CN111996179A

CN111996179A - 一种dna聚合酶及其在pcr检测中的应用

Info

Publication number: CN111996179A
Application number: CN202010849153.9A
Authority: CN
Inventors: 聂子梅; 黄非; 宋乐元; �田润
Original assignee: Chengdu Hyrux Bio Tech Science Co ltd
Current assignee: Chengdu Hyrux Bio Tech Science Co ltd
Priority date: 2020-08-21
Filing date: 2020-08-21
Publication date: 2020-11-27

Abstract

本发明涉及PCR检测技术，具体涉及一种DNA聚合酶及其在PCR检测中的应用。所述DNA聚合酶，是由氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的蛋白和氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的蛋白自N端到C端连接而成的融合蛋白，或者将所述融合蛋白的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加而形成的具有DNA聚合酶功能的蛋白质。该酶具有高保真性和高灵敏度，可用于低丰度模板的扩增检测、免提取‑直接PCR、taqman‑qPCR检测体系以及多重PCR检测体系。

Description

一种DNA聚合酶及其在PCR检测中的应用

技术领域

本发明涉及PCR检测技术，具体涉及一种DNA聚合酶及其在PCR检测中的应用。

背景技术

1983年Mullis等人发明了一种特异性DNA体外扩增技术——聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)简称PCR，是一种在体外模拟体内DNA复制的核酸扩增技术，仅以少量的DNA分子作为模板，经变性-退火-延伸的多次循环，以接近指数扩增的形式产生大量的目标DNA分子的技术。短短数十年时间，随着PCR技术的发展，衍生出了各种基于PCR方法的新技术，比如：多重PCR、反转录PCR、荧光定量PCR、原位PCR、免疫PCR和数字PCR等。PCR技术以其高特异性、高灵敏性、操作简便、成本低廉的优点和可满足高通量、高速度、高灵敏、高特异检测和完全自动化的需求，使其应用范围从基本的基因扩增，扩展到基因克隆、基因改造、医学检验、指纹鉴定以及非生物领域，可以说当下只要是在分子层面上的研究，基本都会用到PCR技术。

成熟意义上PCR方法的核心是耐热型DNA聚合酶(DNA polymerase)，目前已经从海洋极端嗜热菌中开发出多种耐热型DNA聚合酶，如Taq、Tth、Pfu、KOD等广泛应用的品类。根据结构生物学和生物信息学分析，耐热型DNA聚合酶分为两个家族，其中A家族(如Taq、Tth)有两个功能域：5－3聚合酶功能域，5－3外切酶功能域；B家族(如Pfu、KOD)也有两个功能域：5－3聚合酶功能域，3－5外切酶功能域。从结构理论上和实际的应用情况来看，A家族酶与模板DNA的结合能力弱于B家族酶；A家族酶对于不同引物的适配性高于B家族；B家族酶在扩增产物的保真性上远高于A家族酶；B家族酶的产物扩增长度极限高于A家族酶。A家族中的Taq DNA polymerase因其引物适配要求低，扩增缓冲液条件简单，反应成功率高，虽保真性、灵敏度和扩增极限相对较低，也成为当前核酸分子诊断中最广泛使用的聚合酶品种。

为了提高Taq DNA polymerase的反应灵敏度、扩增效率和产物量极限，研究者们从90年代初期就开始对野生型Taq DNA polymerase进行随机突变、人工进化挖掘Taq DNApolymerase的应用潜力。

发明内容

为满足上述领域存在的需求，我们开发了一种重组DNA聚合酶，该酶具有高保真性和高灵敏度，可用于低丰度模板的扩增检测、免提取-直接PCR、taqman-qPCR检测体系以及多重PCR检测体系。

一方面，本发明提供一种DNA聚合酶，是如下a1或a2所述的蛋白质：

a1.由氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的蛋白和氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的蛋白自N端到C端连接而成的融合蛋白；

a2.将a1所述的融合蛋白的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加而形成的具有DNA聚合酶功能的蛋白质。

在本发明的优选实施例中，所述DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

编码所述DNA聚合酶的基因也属于本发明的保护范围。

在本发明的优选实施例中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。

包含所述基因的表达盒、载体或重组菌也属于本发明的保护范围。

另一方面，本发明还提供一种PCR试剂盒，其特征在于：包含所述DNA聚合酶。

在本发明的优选实施例中，所述试剂盒还包含2×反应缓冲液；所述2×反应缓冲液包含：100mM Tris-Cl，pH 8.5；30mM(NH₄)₂SO₄，50mM KCl，0.01％(g/ml)BSA，0.05％(v/v)TritonX-100，4mM MgCl₂。

在本发明的优选实施例中，所述试剂盒还包含10×增强剂或5×q增强剂；所述10×增强剂包含150mM四甲基氯化铵；所述5×q增强剂包含：2.5M甜菜碱，5mM DTT，5％(v/v)DMSO，30μg/mL BSA。

还在另一方面，本发明提供一种PCR方法，其特征在于：使用所述DNA聚合酶或所述试剂盒进行PCR反应。

在本发明所述方法的优选实施例中，所述PCR反应的体系包含：2×反应缓冲液，10×增强剂，dNTP，正向引物，反向引物，权利要求1或2所述的DNA聚合酶，模板DNA；所述2×反应缓冲液包含：100mM Tris-Cl，pH 8.5；30mM(NH₄)₂SO₄，50mM KCl，0.01％(g/ml)BSA，0.05％(v/v)TritonX-100，4mM MgCl₂；所述10×增强剂包含150mM四甲基氯化铵。

优选地，所述PCR反应的体系包括：2×反应缓冲液；10×增强剂；dNTP；正向引物，400nM；反向引物，400nM；权利要求1或2所述的DNA聚合酶，终浓度为2ng/μL；模板DNA，终浓度为0.2ng-100ng/μL；ddH₂O。

在本发明所述方法的优选实施例中，所述PCR反应的体系包含：2×反应缓冲液，5×q增强剂，dNTP，正向引物，反向引物，荧光探针，权利要求1或2所述的DNA聚合酶，模板DNA；所述2×反应缓冲液包含：100mM Tris-Cl，pH 8.5；30mM(NH₄)₂SO₄，50mM KCl，0.01％(g/ml)BSA，0.05％(v/v)TritonX-100，4mM MgCl₂；所述5×q增强剂包含：2.5M甜菜碱，5mMDTT，5％(v/v)DMSO，30μg/mL BSA。

优选地，所述PCR反应的体系包含：2×反应缓冲液；5×q增强剂；dNTP；正向引物，400nM；反向引物，400nM；荧光探针，100nM；权利要求1或2所述的DNA聚合酶，终浓度2ng/μL；模板DNA，终浓度0.2ng-100ng/μL；ddH₂O。

发明人发现，将截短的硫化叶菌(Saccharolobus solfataricus)的DNA单链结合蛋白(SSBp)(氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)与水生嗜热杆菌(Thermus aquaticus)的DNA聚合酶(氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)通过连接序列(氨基酸序列如SEQ ID NO:3)进行连接，利用大肠杆菌进行融合表达，获得的重组DNA聚合酶(命名为SS-HF DNA聚合酶)显著提高了该聚合酶与DNA模板的结合能力。进一步地，发明人针对SS-HF DNA聚合酶对PCR反应缓冲液进行了调试，并在PCR反应体系中引入了自主PCR增强剂，使得SS-HF DNA聚合酶派生出了以下新的应用范畴：

Ⅰ.用于低丰度模板的扩增检测：

利用SS-HF DNA聚合酶与模板之间的高结合力，可结合低丰度模板-引物复合物，从而成功扩增更低浓度的模板。如图3(B)所示，当DNA模板稀释10^-7倍时，本发明的SS-HFDNA聚合酶还能够扩增出明显的目的条带，可检测浓度低至2×10^-6ng/μl的模板DNA。

Ⅱ.用于免提取-直接PCR：

SS-HF DNA聚合酶从简易处理的样品和标准提取的样品中扩增的条带并无显著差异(图4)，表明SS-HF DNA聚合酶具有很高的抗杂质干扰水平和高灵敏度，能结合体系中的少量模板从而成功地扩增目的片段，可用于细菌、真菌、植物组织、动物组织中的靶序列PCR鉴定，免去DNA提取纯化过程。样本通过简单预处理(如研磨、浸润、沸煮等)后可直接加入PCR体系，配合使用PCR增强剂，SS-HF DNA聚合酶可成功扩增获得目的片段，与DNA纯化－扩增的常规方式效果实质等同。

Ⅲ.用于taqman-qPCR检测体系：

增加了模板结合力的SS-HF DNA聚合酶，在taqman探针法qPCR反应体系中，能够一方面发挥该酶的5－3外切酶活性剪切taqman探针形成荧光信号，另一方面利用更强的模板结合力避免在扩增过程中遭遇taqman探针阻挡掉落，完美的实现链替换效果，提高了qPCR成功率，保证扩增过程的热力学稳定性，维持方法学的数学模型。

Ⅳ.用于多重PCR检测体系：

简单调整SS-HF DNA聚合酶的用量，将其调整为普通PCR反应体系中酶用量的5-10倍(终浓度10ng/μL-20ng/μL)，可顺利实施多重PCR。该酶在多重PCR检测体系中表现优良，扩增总效率高，引物之间不易形成竞争，在不同的引物配比下各产物生成水平均一，检测重复性良好(图6，S1-S5)。

Ⅴ.联合使用上述性质，可以组合配制多种实用复合体系：

如高灵敏度的免提取taqman-qPCR检测体系、多重免提取PCR检测体系，等等。

附图说明

图1.本发明的SS-HF DNA聚合酶的表达载体构建示意图；

图2.SS-HF DNA聚合酶蛋白纯化样品的SDS-PAGE图；M为蛋白Marker，从上到下的条带大小依次为116.0、66.2、45.0、35.0、25.0、18.4、14.4kDa；1为超声波破碎原样；2为100mM KCl穿透样(穿透样是指柱体饱和过程中及饱和后样本流穿的组分)；3为150mM KCl清洗液；4为400mM KCl洗脱液；目的条带大小为108kDa。

图3.使用SS-HF DNA聚合酶扩增低丰度模板DNA的电泳图；其中，(A)为使用商用高灵敏度PCR试剂盒A(非融合Taq酶)扩增不同浓度的DNA模板的扩增效果，(B)为使用本发明的SS-HF DNA聚合酶扩增不同浓度的DNA模板的扩增效果；M为DNA Marker，从上到下的条带大小依次为2000、1000、750、500、250、100bp；10^-1～10^-7分别表示模板DNA的稀释倍数；扩增条带的大小为350bp。

图4.使用SS-HF DNA聚合酶对不同处理方法所得样品进行PCR检测的电泳图；其中，M为DNA Marker，从上到下的条带大小依次为2000、1000、750、500、250、100bp；“－”代表经简易处理方法得到的样品，“+”代表经标准提取方法得到的样品。

图5.使用SS-HF DNA聚合酶进行taqman-qPCR的实验结果；其中，(A)：使用商用高荧光强度qPCR检测试剂盒B对空白样品进行qPCR的扩增曲线；(B)：使用商用高荧光强度qPCR检测试剂盒B对标准质粒DNA模板进行qPCR的扩增曲线；(C)：使用SS-HF DNA聚合酶对空白样品进行qPCR的扩增曲线；(D)：使用SS-HF DNA聚合酶对标准质粒DNA模板进行qPCR的扩增曲线；横坐标为PCR循环数，纵坐标为相对荧光强度。

图6.两种多重PCR体系检测沙门氏菌的电泳图；其中，M为DNA Marker，从上到下的条带大小依次为2000、1000、750、500、250、100bp；+1～+5为使用市售沙门氏菌PCR检测试剂盒进行多重PCR的扩增结果；S1～S5为使用SS-HF DNA聚合酶进行多重PCR的扩增结果；+1～+5和S1～S5中的数字1～5分别表示引物组合1～5(三对引物按照不同比例混合形成的5种引物组合)。

具体实施方式

下面结合实施例进一步描述本发明，需要理解的是，下述实施例仅作为对本发明的解释和说明，不以任何方式限制本发明的范围。

Nco I内切酶(Code No.1160S)，Xho I内切酶(Code No.1094S)，EcoR I内切酶(Code No.1040S)，TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0(CodeNo.9762)，T4 DNA Ligase(Code No.2011A)，均购自宝日医生物技术(北京)有限公司(Takara)。rTaq DNA聚合酶，购自TaKaRa公司，货号R001A。质粒小提中量试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，产品目录号：DP106。DTT(二硫苏糖醇)，CAS号：3483-12-3，Sigma-Aldrich，货号：D0632。TritonX-100，CAS号：9002-93-1，Sigma-Aldrich，货号：X100。四甲基氯化铵(Tetramethyl ammonium chloride)，CAS号：75-57-0，Sigma-Aldrich，货号：T3411。甜菜碱(Betaine)，CAS号：75-57-0，Sigma-Aldrich，货号：B0300。

pET15b质粒：购买自Novagen公司。

大肠杆菌(Escherichia coli，DH5α)购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，菌株编号为1.12873，平台资源编号为1511C0002100009047。参照《分子克隆实验指南第三版》Inoue方法制备E.coli DH5α感受态细胞。

大肠杆菌(Escherichia coli，BL21)购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，菌株编号为1.12875，平台资源编号为1511C0002100009049。参照《分子克隆实验指南第三版》Inoue方法制备E.coli BL21(DE3)感受态细胞。

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，Cowan I)购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，菌株编号为1.1476，平台资源编号为1511C0002100001789。

LB培养基

每100ml LB培养基含有：1g胰蛋白胨、0.5g酵母提取物、1g氯化钠，pH 7.4。

配制方法：在950ml ddH₂O中溶解10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠，然后用NaOH调节pH为7.4，用ddH₂O定容至1L。若配制固体培养基，则每升加入15g琼脂。121℃高压蒸汽灭菌20min。

若未特别说明，以下实施例所使用的试剂均为本领域常规试剂，可商购获得或按照本领域常规方法配制而得，规格为实验室纯级即可。若未特别说明，以下实施例所使用的实验方法和实验条件均为本领域常规的实验方法和实验条件，可参考相关实验手册、公知文献或厂商说明书。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。

实施例1、SS-HF DNA聚合酶的构造与制备

1.SSB-Taq融合基因表达式的构建

1.1基因设计与合成

在NCBI(网址：www.ncbi.nlm.nih.gov)中调取硫化叶菌(Saccharolobussolfataricus)的DNA单链结合蛋白(SSBp)的氨基酸序列(NCBI Reference Sequence:WP_009989484.1)和水生嗜热杆菌(Thermus aquaticus)的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)的氨基酸序列(UniProtKB/Swiss-Prot:P19821.1)。选取SSBp蛋白的1-118aa，并在其N端添加6个氨基酸的短肽，得到SEQ ID NO:1所示的蛋白。设计将SEQ ID NO:1所示蛋白的基因序列(SEQ ID NO:5)放置于Taq DNA聚合酶的基因序列(SEQ ID NO:6)的5’端，用(GGGGS×3)作为linker(SEQ ID NO:7)连接两段基因，得到融合基因，命名为SSB-Taq基因(SEQ ID NO:8)。在SSB-Taq基因序列的5’端添加Nco I酶切位点(CCATGG)，在SSB-Taq基因序列的3’端添加Xho I酶切位点(CTCGAG)，然后将含有酶切位点的SSB-Taq基因序列交由苏州金唯智生物科技有限公司进行全基因合成，得到目的基因。

1.2载体构建

将合成的目的基因经由Nco I和Xho I酶切位点插入pET15b质粒中，构建成重组质粒，命名pET15b-SSTaq。

酶切：使用Nco I内切酶(TaKaRa，货号1160S)和Xho I内切酶(Takara，货号1094S)分别对目的基因和pET15b质粒进行双酶切，酶切体系如下：

将酶切体系混匀后置于37℃酶切16h。使用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNAExtraction Kit Ver.4.0(Takara，货号9762)，按照试剂盒说明书进行酶切产物回收，得到pET15b线性化载体和目的基因酶切产物。然后使用T4 DNA Ligase(Takara，货号2011A)，按照如下体系和条件进行连接。

将连接体系置于16℃连接过夜，得到连接产物pET15b-SSTaq质粒。

1.3转化

用连接产物(pET15b-SSTaq质粒)转化E.coli DH5α感受态细胞。转化步骤如下：将pET15b-SSTaq质粒和E.coli DH5α感受态细胞混匀后在冰上孵育半小时，42℃热激90秒，冰上放置2min，然后加入液体LB培养基缓摇1个小时，3000rpm离心5min，将100μl菌液涂布在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB固体平板上，37℃倒置培养过夜。次日挑取单菌落，接种在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃过夜培养，采用质粒小提中量试剂盒(天根，货号DP106)提取质粒。委托生工生物工程(上海)有限公司对质粒进行测序，将测序正确的pET15b-SSTaq质粒转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞(转化步骤同上述E.coli DH5α)，以pET15b-SSTaq载体说明书中列出的T7 promoter primer和T7 terminator primer作为验证引物，通过菌落PCR方法鉴定阳性子。

T7 promoter primer序列：5-TAATACGACTCACTATAGGG；

T7 terminator primer序列：5-TGCTAGTTATTGCTCAGCGG。

2.SSB-Taq融合蛋白的表达与纯化

蛋白表达：将菌落PCR鉴定正确的阳性子单菌落接种于液体LB培养基中，37℃，180rpm摇床培养至OD600＝0.8时，加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，化学式C₉H₁₈O₅S)至终浓度为0.5mM，在37℃，180rpm继续诱导培养20小时；6000rpm离心5分钟收集菌体，用1/4菌液体积的缓冲液(20mM Tris-HCl pH8.0，5％甘油)重悬菌体，在冰浴的条件下超声波破碎，然后以12000rpm离心15分钟，收集上清，用于纯化蛋白。

蛋白纯化：使用肝素琼脂糖凝胶FF(Heparin-Sepharose FF)亲和层析柱填料预装柱(GEHealthcare，货号17-0998-01)进行纯化。

(1)20mM Tris-HCl(pH7.7)，100mM KCl，5％甘油平衡柱体并上样；

(2)20mM Tris-HCl(pH7.7)，150mM KCl，5％甘油清洗杂蛋白；

(3)20mM Tris-HCl(pH7.7)，400mM KCl，5％甘油洗脱目的蛋白。

使用透析袋(索莱宝，货号MD34-14，分子量14kDa)将洗脱液用20mM Tris-HCl(8.0)，50mM KCl，1mM DTT，0.5％(v/v)TritonX-100，0.5％(v/v)Tween-20透析过夜，得到纯化蛋白。SDS-PAGE检测纯化蛋白，结果如图2所示，1为超声波破碎原样，2为100mM KCl穿透样(穿透样是指柱体饱和过程中及饱和后样本流穿的组分)，3为150mM KCl清洗液，4为400mM KCl洗脱液。向纯化的蛋白溶液中加入甘油至终浓度为50％，置于-80℃保存，成品命名为SS-HF DNA聚合酶。

实施例2、SS-HF DNA聚合酶的酶学性能验证

Ⅰ.利用SS-HF DNA聚合酶扩增低丰度模板的灵敏度测试

本实验旨在通过对PCR体系中模板浓度进行由高到低的调整，测定SS-HF DNA聚合酶对低浓度模板的抓捕能力，并与商用高灵敏度PCR试剂盒A(该试剂盒中所用的Taq酶不是SSBp蛋白融合Taq酶)进行比较，以评测本发明的SS-HF DNA聚合酶的扩增灵敏度。

1.1材料

大肠杆菌基因组DNA、SS-HF DNA聚合酶PCR体系、商用高灵敏度PCR试剂盒A(Takara，货号RR001A)、用于扩增大肠杆菌recA基因的引物recA-F和recA-R。recA基因在“黄劭毅.recA基因、katB基因的克隆及其在λ溶原菌中生物学功能的研究.武汉大学硕士论文”中有记载，其Genebank登录号为：MN532540。

1.1.1提取大肠杆菌基因组DNA

菌株E.coli DH5α基因组DNA委托四川川奕科技有限公司代为制备。用紫外分光光度计(上海元析仪器有限公司，UV-5100)检测DNA浓度。获得的大肠杆菌基因组DNA溶液的浓度为0.5μg/μl。将大肠杆菌基因组DNA溶液(0.5μg/μl)用纯水以10的倍数稀释7个梯度，每个梯度的基因组DNA各取1μl作为模板加入到PCR体系中。

1.1.2引物合成

委托苏州金唯智生物科技有限公司合成引物recA-F和recA-R，引物的核苷酸序列如下：

引物recA-F：5-GTGACGCCCTGGCGCGTTCTG；

引物recA-R：5-ACCCACCACGTTTTCGCCCTCTTTC。

1.2方法

1.2.1配制本发明的PCR体系

其中，2×反应缓冲液的配方为：100mM Tris-Cl，pH 8.5；30mM(NH₄)₂SO₄，50mMKCl，0.01％(g/ml)BSA，0.05％(v/v)TritonX-100，4mM MgCl₂。10×增强剂为150mM四甲基氯化铵(Tetramethyl ammonium chloride)。

1.2.2配制商用高灵敏度PCR试剂盒A(Takara，货号RR001A)的PCR体系

1.2.3PCR反应

分别采用上述本发明的PCR体系和商用高灵敏度PCR试剂盒A的PCR体系，以大肠杆菌基因组DNA作为模板，按照如下PCR反应程序扩增大肠杆菌recA基因：

1.3结果检测

配制浓度为1％的琼脂糖凝胶，PCR反应结束后，每个反应管取10μL反应产物进行电泳检测。实验结果如图3所示，商用高灵敏度PCR试剂盒A(非融合Taq酶)在模板稀释到10^-5时扩增效果明显减弱，稀释到10^-6时就已无目的条带(图3A)；而本发明的SS-HF DNA聚合酶在模板稀释到10^-7时都依然能扩增到目的条带(图3B)，表明SS-HF DNA聚合酶在扩增灵敏度上有显著的优势。

Ⅱ.免提取-直接PCR的测试

本实验选取PCR检测常用的且提取繁琐、费时的动植物样本作为测试样本，采用免提取-简易流程与标准核酸提取流程处理样品作为模板进行PCR检测比较，以评定SS-HFDNA聚合酶的粗糙样本直接扩增水平。

2.1材料

植物材料：拟南芥(Arabidopsis thaliana)叶片、玉米(Zea mays L.)叶片、烟草(Nicotiana benthamiana)叶片、番茄(Solanum lycopersicum)叶片。

动物材料：小鼠(mouse)的尾巴、小鼠(mouse)的毛发。

上述植物材料和动物材料由四川大学生命科学学院白林含教授惠赠。实验中涉及的引物均由四川大学生命科学学院白林含教授惠赠。

2.2方法

2.2.1样本处理

(1)简易处理方法

将2.1中各植物材料和动物材料分别按照下列方法进行简易处理：

植物叶尖：取约0.5cm²大小的叶尖组织，确保组织完全浸润在提取缓冲液中，使用研磨棒在EP管中徒手研磨15秒。

动物组织：取约2mg小鼠尾巴尖，确保组织完全浸润在提取缓冲液中，使用研磨棒在EP管中徒手研磨60秒。

动物毛发：取8-15根带有发根的小鼠毛发，调整长度以确保发根完全浸润在提取缓冲液中，95℃温育5分钟。

提取缓冲液配方：100mM Tris-Cl，pH 9.5；1M KCl；10mM EDTA；0.01％(v/v)TritonX-100。

经过简易处理后得到的样品，取5-7μl作为PCR反应的模板。

(2)标准提取方法

使用动植物核酸提取试剂盒(Qiagen，货号51304)，按照说明书操作流程分别提取2.1中各植物材料和动物材料的核酸，取1μl提取的DNA样品作为PCR反应的模板。

2.2.2PCR反应

(1)配制SS-HF DNA聚合酶的反应体系：

(2)按照如下反应程序进行PCR：

2.3结果检测

配制浓度为1％的琼脂糖凝胶，PCR反应结束后，每个反应管取10μL反应产物进行电泳检测。如图4所示，“－”代表经简易处理方法得到的样品，“+”代表经标准提取方法得到的样品；从实验结果可以看出，经两种处理方式得到的样品，扩增结果并无显著差异，说明本发明的SS-HF DNA聚合酶的抗杂质干扰水平和高灵敏度能结合体系中的少量模板从而成功地扩增目的片段，与DNA纯化-扩增的常规方式的效果实质等同，实现了省时省工的免提取-直接PCR的检测效果。

Ⅲ.用于taqman-qPCR体系的测试

本实验选用一常用的taqman-qPCR检测体系的应用案例作为标准方法，将本发明的SS-HF DNA聚合酶体系与标准方法比较，评测SS-HF DNA聚合酶在taqman-qPCR体系中的扩增水平。

3.1材料与仪器

SS-HF DNA聚合酶PCR体系、商用高荧光强度qPCR检测试剂盒B(Bio-rad，货号1725281)、带有金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)核酸酶基因(nuc)的质粒pMD-nuc、标准扩增金葡核酸酶基因(nuc)的引物与荧光探针、荧光定量PCR检测仪器(ABI7500)。

3.1.1质粒pMD-nuc的构建

3.1.1.1提取金黄色葡萄球菌的总DNA

取1mL金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，Cowan I，CGMCC 1.1476)的菌液，6000rpm离心3min，弃掉上清液，保留菌体；用400μL反应缓冲液II重悬菌体，然后加入10μL 1mg/mL溶葡球菌酶(Sigma-Aldrich，货号L7386)，37℃温育15min；加入400μL核酸释放缓冲液(4M GuSCN)，混合均匀，室温放置15分钟；将反应物转移至核酸结合小柱(Biocomma，货号RP20-A)，10000rpm离心2min，将滤出液再次转移至小柱中，重复离心；丢弃滤出液，往小柱中加入700μL核酸清洗液，10000rpm离心2min，将小柱晾干至无乙醇味；往小柱中加入无菌水40μL，室温放置5min，套上EP管(小型离心管)，10000rpm离心2min，收集提取物。

3.1.1.2引物

金黄色葡萄球菌的核酸酶基因nuc记载在非专利文献“实时荧光PCR检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的研究[J].中国感染控制杂志.2008.7(3)：162-166.”中，该基因的Genebank登录号为MN166565.1。委托苏州金唯智生物科技有限公司合成用于扩增核酸酶基因nuc的引物(nuc-F/R，扩增全基因)，引物的核苷酸序列如下：

nuc-F：5-ATGACAGAATACTTTTTAAGTGCTG；

nuc-R：5-TTATTCTGCGTTACCTTCACTCCAA。

3.1.1.3扩增核酸酶基因nuc

以提取的金黄色葡萄球菌的总DNA为模板，使用PCR试剂盒(Takara，货号RR001A)按照如下反应体系和反应程序进行PCR，扩增核酸酶基因nuc。

反应体系：

反应条件：

3.1.1.4载体构建

将扩增的核酸酶基因nuc进行琼脂糖凝胶电泳，使用TaKaRa MiniBEST AgaroseGel DNA Extraction Kit Ver.4.0(Takara，货号9762)，按照试剂盒说明书进行产物回收，得到基因扩增产物。然后使用T-Vector pMD^TM19(Simple)(Takara，货号3271)，按照如下体系和条件进行连接。

16℃连接过夜，得到连接产物(pMD-nuc质粒)。用连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞。转化步骤如下：将pMD-nuc质粒和E.coli DH5α感受态细胞混匀后在冰上孵育半小时，42℃热激90秒，冰上放置2min，然后加入液体LB培养基缓摇1个小时，3000rpm离心5min，将100μl菌液涂布在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB固体平板上，37℃倒置培养过夜。次日挑取单菌落，接种在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃过夜培养，采用质粒小提中量试剂盒(天根，货号DP106)提取质粒。委托生工生物工程(上海)有限公司对质粒进行测序，将测序正确的pMD-nuc质粒备用。

3.2方法

3.2.1标准质粒DNA模板的制备

将质粒pMD-nuc用EcoR I内切酶(TaKaRa，货号1040S)酶切线性化，紫外分光光度计测定浓度并定量至100ng/μL后稀释100000倍，制备成标准测试模板加入到反应体系中，设置空白样品(ddH₂O)，每个样品设置两个重复，涉及的引物和探针序列如下：

qPCR-F：5’-CCAACTAACTGATGAAGAGGGAA-3’；

qPCR-R：5’-CTTGCTTCTGGGCCATATTTT-3’；

荧光探针的序列为：

5’-FAM-CGACATTAATTAAAGCGATCGATGGTGATACGGTT-TAKA-3’。

委托苏州金唯智生物科技有限公司合成上述引物和荧光探针。

3.2.2配制PCR体系

(1)本发明的SS-HF DNA聚合酶反应体系：

其中，2×反应缓冲液的配方为：100mM Tris-Cl，pH 8.5；30mM(NH₄)₂SO₄，50mMKCl，0.01％(g/ml)BSA，0.05％(v/v)TritonX-100，4mM MgCl₂。5×q增强剂配方：2.5M甜菜碱(Betaine)，5mM DTT，5％(v/v)DMSO，30μg/mL BSA，H₂O。

(2)试剂盒B的反应体系

按照商用高荧光强度qPCR检测试剂盒B(Bio-rad，货号1725281)的说明书配制如下反应体系：

3.2.3设置PCR反应程序：

3.2.4结果检测：

使用荧光定量PCR检测仪器(ABI 7500)读取并分析扩增结果。如图5，(A)：使用试剂盒B对空白样品进行qPCR的扩增曲线；(B)：使用试剂盒B对标准质粒DNA模板进行qPCR的扩增曲线；(C)：使用SS-HF DNA聚合酶对空白样品进行qPCR的扩增曲线；(D)：使用SS-HFDNA聚合酶对标准质粒DNA模板进行qPCR的扩增曲线。从实验结果可以看出，相比试剂盒B，本发明的SS-HF DNA聚合酶在扩增上更为平稳，Ct值更早达成，反应荧光强度与试剂盒B相当。

Ⅳ.用于多重PCR检测体系

本实验选用一经典多重PCR体系检测实际应用案例，并通过变换体系中引物对间的浓度比例，提高引物间潜在的竞争压力，来评测SS-HF DNA聚合酶的多重PCR应用的检测水平。

4.1材料

沙门氏菌基因组DNA，SS-HF DNA聚合酶PCR体系，市售沙门氏菌PCR检测试剂盒(邦景，货号BJ-P4164)。

4.1.1沙门氏菌基因组DNA

沙门氏菌：鸡白痢沙门氏菌标准株CVCC533，沙门氏菌基因组DNA由四川大学生命科学院白林含教授惠赠，浓度500ng/μL。

4.1.2引物序列及PCR产物

其中，hns基因记载在非专利文献《沙门氏菌DNA提取及PCR反应条件的优化，食品科学，2007，Vol.28，No.07,331-333》中，其Genebank登录号为X14375.1。invA基因记载在非专利文献《沙门氏菌DNA提取及PCR反应条件的优化，食品科学，2007，Vol.28，No.07,331-333》中，其Genebank登录号为MK017942.1。hilA基因记载在非专利文献《沙门氏菌DNA提取及PCR反应条件的优化，食品科学，2007，Vol.28，No.07,331-333》中，其Genebank登录号为LC494579.1。引物名称中F代表正向引物，R代表反向引物。委托苏州金唯智生物科技有限公司合成上述引物。

4.2方法

4.2.1配制多重PCR反应体系

分别配制10μM的s-F/s-R/v-F/v-R/l-F/l-R引物溶液。然后将s-F和s-R引物溶液按照1:1体积比混合，得到S引物溶液；将v-F和v-R引物溶液按照1:1体积比混合，得到V引物溶液；将l-F和l-R引物溶液按照1:1体积比混合，得到L引物溶液。将S、V和L这三种引物溶液按照如下体积比混合，得到如下引物组合：

引物组合1：S：V：L＝1:2:1(标准方案比例)

引物组合2：S：V：L＝1:3:1

引物组合3：S：V：L＝1:1:1

引物组合4：S：V：L＝1:1:2

引物组合5：S：V：L＝2:1:1

(1)本发明的SS-HF DNA聚合酶反应体系

(2)市售沙门氏菌PCR检测试剂盒的反应体系

按照试剂盒(邦景，货号BJ-P4164)说明书配制多重反应体系，引物添加数量和类别与本发明的SS-HF DNA聚合酶反应体系一致。

4.2.2设置PCR反应程序：

4.2.3结果检测：

配制浓度为1％的琼脂糖凝胶，PCR反应结束后，每个反应管取10μL反应产物进行电泳检测。如图6所示，+1～+5为使用市售沙门氏菌PCR检测试剂盒进行多重PCR的扩增结果；S1～S5为使用SS-HF DNA聚合酶进行多重PCR的扩增结果；+1～+5和S1～S5中的数字1～5分别表示引物组合1～5。

从实验结果可以看出，市售试剂盒使用5个引物组合均能扩增出hns基因目的片段(352bp)和invA基因目的片段(548bp)，但使用引物组合3～5无法扩增出hilA基因目的片段(890bp)。而本发明的SS-HF DNA聚合酶PCR体系在5种引物比例下都可顺利扩增出三个基因的目的条带，且不同引物浓度下的扩增产物并无明显差异，说明酶-反应体系扩增能力优秀，引物之间不易形成竞争，各产物生成水平均一化，在多重PCR检测体系中有良好的表现。

实施例3、本发明的PCR试剂盒

试剂盒的组装：将DNA聚合酶以及说明书装入试剂盒中，在试剂盒的外壳上贴上标签。在本发明的优选实施例中，将2×反应缓冲液、10×增强剂和5×q增强剂也装入试剂盒中。所述2×反应缓冲液的配方为：100mM Tris-Cl，pH 8.5；30mM(NH₄)₂SO₄，50mM KCl，0.01％(g/ml)BSA，0.05％(v/v)TritonX-100，4mM MgCl₂。所述10×增强剂为150mM四甲基氯化铵。所述5×q增强剂的配方为：2.5M甜菜碱，5mM DTT，5％(v/v)DMSO，30μg/mL BSA。

所述试剂盒可用于扩增低丰度模板、免提取-直接PCR、taqman-qPCR、多重PCR检测，PCR体系和程序可参考实施例2。

序列表

<110> 成都汇瑞新元生物科技有限责任公司

<120> 一种DNA聚合酶及其在PCR检测中的应用

<130> P200328-HRX

<160> 23

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ala Ser Gly Gly Gly Met Glu Glu Lys Val Gly Asn Leu Lys Pro

1 5 10 15

Asn Met Glu Ser Val Asn Val Thr Val Arg Val Leu Glu Ala Ser Glu

20 25 30

Ala Arg Gln Ile Gln Thr Lys Asn Gly Val Arg Thr Ile Ser Glu Ala

35 40 45

Ile Val Gly Asp Glu Thr Gly Arg Val Lys Leu Thr Leu Trp Gly Lys

50 55 60

His Ala Gly Ser Ile Lys Glu Gly Gln Val Val Lys Ile Glu Asn Ala

65 70 75 80

Trp Thr Thr Ala Phe Lys Gly Gln Val Gln Leu Asn Ala Gly Ser Lys

85 90 95

Thr Lys Ile Ala Glu Ala Ser Glu Asp Gly Phe Pro Glu Ser Ser Gln

100 105 110

Ile Pro Glu Asn Thr Pro Thr Ala Pro Gln Gln Met

115 120

<210> 2

<211> 832

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Arg Gly Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu

1 5 10 15

Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe His Ala Leu Lys Gly

20 25 30

Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala

35 40 45

Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Asp Ala Val Ile Val

50 55 60

Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Gly Gly

65 70 75 80

Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln Leu

85 90 95

Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Leu Ala Arg Leu Glu

100 105 110

Val Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Ser Leu Ala Lys Lys

115 120 125

Ala Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Lys Asp

130 135 140

Leu Tyr Gln Leu Leu Ser Asp Arg Ile His Val Leu His Pro Glu Gly

145 150 155 160

Tyr Leu Ile Thr Pro Ala Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg Pro

165 170 175

Asp Gln Trp Ala Asp Tyr Arg Ala Leu Thr Gly Asp Glu Ser Asp Asn

180 185 190

Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Arg Lys Leu Leu

195 200 205

Glu Glu Trp Gly Ser Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg Leu

210 215 220

Lys Pro Ala Ile Arg Glu Lys Ile Leu Ala His Met Asp Asp Leu Lys

225 230 235 240

Leu Ser Trp Asp Leu Ala Lys Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val

245 250 255

Asp Phe Ala Lys Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Arg Leu Arg Ala Phe

260 265 270

Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu

275 280 285

Glu Ser Pro Lys Ala Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly

290 295 300

Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp

305 310 315 320

Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Arg Gly Gly Arg Val His Arg Ala Pro

325 330 335

Glu Pro Tyr Lys Ala Leu Arg Asp Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu

340 345 350

Ala Lys Asp Leu Ser Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu Pro

355 360 365

Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn

370 375 380

Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu

385 390 395 400

Glu Ala Gly Glu Arg Ala Ala Leu Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu

405 410 415

Trp Gly Arg Leu Glu Gly Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu

420 425 430

Val Glu Arg Pro Leu Ser Ala Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly

435 440 445

Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala

450 455 460

Glu Glu Ile Ala Arg Leu Glu Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His

465 470 475 480

Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp

485 490 495

Glu Leu Gly Leu Pro Ala Ile Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg

500 505 510

Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile

515 520 525

Val Glu Lys Ile Leu Gln Tyr Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr

530 535 540

Tyr Ile Asp Pro Leu Pro Asp Leu Ile His Pro Arg Thr Gly Arg Leu

545 550 555 560

His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser

565 570 575

Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln

580 585 590

Arg Ile Arg Arg Ala Phe Ile Ala Glu Glu Gly Trp Leu Leu Val Ala

595 600 605

Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly

610 615 620

Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Arg Asp Ile His Thr

625 630 635 640

Glu Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Arg Glu Ala Val Asp Pro

645 650 655

Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly

660 665 670

Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu

675 680 685

Ala Gln Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg

690 695 700

Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Arg Arg Gly Tyr Val

705 710 715 720

Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Glu Ala Arg

725 730 735

Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro

740 745 750

Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu

755 760 765

Phe Pro Arg Leu Glu Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln Val His

770 775 780

Asp Glu Leu Val Leu Glu Ala Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ala Val Ala

785 790 795 800

Arg Leu Ala Lys Glu Val Met Glu Gly Val Tyr Pro Leu Ala Val Pro

805 810 815

Leu Glu Val Glu Val Gly Ile Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Glu

820 825 830

<210> 3

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 4

<211> 971

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Ala Ser Gly Gly Gly Met Glu Glu Lys Val Gly Asn Leu Lys Pro

1 5 10 15

Asn Met Glu Ser Val Asn Val Thr Val Arg Val Leu Glu Ala Ser Glu

20 25 30

Ala Arg Gln Ile Gln Thr Lys Asn Gly Val Arg Thr Ile Ser Glu Ala

35 40 45

Ile Val Gly Asp Glu Thr Gly Arg Val Lys Leu Thr Leu Trp Gly Lys

50 55 60

His Ala Gly Ser Ile Lys Glu Gly Gln Val Val Lys Ile Glu Asn Ala

65 70 75 80

Trp Thr Thr Ala Phe Lys Gly Gln Val Gln Leu Asn Ala Gly Ser Lys

85 90 95

Thr Lys Ile Ala Glu Ala Ser Glu Asp Gly Phe Pro Glu Ser Ser Gln

100 105 110

Ile Pro Glu Asn Thr Pro Thr Ala Pro Gln Gln Met Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Arg Gly Met Leu

130 135 140

Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu Val Asp Gly His His

145 150 155 160

Leu Ala Tyr Arg Thr Phe His Ala Leu Lys Gly Leu Thr Thr Ser Arg

165 170 175

Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala Lys Ser Leu Leu Lys

180 185 190

Ala Leu Lys Glu Asp Gly Asp Ala Val Ile Val Val Phe Asp Ala Lys

195 200 205

Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Gly Gly Tyr Lys Ala Gly Arg

210 215 220

Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln Leu Ala Leu Ile Lys Glu

225 230 235 240

Leu Val Asp Leu Leu Gly Leu Ala Arg Leu Glu Val Pro Gly Tyr Glu

245 250 255

Ala Asp Asp Val Leu Ala Ser Leu Ala Lys Lys Ala Glu Lys Glu Gly

260 265 270

Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Lys Asp Leu Tyr Gln Leu Leu

275 280 285

Ser Asp Arg Ile His Val Leu His Pro Glu Gly Tyr Leu Ile Thr Pro

290 295 300

Ala Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg Pro Asp Gln Trp Ala Asp

305 310 315 320

Tyr Arg Ala Leu Thr Gly Asp Glu Ser Asp Asn Leu Pro Gly Val Lys

325 330 335

Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Arg Lys Leu Leu Glu Glu Trp Gly Ser

340 345 350

Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg Leu Lys Pro Ala Ile Arg

355 360 365

Glu Lys Ile Leu Ala His Met Asp Asp Leu Lys Leu Ser Trp Asp Leu

370 375 380

Ala Lys Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val Asp Phe Ala Lys Arg

385 390 395 400

Arg Glu Pro Asp Arg Glu Arg Leu Arg Ala Phe Leu Glu Arg Leu Glu

405 410 415

Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu Glu Ser Pro Lys Ala

420 425 430

Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly Ala Phe Val Gly Phe

435 440 445

Val Leu Ser Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp Leu Leu Ala Leu Ala

450 455 460

Ala Ala Arg Gly Gly Arg Val His Arg Ala Pro Glu Pro Tyr Lys Ala

465 470 475 480

Leu Arg Asp Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu Ala Lys Asp Leu Ser

485 490 495

Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu Pro Pro Gly Asp Asp Pro

500 505 510

Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn Thr Thr Pro Glu Gly

515 520 525

Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu Glu Ala Gly Glu Arg

530 535 540

Ala Ala Leu Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu Trp Gly Arg Leu Glu

545 550 555 560

Gly Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu Val Glu Arg Pro Leu

565 570 575

Ser Ala Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly Val Arg Leu Asp Val

580 585 590

Ala Tyr Leu Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala Glu Glu Ile Ala Arg

595 600 605

Leu Glu Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His Pro Phe Asn Leu Asn

610 615 620

Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp Glu Leu Gly Leu Pro

625 630 635 640

Ala Ile Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg Ser Thr Ser Ala Ala

645 650 655

Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile Val Glu Lys Ile Leu

660 665 670

Gln Tyr Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr Tyr Ile Asp Pro Leu

675 680 685

Pro Asp Leu Ile His Pro Arg Thr Gly Arg Leu His Thr Arg Phe Asn

690 695 700

Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser Ser Asp Pro Asn Leu

705 710 715 720

Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln Arg Ile Arg Arg Ala

725 730 735

Phe Ile Ala Glu Glu Gly Trp Leu Leu Val Ala Leu Asp Tyr Ser Gln

740 745 750

Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly Asp Glu Asn Leu Ile

755 760 765

Arg Val Phe Gln Glu Gly Arg Asp Ile His Thr Glu Thr Ala Ser Trp

770 775 780

Met Phe Gly Val Pro Arg Glu Ala Val Asp Pro Leu Met Arg Arg Ala

785 790 795 800

Ala Lys Thr Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly Met Ser Ala His Arg

805 810 815

Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu Ala Gln Ala Phe Ile

820 825 830

Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg Ala Trp Ile Glu Lys

835 840 845

Thr Leu Glu Glu Gly Arg Arg Arg Gly Tyr Val Glu Thr Leu Phe Gly

850 855 860

Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Glu Ala Arg Val Lys Ser Val Arg

865 870 875 880

Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro Val Gln Gly Thr Ala

885 890 895

Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu Phe Pro Arg Leu Glu

900 905 910

Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln Val His Asp Glu Leu Val Leu

915 920 925

Glu Ala Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ala Val Ala Arg Leu Ala Lys Glu

930 935 940

Val Met Glu Gly Val Tyr Pro Leu Ala Val Pro Leu Glu Val Glu Val

945 950 955 960

Gly Ile Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Glu

965 970

<210> 5

<211> 372

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggctagtg gtggtggtat ggaagagaaa gtcggtaacc tgaaaccgaa catggaatcc 60

gtgaacgtca ctgtacgtgt tctggaagca tctgaagctc gtcagatcca gaccaagaac 120

ggtgtacgta ccatctctga agctatcgtc ggtgatgaga ctggtcgtgt caaactgact 180

ctgtggggta aacacgcagg tagcatcaaa gaaggtcagg tagtcaagat cgagaacgca 240

tggactaccg cattcaaagg tcaggtgcaa ctgaacgcag gttctaagac caagatcgct 300

gaagcatccg aagatggctt tccggaatcc tctcagattc ctgagaacac tccaactgca 360

ccgcaacaga tg 372

<210> 6

<211> 2499

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atgcgtggta tgctgccgct gttcgaaccg aaaggtcgtg tactgctggt agatggtcac 60

catctggcat atcgtacttt ccatgctctg aaaggtctga ccacttctcg tggtgaaccg 120

gttcaggctg tttacggttt cgctaaatct ctgctgaaag cactgaaaga agatggtgat 180

gcagttatcg ttgtgttcga tgctaaagca ccgtctttcc gtcacgaagc ttacggtggt 240

tacaaagctg gtcgtgcacc aactccagaa gactttccgc gtcaactggc actgatcaaa 300

gaactggttg atctcctggg tctggcacgt ctggaagttc caggttacga agcagatgac 360

gttctggcat ctctggctaa gaaagctgag aaagaaggtt acgaagttcg tattctgact 420

gcagacaaag atctgtatca gctgctgtct gatcgtatcc acgtactgca tccggaaggt 480

tacctgatta ctccagcatg gctgtgggaa aagtacggtc tgcgtccaga tcaatgggct 540

gactatcgtg cactgactgg tgatgaatcc gacaatctgc caggtgtcaa aggcattggt 600

gagaagactg cacgtaaact gctcgaagaa tggggttctc tggaagcact gctgaagaac 660

ctggatcgtc tgaaaccggc tattcgtgag aagattctgg cacacatgga cgatctgaag 720

ctgtcttggg atctggctaa ggttcgtact gatctgccac tggaagttga cttcgccaaa 780

cgtcgcgaac cggatcgtga acgtctgcgt gcatttctgg aacgtctgga gttcggctct 840

ctgctccatg aattcggtct gctggaatct ccgaaagctc tggaagaagc accttggcca 900

cctccggaag gtgcattcgt aggtttcgtt ctgtctcgta aagaaccgat gtgggctgat 960

ctgctggcac tggctgcagc tcgtggtggt cgtgtacatc gtgcacctga accgtataaa 1020

gcactgcgtg atctgaaaga agcacgtggt ctgcttgcta aagatctgag cgttctggca 1080

ctgcgtgaag gtctgggtct tccacctggt gacgatccaa tgctgctggc atatctgctc 1140

gatccgtcta acaccactcc ggaaggtgtt gcacgtcgct acggtggtga atggactgaa 1200

gaggcaggtg aacgtgctgc actgtctgaa cgtctgttcg ctaatctgtg gggtcgtctg 1260

gaaggtgaag agcgtctgct ttggctgtat cgtgaagtcg aacgtccgct gtctgctgta 1320

ctggcacaca tggaagctac tggtgttcgt ctggatgtag cttatctgcg tgcactgtct 1380

ctggaagttg ctgaagagat tgcacgtctg gaagctgaag tgttccgtct ggcaggtcat 1440

ccgttcaatc tgaactctcg tgatcaactg gaacgtgttc tgttcgatga actgggtctg 1500

ccagctatcg gtaagactga gaaaactggt aaacgtagca cctctgcagc tgtactggaa 1560

gcactgcgcg aagctcatcc gatcgttgag aaaattctgc agtatcgtga actgaccaaa 1620

ctgaagtcta cctacattga tccgctgcca gatctgattc atccgcgtac tggtcgtctg 1680

catactcgct tcaaccagac tgcaactgca actggtcgtc tgtcctcttc ggatccgaat 1740

ctgcagaaca ttccggtacg tactccactg ggtcaacgta ttcgtcgtgc attcatcgct 1800

gaagaaggtt ggctgctggt agcactggat tactctcaga tcgaactgcg tgtactggca 1860

catctgtctg gtgacgagaa cctgattcgt gtcttccaag aaggtcgtga catccacact 1920

gagactgcgt cttggatgtt cggtgtaccg cgtgaagctg ttgatccatt gatgcgtcgt 1980

gcagctaaga ctattaactt tggtgtactg tacggtatgt ctgcacatcg tctgtctcaa 2040

gagctggcaa ttccgtacga agaagctcag gcattcattg aacgttactt tcagagcttt 2100

ccgaaagttc gtgcatggat tgagaagact ctcgaagaag gtcgtcgccg tggttacgtt 2160

gagactctgt ttggtcgtcg ccgttatgta ccagatctgg aagctcgtgt taaatctgta 2220

cgtgaagctg ctgaacgtat ggcattcaac atgccagttc aaggtactgc agctgatctg 2280

atgaaactgg ctatggttaa actgtttcca cgtctggaag agatgggtgc acgtatgctg 2340

ctgcaagtac atgacgaact ggtactggaa gctccgaaag aacgtgctga agcagttgca 2400

cgtctggcta aagaagtcat ggaaggtgtt tatccactgg cagttccact ggaagttgaa 2460

gtaggtattg gtgaagattg gctgtctgct aaagagtaa 2499

<210> 7

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggtggaggag gaagcggtgg aggaggtagt ggaggtggag gaagt 45

<210> 8

<211> 2916

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atggctagtg gtggtggtat ggaagagaaa gtcggtaacc tgaaaccgaa catggaatcc 60

gtgaacgtca ctgtacgtgt tctggaagca tctgaagctc gtcagatcca gaccaagaac 120

ggtgtacgta ccatctctga agctatcgtc ggtgatgaga ctggtcgtgt caaactgact 180

ctgtggggta aacacgcagg tagcatcaaa gaaggtcagg tagtcaagat cgagaacgca 240

tggactaccg cattcaaagg tcaggtgcaa ctgaacgcag gttctaagac caagatcgct 300

gaagcatccg aagatggctt tccggaatcc tctcagattc ctgagaacac tccaactgca 360

ccgcaacaga tgggtggagg aggaagcggt ggaggaggta gtggaggtgg aggaagtatg 420

cgtggtatgc tgccgctgtt cgaaccgaaa ggtcgtgtac tgctggtaga tggtcaccat 480

ctggcatatc gtactttcca tgctctgaaa ggtctgacca cttctcgtgg tgaaccggtt 540

caggctgttt acggtttcgc taaatctctg ctgaaagcac tgaaagaaga tggtgatgca 600

gttatcgttg tgttcgatgc taaagcaccg tctttccgtc acgaagctta cggtggttac 660

aaagctggtc gtgcaccaac tccagaagac tttccgcgtc aactggcact gatcaaagaa 720

ctggttgatc tcctgggtct ggcacgtctg gaagttccag gttacgaagc agatgacgtt 780

ctggcatctc tggctaagaa agctgagaaa gaaggttacg aagttcgtat tctgactgca 840

gacaaagatc tgtatcagct gctgtctgat cgtatccacg tactgcatcc ggaaggttac 900

ctgattactc cagcatggct gtgggaaaag tacggtctgc gtccagatca atgggctgac 960

tatcgtgcac tgactggtga tgaatccgac aatctgccag gtgtcaaagg cattggtgag 1020

aagactgcac gtaaactgct cgaagaatgg ggttctctgg aagcactgct gaagaacctg 1080

gatcgtctga aaccggctat tcgtgagaag attctggcac acatggacga tctgaagctg 1140

tcttgggatc tggctaaggt tcgtactgat ctgccactgg aagttgactt cgccaaacgt 1200

cgcgaaccgg atcgtgaacg tctgcgtgca tttctggaac gtctggagtt cggctctctg 1260

ctccatgaat tcggtctgct ggaatctccg aaagctctgg aagaagcacc ttggccacct 1320

ccggaaggtg cattcgtagg tttcgttctg tctcgtaaag aaccgatgtg ggctgatctg 1380

ctggcactgg ctgcagctcg tggtggtcgt gtacatcgtg cacctgaacc gtataaagca 1440

ctgcgtgatc tgaaagaagc acgtggtctg cttgctaaag atctgagcgt tctggcactg 1500

cgtgaaggtc tgggtcttcc acctggtgac gatccaatgc tgctggcata tctgctcgat 1560

ccgtctaaca ccactccgga aggtgttgca cgtcgctacg gtggtgaatg gactgaagag 1620

gcaggtgaac gtgctgcact gtctgaacgt ctgttcgcta atctgtgggg tcgtctggaa 1680

ggtgaagagc gtctgctttg gctgtatcgt gaagtcgaac gtccgctgtc tgctgtactg 1740

gcacacatgg aagctactgg tgttcgtctg gatgtagctt atctgcgtgc actgtctctg 1800

gaagttgctg aagagattgc acgtctggaa gctgaagtgt tccgtctggc aggtcatccg 1860

ttcaatctga actctcgtga tcaactggaa cgtgttctgt tcgatgaact gggtctgcca 1920

gctatcggta agactgagaa aactggtaaa cgtagcacct ctgcagctgt actggaagca 1980

ctgcgcgaag ctcatccgat cgttgagaaa attctgcagt atcgtgaact gaccaaactg 2040

aagtctacct acattgatcc gctgccagat ctgattcatc cgcgtactgg tcgtctgcat 2100

actcgcttca accagactgc aactgcaact ggtcgtctgt cctcttcgga tccgaatctg 2160

cagaacattc cggtacgtac tccactgggt caacgtattc gtcgtgcatt catcgctgaa 2220

gaaggttggc tgctggtagc actggattac tctcagatcg aactgcgtgt actggcacat 2280

ctgtctggtg acgagaacct gattcgtgtc ttccaagaag gtcgtgacat ccacactgag 2340

actgcgtctt ggatgttcgg tgtaccgcgt gaagctgttg atccattgat gcgtcgtgca 2400

gctaagacta ttaactttgg tgtactgtac ggtatgtctg cacatcgtct gtctcaagag 2460

ctggcaattc cgtacgaaga agctcaggca ttcattgaac gttactttca gagctttccg 2520

aaagttcgtg catggattga gaagactctc gaagaaggtc gtcgccgtgg ttacgttgag 2580

actctgtttg gtcgtcgccg ttatgtacca gatctggaag ctcgtgttaa atctgtacgt 2640

gaagctgctg aacgtatggc attcaacatg ccagttcaag gtactgcagc tgatctgatg 2700

aaactggcta tggttaaact gtttccacgt ctggaagaga tgggtgcacg tatgctgctg 2760

caagtacatg acgaactggt actggaagct ccgaaagaac gtgctgaagc agttgcacgt 2820

ctggctaaag aagtcatgga aggtgtttat ccactggcag ttccactgga agttgaagta 2880

ggtattggtg aagattggct gtctgctaaa gagtaa 2916

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

taatacgact cactataggg 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tgctagttat tgctcagcgg 20

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gtgacgccct ggcgcgttct g 21

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

acccaccacg ttttcgccct ctttc 25

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atgacagaat actttttaag tgctg 25

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ttattctgcg ttaccttcac tccaa 25

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ccaactaact gatgaagagg gaa 23

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

cttgcttctg ggccatattt t 21

<210> 17

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

cgacattaat taaagcgatc gatggtgata cggtt 35

<210> 18

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

agagaatgta ctctggaaac gcttga 26

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

tgatcaggaa atcttccagt tgc 23

<210> 20

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tgctcgttta cgacctgaat tactg 25

<210> 21

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

tcatcgcacc gtcaaaggaa cc 22

<210> 22

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

gaatctctta cccgctgtat ttatgc 26

<210> 23

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

ggcgaaagta agttagcttg tttg 24

Claims

1.一种DNA聚合酶，是如下a1或a2所述的蛋白质：

2.根据权利要求1所述的DNA聚合酶，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

3.编码权利要求1或2所述的DNA聚合酶的基因。

4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。

5.包含权利要求3或4所述基因的表达盒、载体或重组菌。

6.一种PCR试剂盒，其特征在于：包含权利要求1或2所述的DNA聚合酶。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：还包含2×反应缓冲液；所述2×反应缓冲液包含：100mM Tris-Cl，pH 8.5；30mM(NH₄)₂SO₄，50mM KCl，0.01％(g/ml)BSA，0.05％(v/v)TritonX-100，4mM MgCl₂。

8.根据权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于：还包含10×增强剂或5×q增强剂；所述10×增强剂包含150mM四甲基氯化铵；所述5×q增强剂包含：2.5M甜菜碱，5mM DTT，5％(v/v)DMSO，30μg/mL BSA。

9.一种PCR方法，其特征在于：使用权利要求1或2所述的DNA聚合酶或权利要求6-8任一所述的试剂盒进行PCR反应。

10.根据权利要求9所述的PCR方法，其特征在于：

所述PCR反应的体系包含：2×反应缓冲液，10×增强剂，dNTP，正向引物，反向引物，权利要求1或2所述的DNA聚合酶，模板DNA；

所述2×反应缓冲液包含：100mM Tris-Cl，pH 8.5；30mM(NH₄)₂SO₄，50mM KCl，0.01％(g/ml)BSA，0.05％(v/v)TritonX-100，4mM MgCl₂；

所述10×增强剂包含150mM四甲基氯化铵。

11.根据权利要求9所述的PCR方法，其特征在于：

所述PCR反应的体系包含：2×反应缓冲液，5×q增强剂，dNTP，正向引物，反向引物，荧光探针，权利要求1或2所述的DNA聚合酶，模板DNA；

所述5×q增强剂包含：2.5M甜菜碱，5mM DTT，5％(v/v)DMSO，30μg/mL BSA。