CN112029831A

CN112029831A - 一种极低载量病原微生物的超灵敏定量pcr检测技术

Info

Publication number: CN112029831A
Application number: CN202010821475.2A
Authority: CN
Inventors: 王继国; 田晓峰; 陈普
Original assignee: Tianluo Diagnostic Technology Jiangsu Co ltd; Tianshai Shanghai Technology Co ltd
Current assignee: Tianluo Diagnostic Technology Jiangsu Co ltd; Tianshai Shanghai Technology Co ltd
Priority date: 2020-08-15
Filing date: 2020-08-15
Publication date: 2020-12-04

Abstract

本发明属于医学检测领域，具体涉及一种极低载量病原微生物的超灵敏定量PCR检测技术。本发明公开了提供一种用于极低载量病原微生物的超灵敏定量PCR检测技术及试剂盒体系，突破目前定量PCR的技术局限，达到每个反应中1copies病毒检测灵敏度极限，即1拷贝病毒检测灵敏度的理论值100％。从而适合便于适合病原微生物普筛，特别是病毒的大规模筛查中对超高灵敏的要求。

Description

一种极低载量病原微生物的超灵敏定量PCR检测技术

技术领域

本发明属于生物诊断领域，具体涉及一种极低载量病原微生物的超灵敏定量PCR检测技术。

背景技术

感染性疾病是临床常见的多发病，是全球死亡率和发病率最高的疾病之一。广义的感染性疾病包括所有病原微生物感染引起的疾病。这些病原微生物以病毒和细菌为代表，主要包括立克次体、支原体、衣原体、螺旋体、真菌、放线菌、朊病毒、寄生虫等物质。

相对于免疫检测技术来说，基于荧光探针的定量PCR技术具有高灵敏高特异的特征，广泛应用于病原微生物的的检测，如丙肝、乙肝、HIV、SRAS-CoV-2等病毒检测。但是当用于检测极低载量病毒尤其是个位数拷贝病毒时，对酶和引物/探针的敏感度要求极高，极易产生核酸检测假阴性，是当前核酸检测技术的一个难题。如在SARS-CoV-2的检测Nalla A K等^【1】报道采用Thermo Fisher公司高性能酶体系筛选出最优引物探针组合，每反应6.3拷贝最高灵敏度为90％(理论值：100％)，每反应0.63拷贝是灵敏度仅为15％(理论值：63％)；同时采用华大基因(BGI)试剂盒测试每反应6.3拷贝灵敏度仅为50％(理论值：100％)，每反应0.63拷贝是灵敏度为0。能将每反应1拷贝的检测灵敏度提高到接近理论值100％是目前定量PCR技术的极限，也是目前国际上尚未解决的技术瓶颈。

【1】Nalla A K,Casto A M,Huang M L W,et al.Comparative Performance ofSARS-CoV-2Detection Assays using Seven Different Primer/Probe Sets and OneAssay Kit[J].Journal of Clinical Microbiology,2020,58(6).

多重qPCR是指在同一PCR反应体系里加上两对以上引物及各自探针，每对引物探针分别对应一个qPCR荧光通道，从而扩增不同的基因或靶标，但是多重qPCR因探针引物的相互干扰容易降低检测的灵敏度，同时依赖于昂贵的多通道仪器。如SRAS-CoV-2的核酸检测试剂盒多重试剂的灵敏度普遍低于单重灵敏度。基于多重PCR发展的利用多重探针扩增(Multiplex Probe Amplification，MPA)的专利技术很好地克服了RT-PCR多重检测的限制，突破荧光PCR仪通道数的瓶颈，可允许每个荧光通道分别检测多达六个不同的靶标，从而可以实现在一个PCR反应管中实现多靶标(18重)同时检测。多重PCR和多重探针扩增虽然解决的多靶标问题用于多种病毒同时检测或基因分型检测，但均不适合大规模病毒筛查中对超高灵敏的要求，尤其如SRAS-CoV-2等具有病毒载量很低且传染性极强的病毒。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于极低载量病原微生物的超灵敏定量PCR检测技术及试剂盒体系，突破目前定量PCR的技术局限，达到每个反应中1copies病毒检测灵敏度极限，即1拷贝病毒检测灵敏度的理论值100％。从而适合便于适合病原微生物普筛，特别是病毒的大规模筛查中对超高灵敏的要求。

一种极低载量病原微生物的超灵敏定量PCR检测技术，其包含以下步骤：

a.依据已公开的种病原微生物基因序列，选取2个以上目标扩增区域序列，设计2对以上的特异性引物对和探针，所述探针为同一波长荧光基团标记，所述目标扩增区域序列为该病原微生物的特异性基因序列，且目标扩增区域序列不重叠；

b.采集样品，用样品直接扩增或核酸提取或富集或一步法裂解得到扩增用DNA或RNA模板；

c.采用上述多对特异性引物对和探针，以上述样品或核酸为模板，进行PCR扩增；

本发明技术原理：在多重PCR技术的基础上，使用某种病原微生物的基因序列设计多对引物和探针进行扩增检测，所有扩增子(目标扩增区域或目标扩增片段)的探针标记采用同一波长荧光基团标记。这样使得PCR或RT-qPCR扩增过程增加了扩增子的理论拷贝数，在PCR扩增过程中多个片段扩增荧光信号叠加，使得Ct值降低荧光信号值提高，从而大大提高了病原微生物检测的灵敏度，通过此技术可使最低1个拷贝病原微生物检测灵敏度提高到极限理论值100％。该技术命名为单色信号叠加多重qPCR技术(Monochrome SignalSuperposition Multiplex qPCR，MSSM qPCR)，简称(原理如图1)，特别适合如SRAS-CoV-2等低载量病毒的大规模筛查。同时若通过每个病毒设计多个扩增子的引物探针，实现多通道同时超高灵敏检测多种病毒靶标，如HIV、HBV、HIV的血源病毒筛查。

在另一优选例中，所述极低载量为每1ml中病原微生物拷贝数50以下样品；本技术仅涉及定量PCR步骤，是指每个反应体系中最低仅含1拷贝病毒的极限值。

在另一优选例中，所述病原微生物指寄生虫、真菌、细菌、螺旋体、支原体、立克次体、衣原体、病毒，其中优选为病毒。

在另一优选例中，所述特异性引物对可包括2-50个引物对或2-30个引物对，较佳地2-10对，更佳地2-6个引物对。

在另一优选例中，所述探针类型不限于水解探针，分子信标等特异性荧光探针标记，优选水解探针。

所述探针的5’端标记的荧光基团为选自FAM、HEX、CY5、TET、JOE、CY3、TAMRA、ROX中的任一种；所述探针的3’端标记的淬灭基团为选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcyl中的任一种。

在一个具体的实施方案中，本发明所述探针的5’端标记的荧光基团为FAM，所述探针的3’端标记的淬灭基团为相同基团或不同基团。

在另一优选例中，所述荧光水解探针数量可包括2-50条，较佳地2-10条，更佳地2-6条探针。

在另一优选例中，所述病原微生物的核酸包括RNA或DNA，优选RNA病毒或DNA病毒。

在另一优选例中，所述检测病原微生物的种类不同通道荧光探针标记，可实现同时检测1-20个病原生物单管联合检测，优选检测病毒数量为1-6个。

在另一优选例中，PCR扩增的反应体系包括单酶法或双酶法RT-qPCR RNA病毒检测；或使用qPCR进行DNA病毒检测。

在另一优选例中，所述RT-qPCR或qPCR包含的酶种类不限于DNA聚合酶，野生或改造的TaqDNA聚合酶、野生或改造的Tth DNA聚合酶、野生或改造的MMLV、AMV等反转录酶；UNG酶和Rnase酶抑制剂。

在本发明的第二方面，提供一种基于定量PCR技术的极低载量病原微生物超灵敏检测核酸检测试剂盒，所述试剂盒包含：

特异性扩增多种靶序列的2对以上引物对和探针，所述探针为同一荧光波长染料标记，每类引物对和探针可分别独立包装或混合包装；以及聚合酶链式反应其他试剂或成分和使用说明书，其中内标基因的探针荧光应在不同于检测病原微生物的探针波长。

在另一优选例中，所述探针不限于水解探针，分子信标等特异性探针标记，优选水解探针。

进一步地，所述试剂盒包括：用于监控的内标上游引物、内标下游引物和内标探针。

进一步地，所述特异性扩增多种靶序列的探针，与内标探针带有彼此不互相干扰的荧光基团。在本文中，“彼此不互相干扰”是指组合物中每个探针所用的荧光基团是不一样的，并且不会影响彼此的检测，即可以利用不同的通道进行检测。例如可以使用FAM、HEX、ROX和CY5，这些基团吸光值不接近，能选择不同的通道，因而不会互相干扰。

进一步地，所述特异性扩增多种靶序列的探针的5’端标记的荧光基团为FAM，所述内标探针的荧光基团为HEX。

在一些的实施方案中，本发明的特异性扩增多种靶序列的引物对和探针存在于同一包装中。

在另一些的实施方案中，本发明的特异性扩增多种靶序列的引物对和探针，分别存在于单独的包装中。

在又一些实施方案中，本发明的特异性扩增多种靶序列的2对以上引物对和探针，和内标引物对和内标探针，分别存在于单独的包装中。

本发明技术可使每个反应体系中低至1拷贝的病原微生物检测灵敏度提高到100％，特别适合如SRAS-CoV-2等低载量病毒的大规模筛查。同时若通过每个病毒设计多个扩增子的引物探针，实现多通道同时超高灵敏检测多个病毒靶标，如HIV、HBV、HIV的血源病毒筛查。

附图说明

图1 MSSM qPCR技术原理图。

图2 RNA模板稀释10⁴(百位数拷贝)检测扩增结果。

图3 RNA模板稀释10⁶(个位数拷贝)检测扩增结果。

图4 1.62拷贝/反应DNA模板检测扩增结果。

图5 0.81拷贝/反应DNA模板检测扩增结果。

具体实施方式

术语

在本发明中，术语“病原微生物”是指可以侵犯人体，引起感染甚至传染病的微生物，或称病原体。病原体中，以细菌和病毒的危害性最大。病原微生物指朊毒体、寄生虫(原虫、蠕虫、医学昆虫)、真菌、细菌、螺旋体、支原体、立克次体、衣原体、病毒

“病原微生物载量”简单的说就是通过测量从而显示每计算体积里病原微生物的数量，如病毒载量以拷贝(copies)数为单位，计算每一毫升(ml)有多少病毒量，如copies/ml。通常若病毒量在100copies/ml以下是“低",100 000copies/ml以上“高”，50copies/ml以下为载量极低。而极低载量的病毒检测灵敏度首先受限于核酸纯化富集方式和定量PCR检测的灵敏度。定量PCR每个反应中检测1个拷贝是定量PCR技术的灵敏度极限。

如本文使用的术语“样品”包括包含核酸的样本或培养物(例如，微生物培养物)。术语“样品”还意图包括生物样品和环境样品。样品可以包括合成起源的样本。生物样品包括全血、血清、血浆、脐带血、绒毛膜绒毛、羊水、脑脊液、脊髓液、灌洗液(例如，支气管肺泡的、胃的、腹膜的、导管的、耳的、关节镜的灌洗液)、活检样品、尿、粪便、痰、唾液、鼻粘液、前列腺液、精液、淋巴液、胆汁、泪液、汗液、乳汁、乳房流体、胚胎细胞和胎儿细胞。在优选的实施方案中，所述生物样品是血液，并且更优选地是血浆。如本文使用的术语“血液”包括全血或任何血液级分，诸如，如常规地定义的血清和血浆。血液血浆是指由用抗凝剂处理过的血液的离心产生的全血级分。血液血清是指血液样品已经凝固后剩余的流体的水样部分。环境样品包括环境材料，诸如表面物质、土壤、水和工业样品，以及从食品和乳制品加工装置、仪器、设备、器具、一次性和非一次性物品获得的样品。这些实例不应解释为限制可应用于本发明的样品类型。

如本文使用的术语“靶序列”或“靶核酸序列”意图指待检测或测量其存在、或者待研究其功能、相互作用或特性的任何分子。因此，靶序列包括存在用于它的可检测探针(例如，寡核苷酸探针)或测定，或可以由本领域技术人员生产的基本上任何的分子。例如，靶序列可以是生物分子，诸如核酸分子、多肽、脂质或碳水化合物，其能够与可检测探针(例如抗体)结合或以其他方式发生接触，其中所述可检测探针还包含能够通过本发明的方法检测的核酸。如本文使用的“可检测探针”是指能够与目标靶生物分子杂交或退火且允许如本文所述的靶生物分子的特异性检测的任何分子或试剂。在本发明的一个方面，所述靶序列是核酸，且所述可检测探针是寡核苷酸。术语“核酸”和“核酸分子”可以在本公开全文互换使用。所述术语是指寡核苷酸、寡聚物、多核苷酸、脱氧核糖核苷酸(DNA)、基因组DNA、线粒体DNA(mtDNA)、互补DNA(cDNA)、细菌DNA、病毒DNA、病毒RNA、RNA、信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、siRNA、催化性RNA、克隆、质粒、M13、P1、粘粒、细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)、扩增的核酸、扩增子、PCR产物及其他类型的扩增的核酸、RNA/DNA杂交体和聚酰胺核酸(PNA)，所有这些可以呈单链或双链形式，并且除非另有限制，否则将包括可以以与天然存在的核苷酸类似的方式起作用的天然核苷酸的已知类似物，及其组合和/或混合物。因此，术语“核苷酸”是指天然存在的和修饰的/非天然存在的核苷酸，包括三、二和单磷酸核苷，以及在聚核酸或寡核苷酸内存在的单磷酸单体。核苷酸也可以是核糖；2'-脱氧；2',3'-脱氧以及本领域众所周知的大量其他核苷酸模拟物。模拟物包括链终止核苷酸，诸如3'-O-甲基，卤代碱基或糖取代；替代糖结构，包括非糖，烷基环结构；替代碱基，包括肌苷；脱氮修饰的；chi和psi，接头修饰的；质量标记修饰的；磷酸二酯修饰或替代，包括硫代磷酸酯，甲基膦酸酯，硼代磷酸酯(boranophosphate)，酰胺，酯，醚；和基本或完全的核苷酸间替代，包括切割连接，诸如光可切割的硝基苯基部分。

可以定量地或定性地测量靶序列的存在或不存在。靶序列可以以多种不同形式出现，包括例如简单或复杂混合物，或基本上纯化的形式。例如，靶序列可以是含有其他组分的样品的一部分，或可以是样品的唯一或主要组分。因此，靶序列可以是全细胞或组织的组分、细胞或组织提取物、其分级分离的裂解物，或基本上纯化的分子。另外，靶序列可以具有已知的或未知的序列或结构。

术语“扩增反应”是指用于扩增靶核酸序列的拷贝的任何体外方式。

“扩增”是指使溶液处于足以允许扩增的条件的步骤。扩增反应的组分可以包括但不限于例如引物、多核苷酸模板、聚合酶、核苷酸、dNTP等。术语“扩增”通常是指靶核酸的“指数”增加。然而，如本文使用的“扩增”还可以是指选定的靶核酸序列的数目的线性增加，但不同于一次性的、单引物延伸步骤。

“多重聚合酶链式反应(多重PCR)”指在一个PCR反应中，使用多对特异性引物对多个扩增子进行同时扩增。在本发明中，所述的多重通常指2-50重，较佳地2-10重，更佳地2-6重。

多重引物对和探针

在本发明中，所使用的多重引物对包括2个或更多个引物对。

在本发明中，用于扩增的多重引物对可包括2-50个引物对或2-30个引物对。通常，本发明多重PCR反应体系中含有2-15个引物对，较佳地2-10对，更佳地2-6个引物对。

在另一优选例中，所述的用于扩增的引物对中至少一个或多个或全部引物(优选全部引物)的长度为15-25bp，较佳地15-20bp，更佳地为15-18bp，最佳地为15-17bp。

在另一优选例中，所述的用于扩增的引物对包括多个引物对，且所有引物中各引物的Tm的最大值Tmax与各引物的Tm的最小值Tmin之间差值Δ＝0-5℃，较佳地Δ＝0-1℃。

在另一优选例中，所述引物对中只含有一个错配碱基。如本文所用，所述“引物对中只含有一个错配碱基”指第一引物对与第二引物对的序列除了一个引物相差1个碱基之外，完全相同。较佳地，所述的错配碱基位于3'端或位于引物的中间区域。

如本文所用“探针”是指与靶核酸通过杂交相互作用的核酸。探针可与靶核酸序列完全互补或部分互补。互补水平将取决于多种因素，通常是基于探针功能。探针可以本领域中熟知的多种方式中的任一种方式经标记或未标记，或经修饰。探针可与靶核酸特异性地杂交。探针可为DNA、RNA或RNA/DNA杂合体。探针可为寡核苷酸、人工染色体、片段化人工染色体、基因组核酸、片段化基因组核酸、RNA、重组核酸、片段化重组核酸、肽核酸(PNA)、锁核酸、环状杂环的寡聚体或核酸的偶联物。探针可包含经修饰核碱基、经修饰糖部分和经修饰核苷酸间连接。探针可用于检测甲基化靶核酸的存在或不存在。探针长度通常为至少约10、15、20、25、30、35、40、50、60、75、100个核苷酸或更长。

所述探针不限于水解探针，分子信标等特异性探针标记，优选水解探针。所述探针的5’端标记的荧光基团为选自FAM、HEX、CY5、TET、JOE、CY3、TAMRA、ROX中的任一种；所述探针的3’端标记的淬灭基团为选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcyl中的任一种。

多重PCR反应体系

采用本发明的多重PCR反应体系，可在常规的PCR反应条件下进行扩增。PCR扩增的反应体系包括单酶法或双酶法RT-qPCR RNA病毒检测；或使用qPCR进行DNA病毒检测。

RT-qPCR或qPCR包含的酶和蛋白包括DNA聚合酶，野生或改造的taqDNA聚合酶、野生或改造的Tth DNA聚合酶、野生或改造的MMLV、AMV等反转录酶；UNG酶和RNase酶抑制剂。

在本发明中，多重PCR反应体系含有待扩增的模板、用于扩增的引物对、聚合酶和用于进行聚合酶链式反应所需的试剂。

通常，所述的待扩增的模板是来源于各种不同生物体(包括病原体、细菌、哺乳动物如人)的总核酸提取物，例如基因组模板。

典型地，在多重PCR反应体系中，模板的浓度通常为0.1-10ng/微升，但是极低浓度核酸无法用紫外方式测量，通过稀释来计算模板的拷贝数，以数字PCR仪器精确定值。

在本发明的多重PCR反应体系中，所述引物对中各引物浓度没有特别限制。典型地，各引物的终浓度为0.05-1.0μM，较佳地为0.1-0.9μM，更佳地为0.3-0.6μM(约0.5μM)。

应理解，在本发明多重PCR反应体系中，可含有其他有助于进行聚合酶链式反应其他试剂或成分，例如包括(但并不限于)一种或多种选自下组的试剂：

(i)PCR缓冲液

(ii)dNTP

(iii)ddH₂O。

在本发明中，所述聚合酶链式反应体系的总体积没有特别限制，通常可以为10-200微升，较佳地20-100微升，更佳地25-50微升。

扩增方法及扩增产物

典型地，该扩增方法包括变性、退火和延伸步骤，并且包括20-50个循环，优选40个循环。

在另一优选例中，聚合酶链式反应的退火温度为T平均±5℃，较佳地为T平均±3℃，其中T平均为所有引物的Tm的算术平均值。

在另一优选例中，聚合酶链式反应的退火温度为55-70℃，较佳地为约60℃。

在本发明中，由于采用了特别优化的反应条件，因此，即使采用高达3个或更多个引物对，仍可高效准确地扩增出全部所需的扩增产物，且可有效抑制了引物二聚体和其它非特异性产物的形成。

在本发明中，所述扩增产物包括分别对应于所述引物对的n种扩增产物。通常，在本发明的反应混合物中，所述n扩增产物中扩增量最大的扩增产物A与所述n扩增物中扩增产量最小的扩增产物的扩增量之比为2-20:1，较佳地3-10：1，更佳地为4-6：1(如约5:1)。

在另一优选例中，所述扩增产物包括分别对应于所述引物对的n种扩增产物，且任意两个扩增产物的长度相差一定长度，例如长度之差≥10bp，较佳地≥30bp(较佳地10-500bp)。

在另一优选例中，所述各扩增产物的长度为10-300bp，较佳地为50-200bp，更佳地为50-150bp。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1 989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1.RNA病毒检测实施例：

1.所用试剂：

RT-qPCR预混液：

Probe 1-step RT-qPCR 5G Premix(TOROIVD，QPR-300)

2.检测RNA靶标：

新型冠装病毒体外转录RNA标准物质(低浓度，编号GBW(E)091111)，其中N基因：2.4×10⁵copies/ul；E基因1.8×10⁵copies/ul；ORF1ab基因：0.70×10⁵copies/ul。稀释倍数为10⁴和10⁶两个浓度。

引物和探针序列：

扩增子一：(CDC公布)

ORF1ab-F：5`-CCCTGTGGGTTTTACACTTAA-3`

ORF1ab-R：5`-ACGATTGTGCATCAGCTGA-3`

ORF1ab-P:5`-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-3`BHQ1

扩增子二：(CDC公布)

N-F:5`-GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT-3`

N-R:5`-CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG-3`

N-P:5`-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-3`TAMRA

扩增子三：(WHO公布)

E-F：5`-ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT-3`

E-R：5`-ATATTGCAGCAGTACGCACACA-3`

N-P:5`-FAM-ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG-3`BHQ1

各引物探针混合液配制方法：引物探针稀释到40uM作为工作液，将上下游引物各250ul与探针100ul混合配成引物探针混合液。

体系配制：

三重引物探针体系配制

将如上总管分装成12管，各加入5ul模板(含3个高浓度模板，6个低浓度模板及3个NTC)。

单引物探针-N/E/ORF1ab

5.循环程序，使用CFX96

6.结果：

RNA模板稀释10⁴检测结果。

从上表数据和图2可以看出，通过多片段扩增在10⁴稀释RNA模板，表现出Ct值明显降低和荧光值明显增高的效果。

RNA模板稀释10⁶检测结果。

从上表数据和图3可以看出，当模板稀释到1个copies左右时，用单引物和探针其检测灵敏度非常低，在33.33％-50％左右。但是我们通过MSSM qPCR技术的单通道三探针和引物混合后，检测灵敏度依然达到100％。

实施例2DNA病毒检测实施例：

所用试剂：

定量PCR预混液：

5G qPCR Premix(TOROIVD，QPT-200)

2.检测DNA靶标：

使用非洲猪瘟病毒(AFSV)B636L基因(编码VP72蛋白)的质粒(浓度为4.05×10⁵copies/ul；稀释倍数为10⁶和0.5×10⁶两个浓度。

3.引物和探针序列：

采用世界动物卫生组织(OIE)提供的两对引物探针组合：

扩增子一：(OIE公布)

OIE-F：5'-CTGCTCATGGTATCAATCTTATCGA-3'

OIE-R：5'-1857-GATACCACAAGATCRGCCGT-3'

OIE-P：5'-FAM-CCACGGGAGGAATACCAACCCAGTG-TAMRA-3'

扩增子二：(OIE公布)

VP72-F：5’-CCCAGGRGATAAAATGACTG-3’

VP72-R：5’-CACTRGTTCCCTCCACCGATA-3’

VP72-P：5-’FAM-TCCTGGCCRACCAAGTGCTT3’-BHQ

各引物探针混合液配制方法：引物到稀释到10uM作为工作液，探针稀释5uM作为工作液。让将各28.8ul的OIE-F和OIE-R上下游引物和57.6ul的OIE-P探针，混匀离心后分为2份，每份52.8ul。让将各14.4ul的VP72-F和VP72-R上下游引物和57.6ul的VP72-P探针，混匀离心后分为2份，每份52.8ul。由此配成两种引物探针混合液。

4.体系配制：

双重引物探针

单重OIE探针和引物

单重VP72探针和引物

将如上各分装15管，分别加入4ul 106和0.5×106稀释的非洲猪瘟病毒B636L模板各6各复孔，并设置3各复孔作为无模板对照。

5.循环程序，使用CFX96

阶段	温度	时间	循环数
				预变性	95℃	1-5min	1
变性	95℃	10s	45
				退火延伸	60℃	20s	45	信号收集

6.结果：

1.62拷贝/反应DNA模板检测结果。

从上表数据和图4以上数据可以看出，1.62copies左右时采用双重混合引物和探针大大增强了扩增信号，同时灵敏度从83.3％提高到100％。

0.81拷贝/反应DNA模板检测结果。

从上表数据和图5可以看出1.62copies左右时采用双重混合引物灵敏度从50％和33.3提高到83.3％。0.81copies/反应在统计学理论上为81％的单copies基因，而双重混合引物探针灵敏度为83.3％，符合统计学意义，所以本发明使得单copies DNA模板高稳定扩增。

实施例3与华大基因SARS-CoV-2检测试剂盒灵敏度对比

采用COVID-19-pseudovirus(2019-nCOV假病毒)(Yeasen)，病毒拷贝数为1.21×10⁸copies/mL，将溶液先按10⁵，10⁶稀释，再将10⁶稀释液进行2倍稀释两个梯度得到1210copies/mL，121copies/mL，60.5copies/mL及30.3copies/mL的模板。各取200ul用病毒核酸提取试剂(Favorgen)进行核酸提取得到50ul RNA模板，设置三个重复。

采用华大基因SARS-CoV-2检测试剂盒及实施案例一的反应体系，每个反应体系加入5ul模板，按各自实验流程进行检测。得到如下结果(表1)：

表1.

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质。

Claims

1.一种极低载量病原微生物的超灵敏定量PCR检测技术，其包含以下步骤：

a.依据已公开的同一目的病原微生物基因序列，选取2个以上目标扩增区域序列，设计2对以上的特异性引物对和探针，所述探针为同一波长荧光基团标记，所述目标扩增区域序列为该病原微生物的特异性基因序列，且目标扩增区域序列不重叠；

b.采集样品，抽提核酸；

c.采用步骤a所述特异性引物对和探针，以上述样品核酸为模板，进行PCR扩增；

同时，模板可为样品采集液或样品采集裂解液。

2.如权利要求1所述的超灵敏定量PCR检测技术，其特征在于所述探针的5’端标记的荧光基团为FAM、HEX、CY5、TET、JOE、CY3、TAMRA、ROX中的一种。

3.如权利要求2所述的超灵敏定量PCR检测技术，其特征在于所述探针的所述探针的3’端标记的淬灭基团为BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcyl中的任一种。

4.如权利要求1所述的超灵敏定量PCR检测技术，其特征在于所述病原微生物为寄生虫、真菌、细菌、螺旋体、支原体、立克次体、衣原体、或病毒。

5.如权利要求1所述的超灵敏定量PCR检测技术，其特征在于所述病原微生物为病毒。

6.如权利要求5所述的超灵敏定量PCR检测技术，其特征在于所述病毒为SRAS-CoV-2或AFSV。

7.如权利要求1所述的超灵敏定量PCR检测技术，其特征在于所述探针不为水解探针。

8.一种极低载量病原微生物的多重PCR试剂盒，所述试剂盒包含：

特异性扩增多种靶序列的2对以上引物对和探针，所述探针为同一荧光波长染料标记，每类引物对和探针可分别独立包装或混合包装；以及聚合酶链式反应其他试剂或成分和使用说明书。

9.如权利要求8所述的多重PCR试剂盒，其特征在于所述探针的5’端标记的荧光基团为FAM、HEX、CY5、TET、JOE、CY3、TAMRA、ROX中的一种；所述探针的3’端标记的淬灭基团为BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcyl中的任一种。

10.如权利要求8所述的多重PCR试剂盒，其特征在于所述病原微生物为SRAS-CoV-2或AFSV。