CN109837333A

CN109837333A - 同时检测多种目标基因的荧光实时检测试剂及方法

Info

Publication number: CN109837333A
Application number: CN201910300060.8A
Authority: CN
Inventors: 张驰宇; 李莹雪
Original assignee: Institut Pasteur of Shanghai of CAS
Current assignee: Shanghai Institute Of Immunology And Infection Chinese Academy Of Sciences
Priority date: 2019-04-15
Filing date: 2019-04-15
Publication date: 2019-06-04
Anticipated expiration: 2039-04-15
Also published as: CN109837333B

Abstract

本发明提供了一种同时检测多种目标基因的荧光实时检测试剂及方法。本发明还提供了针对多种目标基因的引物探针对，将扩增产物Tm值互不相同的多个目标基因的探针上标记相同的荧光基团，组合应用荧光检测以及Tm值分析的方法，实现多个目标基因在单一反应体系的检测。本发明方法简便、快速、灵敏。

Description

同时检测多种目标基因的荧光实时检测试剂及方法

技术领域

本发明属于核酸检测技术领域，更具体地说，涉及同时检测多种目标基因的荧光实时检测试剂及方法。

背景技术

病原检测是在疾病感染初期检测病原体，及时提供治疗，帮助预防疾病。病原体诊断一般分为细菌、病毒和真菌诊断。

近年来，随着碳青霉烯类抗菌药物的广泛使用，多重耐药的革兰阴性杆菌尤其是碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌(carbapenem resistant Enterobacteriaceae，CRE)的检出数量不断增长，导致临床抗感染治疗和院感相关工作困难重重。而CRE有多药耐药倾向以及血流感染期间的高死亡率，严重威胁公共卫生安全。因此鉴定CRE对临床耐药监控来说至关重要。

CRE常表现为多重耐药，不仅对碳青霉烯类抗菌药物耐药，同时也对氟喹诺酮类、头孢类和四环素等多种抗菌药物产生耐药。它的主要耐药机制有2种1)β-内酰胺酶活性与结构突变相结合，多由超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)和AmpC头孢菌素酶(AmpC)导致；2)产生碳青霉烯酶，导致碳青霉烯类抗生素水解。而碳青霉烯酶主要有3类，KPC、GES和IMI(A类)，IMP、NDM和VIM(B类)和OXA-48(D类)，AmpC酶主要有CIT，EBC，DHA，ACC等基因型。

传统鉴定碳青霉烯酶和AmpC酶基因的方法主要有两大类：分子和非分子方法。非分子方法，如培养法、平板凝集法，有良好的特异性和灵敏度，但过程复杂，耗时数天，检测效率低(10％-30％)。分子检测显示了卓越的灵敏度和特异性，但是它昂贵并且需要专业人员。这些方法主要是PCR方法，单重或多重PCR技术。已经有很多多重PCR方法去检测碳青霉烯酶和AmpC酶基因，但很少有方法同时检测碳青霉烯酶和AmpC酶基因在一个反应管中。多重PCR反应大部分是通过荧光探针颜色、扩增产物的Tm值或扩增产物的大小，三者之一来区分不同靶标，因此受PCR仪器通道限制检测的靶标个数有限(4-6个)，并且由扩增产物的大小来区分不同靶标，存在开盖污染的风险，同时可能因为产物片段较大，PCR效率降低。

因此，迫切需要发明一种新的多重PCR检测方法，单管同时检测多个耐药基因。

发明内容

本发明的目的就是提供简便、快速、灵敏、准确地单管同时检测目标基因(如来自病原体的多个耐药基因)的多重检测方法。

在本发明的第一方面，提供一种目标基因多重检测的荧光PCR方法，所述方法包括：

(1)获取待测样品的核酸；

(2)以(1)的核酸为模板，在一个反应体系(如反应管)中，使用针对多种目标基因的特异性引物和探针进行实时荧光定量PCR；所述多种目标基因被分成或若干组，属于同一组的目标基因携带相同的荧光基团、但该组目标基因的PCR扩增产物的Tm值互不相同，而不同组的目标基因携带不同的荧光基团；

其中，所述目标基因包括选自下组的耐药基因：KPC，NDM，ACC，VIM，EBC，CIT，OXA48，GES和DHA；所述的特异性引物和探针包括选自下组的引物和探针：

针对KPC基因：SEQ ID NO:10～11所示的引物，SEQ ID NO:12所示的探针；

针对NDM基因：SEQ ID NO:13～14所示的引物，SEQ ID NO:15所示的探针；

针对ACC基因：SEQ ID NO:16～17所示的引物，SEQ ID NO:18所示的探针；

针对VIM基因：SEQ ID NO:19～20所示的引物，SEQ ID NO:21所示的探针；

针对EBC基因：SEQ ID NO:22～23所示的引物，SEQ ID NO:24所示的探针；

针对CIT基因：SEQ ID NO:25～26所示的引物，SEQ ID NO:27所示的探针；

针对OXA48基因：SEQ ID NO:28～29所示的引物，SEQ ID NO:30所示的探针；

针对GES基因：SEQ ID NO:31～32所示的引物，SEQ ID NO:33所示的探针；

针对DHA基因：SEQ ID NO:34～35所示的引物，SEQ ID NO:36所示的探针；

(3)对(2)的扩增产物进行荧光分析以及Tm值分析，从而确定目标基因的类型。

在一个优选例中，所述耐药基因为来自病原体的耐药基因，较佳地所述病原体为细菌。

在另一优选例中，(2)中，采用四通道或六通道的荧光检测仪器进行荧光基团的鉴别；其中，当基因为mn-2～mn(m为荧光检测仪器通道数减1，n＞1，且n为整数)种时：第mn-2～mn种基因相应的探针携带荧光基团n和猝灭基团n；第m(n+1)-2～m(n+1)种基因相应的探针携带荧光基团n+1和猝灭基团n+1；第m(n+2)-2～m(n+2)种基因相应的探针携带荧光基团n+2和猝灭基团n+2；第m(n+m)-2～m(n+m)种基因相应的探针携带荧光基团n+m和猝灭基团n+m；其余基因相应的探针携带荧光基团和猝灭基团以此类推。

在另一优选例中，采用四通道的荧光检测仪器时，当基因小于3种时：其相应探针携带的荧光基团1和猝灭基团1；当基因为4～6种时：第1～3种基因相应的探针携带荧光基团1和猝灭基团1；其余基因相应的探针携带荧光基团2和猝灭基团2；当基因为7～9种时：第1～3种基因相应的探针携带荧光基团1和猝灭基团1；第4～6种基因相应的探针携带荧光基团2和猝灭基团2；其余基因相应的探针携带荧光基团3和猝灭基团3。

在另一优选例中，所述的荧光基团1、荧光基团2、荧光基团3互不相同。

在另一优选例中，所述的特异性引物和探针包括选自下组的引物和探针：

针对DHA基因：SEQ ID NO:34～35所示的引物，SEQ ID NO:36所示的探针。

在另一优选例中，(3)中，所述荧光分析包括：根据PCR扩增产物的荧光标记，确定各扩增产物所属的荧光组；较佳地，通过绘制PCR扩增曲线来进行荧光分析。

在另一优选例中，(3)中，所述Tm值分析包括：针对所分出的荧光组，分析每一荧光组的扩增产物的Tm值，确定目标基因的类型；较佳地，通过绘制熔解曲线来进行Tm值的区分。

在另一优选例中，(2)中，所述的Tm值互不相同为彼此之间存在显著性差异(两两相差)；较佳地，彼此之间的差异值≥1℃。

在另一优选例中，(2)中，所述荧光基团(荧光报告基团)包括(但不限于)选自下组的基团：Cy5/Quasar 670、Texas Red/Red 610、HEX/TET/VIC/Cal Gold 540、Quasar 705；或所述荧光猝灭基团包括(但不限于)选自下组的基团：BHQ1、BHQ3、Eclipse、TAMRA、BHQ2、Dabcyl、MGB。

在另一优选例中，当PCR仪器是4通道荧光时，(2)中，其中FAM通道和sybr green通道的参数相同，仅选择其中一个通道。

在另一优选例中，所述基因为9种，第1～3种基因为KPC、NDM和ACC，第4～6种基因为VIM、EBC和CIT，第7～9种基因为GES、OXA48和DHA；较佳地，荧光基团1、2、3选自或依次为Texas red，CY5，HEX，相应猝灭基团依次为BHQ2，BHQ3，BHQ2。

在另一优选例中，第1～3种(第1组)基因为KPC、NDM和ACC，荧光基团1为Texasred，猝灭基团1为BHQ2；第4～6种(第2组)基因为VIM、EBC和CIT，荧光基团2为CY5，猝灭基团2为BHQ3；第7～9种(第3组)基因为GES、OXA48和DHA，荧光基团3为HEX，猝灭基团3为BHQ2。

在另一优选例中，PCR体系中含有SYTO 9或SYBR Green Ⅰ，较佳地其终浓度为0.4μM。

在另一优选例中，采用荧光定量PCR，其程序为：第一阶段：95±1℃，15min；第二阶段：95℃，3s；60℃，20s；40个循环，60℃采集信号；第三阶段：95℃，60s；40℃，60s；65℃，1s；97℃，1s(连续采集荧光)。

在另一优选例中，所述的目标基因多重检测的荧光PCR方法是不以疾病诊断为直接目的的方法。

在本发明的另一方面，提供一种用于检测目标基因的试剂盒，其中包括：目标基因的特异性引物和探针，所述目标基因包括下组的9种：KPC，NDM，ACC，VIM，EBC，CIT，OXA48，GES和DHA；所述9种目标基因分为3组，第1组目标基因相应的探针携带荧光基团1和猝灭基团1、且该组基因的PCR扩增产物的Tm值互不相同；第2组目标基因相应的探针携带荧光基团2和猝灭基团2、且该组基因的PCR扩增产物的Tm值互不相同；第3组目标基因相应的探针携带荧光基团3和猝灭基团3、且该组基因的PCR扩增产物的Tm值互不相同；其中，所述的特异性引物和探针包括选自下组的引物和探针：

在另一优选例中，第1组基因为KPC、NDM和ACC，第2组基因为VIM、EBC和CIT，第3组基因为GES、OXA48和DHA；较佳地，荧光基团1、2、3选自或依次为Texas red，CY5，HEX，相应猝灭基团依次为BHQ2，BHQ3，BHQ2。

在另一优选例中，所述试剂盒中还包括(但不限于)：SYTO 9或SYBR GreenⅠ，PCR缓冲液，DNA聚合酶，或它们的混合液；和/或说明操作方法的说明书。

在本发明的另一方面，提供所述的试剂盒的用途，用于目标基因的检测；其中标基因包括下组的9种：KPC，NDM，ACC，VIM，EBC，CIT，OXA48，GES和DHA；较佳地，用于进行基于荧光PCR(更佳地为荧光定量PCR)的检测。

在另一优选例中，所述的用途是不以疾病诊断为直接目的的用途。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、多重qPCR区分多个耐药基因并进行定量检测的原理图。

图2、多重qPCR分别扩增9种基因的模板的扩增曲线图和标准化溶解峰图。

图3、多重荧光qPCR法检测Texas Red，CY5和HEX通道混合模板的扩增曲线图和标准化溶解峰图。

图4、多重荧光qPCR法检测的灵敏度。

图5、多重荧光qPCR法检测的特异性。

图6A～图6B、多重荧光qPCR法检测36种混合模板的扩增曲线图和产物标准化溶解峰图。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次开发了一种可简便、快速、灵敏地在单一反应体系中同时检测目标基因的多重基因检测方法。本发明还提供了针对多种目标基因的引物探针对，将扩增产物Tm值互不相同的多个目标基因的探针上标记相同的荧光基团，组合应用荧光检测以及Tm值分析的方法，实现多个目标基因的检测。本发明方法可广泛用于诊断和非诊断性的检测，并且可用于检测各种不同的病原体，如细菌、病毒等。

本领域公知，在单一反应体系中进行多重检测会面临特异性或灵敏度降低、交叉反应、假阳性或假阴性等问题，使得反应体系的设计上面临障碍，而解决此类问题，最好的办法是单重基因、单重检测，这样便得牺牲检测通量和检测成本的要求，当应用于临床大样品量检测时，这更是造成了很大的困扰。针对这一问题，本发明人进行反复研究，集成了一系列的目标基因，排除了一些不合适的目标基因，针对本发明所选择的目标基因配合本发明人优化的检测试剂(引物和探针)，可以实现在单一反应体系中进行多重检测，且交叉反应性低或不可见，特异性或灵敏度良好。

细菌的耐药基因种类繁多，哪些能够在单一反应体系中实现多重检测也是未知的，在本发明人的前期研究中，进行大量的研究，去伪存真，确定将耐药基因KPC，NDM，ACC，VIM，EBC，CIT，OXA48，GES和DHA作为多重检测的目标基因，排除了在实践中易于发生交叉反应的其它目标基因。

术语

如本文所用，术语“本发明方法”、“本发明检测方法”和“耐药基因多重检测的荧光PCR方法”可互换使用，指本发明第一方面中所述的耐药基因多重检测的荧光PCR方法。

如本文所用，“待测样本”、“待测样品”或“待测核酸(如DNA)样品”是指待检测的核酸样本，其中含有一种核酸或多种核酸，需要了解其中是否存在目标基因。

如本文所用，“目标基因”或“目标核酸”可互换使用，是指感兴趣的核酸或核酸片段，较佳地其是来自于病原体的基因或基因片段，更佳地其是来自于病原体的耐药基因或基因片段。当进行PCR反应以及获得扩增产物时，所述的目标核酸一般存在于该扩增产物中。

如本文所用，“探针”是指一种具有已知核苷酸序列的单链核酸，其具有与目标核酸基本上互补的核苷酸序列结构，可以与“目标核酸”形成双链。所述的“探针”可以携带标记物。例如，标记物可以连接在探针的5’末端或3’末端。

如本文所用，所述的“多种”是大于或等于2种，较佳地大于等于3种。一般地可以是在2～99种的范围内，如3、4、5、6、7、8、9、12、15、18、24、30、36、45、54、63、72、81、90种。

如本文所用，所述的“若干组”一般是指大于或等于2组，较佳地大于等于3组。一般地可以是在2～40组的范围内，如3、4、5、6、7、8、9、12、15、18、24、30、33组；但是，当需要检测的目标基因(或目标核酸)的数量特别少，如少于或等于3种时，该“若干组”可以是1组。

检测方法

本发明提供了一种可用于快速、灵敏而准确地对病原体进行多重检测和或基因定性检测的方法。本发明的方法适用于在同一扩增反应体系中，进行多种目标基因的检测，也即多重检测。本发明方法可以是诊断性或非诊断性的。

为了便于理解，本发明人提供以下基本原理供参考。应理解，本发明的保护范围并不受所述基本原理的任何限制。

本发明的一个主要原理如下：本发明方法基于对多种目标基因的探针用同一种荧光基团标记(作为一个荧光组)后，利用其扩增产物的Tm值的不同区分这些目标基因(如通过绘制熔解曲线来判断这种Tm值)。本发明的方法的原理示意图如图1所示。

可以应用本领域公知的方法对扩增产物进行荧光分析。较佳地，所述荧光分析包括：根据PCR扩增产物的荧光标记的种类，确定各扩增产物所属的荧光组。作为一种优选的方式，通过绘制PCR扩增曲线来进行荧光分析。

探针是一种寡核苷酸序列，与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对。本发明中，所述的探针连接有用于进行基因分组的荧光基团，使得基因分成不同的荧光组。探针的一端(较佳地为5’端)标记有荧光基团，另一端(较佳地为3’端)标记有淬灭基团，其中淬灭基团可淬灭荧光基团发出的荧光。PCR扩增反应进行时，当完整的探针与目标序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3’端的淬灭剂接近而被淬灭，但在进行延伸反应时，聚合酶的5’外切酶活性将探针进行酶切，使得荧光基团与淬灭剂分离。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累，从而可以检测到目标核酸的存在。同时，荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系，会呈现一种S型曲线。本发明中，所述的探针可以是荧光定量中TaqMan探针。

根据目前商品化的荧光检测仪器的特点，其中FAM通道和SYBR GREEN通道的参数相同，在实施本发明的方法时，也需要考虑将FAM通道与SYBR GREEN通道在可被足够辨别的情况下运用。

在将扩增产物进行所述荧光组的区分后，进一步地，进行Tm值分析，从而确定耐药基因的类型。较佳地，所述Tm值分析包括：针对所分出的荧光组，分析每一荧光组的扩增产物的Tm值，确定耐药基因的类型。由于每一荧光组中不同基因的PCR扩增产物的Tm值互不相同，所以可以方便地通过Tm值加以区分。作为一种优选的方式，通过绘制熔解曲线来进行Tm值的区分。

本发明中，为了获得良好地Tm值区分，在基因的分组以及引物的设计方面作了优化，使得在对耐药基因的分辨上呈现非常优异的效果，特异性和灵敏度特别理想。Tm值的高低决于扩增产物的序列，也即本发明种通过引物设计来调整Tm值。

目前商品化的荧光检测仪器多是4通道荧光。因此，作为本发明的一种特别优选的方式，基于4通道的荧光检测仪器，提供一种多重定量PCR检测方法，所述9种耐药基因为KPC、NDM、ACC、VIM、DHA、OXA48、CIT、EBC、GES。经过深入分析和反复实验，优化了目标基因的分子、引物和探针的设计(它们的具体序列如本发明的实施例中所列)，并且进行了合理的荧光基团分配。在更为优选的方式中，KPC、NDM和ACC探针的5’末端和3’末端分别用TXR和BHQ2荧光基团标记，OXA48、DHA和GES探针的5’末端和3’末端分别用HEX和BHQ2荧光基团标记，CIT、EBC和VIM探针的5’末端和3’末端分别用CY5和BHQ3荧光基团标记。进一步地，在PCR反应过程中，本发明人运用染料SYTO 9，利用高分辨率熔解曲线，根据扩增子的Tm值区分不同耐药基因，从而实现对细菌耐药基因的多重定性PCR检测。

SYTO 9染料是一种荧光染料，本发明人在本发明的研究和实验中发现，其性能优于SYBR Green。SYTO 9在本发明的方法中，呈现以下优点：(1)扩增产物的Tm值受染料和模板浓度的变化影响较小，因此更稳定；(2)SYTO 9与DNA双链的结合的无序列偏好性，因此可以更均匀地插入DNA双链；(3)对PCR的抑制作用较弱。

在更为优选以及具体的方案中，所述的方法包括以下步骤：

步骤1，根据9种基因序列设计正向普通引物，探针和反向普通引物，对其中探针进行5’，3’末端的荧光基团和淬灭基团标记，其中每3个基因标记同一种荧光基团，共3种荧光标记9个探针，PCR产物相邻Tm值间的温度差异都大于1.5℃，9种基因扩增产物的片段大小均不同；

步骤2，用所述正向普通引物，探针和反向普通引物(实时荧光定量)进行PCR扩增反应，反应体系中加入核酸染料SYTO 9；由于只有3种荧光标记，因此扩增曲线只有3条。

步骤3，扩增结束后，通过熔解曲线分析，9种产物具有不同的熔解温度，因此可以很方便地鉴定模板的种类。

试剂盒

本发明还涉及一种用于对待测核酸样品进行序列检测的试剂盒，所述试剂盒中含有：针对感兴趣的目标基因的特异性引物和探针，根据目标基因所在的荧光组，所述的探针携带特定的荧光基团以及相应的猝灭基团；并且，分为同一荧光组的目标基因，其扩增产物的Tm值互不相同。

作为本发明的特别优选的方式，本发明提供了优化的目标基因分组、优化了用于扩增的引物，更特别地还提供了优化的荧光基团配置。所述目标基因包括下组的9种：KPC，NDM，ACC，VIM，EBC，CIT，OXA48，GES和DHA；所述9种目标基因分为3组，第1组基因为KPC、NDM和ACC，第2组基因为VIM、EBC和CIT，第3组基因为GES、OXA48和DHA；较佳地，第1组目标基因相应的探针携带荧光基团1和猝灭基团1、且该组基因的PCR扩增产物的Tm值互不相同；第2组目标基因相应的探针携带荧光基团2和猝灭基团2、且该组基因的PCR扩增产物的Tm值互不相同；第3组目标基因相应的探针携带荧光基团3和猝灭基团3、且该组基因的PCR扩增产物的Tm值互不相同。

所述试剂盒中还可含有其它检测试剂，包括但不限于：SYTO 9，PCR缓冲液，DNA聚合酶，或它们的混合液，或它们的混合液。

此外，所述试剂盒中还可含有说明检测方法的使用说明书和/或标准操作程序，从而便于本领域技术人员进行操作。

应用

本发明可广泛用于诊断和非诊断性的检测，并且可用于检测各种不同的病原体，如细菌、病毒等，尤其是有多种耐药基因的病原体微生物。

作为本发明的优选方式，本发明的检测是针病原微生物(细菌)的检测。

此外，本发明可广泛用于传染病病原耐药基因快速多重检测及基因定性检测。

本发明的主要优点

(1)本发明可以单管同时检测多种耐药基因，省时省力。设计简单，操作快捷、灵敏性强、准确度高，可广泛用于传染病病原快速多重检测及基因定性检测等相关领域。与现有所有应用于病原微生物核酸检测方法相比，在检测病原微生物(细菌、病毒等)的核酸检测过程中，检测操作简便快捷，检测结果准确可靠。

(2)本发明的方法通过荧光探针和高分辨率熔解曲线，从两个维度实现同时对多个扩增靶标的区分和鉴定，突破了当前荧光定量PCR仪荧光通道数的限制。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、单管多重qPCR分别扩增9种基因的模板

本实施例通过基因合成获取了细菌的KPC(SEQ ID NO:1)、NDM(SEQ ID NO:2)、ACC(SEQ ID NO:3)、VIM(SEQ ID NO:4)、EBC(SEQ ID NO:5)、CIT(SEQ ID NO:6)、OXA48(SEQ IDNO:7)、GES(SEQ ID NO:8)和DHA(SEQ ID NO:9)，共9种耐药基因片段作为模板。各个基因的引物和探针序列如下所示，其中KPC、NDM和ACC的探针5’端标记Texas red荧光基团，3’端标记BHQ2猝灭基团；VIM、EBC和CIT的探针5’端标记CY5荧光基团，3’端标记BHQ3猝灭基团；GES、OXA48和DHA的探针5’端标记HEX荧光基团，3’端标记BHQ2猝灭基团。

KPC-F：CGGCAGCAGTTTGTTGATTG(SEQ ID NO:10)

KPC-R：CAGACGACGGCATAGTCATTT(SEQ ID NO:11)

KPC-probe：Texas red-CAGTCGGAGACAAAACCGGAACCTGC-BHQ2(SEQ ID NO:12)

NDM-F：GTTTGGCGATCTGGTTTTC(SEQ ID NO:13)

NDM-R：CCGGCATGTCGAGATAGGA(SEQ ID NO:14)

NDM-probe：Texas red-TCGCACCGAATGTCTGGCAGCA-BHQ2(SEQ ID NO:15)

ACC-F：CAATATGGGGCAGTTAAAGCTT(SEQ ID NO:16)

ACC-R：CCTGAGTAATCTCACCCGATTT(SEQ ID NO:17)

ACC-probe：Texas red-TGCTAATGCCAAGATGCAACAGGC-BHQ2(SEQ ID NO:18)

VIM-F：GCAAATTGGACTTCCCGTAAC(SEQ ID NO:19)

VIM-R：CGCCCGAAGGACATCAA(SEQ ID NO:20)

VIM-probe：CY5-ACGCACTTTCATGACGACCGCGTC-BHQ3(SEQ ID NO:21)

EBC-F：ACGTGCGCGGGGTATTCGTATGCTGGATCTC(SEQ ID NO:22)

EBC-R：CCAGGCGGTTAAAGACGCGTTGTGCCA(SEQ ID NO:23)

EBC-probe：CY5-CTTCCATTGCGGCTGCCAGTTTTGATAAA-BHQ3(SEQ ID NO:24)

CIT-F：AGAAAACGCTCCARCAGGGCATTG(SEQ ID NO:25)

CIT-R：CGCTRCCGTTGATGATYGAAT(SEQ ID NO:26)

CIT-probe：CY5-TGGGAGATGCTGAACTGGCCGCTGAA-BHQ3(SEQ ID NO:27)

OXA48-F：TTCGGCCACGGAGCAAATCAG(SEQ ID NO:28)

OXA48-R：GATGTGGGCATATCCATATTCATCGCA(SEQ ID NO:29)

OXA48-probe：HEX-CTGGCTGCGCTCCGATACGTGTAACTTATTG-BHQ2(SEQ ID NO:30)

GES-F：CGGTTTCTAGCATCGGGACACAT(SEQ ID NO:31)

GES-R：CCGCCATAGAGGACTTTAGCCACAG(SEQ ID NO:32)

GES-probe：HEX-CGACCTCAGAGATACAACTACGCCTATTGC-BHQ2(SEQ ID NO:33)

DHA-F：CGGTTATACGGCTGAACCTGGTTGT(SEQ ID NO:34)

DHA-R：TACTATAAAACCGCCGCGATT(SEQ ID NO:35)

DHA-probe：HEX-CCGTTAATGATCATATCTTTCTCCTGCG-BHQ2(SEQ ID NO:36)

反应体系：

2×PCR缓冲液(含酶)	12.5μl
		SYTO 9(10μM)	1
正向引物(10μM)	0.25*9
		探针(10μM)	0.1*9μl
反向引物(10μM)	0.25*9μl
		模板DNA 10<sup>6</sup>	3μl
灭菌蒸馏水	加至25μl

PCR反应程序如下：

95℃ 15分钟；40个循环：95℃ 3秒，60℃ 20秒(收集荧光信号)；

高分辨率熔解曲线分析：

95℃ 60s；40℃ 60s；65℃ 1s；97℃，1s(连续采集荧光)。

按上述反应体系和反应条件在ROCHE96实时荧光定量PCR仪上进行反应，其中反应体系中的预混液来自天根有限公司，SYTO 9染料为Life公司产品(5mM溶液，溶于DMSO)，使用时将其稀释至10μM。分析扩增曲线(图2)和熔解曲线(图2)。

结果表明，本发明的方法可以很好区分9种耐药基因，每个通道中的3种耐药基因其扩增产物的Tm值均不同，因此可以由Tm值区分同一通道内的耐药基因。其中，KPC的PCR产物的Tm值为88.75℃；NDM的PCR产物的Tm值为85.77℃；ACC的PCR产物的Tm值为82.6℃；VIM的PCR产物的Tm值为86.07℃；CIT的PCR产物的Tm值为82.89℃；EBC的PCR产物的Tm值为88.44℃；OXA48的PCR产物的Tm值为83.95℃；GES的PCR产物的Tm值为86.8℃；DHA的PCR产物的Tm值为85.7℃。

实施例2、单管多重荧光qPCR法检测Texas red，CY5和HEX通道3种混合模板

本实施例用已合成的基因KPC(SEQ ID NO:1)、NDM(SEQ ID NO:2)和ACC(SEQ IDNO:3)的质粒，按1:1:1混合配置成混合模板Mix1，VIM(SEQ ID NO:4)、EBC(SEQ ID NO:5)和CIT(SEQ ID NO:6)的质粒，按1:1:1混合配置成混合模板Mix 2，OXA48(SEQ ID NO:7)、GES(SEQ ID NO:8)和DHA(SEQ ID NO:9)的质粒，按1:1:1混合配置成混合模板Mix 3，用多重qPCR检测混合模板，使用的引物探针和实施例1相同。

反应体系：

2×PCR缓冲液(含酶)	12.5μl
		SYTO 9(10μM)	1
正向引物(10μM)	0.25*9
		探针(10μM)	0.1*9μl
反向引物(10μM)	0.25*9μl
		模板DNA10<sup>6</sup>	3μl
灭菌蒸馏水	加至25μl

PCR反应程序如下：

95℃ 15分钟；40个循环：95℃ 3秒，60℃ 20秒(收集荧光信号)；

高分辨率熔解曲线分析

95℃ 60s；40℃ 60s；65℃ 1s；97℃，1s(连续采集荧光)

按上述反应体系和反应条件在ROCHE96实时荧光定量PCR仪上进行反应，其中反应体系中的预混液来自天根有限公司，SYTO 9染料为Life公司产品(5mM溶液，溶于DMSO)，使用时将其稀释至10μM。分析扩增曲线(图3)和熔解曲线(图3)。

结果表明，当模板是3种基因的混合物时，只有一条扩增曲线，没有假阳性和假阴性的发生。本方法可以通过产物Tm值很好区分Texas red，CY5和HEX通道的3种基因。KPC的PCR产物的Tm值为88.75℃；NDM的PCR产物的Tm值为85.77℃；ACC的PCR产物的Tm值为82.6℃；VIM的PCR产物的Tm值为86.07℃；CIT的PCR产物的Tm值为82.89℃；EBC的PCR产物的Tm值为88.44℃；OXA48的PCR产物的Tm值为83.95℃；GES的PCR产物的Tm值为86.8℃；DHA的PCR产物的Tm值为85.7℃。

实施例3、单管多重荧光qPCR法检测的灵敏度测定

本实施例用已合成的基因KPC(SEQ ID NO:1)、NDM(SEQ ID NO:2)、ACC(SEQ IDNO:3)、VIM(SEQ ID NO:4)、EBC(SEQ ID NO:5)、CIT(SEQ ID NO:6)、OXA48(SEQ ID NO:7)、GES(SEQ ID NO:8)和DHA(SEQ ID NO:9)的质粒，各自梯度稀释成10¹-10⁷copies/μl的模板，用多重qPCR检测不同浓度的9个基因，使用的引物探针和实施例1相同。

反应体系：

PCR反应程序如下：

95℃ 15分钟；40个循环：95℃ 3秒，60℃ 20秒(收集荧光信号)；

高分辨率熔解曲线分析：

95℃ 60s；40℃ 60s；65℃ 1s；97℃，1s(连续采集荧光)。

按上述反应体系和反应条件在ROCHE96实时荧光定量PCR仪上进行反应，其中反应体系中的预混液来自天根有限公司，SYTO 9染料为Life公司产品(5mM溶液，溶于DMSO)，使用时将其稀释至10μM。分析扩增曲线和熔解曲线(图4)。

结果表明，本方法对于DHA，OXA-48和GES每反应可以检测到3000拷贝，ACC，KPC，NDM，EBC和VIM每反应可以检测到300拷贝，CIT每反应可以检测到30拷贝。说明本方法有较高的灵敏度。

实施例4、单管多重荧光qPCR法检测的特异性测定

本实施例为了测试分析方法的特异性，使用了18种标准病毒株，包括腺病毒(VR-930)，肠道病毒(VR-1076)，甲型和乙型流感病毒(VR-333和VR-789)，副流感病毒3(VR-93)，HCoV-229E(VR-740)，HCoV-OC43(VR-1558)，RSV-A(VR-1540)和RSV-B(VR-1400)，人鼻病毒(VR-489)，DENV-1(16007)，DENV-2(16681)，DENV-3(16562)，DENV-4(1036)，HHV-1(VR-1493)，HHV-3(VR-1367)，HHV-5(VR-538)和HHV-6(VR-1480)作为对照模板。并且使用11种临床分离菌株，包括3种大肠杆菌，3种肺炎克雷伯菌，1种金黄色葡萄球菌，1种副溶血性弧菌，1种单增李斯特菌，1种志贺氏菌和1种阪崎肠杆菌作为对照模板。用多重qPCR检测这些模板，使用的引物探针和实施例1相同。

反应体系：

PCR反应程序如下：

95℃ 15分钟；40个循环：95℃ 3秒，60℃ 20秒(收集荧光信号)；

高分辨率熔解曲线分析：

95℃ 60s；40℃ 60s；65℃ 1s；97℃，1s(连续采集荧光)。

按上述反应体系和反应条件在ROCHE96实时荧光定量PCR仪上进行反应，其中反应体系中的预混液来自天根有限公司，SYTO 9染料为Life公司产品(5mM溶液，溶于DMSO)，使用时将其稀释至10μM。分析扩增曲线(图5)。

结果表明，本方法只能检测DHA，OXA-48，GES，ACC，KPC，NDM，EBC，VIM和CIT，其余对照模板均不能检测，说明本方法有较高的特异性。

实施例5、单管多重荧光qPCR法检测36种混合模板

本实施例用已合成的基因KPC(SEQ ID NO:1)、NDM(SEQ ID NO:2)、ACC(SEQ IDNO:3)、VIM(SEQ ID NO:4)、EBC(SEQ ID NO:5)、CIT(SEQ ID NO:6)、OXA48(SEQ ID NO:7)、GES(SEQ ID NO:8)和DHA(SEQ ID NO:9)的质粒，两两混合配置成混合模板，用多重qPCR检测混合模板，使用的引物探针和实施例1相同。

反应体系：

PCR反应程序如下：

95℃ 15分钟；40个循环：95℃ 3秒，60℃ 20秒(收集荧光信号)；

高分辨率熔解曲线分析：

95℃ 60s；40℃ 60s；65℃ 1s；97℃，1s(连续采集荧光)。

按上述反应体系和反应条件在ROCHE96实时荧光定量PCR仪上进行反应，其中反应体系中的预混液来自天根有限公司，SYTO 9染料为Life公司产品(5mM溶液，溶于DMSO)，使用时将其稀释至10μM。分析扩增曲线和熔解曲线(图6A～图6B)。

结果表明，当模板是36种混合物时，本方法可以通过产物Tm值很好区分。

实施例6、单管多重荧光qPCR法检测14个CRE菌株

本实施例用从医院收集的14株CRE菌株，抽核酸后做为模板，使用多重荧光qPCR法检测，使用的引物探针和实施例1相同，并且用单重qPCR和sanger测序对结果进行验证。

反应体系：

PCR反应程序如下：

95℃ 15分钟；40个循环：95℃ 3秒，60℃ 20秒(收集荧光信号)；

高分辨率熔解曲线分析：

95℃ 60s；40℃ 60s；65℃ 1s；97℃，1s(连续采集荧光)。

按上述反应体系和反应条件在ROCHE96实时荧光定量PCR仪上进行反应，其中反应体系中的预混液来自天根有限公司，SYTO 9染料为Life公司产品(5mM溶液，溶于DMSO)，使用时将其稀释至10μM。分析检测结果(表1)，发现14个CRE中，7个表达NDM，5个表达KPC，1个共表达NDM和KPC，1个共表达VIM和EBC。单重qPCR和测序结果与多重qPCR检测结果完全一致，说明单管多重荧光qPCR法检测准确率很高。

表1

综上所述，本发明人通过反复筛选，集成了可以组合单管进行检测的目标基因，并优化了合适的检测试剂，从而可通过扩增曲线和熔解曲线可以单管同时区分细菌的9种耐药基因，该方法简便且迅速，适用于临床细菌耐药的诊断。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院上海巴斯德研究所

<120> 同时检测多种目标基因的荧光实时检测试剂及方法

<130> 191940

<160> 36

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 143

<212> DNA

<213> 细菌KPC基因(bacteria KPC)

<400> 1

cggcagcagt ttgttgattg gctaaaggga aacacgaccg gcaaccaccg catccgcgcg 60

gcggtgccgg cagactgggc agtcggagac aaaaccggaa cctgcggagt gtatggcacg 120

gcaaatgact atgccgtcgt ctg 143

<210> 2

<211> 71

<212> DNA

<213> 细菌NDM基因(bacteria NDM)

<400> 2

gtttggcgat ctggttttcc gccagctcgc accgaatgtc tggcagcaca cttcctatct 60

cgacatgccg g 71

<210> 3

<211> 98

<212> DNA

<213> 细菌ACC基因(bacteria ACC)

<400> 3

caatatgggg cagttaaagc ttgatgctaa tgccaagatg caacaggctc tgacagccac 60

ccacaccggc tatttcaaat cgggtgagat tactcagg 98

<210> 4

<211> 95

<212> DNA

<213> 细菌VIM基因(bacteria VIM)

<400> 4

cggagattga aaagcaaatt ggacttcccg taacgcgtgc agtctccacg cactttcatg 60

acgaccgcgt cggcggcgtt gatgtccttc gggcg 95

<210> 5

<211> 147

<212> DNA

<213> 细菌EBC基因(bacteria EBC)

<400> 5

gcagggtatt cgtatgctgg atctcgccac ctacaccgct ggcggcctgc cgctacaggt 60

accggatgag gtcacggata acgcctccct gctgcgcttt tatcaaaact ggcagccgca 120

gtggaagcct ggcacaacgc gtcttta 147

<210> 6

<211> 129

<212> DNA

<213> 细菌CIT基因(bacteria CIT)

<400> 6

agaaaacgct ccagcagggc attgcgcttg cgcagtctcg ctactggcgt attggcgata 60

tgtaccaggg tttaggctgg gagatgctga actggccgct gaaagctgat tcgatcatca 120

acggcagcg 129

<210> 7

<211> 240

<212> DNA

<213> 细菌OXA48基因(bacteria OXA48)

<400> 7

ttcggccacg gagcaaatca gctttttaag aaagctgtat cacaataagt tacacgtatc 60

ggagcgcagc cagcgtattg tcaaacaagc catgctgacc gaagccaatg gtgactatat 120

tattcgggct aaaactggat actcgactag aatcgaacct aagattggct ggtgggtcgg 180

ttgggttgaa cttgatgata atgtgtggtt ttttgcgatg aatatggata tgcccacatc 240

<210> 8

<211> 263

<212> DNA

<213> 细菌GES基因(bacteria OGES)

<400> 8

cggtttctag catcgggaca catgacggtt ctcgaggcag cgcaagctgc ggtgcagctt 60

agcgacaatg gggctactaa cctcttactg agagaaattg gcggacctgc tgcaatgacg 120

cagtattttc gtaaaattgg cgactctgtg agtcggctag accggaaaga gccggagatg 180

agcgacaaca cacctggcga cctcagagat acaactacgc ctattgctat ggcacgtact 240

gtggctaaag tcctctatgg cgg 263

<210> 9

<211> 149

<212> DNA

<213> 细菌DHA基因(bacteria ODHA基因)

<400> 9

tactataaaa ccgccgcgat taaccagggg ctgggctggg aaatgtatga ctggccgcag 60

cagaaagata tgatcattaa cggtgtgacc aacgaggtcg cattgcagcc gcatccggta 120

acagacaacc aggttcagcc gtataaccg 149

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 10

cggcagcagt ttgttgattg 20

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 11

cagacgacgg catagtcatt t 21

<210> 12

<211> 26

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 12

cagtcggaga caaaaccgga acctgc 26

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 13

gtttggcgat ctggttttc 19

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 14

ccggcatgtc gagatagga 19

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 15

tcgcaccgaa tgtctggcag ca 22

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 16

caatatgggg cagttaaagc tt 22

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 17

cctgagtaat ctcacccgat tt 22

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 18

tgctaatgcc aagatgcaac aggc 24

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 19

gcaaattgga cttcccgtaa c 21

<210> 20

<211> 17

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 20

cgcccgaagg acatcaa 17

<210> 21

<211> 24

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 21

acgcactttc atgacgaccg cgtc 24

<210> 22

<211> 31

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 22

acgtgcgcgg ggtattcgta tgctggatct c 31

<210> 23

<211> 27

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 23

ccaggcggtt aaagacgcgt tgtgcca 27

<210> 24

<211> 29

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 24

cttccattgc ggctgccagt tttgataaa 29

<210> 25

<211> 24

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 25

agaaaacgct ccarcagggc attg 24

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 26

cgctrccgtt gatgatygaa t 21

<210> 27

<211> 26

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 27

tgggagatgc tgaactggcc gctgaa 26

<210> 28

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 28

ttcggccacg gagcaaatca g 21

<210> 29

<211> 27

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 29

gatgtgggca tatccatatt catcgca 27

<210> 30

<211> 31

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 30

ctggctgcgc tccgatacgt gtaacttatt g 31

<210> 31

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 31

cggtttctag catcgggaca cat 23

<210> 32

<211> 25

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 32

ccgccataga ggactttagc cacag 25

<210> 33

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 33

cgacctcaga gatacaacta cgcctattgc 30

<210> 34

<211> 25

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 34

cggttatacg gctgaacctg gttgt 25

<210> 35

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 35

tactataaaa ccgccgcgat t 21

<210> 36

<211> 28

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 36

ccgttaatga tcatatcttt ctcctgcg 28

Claims

1.一种目标基因多重检测的荧光PCR方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)获取待测样品的核酸；

(2)以(1)的核酸为模板，在一个反应体系中，使用针对多种目标基因的特异性引物和探针进行实时荧光定量PCR；所述多种目标基因被分成或若干组，属于同一组的目标基因携带相同的荧光基团、但该组目标基因的PCR扩增产物的Tm值互不相同，而不同组的目标基因携带不同的荧光基团；

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述耐药基因为来自病原体的耐药基因，较佳地所述病原体为细菌。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，(2)中，采用四通道或六通道的荧光检测仪器进行荧光基团的鉴别；其中，

当基因为mn-2～mn(m为荧光检测仪器通道数减1，n＞1，且n为整数)种时：第mn-2～mn种基因相应的探针携带荧光基团n和猝灭基团n；第m(n+1)-2～m(n+1)种基因相应的探针携带荧光基团n+1和猝灭基团n+1；第m(n+2)-2～m(n+2)种基因相应的探针携带荧光基团n+2和猝灭基团n+2；第m(n+m)-2～m(n+m)种基因相应的探针携带荧光基团n+m和猝灭基团n+m；其余基因相应的探针携带荧光基团和猝灭基团以此类推；

较佳地，采用四通道的荧光检测仪器时，当基因小于3种时：其相应探针携带的荧光基团1和猝灭基团1；当基因为4～6种时：第1～3种基因相应的探针携带荧光基团1和猝灭基团1；其余基因相应的探针携带荧光基团2和猝灭基团2；当基因为7～9种时：第1～3种基因相应的探针携带荧光基团1和猝灭基团1；第4～6种基因相应的探针携带荧光基团2和猝灭基团2；其余基因相应的探针携带荧光基团3和猝灭基团3。

4.如权利要求1～3任一所述的方法，其特征在于，所述的特异性引物和探针包括选自下组的引物和探针：

5.如权利要求1～3任一所述的方法，其特征在于，(3)中，所述荧光分析包括：根据PCR扩增产物的荧光标记，确定各扩增产物所属的荧光组；较佳地，通过绘制PCR扩增曲线来进行荧光分析。

6.如权利要求1～3任一所述的方法，其特征在于，(3)中，所述Tm值分析包括：针对所分出的荧光组，分析每一荧光组的扩增产物的Tm值，确定目标基因的类型；较佳地，通过绘制熔解曲线来进行Tm值的区分。

7.如权利要求1～3任一所述的方法，其特征在于，(2)中，所述的Tm值互不相同为彼此之间存在显著性差异；较佳地，彼此之间的差异值≥1℃。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(2)中，所述荧光基团包括选自下组的基团：Cy5/Quasar 670、Texas Red/Red 610、HEX/TET/VIC/Cal Gold 540、Quasar 705；或

所述荧光猝灭基团包括选自下组的基团：BHQ1、BHQ3、Eclipse、TAMRA、BHQ2、Dabcyl、MGB。

9.如权利要求2～3或8所述的方法，其特征在于，所述基因为9种，第1～3种基因为KPC、NDM和ACC，第4～6种基因为VIM、EBC和CIT，第7～9种基因为GES、OXA48和DHA；较佳地，荧光基团1、2、3选自或依次为Texas red，CY5，HEX，相应猝灭基团依次为BHQ2，BHQ3，BHQ2。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，PCR体系中含有SYTO 9或SYBR Green Ⅰ，较佳地其终浓度为0.4±0.05μM；或

采用荧光定量PCR，其程序为：

第一阶段：95±1℃，15min；

第二阶段：95℃，3s；60℃，20s；40个循环，60℃采集信号；

第三阶段：95℃，60s；40℃，60s；65℃，1s；97℃，1s。

11.一种用于检测目标基因的试剂盒，其特征在于，其中包括：目标基因的特异性引物和探针，所述目标基因包括下组的9种：KPC，NDM，ACC，VIM，EBC，CIT，OXA48，GES和DHA；所述9种目标基因分为3组，第1组目标基因相应的探针携带荧光基团1和猝灭基团1、且该组基因的PCR扩增产物的Tm值互不相同；第2组目标基因相应的探针携带荧光基团2和猝灭基团2、且该组基因的PCR扩增产物的Tm值互不相同；第3组目标基因相应的探针携带荧光基团3和猝灭基团3、且该组基因的PCR扩增产物的Tm值互不相同；

其中，所述的特异性引物和探针包括选自下组的引物和探针：

12.如权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，第1组基因为KPC、NDM和ACC，第2组基因为VIM、EBC和CIT，第3组基因为GES、OXA48和DHA；较佳地，荧光基团1、2、3选自或依次为Texas red，CY5，HEX，相应猝灭基团依次为BHQ2，BHQ3，BHQ2。

13.如权利要求11～12一所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括：SYTO 9或SYBR Green Ⅰ，PCR缓冲液，DNA聚合酶，或它们的混合液；和/或说明操作方法的说明书。

14.权利要求11～12一所述的试剂盒的用途，用于目标基因的检测；其中标基因包括下组的9种：KPC，NDM，ACC，VIM，EBC，CIT，OXA48，GES和DHA；较佳地，用于进行基于荧光PCR的检测。