌的实验室方法,致使临床曲霉病的病死率居高不下(>30%),若未及时治疗,病死率可达90%以上。而临床上对曲霉菌病的治疗费用昂贵,许多患者会放弃治疗。故一种早期快速准确的诊断曲霉菌的实验室诊断方法,可以有效降低曲霉病病死率和医疗负担。
传统的曲霉菌检测方法有培养法、影像学检查、组织病理学检查等方法,如大部分实验室需要根据真菌的菌落表现特征以及显微镜下特征性的分子孢子头和足细胞来鉴定,过程需要7~14天。传统的检测方法存在检测时间长,阳性率低等缺陷。另外也有一些非传统的检测方法,如乳胶凝集法、半乳甘露聚糖法等,乳胶凝集法存在检测敏感度低及假阳性率高等问题;众多学者对半乳甘露聚糖法的特异性和灵敏性高低存在争论。随着技术的发展,PCR方法进入到临床检测领域,特别是实时荧光定量PCR(real-time polymerase chainreaction,real-time PCR)技术的应用,不仅可以早期准确检测,还可以进行定量和分型检测。
Real-time PCR分为内掺式染料技术和探针技术两类。内掺式染料技术采用的染料一般为溴化乙啶、YO-PRO 1和SYBR Green。其原理是利用游离DNA染料不发射荧光,而与双链DNA结合后,荧光值大大增强,从而进行DNA定量。并且还可通过荧光信号监测产物解链温度差异,进行熔解曲线分析,根据不同DNA产物会产生不同的熔解曲线,而实现基因分型。其优势在于能够监测任何双链DNA,只需设计普通引物,使检测方法简化,成本低。但也正是由于染料能够与任何双链DNA结合,因此其也能和非特异性产物如引物二聚体、非特异扩增产物、双链模板等结合,产生非特异荧光信号,降低了特异性,故不适于临床检测。
探针技术采用了基于荧光淬灭原理或荧光共振能量转移(fluorescenceresonance energy transfer,FRET)的探针,包括TaqMan探针、Amplifluor探针、分子信标、蝎型探针等。这些探针均是在与模板互补的同一寡核苷酸链上,分别标记荧光基团和淬灭基团,每一次扩增中通过水解或者杂交等方式破坏两者之间的FRET,从而发出与扩增产物数等量的荧光信号,故其特异性高,定量准确,因而广泛应用于科研和临床诊断中。但这些探针属于多标记探针,其合成难度和成本较高,制约了其推广应用。不少研究人员试图采用单标记探针来降低合成难度和成本,如杂交探针(hybridization probes)和荧光置换探针(displacing probes)[12],取得了较好效果。但为防止探针与靶序列杂交引起自身延伸而被破坏,仍然需要在探针末端磷酸化来阻断其延伸,因此,并非真正意义的单标记探针技术。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足,提供一种对4种曲霉菌同步定量和基因分型的二聚体突变荧光引物定量PCR方法。
基于二聚体突变引物技术建立的荧光定量PCR方法的工作原理:
将荧光报告基团标记在一条引物的5’端,称为上游引物,淬灭基团标记在与荧光引物互补的寡核苷酸链的3’端上,称为上游引物互补链,在上游引物互补链序列中,人为设计一个碱基突变;另外还设计一条和靶基因另一端互补的引物,称为下游引物;将三种寡核苷酸链加入PCR反应体系,无靶基因时,两者将相互结合形成二聚体,产生荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET),不会发射荧光;一旦存在靶基因,由于荧光引物与靶基因完全互补,而上游引物互补链存在1个突变碱基,在较高温度下,荧光引物与靶基因的亲和力大于与上游引物互补链间的亲和力,从而优先和靶基因结合,在PCR体系中发挥普通引物引导延伸的功能,标记的荧光基团随引物整合在新生PCR产物中起探针的指示作用,所有新生PCR产物均被荧光基团标记,此时,FRET被破坏,反映PCR产物量的荧光信号可被实时定量检测;通过荧光信号监测产物解链温度差异,进行熔解曲线分析,实现基因分型。
上述技术方案的原理:将荧光报告基团标记在引物上,而淬灭基团标记在与荧光引物互补的寡核苷酸链上,即两条互补的寡核苷酸只分别标记了相应的淬灭或者报告基团。这种结构设计可巧妙地回避对淬灭链末端进行封闭,因为它虽与引物互补,而3’端已被淬灭基团阻断,而PCR不能从5’端延伸,所以不需要对5’端进行磷酸化阻断;而引物仅5’端标记了荧光报告基团,引物与靶基因结合后,可从3’端延伸完成靶基因复制进行定量;扩增完成后由于引物标记有荧光基团,新生的DNA产物将被荧光基团示踪,如果扩增的DNA有碱基差异或长度差异,进行熔解曲线分析时,可以将不同序列的产物按熔解温度差异区分出来,实现基因分型(结构和工作原理见图1)。
这样的设计实现了真正的单标记结构,故合成、纯化简单且成本低,克服了普通多标记探针法成本高的难题。是一种高通用性、高特异性和灵敏性、操作简单、价廉的新型real-time PCR技术,不但具有探索性和创新性,还具有临床应用价值,可望产生良好的社会效益和经济效益。故我们成功的将这种方法应用于曲霉菌的检测中去,实现了定量检测和基因分型。
本发明利用生物信息学分析寻找适合曲霉菌(烟曲霉菌、黑曲霉菌、黄曲霉菌和土曲霉菌)定量和分型的序列,采用PRIMER EXPRESS 2.0软件设计可同时定量和分型的一对引物及标记猝灭基团的互补链。提取DNA后,以最适的体系和循环条件在荧光定量PCR仪上进行扩增,同时本发明采用取黑曲霉菌DNA构建定量的标准质粒。最终通过分析扩增曲线和溶解曲线,实现对4种曲霉菌同时定量和分型。
具体包括以下步骤:
(1)生物信息学分析寻找适合曲霉菌定量和分型的序列设计引物和互补链序列
在GenBank数据库获取得4种曲霉菌(烟曲霉菌、黑曲霉菌、黄曲霉菌和土曲霉菌)基因组序列的登录号,选择5.8srRNA、28srRNA基因、ITS区的DNA序列,通过核酸分析软件DNAman寻找出适合定量和分子分型的DNA区域(图2)。PRIMER EXPRESS 2.0软件设计可同时定量和分型的一对引物:
上游引物:5'-FAM-CCCTACCTGATCCGAGGTCAACC-3'(SEQ ID No.1);
下游引物:5'-AAAGTAAGACAGGAAATGTG-3'(SEQ ID No.2)。
上游引物互补链:GGTTGACCTCGAATCAGGTAGGG-Dabcyl-3'
(SEQ ID No.3),引物中碱基以斜体标记的序列是人为设计碱基突变,使引物和互补链不完全匹配。
进一步地,本发明的荧光报告基团可供选择的有6-FAM、TET、HEX、JOE、CY3、CY5、TAMRA、Texas Red,荧光淬灭基团有BHQ-1、BHQ-2、Lowa BlackTMRQ、Lowa BlackTMFQ、Dabcy1。
(2)真菌培养和DNA提取
从广东省菌种保存中心购买曲霉菌的标准菌株:烟曲霉菌(ATCC 36607),黑曲霉(ATCC 16888),黄曲霉(ATCC 16883)和土曲霉(ATCC 16792),沙堡弱培养基培养后,用真菌DNA提取试剂盒提取DNA。
(3)构建定量的标准质粒
用普通PCR法扩增黑曲霉菌的分型和定量序列,纯化DNA,pMD-18T质粒TA克隆,转化大肠埃希菌DH5α。测序鉴定后,对阳性克隆菌进行增菌繁殖,纯化获取大量重组质粒作为DNA模板,为real-time PCR方法的建立提供可靠的DNA标准品。
上游引物序列:5'-CCCTACCTGATCCGAGGTCAACC-3'(SEQ ID No.1);
下游引物序列:5'-AAAGTAAGACAGGAAATGTG-3'(SEQ ID No.2)。
(3)Real-time PCR体系和循环参数
扩增体系为:
循环条件为:
(4)绘制标准曲线和建立曲霉菌real-time PCR分子分型的标准熔解曲线图谱
绘制标准曲线:标准质粒10倍倍比稀释成107-101copies/ml浓度梯度,计算机自动绘制标准曲线。
标准熔解曲线图谱的建立:定量检测扩增完成后,进行熔解曲线分析。同时对4种标准菌株的检测,进行熔解曲线分析,获取它们自身特异的熔解曲线图谱,建立真菌分型的标准熔解曲线图谱。从左至右代表黑曲霉(A.niger),黄曲霉(A.flavus),烟曲霉(A.fumigatus),土曲霉(A.terreus),解链温度分别为:82.42℃,83.90℃,84.35℃,85.81℃(见图4)。
在本发明的一个实施例中,采用上述法对曲霉菌的标准菌株和白假丝酵母菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌标准菌株、志贺菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌以及伤寒沙门菌提取DNA后用建立的方法进行检测,分析Real-time PCR检测的特异性,结果显示具有很好的特异性。
在本发明的另一个实施例中,通过对3个系列标准品(1×104~1×1012copies/ml)和一种浓度临床样品重复做5个平行管,定量结果计算SD和CV,进行批内重复性检测,结果显示具有很好的重复性。
本发明还提供一种对烟曲霉菌、黑曲霉菌、黄曲霉菌和土曲霉菌同步定量和基因分型的检测试剂盒,所述试剂盒包括用于扩增适合曲霉菌定量和分型的序列的引物,其中:
上游引物:5'-FAM-CCCTACCTGATCCGAGGTCAACC-3'(SEQ ID No.1),
下游引物:5'-AAAGTAAGACAGGAAATGTG-3'(SEQ ID No.2),
上游引物互补链:5’-GGTTGACCTCGAATCAGGTAGGG-Dabcyl-3'(SEQ ID No.3),互补链中碱基以斜体标记的序列是人为设计碱基突变,使上游引物和互补链不完全匹配。
所述的试剂盒,上游引物5’端标记的荧光报告基团可以是6-FAM、TET、HEX、JOE、CY3、CY5、TAMRA、Texas Red中的任意一种,上游引物互补链3’端标记的荧光淬灭基团可以是BHQ-1、BHQ-2、Lowa BlackTMRQ、Lowa BlackTMFQ、Dabcy1中的任意一种。
本发明的另一个目的是提供上述试剂盒在用于检测和基因分型烟曲霉菌、黑曲霉菌、黄曲霉菌和土曲霉菌的产品中的应用。
本发明基于上述设计方案,可利用一对引物——一条含有报告荧光集团的上游引物,一条和上游互补的淬灭荧光基团的引物、一条普通下游引物,在同一PCR反应体系中,同时对4种曲霉菌定量检测和基因分型。该法的各项技术指标经评价都达到临床要求,方法具有灵敏度高、特异性好、检测速度快、操作简便、成本低廉等优点,可用于临床诊断、治疗监测和预后判断和流行病学调查,具有较高的临床诊断价值,适于推广应用。
附图说明
图1是基于二聚体突变引物技术建立的荧光定量PCR方法工作原理图;
i:二聚体荧光突变引物与模板DNA,由于荧光共振能量转移(FRET)作用,荧光基团被抑制;ii:变性时,包括二聚体荧光突变引物的所有双链DNA解链,FRET也被破坏;iii:退火时,引物复性优先与完全互补的靶基因结合;iv:产物延伸阶段;v:再次变性;荧光基团掺入新生链,此时FRET消失荧光信号被检测到,同时可进行熔解曲线分析。
图2是对曲霉菌定量和分型序列和引物位置的示意图;
图3是不同浓度标本荧光定量PCR扩增标准曲线;
图4是4种曲霉菌基因分型标准熔解曲线图谱;
熔解曲线从左至右代表黑曲霉A.niger(82.42),黄曲霉A.flavus(83.90),烟曲霉A.fumigatus(84.35),土曲霉A.terreus(85.81),括弧数值代表熔解温度。
图5是显示特异性和重复性荧光扩增图;
左图:除阳性黑曲霉菌对照有荧光扩增曲线外,白假丝酵母菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌标准菌株、志贺菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、伤寒沙门菌均无扩增曲线。右图:1×104~1×102copies/ml的标准品5次重复荧光扩增曲线。
图6是4株临床菌株测定的扩增曲线和溶解曲线图;
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明,而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
【实施例1】4种曲霉菌的定量和基因分型检测
扩增体系的准备:
(1)所需试剂:PCR-mix buffer(Takara),模板DNA
(2)引物混合液:为各2.0μM的三条引物组成的混合液
1.真菌培养和DNA提取
将标准菌株烟曲霉菌(ATCC 36607),黑曲霉(ATCC 16888),黄曲霉(ATCC 16883)和土曲霉(ATCC 16792),利用沙堡弱培养基培养后,用真菌DNA提取试剂盒提取DNA。
2.构建定量的标准质粒
用普通PCR法扩增黑曲霉菌DNA序列:
上游引物序列为:5'-CCCTACCTGATCCGAGGTCAACC-3'(SEQ ID No.1);
下游引物序列为:5'-AAAGTAAGACAGGAAATGTG-3'(SEQ ID No.2)。
扩增条件和体系同Real-time PCR。
将扩增产物纯化(Axygen PCR产物纯化试剂盒),pMD-18T质粒TA克隆,转化大肠埃希菌DH5α(参考Takara pMD-18T vector说明书步骤)。测序(华大基因测序)鉴定后,对阳性克隆菌进行增菌繁殖,纯化获取大量重组质粒作为后续real-time PCR方法的DNA标准品。
3.Real-time PCR
以提取的各菌株DNA和前面所制作的标准质粒为模板,按照下面体系和循环条件进行扩增:
扩增体系为:
循环条件为:
4.绘制标准曲线
标准质粒10倍倍比稀释成107-101copies/ml浓度梯度,计算机自动绘制标准曲线。本实验所建立的标准曲线R值大于0.99,具有优秀的线性,见图3:从左至右代表的浓度为1×107~1×101copies/ml。
5.基因分型结果判定
PCR循环扩增产物后,不同曲霉菌DNA序列的熔解温度不同,示踪的荧光基团解离后,荧光值发生改变,从而4种不同曲霉菌的DNA序列会得到不同的荧光曲线,本法基因分型结果与测序结果完全一致,4种曲霉菌基因分型熔解曲线见图4。
【实施例2】对本方法进行特异性和重复性分析
特异性:采用本法对曲霉菌的标准菌株和白假丝酵母菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌标准菌株、志贺菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌以及伤寒沙门菌提取DNA后用建立的方法进行检测,分析Real-time PCR检测的特异性,扩增曲线见图5左。
重复性:批内重复性通过对3个系列标准品(1×104~1×102copies/ml)和1.5×103浓度临床样品重复做5个平行管,定量结果计算SD和CV。
标准质粒1×102~1×104copies/ml,SD分别:0.707,0.1845,0.3172,CV分别为:4.79%,5.83%,4.94%,扩增曲线见图5右。
临床样品浓度为1.5×103copies/ml,SD:0.1283,CV:6.25%,
本法特异性和重复性均较好。
【实施例3】4株临床菌株的测定
根据上述描述的方法,我们从临床搜集了经生化验证的四株不同类型的曲霉菌进行检测。扩增曲线和溶解曲线的结果如图6所示,本发明可同步的定量检测4种不同类型的曲霉菌。
图6左:扩增曲线从左至右分别是黄曲霉、烟曲霉、黑曲霉、土曲霉;
图6右:熔解曲线从左至右代表黑曲霉,黄曲霉,烟曲霉,土曲霉。
SEQUENCE LISTING
<110> 海南医学院
<120> 对4种曲霉菌同步定量和基因分型的二聚体突变荧光引物定量PCR方法
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ccctacctga tccgaggtca acc 23
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aaagtaagac aggaaatgtg 20
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ggttgacctc gaatcaggta ggg 23
Claims (8)
1.一种对烟曲霉菌、黑曲霉菌、黄曲霉菌和土曲霉菌同步定量和基因分型的二聚体突变荧光引物定量PCR方法,其特征在于,该方法中:
上游引物:5'-FAM-CCCTACCTGATCCGAGGTCAACC-3'(SEQ ID No.1),
下游引物:5'-AAAGTA AGACAGGAAATGTG-3'(SEQ ID No.2),
上游引物互补链:5’-GGTTGACCTCGAATCAGGTAGGG-Dabcyl-3'(SEQ ID No.3),互补链中碱基以斜体标记的序列是人为设计碱基突变,使上游引物和互补链不完全匹配。
2.根据权利要求1所述的对烟曲霉菌、黑曲霉菌、黄曲霉菌和土曲霉菌同步定量和基因分型的二聚体突变荧光引物定量PCR方法,其特征在于,该方法具体为:
1)提取待检测样品及4种标准菌株中的DNA;
2)制备阳性质粒标准品;
3)运行荧光定量PCR;
4)数据分析。
3.根据权利要求1所述的对烟曲霉菌、黑曲霉菌、黄曲霉菌和土曲霉菌同步定量和基因分型的二聚体突变荧光引物定量PCR方法,其特征在于,上游引物5’端标记的荧光报告基团可以是6-FAM、TET、HEX、JOE、CY3、CY5、TAMRA、Texas Red中的任意一种,上游引物互补链3’端标记的荧光淬灭基团可以是BHQ-1、BHQ-2、Lowa BlackTMRQ、Lowa BlackTMFQ、Dabcy1中的任意一种。
4.根据权利要求2所述的对烟曲霉菌、黑曲霉菌、黄曲霉菌和土曲霉菌同步定量和基因分型的二聚体突变荧光引物定量PCR方法,其特征在于,所述步骤2)中用普通PCR法扩增黑曲霉菌的分型和定量序列,纯化DNA,pMD-18T质粒TA克隆,转化大肠埃希菌DH5α,测序鉴定后,对阳性克隆菌进行增菌繁殖,纯化获取重组质粒作为DNA模板,为real-time PCR方法的建立提供DNA标准品,
上游引物序列:5'-CCCTACCTGATCCGAGGTCAACC-3'(SEQ ID No.1);
下游引物序列:5'-AAAGTA AGACAGGAAATGTG-3'(SEQ ID No.2)。
5.根据权利要求2所述的对烟曲霉菌、黑曲霉菌、黄曲霉菌和土曲霉菌同步定量和基因分型的二聚体突变荧光引物定量PCR方法,其特征在于,所述步骤3)中扩增体系为:
循环条件为:
6.一种对烟曲霉菌、黑曲霉菌、黄曲霉菌和土曲霉菌同步定量和基因分型的检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括用于扩增适合曲霉菌定量和分型的序列的引物,其中:
上游引物:5'-FAM-CCCTACCTGATCCGAGGTCAACC-3'(SEQ ID No.1),
下游引物:5'-AAAGTA AGACAGGAAATGTG-3'(SEQ ID No.2),
上游引物互补链:5’-GGTTGACCTCGAATCAGGTAGGG-Dabcyl-3'(SEQ ID No.3),互补链中碱基以斜体标记的序列是人为设计碱基突变,使上游引物和互补链不完全匹配。
7.根据权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,上游引物5’端标记的荧光报告基团可以是6-FAM、TET、HEX、JOE、CY3、CY5、TAMRA、Texas Red中的任意一种,上游引物互补链3’端标记的荧光淬灭基团可以是BHQ-1、BHQ-2、Lowa BlackTMRQ、Lowa BlackTMFQ、Dabcy1中的任意一种。
8.如权利要求6所述的试剂盒在制备用于检测和基因分型烟曲霉菌、黑曲霉菌、黄曲霉菌和土曲霉菌的产品中的应用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201611145658.7A CN106755379B (zh) | 2016-12-13 | 2016-12-13 | 对4种曲霉菌同步定量和基因分型的二聚体突变荧光引物定量pcr方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201611145658.7A CN106755379B (zh) | 2016-12-13 | 2016-12-13 | 对4种曲霉菌同步定量和基因分型的二聚体突变荧光引物定量pcr方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN106755379A true CN106755379A (zh) | 2017-05-31 |
CN106755379B CN106755379B (zh) | 2021-06-04 |
Family
ID=58876358
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201611145658.7A Expired - Fee Related CN106755379B (zh) | 2016-12-13 | 2016-12-13 | 对4种曲霉菌同步定量和基因分型的二聚体突变荧光引物定量pcr方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN106755379B (zh) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2018232596A1 (zh) * | 2017-06-20 | 2018-12-27 | 深圳华大基因研究院 | 定量pcr扩增引物对及其应用 |
CN109943662A (zh) * | 2019-05-07 | 2019-06-28 | 丹娜(天津)生物科技有限公司 | 一种曲霉菌分种检测的引物探针组合、试剂盒、检测方法及其应用 |
CN117248055A (zh) * | 2023-09-12 | 2023-12-19 | 深圳市海微生物科技有限公司 | 曲霉菌的荧光定量pcr检测试剂盒及其应用 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
NZ516278A (en) * | 1999-06-22 | 2004-03-26 | Invitrogen Corp | Improved primers and methods for the detection and discrimination of nucleic acids |
CN102321738A (zh) * | 2011-07-29 | 2012-01-18 | 广州呼吸疾病研究所 | 检测致病曲霉菌的荧光定量pcr通用引物、检测探针和试剂盒 |
CN103525902A (zh) * | 2012-09-18 | 2014-01-22 | 南宁金域医学检验所有限公司 | 嗜肺军团菌快速鉴定方法 |
CN104379763A (zh) * | 2012-03-22 | 2015-02-25 | Lgc基因组学有限公司 | 使用包含硫代磷酸酯基的寡核苷酸的聚合酶链式反应检测系统 |
CN104789700A (zh) * | 2015-04-03 | 2015-07-22 | 中国农业科学院上海兽医研究所 | 基于荧光定量pcr熔解曲线法的dhav分型检测法 |
-
2016
- 2016-12-13 CN CN201611145658.7A patent/CN106755379B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
NZ516278A (en) * | 1999-06-22 | 2004-03-26 | Invitrogen Corp | Improved primers and methods for the detection and discrimination of nucleic acids |
CN102321738A (zh) * | 2011-07-29 | 2012-01-18 | 广州呼吸疾病研究所 | 检测致病曲霉菌的荧光定量pcr通用引物、检测探针和试剂盒 |
CN104379763A (zh) * | 2012-03-22 | 2015-02-25 | Lgc基因组学有限公司 | 使用包含硫代磷酸酯基的寡核苷酸的聚合酶链式反应检测系统 |
CN103525902A (zh) * | 2012-09-18 | 2014-01-22 | 南宁金域医学检验所有限公司 | 嗜肺军团菌快速鉴定方法 |
CN104789700A (zh) * | 2015-04-03 | 2015-07-22 | 中国农业科学院上海兽医研究所 | 基于荧光定量pcr熔解曲线法的dhav分型检测法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
SIXTO M. LEAL, JR.等: "Targeting Iron Acquisition Blocks Infection with the Fungal Pathogens Aspergillus fumigatus and Fusarium oxysporum", 《PLOS PATHOGENS》 * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2018232596A1 (zh) * | 2017-06-20 | 2018-12-27 | 深圳华大基因研究院 | 定量pcr扩增引物对及其应用 |
CN109943662A (zh) * | 2019-05-07 | 2019-06-28 | 丹娜(天津)生物科技有限公司 | 一种曲霉菌分种检测的引物探针组合、试剂盒、检测方法及其应用 |
CN117248055A (zh) * | 2023-09-12 | 2023-12-19 | 深圳市海微生物科技有限公司 | 曲霉菌的荧光定量pcr检测试剂盒及其应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN106755379B (zh) | 2021-06-04 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN110551846B (zh) | 一种用于非洲猪瘟病毒核酸快速检测的Cpf1试剂盒及其检测方法 | |
CN105821138B (zh) | 一种基于连接反应构建双茎环结构dna模板检测核酸的方法 | |
CN106661606A (zh) | 用于检测和表征微生物的方法 | |
CN105316422A (zh) | 一种用于对虾急性肝胰腺坏死病病原的快速检测试剂盒及其应用 | |
CN113249499B (zh) | 一种伤寒沙门氏菌的检测试剂盒、其制备方法及其应用 | |
CN103436602A (zh) | 双重分子信标-lamp法同时检测金黄色葡萄球菌基因和大肠杆菌基因的试剂盒及方法 | |
CN105779625B (zh) | 一种同时检测猪链球菌通用型和猪链球菌2型双重荧光定量pcr引物、试剂盒及方法 | |
CN110055347A (zh) | 一种利用高分辨熔解曲线鉴别五种皮肤癣菌的方法 | |
CN110093450A (zh) | 一种甘薯黑斑病菌的lamp检测引物及其应用 | |
CN109913565A (zh) | 一种用于检测副溶血弧菌的试剂盒、引物对、探针及方法 | |
CN109837333A (zh) | 同时检测多种目标基因的荧光实时检测试剂及方法 | |
CN108531627A (zh) | 一种用于检测b族链球菌的rpa荧光定量引物对、探针、试剂盒及检测方法 | |
CN116516058A (zh) | 可视化检测大豆疫霉菌的方法及试剂盒 | |
CN105755143B (zh) | 一种用于检测菌的试剂盒及检测方法 | |
CN108588246A (zh) | 一种检测下呼吸道细菌特异性基因的引物、探针、方法及试剂盒 | |
CN106755379A (zh) | 对4种曲霉菌同步定量和基因分型的二聚体突变荧光引物定量pcr方法 | |
CN111518935A (zh) | 一种用于检测阪琦肠杆菌的试剂盒、引物对、探针及方法 | |
CN109234432B (zh) | 一种基于重组酶聚合酶扩增方法检测大豆猝倒病的引物、探针和试剂盒 | |
CN110878373A (zh) | 一种致病疫霉菌的重组酶聚合酶扩增检测试剂盒及其应用 | |
CN103509790B (zh) | 利用单管巢式实时聚合酶链反应(pcr)的改良结核菌诊断方法 | |
CN102676678B (zh) | 用于区分五种贝类饵料微藻的pcr引物组 | |
CN110804674B (zh) | 一种基于重组酶聚合酶扩增方法检测大豆根腐病的引物探针组合物、试剂盒及其应用 | |
CN106884048A (zh) | 一种检测鱼类海豚链球菌荧光pcr试剂盒及其应用 | |
CN105779570B (zh) | 一种检测snp位点的方法 | |
CN106701966A (zh) | 基于分析pcr副产物焦磷酸的病原微生物快速检测方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20210604 |