CN115029462B - 一种动植物疫病的核酸标准物质、形貌模拟方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种动植物疫病的核酸标准物质、形貌模拟方法及其应用，涉及生物参数测量及分子诊断技术领域。通过PCR扩增，使得带有接头的动物疫病病原体或植物疫病病原体的检测目的基因片段整合到目标动植物的基因组核酸中，模拟出感染动植物疫病后的动植物材料形貌，以此制备出相对稳定的动物疫病或植物疫病的核酸标准物质的候选材料，以期进一步通过筛选获得动物疫病或植物疫病的核酸标准物质。该方法可以广泛应用于多种动物疫病或植物疫病的核酸标准物质制备，解决了原始材料获取难的“卡脖子”问题，对于生物安全的预警、防控、监管与检测具有重要意义。

Description

一种动植物疫病的核酸标准物质、形貌模拟方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物参数测量及分子诊断技术领域，具体而言，涉及一种动植物疫病的核酸标准物质、形貌模拟方法及其应用。
背景技术
农业生物安全定义为：指有效防范由各类生物因子和生物技术误用滥用对农业生产和生态环境所造成的威胁与伤害，特别是高度危险性人兽共患病、动物疫病、植物病虫害和外来生物的致灾性。针对农业生物安全的预警、防控、监管与检测，需依赖行之有效的检测方法与标准物质。
我国已有开展核酸标准物质研究已有十余年的历史，主要由计量机构及农业研究机构开展了核酸标准物质的研究。目前，发布的植物标准物质种类主要是基体、基因组DNA和质粒DNA三种形式。
其中，基体和基因组DNA均来自于植物材料本身，和待测样本具备较高的一致性，较为受到欢迎。质粒DNA标准物质能是将检测片段，包括检测目标基因和内源基因，克隆到质粒上，组织重组质粒作为标准品，但质粒DNA的结构、分子量和基因组DNA的结构、分子量差异较大，且质粒分子易产生气溶胶，核酸拷贝数受到管壁吸附及冻融的影响，但是测量偏差（不确定度）较大。
同样地，动物疫病安全指有效防范由各类生物因子和生物技术误用滥用对动物所造成的威胁与伤害，特别是高度危险性人兽共患病、动物疫病、动物病虫害和外来生物的致灾性。针对动物疫病安全的预警、防控、监管与检测，需依赖行之有效的检测方法与标准物质。
动/植物疫病检测技术方法国家、行业标准已有百余项，但标准物质的缺乏已成为制约动/植物疫病检测技术发展和检测机构建设的瓶颈问题之一。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种动植物疫病的核酸标准物质、形貌模拟方法及其应用以解决上述技术问题。
本发明是这样实现的：
本发明提供了一种制备动物疫病或植物疫病的核酸标准物质的形貌模拟方法，其包括如下步骤：将两端带有接头的动物疫病病原体或植物疫病病原体的检测目的基因片段与目标动物或目标植物的基因组核酸混合，通过高低温切换反应使得带有接头的检测目的基因片段整合到目标动物或目标植物的基因组核酸中从而获得核酸混合物，然后进行PCR验证；
PCR验证是以核酸混合物为模板，以检测目的基因的检测引物和探针对模板进行PCR获得第一产物，以目标动物或目标植物的内标基因的检测引物和探针对模板进行PCR获得第二产物，分别检测第一产物和第二产物的拷贝数，并将第一产物和第二产物进行混合。
检测目的基因片段两端的接头与目标动物或目标植物的基因组核酸通过碱基互补匹配。
在一种可选的实施方式中，调整检测目的基因片段与目标动物或目标植物的基因组核酸的混合质量比，至第一产物与第二产物的拷贝数比例接近或等于检测试剂或试剂盒中要求的比例。
发明人提供了一种动植物疫病的核酸标准物质的形貌模拟新思路，通过对检测目的基因片段和植物的基因组核酸的混合物进行PCR，分别检测检测目的基因和内标基因的含量，通过调整检测目的基因片段与目标植物的基因组核酸的混合质量比，直至接近或达到目标动物或目标植物含检测的目的基因片段的比例，从而根本上模拟原始感染动植物疫病后的动植物形貌特征。例如，当目标动物或目标植物含检测的目的基因片段的比例为100%，则通过调整检测目的基因片段与目标动物或目标植物的基因组核酸的混合质量比，使得第一产物与第二产物的拷贝数比例接近或达到100%，从而获得动植物疫病的核酸标准物质。
该方法通过高低温切换反应，使得带有接头的检测目的基因片段整合到目标动物或目标植物的基因组核酸中，模拟出原始感染动植物疫病后的动植物形貌特征，以此制备出相对稳定的动植物疫病的核酸标准物质的候选材料，以期进一步通过筛选获得动植物疫病的核酸标准物质。
本发明提供的方法可以广泛应用于多种动植物疫病的核酸标准物质制备，解决了原始材料获取难的“卡脖子”问题。
此外，本发明提供的方法，还可以规避现有的质粒DNA的结构、分子量和基因组DNA的结构、分子量差异较大的问题，也可以规避气溶胶的问题，通过标准物质，可以开发相应的检测试剂或试剂盒，受核酸标准物质形貌模拟的真实性影响，本发明提供的方法极大程度上提升了检测准确度。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述形貌模拟方法还包括获得两端带有接头的动物疫病病原体或植物疫病病原体的检测目的基因片段，其包括：
根据动物疫病病原体或植物疫病病原体的检测目的基因片段的全长序列，设计并筛选出扩增全长序列的正向引物和反向引物，然后在正向引物和反向引物的两端添加接头以与目标动物或目标植物的基因组核酸通过碱基互补匹配，通过分子克隆的方法或基因合成的方法获得两端带有接头的转基因植物的检测目的基因片段。
动物疫病病原体或植物疫病病原体的检测目的基因片段的全长序列可以通过现有的信息索引网址或书籍等媒介获得。
在其他实施方式中，也可根据农业微生物基因组序列数据库获得，可以包括细菌，真菌等微生物基因序列。同样也可以基于现有的动物或植物疫病的微生物资源平台采集得到的微生物并对其进行测序得到检测目的基因序列。
扩增全长序列的上游扩增引物和下游扩增引物需要经过筛选，确保上下游扩增引物能够扩增到预期片段。例如通过琼脂糖凝胶电泳验证或测序验证。
添加接头的方式可以直接由测序公司将接头的序列和引物合成。上述上游扩增引物的接头和下游扩增引物的接头序列不同。
在本发明应用较佳的实施方式中，以两端添加接头的正向引物和反向引物对检测目的基因片段进行扩增。
在检测目的基因片段加上接头的目的是可以通过反复退火（PCR扩增），将加了接头的检测目的基因片段两端与目标动植物的基因组结合，提高稳定性。经发明人验证，加了接头的标准物质比不加接头的标准物质的相对标准偏差更小，即加了接头的标准物质更稳定。
在一种可选的实施方式中，将扩增获得的扩增产物连接T载体，通过大肠杆菌复制质粒、酶切质粒获得两端带有接头的动物疫病病原体或植物疫病病原体的检测目的基因片段。
在本发明应用较佳的实施方式中，接头的长度为20bp-25bp。例如21bp，22bp，23bp，24bp，24bp或25bp。
在本发明应用较佳的实施方式中，目标植物包含单子叶植物或双子叶植物；
在一种可选的实施方式中，目标植物包含来自禾本目(Poales)、石竹目(Caryophyllales)、茄目(Solanales)、豆目(Fabales)、锦葵目(Malvales)、伞形目(Apiales)、十字花目(Brassicales)、天门冬目(Asparagales)、薯蓣目(Dioscoreales)、葫芦目、蔷薇目、无患子目、山茱萸目、杜鹃花目、龙胆目、凤梨目、兰目、南天星目、棕榈目、山茶目、菊目、亚麻目、鼠李目、睡莲目或百合目(Liliales)的植物；
在一种可选的实施方式中， (a)当目标植物包含来自禾本目的植物时，植物选自以下属：稻属(Oryza)、大麦属(Hordeum)、燕麦属(Avena)、玉蜀黍属（Zea mays L）和小麦属(Triticum)；
稻属(例如水稻(Oryza sativa)和光稃稻[稻谷])、大麦属(例如大麦[Hordeumvulgare])、燕麦属(例如燕麦[Avena sativa]、毛燕麦(Avena strigosa))和小麦属(例如斯佩耳特小麦[Triticum spelta])。
(b)当目标植物包含来自石竹目的植物时，植物选自以下属：菠菜属(Spinacia)、藜属(Chenopodium)、甜菜属(Beta genus)、大黄属(Rheum)、麦蓝菜属(Vaccaria)、肥皂草属(Saponaria)和石头花属(Gypsophila)；
菠菜属(例如菠菜(Spinacia oleracea))、藜属(例如奎奴亚藜(Chenopodiumquinoa))、甜菜属(例如甜菜(Beta vulgaris))、大黄属(例如大黄(Rheum hybridum)、食用大黄(Rheum rhaponticum)、波叶大黄(Rheumrhabarbarum)、穗序大黄(Rheum ribes))、麦蓝菜属(例如麦蓝菜(Vaccaria hispanica))、肥皂草属(王不留行(Saponaria vaccaria))和石头花属(圆锥石头花(Gypsophilapaniculata))。在一些实施方案中，石竹目植物选自菠菜、甜菜根和奎藜籽。
(c)当目标植物包含来自茄目的植物时，植物选自以下属：茄属(Solanum)、辣椒属(Capsicum)、烟草属(Nicotiana)、莨菪属(Hyoscyamus)、曼陀罗属(Datura)和颠茄属(Atropa)；
烟草属(例如，本赛姆氏烟草(Nicotiana benthamiana))、茄属(例如，番茄(Solanum lycopersicum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、茄子(Solanummelongena)、潘那利番茄(Solanum pennellii)、查科茄(Solanum chacoense)、欧白英(Solanumdulcamara))；
辣椒属(例如辣椒(Capsicum annuum))。在一些实施方案中，茄科或茄目植物选自地樱桃、茄子、马铃薯、番茄、野生番茄、马铃薯、野生马铃薯、胡椒、甜椒、卡宴辣椒、红辣椒、甘椒、塔巴斯科辣椒、烟草和南蛇藤。
(d)当目标植物包含来自豆目的植物时，植物选自以下属：甘草属(Glycyrrhiza)、苜蓿属(Medicago)、大豆属(Glycine)、百脉根属(Lotus)、鹰嘴豆属(Cicer)、菜豆属(Phaseolus)、豌豆属(Pisum)、花生属(Arachis)、羽扇豆属(Lupinus)和金合欢属(Acacia)；
甘草属(例如，甘草(Glycyrrhiza uralensis)、甘草(Glycyrrhiza glabra))、苜蓿属(例如，紫苜蓿(Medicago sativa)、蒺藜状苜蓿(Medicago truncatula))、皂皮树属(例如皂树(Quillajasaponaria))、大豆属(例如橹豆[大豆/黄豆])、百脉根属(例如百脉根(Lotusjaponicus))、鹰嘴豆属(例如鹰嘴豆[鸡豆、鹰嘴豆])、菜豆属(例如菜豆[四季豆、刀豆、芸豆])、豌豆属(例如豌豆[Pisum sativum])、落花生属(如花生[Arachis hypogaea])、羽扇豆属(例如，白羽扇豆[羽扇豆/羽扇豆蓝])和金合欢属(Acacia)。在一些实施方案中，豆目植物选自紫苜蓿、大豆、百脉根和甘草。
(e)当目标植物包含来自锦葵目的植物时，植物选自可可属(Theobroma)；例如可可树。
(f)当目标植物包含来自伞形目的植物时，植物选自以下属：胡萝卜属(Daucus)、芹属(Apium)、香芹菜属(Petroselinum)、人参属(Panax)、柴胡属(Bupleurum)、常春藤属(Hedera)和积雪草属(Centella)；
胡萝卜属(例如，胡萝卜(Daucus carota))、芹属(例如，旱芹(Apiumgraveolens))、香芹菜属(例如香芹(Petroselinum crispum))、人参属(例如高丽参(Panaxginseng))、柴胡属(Bupleurum)、常春藤属(Hedera)和积雪草属(例如积雪草(Centellaasiatica))。
(g)当目标植物包含来自十字花目的植物时，植物选自以下属：拟南芥属(Arabidopsis)、芸苔属(Brassica)、山柑属(Capparis)和番木瓜属(Carica)。
腰果属(例如，腰果，拟南芥(Arabidopsis thaliana))、芸苔属(例如，甘蓝[卷心菜]、芥菜[白芥]、黑芥菜(Brassica nigra)、西洋油菜(Brassica napus))、山柑属(例如续随子[刺山柑])和番木瓜属(例如番木瓜[Carica papaya])。
在一种可选的实施方式中，目标植物包括不限于：
柑橘、小麦、水稻、大麦、燕麦、玉米、高粱、谷子、荞麦、黍稷、甘薯、马铃薯、棉花、油菜、芝麻、花生、向日葵、萝卜、胡萝卜、花椰菜、番茄、茄子、辣椒、韭菜、大葱、洋葱、韭葱、菠菜、芹菜、糖甜菜、苋菜、莴苣、茼蒿、黄花菜、葡萄、草莓、甘蔗、烟草、芸薹属蔬菜、葫芦科植物、豆科植物、牧草、茶或木薯。
在本发明应用较佳的实施方式中，牧草包括不限于禾本科牧草或豆科牧草。
在本发明应用较佳的实施方式中，芸薹属蔬菜包括不限于芜菁、白菜、芥菜、甘蓝、芥蓝、菜苔、苦芥、擎蓝、芸苔、青菜或甜菜。
在本发明应用较佳的实施方式中，葫芦科植物包括不限于黄瓜、西葫芦、南瓜、冬瓜、苦瓜、丝瓜、菜瓜、西瓜或甜瓜。
在本发明应用较佳的实施方式中，豆科植物包括不限于绿豆、蚕豆、豌豆、扁豆、大豆、菜豆、豇豆或毛豆。
在一种可选的实施方式中，上述植物选自下组：非洲小米(fonio)、帕尔默草(Palmer’s grass)、黑麦、珍珠粟、斯佩耳特小麦(spelt)、埃塞俄比亚画眉草(teff)、黑小麦、面包果、荞麦、香蒲、芡欧鼠尾草(chia)、亚麻、籽粒苋、邯杂(hanza)和藜麦。
在本发明应用较佳的实施方式中，目标动物为：脊椎动物或无脊椎动物；
在一种可选的实施方式中，脊椎动物为鱼类、爬行类、鸟类、两栖类或哺乳类动物；无脊椎动物为原生动物、腔肠动物、腐性动物、线性动物、环节动物、软体动物、节肢动物、蠕虫、棘皮动物或甲壳动物。
在一种可选的实施方式中，脊椎动物选自人、绵羊、牛、马、山羊、鹿、家禽、猪、猫、狗、猴和鼠。
在本发明应用较佳的实施方式中，高低温切换反应是指：95℃ 20-30s，4℃ 20-30s，20-25个循环。在上述反应条件下可以很好的实现将带有接头的检测目的基因片段整合到目标动物或目标植物的基因组核酸中。
PCR验证时对模板进行PCR的程序包括：94-98℃，10-30s；50-58℃，30-60s；共20-50个循环。
在一种可选的实施方式中，在94-96℃，1-10min；94-95℃，20-30s；55-58℃，30-60s；共20-40个循环。
植物疫病检测目的基因的检测引物和探针的终浓度比值为3-5:1，植物疫病内源目的基因的检测引物和探针的终浓度比值为3-5:1。
在上述引物探针比例下，阳性微滴和阴性微滴都分开的较为清晰，“下雨”现象均不严重。在一种可选的实施方式中，采用引物探针浓度比为 3:1作为检测用量。
优选地，动物疫病检测目的基因的检测引物和探针的终浓度比值为2-4:1，动物疫病内源目的基因的检测引物和探针的终浓度比值为2-4:1。在上述引物探针浓度下具有更好的检测效果。
在本发明应用较佳的实施方式中，动物疫病或植物疫病来源于如下至少一种的病原体：细菌、病毒、立克次体、支原体、衣原体、螺旋体、真菌、放线菌和朊粒。
上述细菌包括但不限于气芽孢杆菌、西瓜嗜酸菌，柑桔溃疡病菌，鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumanii)、洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)、脆弱拟杆菌(Bacterioides fragilis)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、大肠杆菌(Escherichia coli)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)、乙型流感嗜血杆菌(Haemophilus inf b)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、肺炎克雷伯氏菌(K.pneumonia)(MDR/CRE)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitides)、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、副伤寒杆菌(paratyphi)、鼠伤寒杆菌(typhimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、福氏志贺菌(Shigella flexneri)、嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、假结核耶尔森菌(Yersinia pseudotuberculosis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、新型梭菌(Clostridium neoformans)、艰难梭菌(C.difficile)、产气荚膜梭菌(C.perfringens)、棒状杆菌(Corynebacterium spp)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、耐万古霉素肠球菌(VRE)(vancomycin-resistantEnterococci)、单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、鸟分枝杆菌(Mycobactrium avium)、结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、麻风杆菌(M.leprae)、皮疽诺卡菌(Nocardia farcinica)、痤疮丙酸杆菌(P.acnes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(MSSA)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、A群链球菌(Strep)、B群链球菌(无乳链球菌)和C群链球菌；
立克次体包括但不限于：普氏立克次体、莫氏立克次体、康氏立克次体、黑龙江立克次体、立氏立克次体、西伯利亚立克次体、查菲埃立克体、犬埃立克体、恙虫病东方体和贝氏柯克斯体；
病毒包括但不限于登革热病毒(Denguevirus)、埃博拉病毒(Ebola virus)、EBV、甲型肝炎病毒(Hepitis A virus)、乙型肝炎病毒(Hepitis B virus)、丙型肝炎病毒(Hepitis C virus)、丁型肝炎病毒(Hepitis Dvirus)、HSV 1、HSV 2、HIV、巨细胞病毒(CMV)、甲型流感病毒(Influenza A virus)、马尔堡病毒(Marburg virus)、人呼吸道合胞病毒(RSV)、SARS冠状病毒(SARS-CoV)、西尼罗河病毒(West Nile virus)、人乳头瘤病毒(HPV)、人鼻病毒(HRV)和寨卡病毒(Zica virus)；
真菌包括但不限于曲霉菌(Aspergillusspp)、芽生菌属(Blastomyces)、白色念珠菌(Candida albicans)、glabrata、guilliermondii、krusei、parapsilosis、tropicalis、隐球菌属(Cryptococcus)、镰刀菌(Fusarium spp.)、毛霉菌(Mucor spp.)、酵母属(Saccharomyces)和耶氏(卡氏)肺孢子虫(Pneumocystis jirovecii(carinii))；
支原体包括但不限于肺炎支原体、人型支原体和口腔支原体。
衣原体包括但不限于沙眼衣原体、肺炎衣原体、鹦鹉热衣原体、鼠型沙眼衣原体和猪衣原体。
螺旋体包括但不限于梅毒密螺旋体、雅司螺旋体、品他病密螺旋体、地方性病梅毒螺旋体、伯氏包氏螺旋体、赫姆斯包柔螺旋体或问号钩端螺旋体。
放线菌是包括但不限于链霉菌属的放线菌。例如选自鼠灰链霉菌、纤维黄链霉菌、灰链霉菌。
朊粒包括但不限于牛PRP、人脑PRP。
在一种可选的实施方式中，动物疫病为：人兽共患病、动物疫病或动物病虫害。
在一种可选的实施方式中，动物疫病来源于如下至少一种的病原体：动物布鲁氏菌、牛结核分枝杆菌、金黄色葡萄球菌、狂犬病毒、猪链球菌2型、炭疽芽胞杆菌、沙门氏菌、非洲猪瘟病毒、新冠病毒、流感病毒、HPV病毒、乙肝病毒、人免疫缺陷病毒、SARS、MERS、登革热病毒、禽流感、埃博拉和大肠杆菌。
植物疫病来自植物细菌病害、植物真菌病害、植物土传病害和/或根结线虫病害。
在一种可选的实施方式中，根结线虫病害包括不限于南方根结线虫（Meloidogyneincognita）、北方根结线虫（Meloidogyne hapla）、爪哇根结线虫（Meloidogyne javanica）和/或花生根结线虫引起的结线虫病害。
植物细菌病害包括不限于亚洲韧皮杆菌、青枯劳尔氏菌、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、猕猴桃溃疡病菌(Pseudomonas syringae)、水稻白叶枯病菌(Xanthomonascampestris)、白菜软腐病菌(Erwiniacarotorora)、核桃黑斑病菌(Xanthomonascampestris)、魔芋软腐病菌(Erwiniacarotovora)和/或金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)引起的细菌病害。例如亚洲韧皮杆菌引起的亚洲柑橘黄龙病。
植物真菌病害或植物土传病害包括不限于由立枯丝核菌、镰刀菌、油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)、番茄灰霉病菌(Botrytis cirerea)、黄瓜枯萎病菌(Fusari umoxysporum.sp.cucumebrium Owen)、小麦全蚀病菌(Gaeumannomycescritici)、小麦赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、苹果树腐烂病菌(Valsamali)、苹果炭疽病菌(Glomerellacingulata)、水稻纹枯病菌(Rhizoctoniasolan)、稻瘟病菌(Pyriculariagrisea)、番茄早疫病菌(Alternariasolani)、草莓灰霉病菌(Botrytis cirerea)、马铃薯晚疫病菌(Phytophthorainfestans)、玉米大斑病菌(Exserohilumturcicum)、玉米小斑病菌(Bipolariamaydis)、西瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.niveum)、茄子黄萎病菌(Verticilliumdahliae)、棉花枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.vasinfectum)、辣椒疫霉病菌(Phytophthoracapsici)和/或烟草疫霉病菌(Phytophthoranicotianae)引起的植物病害。
本发明还提供了一种由上述形貌模拟方法制得的动物疫病或植物疫病的核酸标准物质。
上述核酸标准物质的形态包括不限于粉剂、液体制剂、颗粒剂、悬浮液、乳浊液或半乳液。
本发明还提供了一种试剂或试剂盒，其包括上述的动物疫病或植物疫病的核酸标准物质。
在一种可选的实施方式中，上述试剂或试剂盒还包括保存剂、防腐剂等助剂。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种获取动植物疫病的核酸标准物质的新思路，通过对检测的目的基因片段和目标动物或植物的基因组核酸的混合物进行PCR，分别检测检测目的基因和内标基因的含量，通过混合第一产物和第二产物，从而根本上模拟原始感染动植物疫病后的动植物的形貌特征。
该方法通过PCR扩增，使得带有接头的动物疫病病原体或植物疫病病原体的检测目的基因片段整合到目标动植物的基因组核酸中，模拟出原始感染动植物疫病后的动植物材料形貌，以此制备出相对稳定的动物疫病或植物疫病的核酸标准物质的候选材料，以期进一步通过筛选获得动物疫病或植物疫病的核酸标准物质。
本发明提供的方法可以广泛应用于多种动物疫病或植物疫病的核酸标准物质制备，解决了原始材料获取难的“卡脖子”问题，对于生物安全的预警、防控、监管与检测具有重要意义。
此外还提供了相应的试剂和试剂盒。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为制备植物疫病的核酸标准物质的形貌模拟方法技术路线图；
图2为带接头的重组质粒酶切鉴定电泳图；
图3为亚洲黄龙病采用不同引物探针浓度组合进行ddPCR的扩增曲线图；
图4为柑橘内源基因采用不同引物探针浓度组合进行ddPCR的扩增曲线；
图5为不同退火温度下检测基因ddPCR的扩增曲线；
图6为不同退火温度下内源基因ddPCR的扩增曲线；
图7为柑橘黄龙病菌ddPCR的特异性检测扩增曲线图（左边为柑橘黄龙病菌检测；注：1-9分别为：患柑橘黄龙病柑橘，健康的柑橘，大肠杆菌，西瓜嗜酸菌，柑桔溃疡病菌，放线菌，气芽孢杆菌，酵母菌，H2O；
图8为柑橘内源基因ddPCR的特异性检测扩增曲线图；1-11分别为：阴性柑橘，阳性柑橘，鸡爪槭，漆树，桐树，玉米，水稻，南天竹，大豆，枫树，H2O；
图9为制备动物疫病的核酸标准物质的形貌模拟方法技术路线图；
图10为带接头的靶标基因重组质粒酶切鉴定电泳图。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
除非另外指明，否则实践本发明将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术，如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》，第二版(Sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)》(M.J.Gait编，1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编，1987)；《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社有限公司(Academic Press，Inc.)；《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；《哺乳动物细胞用基因转移载体(Gene Transfer Vectors forMammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编，1987)；《当代分子生物学方法(CurrentProtocols in Molecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编，1987)；《PCR:聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编，1994)；以及《当代免疫学方法(Current Protocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编，1991)，所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例以亚洲柑橘黄龙病为例，分别进行亚洲柑橘黄龙病靶标基因的克隆、柑橘叶片基因组DNA的提取及两种材料的整合和测试。形貌模拟技术路线参照图1所示，如下为亚洲柑橘黄龙病靶标基因的克隆步骤。
采用如下所述的实验材料：
（1）DNA片段材料
本发明中涉及的柑橘材料为染病及非染病（健康）柑橘材料，目标DNA片段通过及基因合成技术获得。
（2）实验仪器
分光光度计： Nanodrop 核酸蛋白测定仪（美国 Thermo 公司)；
离心机：TG16W (湖南平凡科技有限公司)；
定性PCR仪：BioRad T100 ThermalCycler；
数字PCR仪：Automated Droplet Generator、BioRad QX 200；
涡旋仪：MV-100 (武汉塞维尔生物科技有限公司)；
金属浴：GT20401 (莫纳生物科技有限公司)；
洁净工作台：SCB-1360 (北京东联哈尔仪器制造有限公司)；
电子天平：XJ3200C (上海天美天平仪器有限公司)。
1. 先进行靶标基因（即检测目的基因）片段的制备。
生物信息学分析。
发明人以亚洲柑橘黄龙病为例，亚洲柑橘黄龙病菌的16S rDNA基因序列来自NCBI数据库。依据国内外检测标准及文献报道的检测方法，截选序列能覆盖上述扩增片段的序列，共698 bp（下称为asi），左右加入BamHI/ HindIII酶切位点（用于酶切制备目的片段），序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成进入目标载体为pUC57，称为pUC57-asi，将所构建的重组质粒转入感受态的大肠杆菌DH5α(Amp抗性)菌株中。
经生工测序，证明所合成的序列100%正确。
2 .加接头的引物设计及扩增。
将黄龙病菌DNA的698 bp扩增子的引入F和R两端加上柑橘基因组接头，上下游各20个碱基，目的是可以通过反复退火，将加了接头的片段两端与柑橘基因组结合，提高稳定性。
Adapter-F/R（接头（下划线）是指正反引物上各有20个碱基与柑橘基因组DNA上的某个基因互补），外侧分别加入BamHI/HindIII酶切位点，序列如下：
Adapter-F: 5'-ggatccGAAACCCACGCTTCTCTTTCAGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3'；
Adapter-R: 5'- aagcttCCATAAAGAAGCTCCAATTGCTCAGCGTCAGTATCAGGCC-3'。
用上述引物克隆目的片段，连接入pET-42a(+)载体，质粒称为pET-asi，用BamHI/HindIII酶对asi进行酶切，电泳检测结果图2所示，第一泳道为Marker，第二泳道为质粒，第二泳道目的片段asi的酶切产物。结果符合预器。
3.进行质粒DNA的序列验证及酶切制备。
经华大基因有限公司、北京擎科新业生物技术有限公司和生工生物工程(上海)股份有限公司联合验证。将测序结果在NCBI上进行blast比对，质粒DNA标准物质的插入序列与设计克隆的片段完全相符，正确率为100%。
将pUC57-asi和pET-asi的宿主菌在合适的条件下培养，以获取大量质粒DNA。BamHI/HindIII酶切质粒及大量制备目的片段（asi）及带接头Adapter的片段(asi-adapter)。
4.带目的DNA标准物质的纯度验证。
在DNA纯度验证方面，通过紫外分光光度法进行鉴定，通过测出样品在230 nm、260nm和280 nm紫外光下的吸光度，比较A260/A230，A260/A280的值，结果显示，A260/A280大于1.8小于2.0，A260/230大于2.0，证明所提取的质粒DNA多肽，碳水化合物，盐成分，RNA等杂质较少，纯度高，可以用于标准物质的后续制备。
实施例2
本实施例进行植物基因组DNA提取与质量检测：
提取健康柑橘叶片及染黄龙病的柑橘叶片。
前期经预试验，筛选出较为合适植物基因组DNA大量提取方法，为改良的CTAB法。具体方法如下：
1）取3g新鲜的柑橘叶片，避开叶脉部分，将叶片剪碎放入研钵中，加入液氮，快速研磨成粉末。
2）将粉末转入50 mL的离心管中， 加入20mL先前配置好的并且在65℃的水浴锅中预热的 CTAB提取液, 充分颠倒混匀后，在70 ℃水浴锅中水浴1 h30min。
3）取出冷却至室温，加入等体积的DNA提取液=25：24：1，颠倒混匀10此，静置3min使之乳化10 min后于4 ℃，10 000 r/min的冷冻离心机中离心15 min。
4）小心取出离心管，用移液器将上清液转入新的50 mL离心管中。
5）可将3，4步骤多重复几次，直到两项分层的溶液中间没有肉眼可见的杂质。
6）用移液器将上层的澄清液体移入另一个50mL离心管中，总体积约20mL，随后加入15 mL的异丙醇溶液，将离心管颠倒混匀10次，让异丙醇与所吸取的上清液成分接触，放置在4℃冰箱中沉淀30min。
7）取出离心管，在5000r/min离心5min后立即倒掉上清液，注意勿将白色DNA倒出。
8）加入70 %的乙醇洗涤沉淀物3次。
9）将沉淀物置于35 ℃的鼓风机中干燥，其间不断观察其DNA的析出情况，待水分蒸发完毕时用60℃提前预热的2 mLTE溶解沉淀，于- 20 ℃贮藏备用。
将提取的基因组DNA用NanoDrop 2000对其浓度和纯度进行预检测，一般A260/A280值在1.8-2.0 之间，A260/A230值大于2.0，说明提取的DNA质量良好。再通过1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，电泳出现单一明亮清晰的条带说明提取的DNA质量较好。
实施例3
本实施例采用数字PCR技术对亚洲柑橘黄龙病菌及柑橘内标基因进行浓度测定，本实施例展示了黄龙病菌及内标准基因Sand的数字PCR方法的建立。
1．建立目的片段和基因组内标准基因Sand的数字PCR方法。
采用表1的引物探针进行黄龙病菌及内标准基因Sand的ddPCR反应体系的建立，分别对反应的引物探针浓度比，退火温度，反应特异性，灵敏度进行优化。具体引物探针序列、引物探针浓度组合及反应体系见表1，表2和表3。
表1. 实验中所用的引物探针
Figure P_221013093822983_983892001
本实施例还进行了ddPCR反应体系的优化，具体通过采用设置不同浓度以及比例的引物和探针
进行ddPCR实验以选出效果最好的比例，具体引物探针浓度见表2。实验采用的模板与反应条件均一致。通过对反应热图3和图4的比较，以确定终浓度。
表2. ddPCR 引物和探针浓度组合
Figure P_221013093823046_046393001
结果显示，所设置的这几组引物探针比例效果图阳性微滴和阴性微滴都分开的较为清晰，“下雨”现象均不严重，都可以考虑作为本实验的最终检测体系引物探针浓度比。而出于节省试剂的用量，以及内源与检测比例的一致性，因此最终采用引物探针浓度比为 3:1作为检测用量。最终确认检测柑橘黄龙病ddPCR的反应扩增体系如表3。
表3. ddPCR反应体系
Figure P_221013093823125_125974001
ddPCR退火温度的筛选过程如下:
ddPCR中退火温度设置的大小和实验结果的“下雨”现象存在直接的关系，对前期筛选出的最优引物探针组合和优化得出的浓度比，进行进一步的退火温度的筛选，均采用相同的模板，退火温度分别设置为56℃，57℃，58℃，59℃。筛选出“下雨”现象最不严重的温度作后续的实验。
在ddPCR反应过程中，发明人还对退火环节进行了筛选。首先对亚洲黄龙病质粒DNA的退火温度进行筛选设置了56℃， 57 ℃，58 ℃这三个温度梯度。参照图5所示的检测基因和图6所示的内源基因在不同退火温度下ddPCR的扩增曲线图。发现随着退火温度的提高，荧光值在不断降低，再以56 ℃，57 ℃，58 ℃对柑橘内源基因退火温度进行筛选，结果显示随着温度的升高“下雨”现象变得越来越严重，综合考虑将退火温度一致设置为 57℃。
最终确定反应程序为95℃预变性10min；94℃变性15 s，57 ℃延伸1min；40个循环，98℃酶灭活10min，4 ℃保存, 升温度速率2 ℃/s。
发明人还进行了ddPCR的特异性验证如下：
采用健康的柑橘DNA，患柑橘黄龙病柑橘DNA，各类植物致病菌DNA（大肠杆菌DNA，西瓜嗜酸菌DNA，柑桔溃疡病菌DNA，放线菌DNA，气芽孢杆菌DNA）、H2O作为模板，按照本实施例上述的PCR体系和条件进行ddPCR特异性检测黄龙病亚洲种的特异性。结果参照图7所示。柑橘黄龙病菌检测基因引物在除患柑橘黄龙病柑橘以外的多个物种和H2O中都没有阳性微滴的扩增，只有在患柑橘黄龙病柑橘有阳性微滴出现。
通过以健康的柑橘DNA，患柑橘黄龙病柑橘DNA，鸡爪槭DNA，漆树DNA，桐树DNA，玉米DNA，水稻DNA，南天竹DNA，H2O作为模板，按照本实施例上述的PCR体系和条件进行ddPCR的特异性检测柑橘内源基因Sand的特异性。结果参照图8所示。
内源基因引物在除柑橘以外的多个物种和H2O中都没有阳性微滴的扩增，只有在柑橘DNA有阳性微滴出现，说明可以作为内参基因进行实验的参考。
实施例4
本实施例进行接头效果比较试验。
发明人将对三种样品进行测试：asi片段+柑橘基因组DNA；asi-adapter片段+柑橘基因组DNA；黄龙病菌DNA+柑橘基因组DNA（也就是染病柑橘DNA），比较接头的效果。
设置高低温循环（95° 30s，4℃ 30s，20个循环），采用数字PCR分别测试三组样品，研究接头效果，结果分别见表4。
表4. asi、asi-adapter与染黄龙病菌DNA测试数据（copies/μL）
Figure P_221013093823219_219760001
采用数字PCR方法比较三组样品，数字PCR结果表明，带接头（asi-adapter）的标准物质RSD值为3.11%，黄龙病菌DNA的RSD值为3.21%，显著低于普通片段（asi）的RSD值6.25%，证明了带接头的标准物质与染病的黄龙病菌DNA更接近，更稳定。
实施例5
本实施例进行亚洲柑橘黄龙病标准物质的形貌模拟。
将提取的健康柑橘DNA用TE进行稀释，采用NanoDrop 2000使浓度统一为50 ng/uL，以此为背景溶液，对带接头的asi片段进行稀释，分别按照10,100,1000,10000,100000的稀释梯度采用健康柑橘DNA对带接头的片段进行稀释，然后通过反复退火的方式进行20个循环。具体设置高低温循环（95° 30s，4℃ 30s，20个循环），使带接头的asi片段与柑橘基因组DNA发生整合，提高标准物质的稳定性。分别测量检测目的基因和内标准基因，直至比例为100%。
全程采用NanoDrop 2000对其纯度进行监测，保证A260/A280值在1.8-2.0之间，A260/A230值大于2.0。
本发明将研制亚洲柑橘黄龙病DNA标准物质，每个浓度分装200管，每管100μL，整个分装过程都置于生物安全柜的冰盒中进行，以保证DNA不被降解。分装完成后，将分装的DNA标准物质置于100格冷冻盒中，-20 ℃冰箱保存。
对形貌模拟完成的标准物质进行量值确定，结果见表5，均值为3831，RSD为2.89%，柑橘内源基因的拷贝数为4241，RSD为3.16%，数据稳定可靠，满足亚洲柑橘黄龙病的检测需求。由此可知，本发明提供的方法通过形貌模拟出了含量为100%的亚洲柑橘黄龙病植物材料，且通过接头显著提升了稳定性。
表5.亚洲柑橘黄龙病DNA标准物质值数据分析
Figure P_221013093823299_299314001
实施例6
本实施例以模拟非洲猪瘟材料的形貌为例，展示对非洲猪瘟的病菌DNA片段的制备、猪基因组DNA制备及两种材料的整合和测试，原理参照图9所示。
下述实验采用如下所述的实验材料
DNA片段材料
本发明中涉及的猪源性材料为非洲猪瘟染病和非染病（健康）猪源性材料，目标DNA片段通过及基因合成技术获得。
1. 先进行靶标基因（即检测目的基因）片段的制备。
生物信息学分析。
实施例以非洲猪瘟（DNA病毒）为例，非洲猪瘟的p72基因序列来自NCBI数据库。依据国内外检测标准及文献报道的检测方法，截选序列能覆盖上述扩增片段的序列，共698bp（下称为p72），序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成进入目标载体为pUC57的EcoRV位点，称为pUC-p72，将所构建的重组质粒转入感受态的大肠杆菌DH5α(Amp抗性)菌株中。
经生工测序，证明所合成的序列100%正确。
2 .加接头的引物设计及扩增
将p72的698 bp扩增子的引入F和R两端加上猪源性基因组接头，上下游各20个碱基，目的是可以通过反复退火，将加了接头的片段两端与猪基因组结合，提高稳定性。
Adapter-F/R（接头（下划线）是指正反引物上各有20个碱基与猪源性基因组DNA上的某个基因互补），外侧分别加入BamHI/XbaI酶切位点，序列如下。
Adapter-F: 5'-ggatccCCTTGTGGCTGAGGCTTGATAACCTGTTTGTAACCCCT -3'
Adapter-R: 5'-tctagaCAATAACCCAGACAACCACCTTAGGTACTGTAACGCAGCA-3'
用上述引物克隆目的片段，连接入pUC57载体，质粒称为pUC-adapter-p72，用BamHI/XbaI酶对质粒进行酶切，电泳检测结果图10所示，第一泳道为Marker，第二泳道为目的片段p72的酶切产物。结果符合预期。
3．进行质粒DNA标准物质的序列验证及酶切制备。
经生工生物工程(上海)股份有限公司联合验证。将测序结果在NCBI上进行blast比对，质粒DNA标准物质的插入序列与设计克隆的片段完全相符，正确率为100%。
将pUC-p72和pUC-adapter-p72的宿主菌在合适的条件下培养，以获取大量质粒DNA。BamHI/XbaI酶切质粒及大量制备目的片段（pUC-p72）及带接头Adapter的片段(pUC-adapter-p72)。
4.带目的DNA标准物质的纯度验证。
在DNA纯度验证方面，通过紫外分光光度法进行鉴定，通过测出样品在230 nm、260nm和280 nm紫外光下的吸光度，比较A260/A230，A260/A280的值，结果显示，A260/A280大于1.8小于2.0，A260/230大于2.0，证明所提取的质粒DNA多肽，碳水化合物，盐成分，RNA等杂质较少，纯度高，可以用于标准物质的后续制备。
实施例7
本实施例进行猪源性基因组DNA及染病的猪源性基因组DNA的提取。
本项目采用自行改良的CTAB-氯仿法大量提取DNA。其原理是用CTAB为主要成分的裂解液将组织细胞裂解后，用氯仿-异戊醇除去蛋白质等杂质，再用-20℃预冷的无水乙醇使DNA沉淀，最后用TE缓冲液回收DNA。这种方法可以一次性提取大量DNA，提取产物浓度、纯度高，不需要使用离心柱或磁珠等较为昂贵的试剂耗材，成本较低。
具体提取步骤如下：
（1）称取6 g肉匀浆到50 mL离心管中，加入30 mL CTAB裂解液和300 μL蛋白酶K（浓度为 20 mg/mL），65℃水浴，每隔30 min颠倒混匀一次，裂解消化至无肉眼可见固体。取出后放置到常温，5,000 rpm 离心5 min。
（2）取25 mL 上清液至新的50 mL离心管中，加入20 mL氯仿-异戊醇（体积比24:1）,轻摇混匀5 min，5,000 rpm离心2 min。
（3）取22 mL上清液至新的50 mL离心管中，加入20 mL氯仿-异戊醇（体积比24:1）,轻摇混匀5 min，5,000 rpm离心 2 min。
（4）取20 mL上清液至新的50 mL离心管中，加入25 mL在-20 ℃中提前预冷的无水乙醇。
（5）将离心管于-20℃中放置1-2小时，5,000 rpm离心 5 min，弃去上清液。
（6）加入 20mL 80%乙醇轻摇混匀2 min，5,000 rpm 离心2 min，弃去上清液。
（7）加入20mL 80%乙醇轻摇混匀2 min，5,000 rpm离心2 min，弃去上清液，打开离心管盖晾干15 min。
（8）加入10 mL TE缓冲液，轻摇混匀，56 ℃水浴10 min。
将提取的基因组DNA用NanoDrop 2000对其浓度和纯度进行预检测，一般A260/A280值在1.8-2.0之间，A260/A230值大于2.0，说明提取的DNA质量良好。再通过1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，电泳出现单一明亮清晰的条带说明提取的DNA质量较好。
实施例8
本实施例采用数字PCR技术对非洲猪瘟病毒及猪源性内标基因进行浓度测定，本实施例展示了非洲猪瘟病毒p72基因及猪源性内标准基因RRA1的数字PCR方法的建立。
采用表6的引物探针进行p72及RRA1的ddPCR反应体系的建立，分别对反应的引物探针浓度比，退火温度，反应特异性，灵敏度进行优化。
表6. 实验中所用的引物探针
Figure P_221013093823393_393039001
发明人对ddPCR反应体系进行优化如下：
（1）引物探针比优化。
P72和RPA1引物/探针设置4种不同组合浓度比进行数字PCR，优化反应体系中引物/探针的终浓度（表7）。筛选原则参加柑橘黄龙病实施例，研究结果表明，组合1、2、3阳性液滴的荧光值较大，但液滴较分散、存在下雨现象；组合4阳性液滴的荧光值较小；组合2和组合3阳性液滴的下雨现象较弱，且荧光值差距不大。比较组合2与组合3，只有引物浓度不同，此时选择低引物浓度为0.4 μmol/L。因此确定本发明数字PCR后续测试引物、探针终浓度分别为0.4 μmol/L和0.2 μmol/L。
表7 引物、探针浓度组合表。
Figure P_221013093823455_455557001
（2）进行数字PCR退火温度的优化。
PCR反应程序中退火温度的高低对荧光强度和微滴下雨现象有显著的影响，因此在反应程序的退火环节，设置了温度梯度（57℃~65℃）进行优化实验。筛选原则参加柑橘黄龙病实施例，结果显示：P72和RPA1引物/探针在不同的退火温度下，微滴的荧光强度存在较显著差异，退火温度为57~60 ℃时，荧光强度值较大，且没有明显的下雨现象。因此，本发明选择温度较高，且没有明显的下雨现象的温度，即60℃。
综上所述，经优化后，微滴数字PCR体系为20 µL，包含10 μL 2×dPCR MasterMix，10 µmol/L正向引物和反向引物各0.8 µL、探针0.4 µL，DNA模板2 µL，水补足。微滴式数字PCR反应程序为95℃ 变性10 min；40 个循环（94 ℃ 变性15 s，60.0 °C 退火延伸1min）；98 ℃变性10 min；4 ℃保存。扩增结束后，将96 孔板置入微滴读取仪中读取信号，并使用软件QuantaSoft Version 1.6.6.0320 分析实验数据，获得绝对定量结果。
实施例9
本实施例进行接头效果比较试验。
将对三种样品进行测试：p72片段+猪源性DNA；adapter-p72片段+猪源性DNA；非洲猪瘟病毒+猪源性DNA（也就是染病的材料），比较接头的效果。
设置高低温循环（95° 30s，4℃ 30s，20个循环），采用数字PCR分别测试三组样品，研究接头效果，结果分别见表8。
表8. p72、adapter-p72与非洲猪瘟病毒DNA测试数据（copies/μL）
Figure P_221013093823503_503943001
采用数字PCR方法比较三组样品，数字PCR结果表明，带接头（Adapter-p72）的标准物质RSD值为2.47%，非洲猪瘟病毒DNA的RSD值为2.89%，显著低于普通片段（p72）的RSD值5.51%，证明了带接头的标准物质与非洲猪瘟病毒DNA更接近，更稳定。
实施例10
本实施例提供了一种非洲猪瘟标准物质的形貌模拟方法。
将上述实施例7提取的健康猪源性DNA用TE进行稀释，采用NanoDrop 2000使浓度统一为50 ng/uL，以此为背景溶液，对带接头的p72片段进行稀释，分别按照10,100,1000,10000,100000的稀释梯度采用健康猪源性DNA对带接头的片段进行稀释，然后通过反复退火的方式进行20个循环。模拟染非洲猪瘟病的形貌。设置高低温循环（95° 30s，4℃ 30s，20个循环），使带接头的p72片段与猪源性DNA发生整合，提高标准物质的稳定性。分别测量检测目的基因和内标准基因，直至比例为100%。
全程采用NanoDrop 2000对其纯度进行监测，保证A260/A280值在1.8-2.0之间，A260/A230值大于2.0。
本发明将研制非洲猪瘟病毒DNA标准物质，每个浓度分装300管，每管100μL，整个分装过程都置于生物安全柜的冰盒中进行，以保证目的基因片段和猪源性基因组DNA不被降解。分装完成后，将分装的标准物质置于100格冷冻盒中，-20 ℃冰箱保存。
对形貌模拟完成的标准物质进行量值确定，结果见表9，均值为6302，RSD为2.11%，猪源性内标基因的拷贝数为6216，RSD为2.56%，数据稳定可靠，满足非洲猪瘟病的检测需求。由此可知，本发明提供的方法通过形貌模拟出了含量为100%的非洲猪瘟动物材料，且通过接头显著提升了稳定性。
表9.非洲猪瘟DNA标准物质值数据分析
Figure P_221013093823566_566893001
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种制备动物疫病或植物疫病的核酸标准物质的形貌模拟方法，其特征在于，其包括如下步骤：将两端带有接头的动物疫病病原体或植物疫病病原体的检测目的基因片段与目标动物或目标植物的基因组核酸混合，通过高低温切换反应使得带有接头的检测目的基因片段整合到目标动物或目标植物的基因组核酸中从而获得核酸混合物，然后进行PCR验证；所述高低温切换反应是指：95℃ 20-30s，4℃ 20-30s，20-25个循环；
所述PCR验证是以所述核酸混合物为模板，以检测目的基因的检测引物和探针对所述模板进行PCR获得第一产物，以目标动物或目标植物的内标基因的检测引物和探针对所述模板进行PCR获得第二产物，分别检测所述第一产物和第二产物的拷贝数；并将第一产物和第二产物进行混合；
所述检测目的基因片段两端的接头与目标动物或目标植物的基因组核酸通过碱基互补匹配，所述接头的长度为20bp-25bp。
2.根据权利要求1所述的形貌模拟方法，其特征在于，所述形貌模拟方法还包括获得两端带有接头的动物疫病病原体或植物疫病病原体的检测目的基因片段，其包括：
根据动物疫病病原体或植物疫病病原体的检测目的基因片段的全长序列，设计并筛选出扩增所述全长序列的正向引物和反向引物，然后在所述正向引物和反向引物的两端添加接头以与所述目标动物或目标植物的基因组核酸通过碱基互补匹配，通过分子克隆的方法或基因合成的方法获得两端带有接头的转基因植物的检测目的基因片段。
3.根据权利要求2所述的形貌模拟方法，其特征在于，以两端添加接头的正向引物和反向引物对检测目的基因片段进行扩增；
将扩增获得的扩增产物连接T载体，通过大肠杆菌复制质粒和酶切质粒获得两端带有接头的动物疫病病原体或植物疫病病原体的检测目的基因片段。
4.根据权利要求1-3任一项所述的形貌模拟方法，其特征在于，
所述目标植物包含来自禾本目(Poales)、石竹目(Caryophyllales)、茄目(Solanales)、豆目(Fabales)、锦葵目(Malvales)、伞形目(Apiales)、十字花目(Brassicales)、天门冬目(Asparagales)、薯蓣目(Dioscoreales)、葫芦目、蔷薇目、无患子目、山茱萸目、杜鹃花目、龙胆目、凤梨目、兰目、南天星目、棕榈目、山茶目、菊目、亚麻目、鼠李目、睡莲目或百合目(Liliales)的植物；
(a)当所述目标植物包含来自禾本目的植物时，所述植物选自以下属：稻属(Oryza)、大麦属(Hordeum)、燕麦属(Avena)、玉蜀黍属（Zea mays L）或小麦属(Triticum)；
(b)当所述目标植物包含来自石竹目的植物时，所述植物选自以下属：菠菜属(Spinacia)、藜属(Chenopodium)、甜菜属(Beta genus)、大黄属(Rheum)、麦蓝菜属(Vaccaria)、肥皂草属(Saponaria)或石头花属(Gypsophila)；
(c)当所述目标植物包含来自茄目的植物时，所述植物选自以下属：茄属(Solanum)、辣椒属(Capsicum)、烟草属(Nicotiana)、莨菪属(Hyoscyamus)、曼陀罗属(Datura)或颠茄属(Atropa)；
(d)当所述目标植物包含来自豆目的植物时，所述植物选自以下属：甘草属(Glycyrrhiza)、苜蓿属(Medicago)、大豆属(Glycine)、百脉根属(Lotus)、鹰嘴豆属(Cicer)、菜豆属(Phaseolus)、豌豆属(Pisum)、花生属(Arachis)、羽扇豆属(Lupinus)或金合欢属(Acacia)；
(e)当所述目标植物包含来自锦葵目的植物时，所述植物选自可可属(Theobroma)；
(f)当所述目标植物包含来自伞形目的植物时，所述植物选自以下属：胡萝卜属(Daucus)、芹属(Apium)、香芹菜属(Petroselinum)、人参属(Panax)、柴胡属(Bupleurum)、常春藤属(Hedera)或积雪草属(Centella)；或
(g)当所述目标植物包含来自十字花目的植物时，所述植物选自以下属：拟南芥属(Arabidopsis)、芸苔属(Brassica)、山柑属(Capparis)或番木瓜属(Carica)。
5.根据权利要求1-3任一项所述的形貌模拟方法，其特征在于，所述目标动物为：脊椎动物或无脊椎动物；
所述脊椎动物选自人、绵羊、牛、马、山羊、鹿、家禽、猪、猫、狗、猴或鼠；
所述无脊椎动物为原生动物、腔肠动物、腐性动物、线性动物、环节动物、软体动物、节肢动物、蠕虫、棘皮动物或甲壳动物。
6.根据权利要求1所述的形貌模拟方法，其特征在于，所述PCR验证时对所述模板进行PCR的程序包括：94-98℃，10-30s；50-58℃，30-60s；共20-50个循环；
植物疫病检测目的基因的检测引物和探针的终浓度比值为3-5:1，植物疫病内源目的基因的检测引物和探针的终浓度比值为3-5:1；
动物疫病检测目的基因的检测引物和探针的终浓度比值为2-4:1，动物疫病内源目的基因的检测引物和探针的终浓度比值为2-4:1。
7.根据权利要求1所述的形貌模拟方法，其特征在于，所述动物疫病为：人兽共患病、动物疫病或动物病虫害；
所述动物疫病来源于如下至少一种的病原体：动物布鲁氏菌、牛结核分枝杆菌、金黄色葡萄球菌、狂犬病毒、猪链球菌2型、炭疽芽胞杆菌、沙门氏菌、非洲猪瘟病毒、新冠病毒、流感病毒、HPV病毒、乙肝病毒、人免疫缺陷病毒、SARS、MERS、登革热病毒、禽流感、埃博拉或大肠杆菌；
所述植物疫病来自植物细菌病害、植物真菌病害、植物土传病害或根结线虫病害；
所述根结线虫病害包括南方根结线虫（Meloidogyne incognita）、北方根结线虫（Meloidogyne hapla）、爪哇根结线虫（Meloidogyne javanica）或花生根结线虫引起的结线虫病害；
所述植物细菌病害包括气芽孢杆菌、西瓜嗜酸菌、亚洲韧皮杆菌、青枯劳尔氏菌、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、猕猴桃溃疡病菌(Pseudomonas syringae)、水稻白叶枯病菌(Xanthomonascampestris)、白菜软腐病菌(Erwiniacarotorora)、核桃黑斑病菌(Xanthomonascampestris)、魔芋软腐病菌(Erwiniacarotovora)或金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)引起的细菌病害；
所述植物真菌病害或植物土传病害包括由立枯丝核菌、镰刀菌、油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)、番茄灰霉病菌(Botrytis cirerea)、黄瓜枯萎病菌(Fusari umoxysporum.sp.cucumebrium Owen)、小麦全蚀病菌(Gaeumannomycescritici)、小麦赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、苹果树腐烂病菌(Valsamali)、苹果炭疽病菌(Glomerellacingulata)、水稻纹枯病菌(Rhizoctoniasolan)、稻瘟病菌(Pyriculariagrisea)、番茄早疫病菌(Alternariasolani)、草莓灰霉病菌(Botrytis cirerea)、马铃薯晚疫病菌(Phytophthorainfestans)、玉米大斑病菌(Exserohilumturcicum)、玉米小斑病菌(Bipolariamaydis)、西瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.niveum)、茄子黄萎病菌(Verticilliumdahliae)、棉花枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.vasinfectum)、辣椒疫霉病菌(Phytophthoracapsici)或烟草疫霉病菌(Phytophthoranicotianae)引起的植物病害。
8.一种如权利要求1-7任一项所述的形貌模拟方法制得的动物疫病或植物疫病的核酸标准物质。
9.一种试剂或试剂盒，其特征在于，其包括权利要求8所述的动物疫病或植物疫病的核酸标准物质。
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