CN117821665A - 一种利用溶解曲线检测8种呼吸道病原体恒温检测试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用溶解曲线检测8种呼吸道病原体恒温检测试剂盒，8种生殖病原体为甲型H1N1型流感病毒、肺炎克雷伯杆菌、流感嗜血杆菌、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、肺炎衣原体、肺炎链球菌、肺炎支原体，试剂盒包括：扩增反应液、酶反应液、探针。本发明是等温扩增结合溶解曲线的分析方法，不同于SAT方法使用分子信标实时对反应进行荧光收集产生扩增曲线，进行同步放大检测方式。由于等温扩增的产物主要为RNA单链，故可以反应完成后进行终点检测的溶解曲线分析进行检测，利用探针与单链RNA产物杂交解离过程中所产生的的荧光值的突然变化，形成不同的溶解峰，从而达到判断是否存在探针结合的目标产物的目的。
Description
技术领域
本发明涉及一种恒温扩增检测试剂盒，具体涉及一种利用溶解曲线检测8种呼吸道病原体恒温检测试剂盒及其应用。
背景技术
呼吸道病原体感染的症状大多数表现为发热、咳嗽、肿痛、头痛等症状，其临床表现与病毒感染、细菌感染所导致的临床表现相似，起病急、进展快、症状及体征不典型，因此对呼吸道病原体进行鉴别诊断，可快速明确引起呼吸道症状的病原体，从而让医生有针对性的制定治疗方案和健康管理措施，尽快治愈疾病，避免抗生素的过度使用。
目前检测呼吸道病原体的分子检测技术主要为基于DNA检测的PCR荧光定量法。PCR荧光定量法一管检测灵敏度高但指标少，一般为1-4个指标，且检测DNA无法判断病原体是否存活，可能存在假阳性结果。
以RNA为检测模板的等温扩增技术目前主要是以AMV为逆转录酶的基于核酸序列的扩增技术及以MMLV为逆转录酶的TMA及SAT扩增技术，该两种方法扩增原理几乎完全相同，只是逆转录酶种类存在差别。目前国内针对泌尿生殖道病原体检测主要应用的是TMA及SAT扩增技术。该两种方法的主要区别在于扩增产物的检测方法，TMA主要在反应完成后对产物进行HPA及杂交保护检测，该检测方法由于在反应完成后仍然需要开盖进行检测，一定程度增加了污染的可能。SAT检测则通过在反应体系中加入诸如分子信标等探针，对反应进行不开盖实时报告及检测技术(200810111479.0，核酸恒温同步放大检测方法及应用)，该方法可在扩增发生产物产生时利用分子信标进行实时检测，利用扩增曲线的有无进行结果的判断，该检测灵敏度高，且不开盖检测，污染可能性小。但该方法目前针对4通道机器单管最多只能分别检测四个指标，且实验的RNA聚合酶及反转录酶量较多，单个指标成本较高。
多通道溶解曲线技术是一种PCR终点检测技术，在PCR扩增结束之后，利用温度的升高实现探针与目的单链的逐渐解链，发生荧光值的变化，通过仪器生成探针熔解曲线。依靠探针TM值的差异，可以在同一管内实现多重检测，使用不同荧光标记的探针，即可实现多通道多重检测。如何将两个维度技术的结合是迫切需要解决的。
发明内容
为解决检测通量少、单指标检测成本较高的问题，本发明提供一种利用溶解曲线检测8种呼吸道病原体恒温检测试剂盒。本发明是等温扩增结合溶解曲线的分析方法，不同于SAT方法使用分子信标实时对反应进行荧光收集产生扩增曲线，进行同步放大检测方式。由于等温扩增的产物主要为RNA单链，故可以反应完成后进行终点检测的溶解曲线分析进行检测，利用探针与单链RNA产物杂交解离过程中所产生的的荧光值的突然变化，形成不同的溶解峰，从而达到判断是否存在探针结合的目标产物的目的。
本发明提供如下技术方案：
一种利用溶解曲线检测8种呼吸道病原体恒温检测试剂盒，包括甲型H1N1型流感病毒、肺炎克雷伯杆菌、流感嗜血杆菌、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、肺炎衣原体、肺炎链球菌、肺炎支原体，试剂盒包括：
1)扩增反应液：含10-150mM KCl，3-40mM MgCl2，10-150mM Tris-HCl，0.1-5mMdNTP,0.1-8mM NTP，3％-30％甘油，1-20mM DTT，0.1-5mM精氨酸，甲酰胺0.05-2mM 0.05-2μM扩增引物1，0.05-2μM扩增引物2；
扩增引物有八对：甲型H1N1型流感病毒、肺炎克雷伯杆菌、流感嗜血杆菌、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、肺炎衣原体、肺炎链球菌、肺炎支原体，具体的：
(1)甲型H1N1型流感病毒的扩增引物：
IAV-扩增引物1：GCGCAGAGACTGGAAAGTG
IAV-扩增引物2：AATTCTAATACGACTCACTATAGGGCGCTCACTGGGCACGGT
(2)肺炎克雷伯杆菌的扩增引物：
KP-扩增引物1：CTTTGTGGCTTCAACAGCG
KP-扩增引物2：AATTCTAATACGACTCACTATAGGGGAAATAGTGCATGGCTTTGATC
(3)流感嗜血杆菌的扩增引物：
HI-扩增引物1：TAAGATTTCCCAGGTGCCAG
HI-扩增引物2：TTCCCTCCTATGCGTTATGC
(4)乙型流感病毒的扩增引物：
IBV-扩增引物1：GGAGGACCCTACAAAATTGGAAC
IBV-扩增引物2：
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(5)呼吸道合胞病毒的扩增引物：
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RSV-扩增引物2：AATTCTAATACGACTCACTATAGGGGCATCCATRGCTTGTCTTTCATC
(6)肺炎衣原体的扩增引物：
CP-扩增引物1：GGTTCACTAATGCAGGCTTCAT
CP-扩增引物2：
AATTCTAATACGACTCACTATAGGGACTCCGAATAAACCAACGAGATTGAACG
(7)肺炎链球菌的扩增引物：
SP-扩增引物1：CTAAGTCAGCACTTGGTTTCGT
SP-扩增引物2：
AATTCTAATACGACTCACTATAGGGCCTCTAATCCTTGCATGATTTGACG
(8)肺炎支原体的扩增引物：
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MP-扩增引物2：AATTCTAATACGACTCACTATAGGGGGGACCTTGACTGGAGGCC
2)酶反应液：1-800U逆转录酶，10-1000U RNA聚合酶，0-100U RNA酶抑制剂，10％-50％甘油10-100mM Tris-HCl，20-200mM KCl，0.1-5mM DTT，0.1-1μg/μL BSA，0-0.5U核糖核酸酶H；
3)探针0.05-2μM，探针是一种或多种荧光探针，荧光探针的类型为taqman荧光探针、分子信标或蝎型探针。
酶反应液中的四种酶如下：
RNA聚合酶:T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶、M13 RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶；
逆转录酶：AMV反转录酶或MMLV反转录酶；
具有降解RNA&DNA杂交链中RNA链活性的核糖核酸酶H；
抑制核糖核酸酶A，B，C的鼠源或人源的RNA酶抑制剂。
扩增引物1与目的核酸负链5'杂交的一段核酸序列；
扩增引物2的5'端为RNA聚合酶(T7 RNA聚合酶，T3 RNA聚合酶，M13 RNA聚合酶，SP6 RNA RNA聚合酶)启动子，3'端与目的核酸3'杂交的一段核酸序列。
探针一端标记有荧光基团(包括atto425、FAM、VIC/HEX/JOE、ROX、CY5，CY5.5)，探针另一端标记有淬灭基团(包括MGB，BHQ1,BHQ2,BHQ3,Dabcyl等)。
荧光探针序列为：
(1)甲型H1N1型流感病毒的荧光探针：
IAV-荧光探针：FAM-TAAAGACAAGACCAATC-MGB
(2)肺炎克雷伯杆菌的荧光探针：
KP-扩增引物1：FAM-GAACGCGAACAAGCTG-MGB
(3)流感嗜血杆菌的荧光探针：
HI-荧光探针：FAM-ACTTAACACAGGCTGATTCAGCCC-BHQ1
(4)乙型流感病毒的荧光探针：
IBV-荧光探针：HEX-AACAATGGCTTGGGC-MGB
(5)呼吸道合胞病毒的荧光探针：
RSV-荧光探针：HEX-ATATTTGGACACCC-MGB
(6)肺炎衣原体的荧光探针：
CP-荧光探针：ROX-CATTTGGGATCGCTTTGATGTTTTCTG-BHQ2
(7)肺炎链球菌的荧光探针：
SP-荧光探针：ROX-AGCAGATGGAGATCGTGATCGAGGACGG-BHQ2
(8)肺炎支原体的荧光探针：
MP-荧光探针：Cy5-CCTGATCAAGATACCCAACCAAACAAC-BHQ3
同一荧光通道、不同指标的探针与目的核酸负链杂交的TM值不同,其在体系中的TM值为45-80摄氏度。
检测方法：
将扩增反应液与模板混合后37-70℃孵育1-30min后，加入酶反应液继续37-50℃孵育30-120min扩增反应结束后，温度以0.01-0.1℃缓慢上升至65-90℃，开始在最多六个通道atto425、FAM、VIC/HEX/JOE、ROX、CY5，CY5.5收集溶解曲线，观察仪器溶解峰型,判断是否存在目的核酸。
本发明预期可一管同时检测8种较为流行且危害较大的呼吸道病原体，包括甲型H1N1型流感病毒(H1N1 influenza A virus)、乙型流感病毒(influenza B virus)、呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、肺炎克雷伯杆菌(klebsiella pneumoniae)，流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae)。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、通过等温扩增结合溶解曲线的分析方法，在同一管内能够同时扩增甲型H1N1型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、肺炎衣原体、肺炎支原体、肺炎克雷伯杆菌，流感嗜血杆菌、肺炎链球菌八个指标，实现多通道多重检测，两个维度技术的结合，可以大大增加检测通量；
2、RNA检测，判断病原体是否存活，减少假阳性检出，抗生素滥用；
3、较常规四通道荧光定量方法包含内参最多仅可检测三个靶标，该发明单管除内标外还可检测并区分8个指标，检测指标较多；
4、闭管检测，且扩增出的核酸产物为RNA，环境中易降解，不易污染。
本发明通过等温扩增结合溶解曲线的分析方法，适用于临床检验、血液筛查、食品安全检查及环境监测等领域中的核酸检验。
附图说明
图1为本发明原理图。
图2为本发明FAM通道溶解曲线图。
图3为本发明HEX通道溶解曲线。
图4为本发明ROX通道溶解曲线图。
图5为本发明Cy5通道溶解曲线图。
实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
考虑到目前依赖于核酸序列的RNA等温扩增技术使用了较多的酶类，检测成本较高，故提出了等温扩增技术与溶解曲线后PCR终点报告相结合的方法，
本发明一种利用溶解曲线检测8种呼吸道病原体恒温检测试剂盒，
试剂盒包括：
1)扩增反应液：含10-150mM KCl，3-40mM MgCl2，10-150mM Tris-HCl，0.1-5mMdNTP,0.1-8mM NTP，3％-30％甘油，1-20mM DTT，0.1-5mM精氨酸，甲酰胺0.05-2mM 0.05-2μM扩增引物1，0.05-2μM扩增引物2；
2)酶反应液：1-800U逆转录酶，10-1000U RNA聚合酶，0-100U RNA酶抑制剂，10％-50％甘油10-100mM Tris-HCl，20-200mM KCl，0.1-5mM DTT，0.1-1μg/μL BSA，0-0.5U核糖核酸酶H；
3)探针0.05-2μM，探针是一种或多种荧光探针，荧光探针的类型为taqman荧光探针、分子信标或蝎型探针。
酶反应液中的四种酶如下：
RNA聚合酶:T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶、M13 RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶；
逆转录酶：AMV反转录酶或MMLV反转录酶；
具有降解RNA&DNA杂交链中RNA链活性的核糖核酸酶H；
抑制核糖核酸酶A，B，C的鼠源或人源的RNA酶抑制剂。
扩增引物1与目的核酸负链5'杂交的一段核酸序列；
扩增引物2的5'端为RNA聚合酶(T7 RNA聚合酶，T3 RNA聚合酶，M13 RNA聚合酶，SP6 RNA RNA聚合酶)启动子，3'端与目的核酸3'杂交的一段核酸序列。
探针一端标记有荧光基团(包括atto425、FAM、VIC/HEX/JOE、ROX、CY5，CY5.5)，探针另一端标记有淬灭基团(包括MGB，BHQ1,BHQ2,BHQ3,Dabcyl等)。
同一荧光通道、不同指标的探针与目的核酸负链杂交的TM值不同,其在体系中的TM值为45-80摄氏度。
其主要步骤包括:
1、RNA提取，可使用常规的商品化RNA提取试剂盒或Trizol方法进行RNA提取。
2、变性退火：将反应液与模板在37-70摄氏度下进行孵育，反应液中的引物2与模板在该步骤下进行杂交退火。
3、扩增：将温度降至37-50摄氏度，在该步骤下加入酶混合液，并进行扩增反应。
扩增原理阐述如下：
扩增引物2与模板杂交后，在RNA依赖的DNA聚合酶(MMLV或AMV)作用下进行延伸，产生DNA：RNA杂交链后，在RnaseH的作用下，RNA链降解。
扩增引物1与DNA链退火结合，再次延伸产生含T7启动子序列的双链DNA，在T7 RNA聚合酶的作用下，产生RNA单链，RNA单链与扩增引物1结合，延伸后产生DNA：RNA杂交链，RnaseH作用下杂交链中的RNA链降解，扩增引物2与DNA链结合后延伸产生含T7启动子的双链DNA，在T7聚合酶作用下，产生RNA单链，并循环扩增，产生大量RNA单链，产生的单链可以与探针结合。
溶解曲线判读扩增完成后，将温度以0.01-0.1摄氏度/秒速率缓慢提升至65-90摄氏度，观察溶解曲线峰，是否出现目的溶解峰判断是否存在有待测靶标，在该步骤中，探针与扩增所产生的大量RNA单链结合，随着温度的升高，不同TM值的探针与RNA单链逐渐解链，导致反应荧光值突然下降，形成对应TM值的溶解峰。
将含有8种，包括甲型H1N1型流感病毒(H1N1 influenza A virus)、乙型流感病毒(influenza B virus)、呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、肺炎克雷伯杆菌(klebsiella pneumoniae)，流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae)中的一种或数种临床样本使用Trizol法进行RNA提取，得到RNA样本后，取5微升RNA模板与15微升反应液混合。
反应液:Tris-HCl(PH＝8.0)30mM，50mM KCl，2mM dNTP,4mM NTP，10mM MgCl2，F1-F5，R1-R5各400nM，P1-P5各200nM，精氨酸1mM，DTT 1mM，甲酰胺100μM。65℃反应5min。降温至41℃后加入5ml酶混合液。
酶混合液包含80U T7聚合酶，8U AMV,0.3U RnaseH，40U RNA酶抑制剂，20mMTris-HCl(PH＝8.0)，100mM KCl，2mM DTT，0.5μg/μL BSA。
表1探针不同TM值在不同通道的分布表
表2病原体序列表
表2不同病原体的序列表在宏石slan-96S机器上反应40min后，以0.03℃/秒的速率升温至80℃，收集溶解曲线，更具对应TM值出是否出现溶解峰判读结果。
使用的检测扩增模板为含有靶标序列的体外转录RNA,每反应RNA拷贝数为200拷贝/反应。
甲型H1N1型流感病毒靶标序列
GCGCAGAGACTGGAAAGTGTCTTTGCAGGAAAGAATACAGACCTTGAGGCTCTCATGGAATGGCTAAAGACAAGACCAATCTTGTCACCTTTGACTAAGGGAATTTTAGGATTTGTGTTCACGCTCACCGTGCCCAGTGAGCG
肺炎克雷伯菌靶标序列
GAAATAGTGCATGGCTTTGATCTTGCCGTACACATCCAGCTTGTTCGCGTTCTTATTATAAACTTCCGCTGCCTGCGTCGCTGTTGAAGCCACAAAG
流感嗜血杆菌靶标序列
TTCCCTCCTATGCGTTATGCAGGTAAAAAAGTTGGAAAATTACGTACACCGTTAGCCCAGAAATGGGGATTAAATCCCGTACCTGTCATTTCTTGTGGACATGATACTCAATTTGCTGTGTTTGGATCTGGTGCAGGGCTGAATCAGCCTGTGTTAAGTTCTGGCACCTGGGAAATCTTA
乙型流感病毒靶标序列
GGAGGACCCTACAAAATTGGAACCTCAGGGTCTTGCCCTAACGTTACCAATGGAAACGGATTCTTCGCAACAATGGCTTGGGCCGTCCCAAAAAACGACAAAAACAAAACAGCAACAAATCCATTAACAATAGAAGTACCATACATTTGTACAGAAGGAGAAGACC
呼吸道合胞病毒靶标序列
GCTTGCAGGTGACAATAACCTCAACAATCTGAGTGAATTATATTTTTTGTTCAGAATATTTGGACACCCAATGGTAGATGAAAGACAAGCCATGGATGC
肺炎衣原体靶标序列
CTGTCGGCTCCTTACAAGCCTTGCCTGTAGGGAACCCTTCTGATCCAAGCTTATTAATTGATGGTACAATATGGGAGGGTGCTGCAGGAGATCCTTGCGATCCTTGCGCTACTTGGTGCGACGCTATTAG
肺炎链球菌靶标序列
CTAAGTCAGCACTTGGTTTCGTTCGAGAACGTCATTCTCTAGCAGATGGAGATCGTGATCGAGGACGGAATCAACAGAAGGTGCTCGCTGCAATTATTCAAAAATTAACCTCAATAGAATCATTGAAAAATTATCGTCAAATCATGCAAGGATTAGAGG
肺炎支原体靶标序列
GAGCTTAGGTCTCCGCTTAGAGTTCTTTAAACCTGATCAAGATACCCAACCAAACAACAACGTTCAGGTCAATCCGAATAACGGTGACTTCTTACCACTGTTAACG
内参扩增序列
CCTTCTGCATCCTGTCGGCAATGCCAGGGTACATGGTGGTGCCGCCAGACAGCACTGTGTTGGCGTACAGGTCTTTGCGGATGTCCACGTCACACTTCATGATGGAGTTGAAGGTAGTTTCGTGGATGCCACAGGACTCCATGCCTGAGAGGGAAATGAGGGCAGG
图2所示，FAM通道溶解曲线图。
图3所示，HEX通道溶解曲线。
图4所示，ROX通道溶解曲线图。
图5所示，Cy5通道溶解曲线图。
从以上结果可以看出，本试剂盒对不同的病原体株具有很好的检出能力。
临床样本举例
在应用本发明试剂和“金标准”测序方法测定的样本1716例，包含甲型流感阳性样本共181例；乙型流感病毒阳性样本84例；流感嗜血杆菌阳性样本50例；呼吸道合胞病毒阳性样本53例；肺炎克雷伯杆菌阳性样本60例；肺炎支原体阳性样本56例；肺炎支原体阳性样本47例，肺炎链球菌阳性样本23例。阳性符合率99.3％-100％，阴性符合率99.7-99.9％。本发明专利试剂盒检测临床样本与金标准测序方法比较，无明显差异，但是在多重检测、操作时间短等方面具有明显的优势。
本发明实现在单管反应中检测八种泌尿生殖道病原体的目的，降低单指标检测成本的同时，降低反应管数，提高操作的便捷性。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (5)
1.一种利用溶解曲线检测8种呼吸道病原体恒温检测试剂盒，8种生殖病原体为甲型H1N1型流感病毒、肺炎克雷伯杆菌、流感嗜血杆菌、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、肺炎衣原体、肺炎链球菌、肺炎支原体，其特征在于：试剂盒包括：
1)扩增反应液：含10-150mM KCl，5-30mM MgCl2，10-150mM Tris-HCl，0.1-5mM dNTP,0.1-8mM NTP，3％-30％甘油，1-20mM DTT，0.1-5mM精氨酸，0.05-2mM甲酰胺，0.05-2μM扩增引物1，0.05-2μM扩增引物2；
扩增引物有八对：甲型H1N1型流感病毒、肺炎克雷伯杆菌、流感嗜血杆菌、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、肺炎衣原体、肺炎链球菌、肺炎支原体，具体的：
(1)甲型H1N1型流感病毒的扩增引物：
IAV-扩增引物1：GCGCAGAGACTGGAAAGTG
IAV-扩增引物2：AATTCTAATACGACTCACTATAGGGCGCTCACTGGGCACGGT
(2)肺炎克雷伯杆菌的扩增引物：
KP-扩增引物1：CTTTGTGGCTTCAACAGCG
KP-扩增引物2：AATTCTAATACGACTCACTATAGGGGAAATAGTGCATGGCTTTGATC
(3)流感嗜血杆菌的扩增引物：
HI-扩增引物1：TAAGATTTCCCAGGTGCCAG
HI-扩增引物2：TTCCCTCCTATGCGTTATGC
(4)乙型流感病毒的扩增引物：
IBV-扩增引物1：GGAGGACCCTACAAAATTGGAAC
IBV-扩增引物2：
AATTCTAATACGACTCACTATAGGGGGTCTTCTCCYTCTGTACAAATGT
(5)呼吸道合胞病毒的扩增引物：
RSV-扩增引物1：RCTTGCAGGTGACAAYAAC
RSV-扩增引物2：AATTCTAATACGACTCACTATAGGGGCATCCATRGCTTGTCTTTCATC
(6)肺炎衣原体的扩增引物：
CP-扩增引物1：GGTTCACTAATGCAGGCTTCAT
CP-扩增引物2：
AATTCTAATACGACTCACTATAGGGACTCCGAATAAACCAACGAGATTGAACG
(7)肺炎链球菌的扩增引物：
SP-扩增引物1：CTAAGTCAGCACTTGGTTTCGT
SP-扩增引物2：
AATTCTAATACGACTCACTATAGGGCCTCTAATCCTTGCATGATTTGACG
(8)肺炎支原体的扩增引物：
MP-扩增引物1：GAGCTTAGGTCTCCGCTTAGA
MP-扩增引物2：AATTCTAATACGACTCACTATAGGGGGGACCTTGACTGGAGGCC
2)酶反应液：1-800U逆转录酶，10-1000U RNA聚合酶，0-200U RNA酶抑制剂，10％-50％甘油10-200mM Tris-HCl，20-200mM KCl，0.1-5mM DTT，0.1-1μg/μL BSA，0-0.5U核糖核酸酶H；
3)探针0.05-2μM，探针是一种或多种荧光探针，荧光探针的类型为taqman荧光探针、分子信标或蝎型探针。
2.根据权利要求1所述的一种利用溶解曲线检测8种呼吸道病原体恒温检测试剂盒，其特征在于：所述酶反应液含有的四种酶如下：
RNA聚合酶:T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶、M13 RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶；
逆转录酶：AMV反转录酶或MMLV反转录酶；
具有降解RNA&DNA杂交链中RNA链活性的核糖核酸酶H；
抑制核糖核酸酶A，B，C的鼠源或人源的RNA酶抑制剂。
3.根据权利要求1所述的一种利用溶解曲线检测8种呼吸道病原体恒温检测试剂盒，其特征在于：所述扩增引物1与目的核酸负链5'杂交的一段核酸序列；扩增引物2的5'端为RNA聚合酶启动子，3'端与目的核酸3'杂交的一段核酸序列。
4.根据权利要求1所述的一种利用溶解曲线检测8种呼吸道病原体恒温检测试剂盒，其特征在于：所述探针一端标记有荧光基团，探针另一端标记有淬灭基团。
5.根据权利要求1所述的试剂盒在制备检测8种生殖病原体核酸检测试剂中的应用，其特征在于：8种生殖病原体为甲型H1N1型流感病毒、肺炎克雷伯杆菌、流感嗜血杆菌、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、肺炎衣原体、肺炎链球菌、肺炎支原体。
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