CN113388595B - 高效末端加A的突变型Taq DNA聚合酶及其编码DNA - Google Patents

高效末端加A的突变型Taq DNA聚合酶及其编码DNA Download PDF

Info

Publication number
CN113388595B
CN113388595B CN202110677296.0A CN202110677296A CN113388595B CN 113388595 B CN113388595 B CN 113388595B CN 202110677296 A CN202110677296 A CN 202110677296A CN 113388595 B CN113388595 B CN 113388595B
Authority
CN
China
Prior art keywords
leu
ala
glu
arg
gly
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110677296.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113388595A (zh
Inventor
黄淑云
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wuhan Yisheng Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Wuhan Yisheng Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wuhan Yisheng Biotechnology Co ltd filed Critical Wuhan Yisheng Biotechnology Co ltd
Publication of CN113388595A publication Critical patent/CN113388595A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113388595B publication Critical patent/CN113388595B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1252—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12Y207/07007—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供一种高效末端加A的突变型Taq DNA聚合酶，其蛋白质序列为在如SEQ ID NO：1所示的野生型Taq DNA聚合酶基础上进行如下四个位点的突变：D188K、T506R、T710R和A744K。本发明的Taq DNA聚合酶突变体，在加A效率上显著提高；能够耐受血液，腐殖酸，靛蓝这些常见的抑制剂；能直接进行PCR扩增，不需对DNA样本进行提取；显著缩短扩增时间，能更快获得STR检测结果。

Description

高效末端加A的突变型Taq DNA聚合酶及其编码DNA
技术领域
本发明专利涉及一种高效末端加A的突变型Taq DNA聚合酶及其编码DNA，属于生物技术领域。
背景技术
STR（Short Tandem Repeat 短串联重复序列）是一种广泛存在于人类基因组中的分子遗传标记，是由2～6个碱基组成核心单位串联重复而形成的DNA序列。核心序列重复数目的变化，使其在群体中呈现多态性；同时在同一家系中又以孟德尔方式遗传，具有高度的遗传保守性；而且检测方法相对简单。因此该遗传标记物在法医学个体识别、亲子鉴定及DNA家谱构建等领域广泛应用。
Taq DNA聚合酶是第一个从水生嗜热杆菌中分离出来的耐热性DNA聚合酶。因为Taq DNA聚合酶具有极好的热稳定性，能够耐受PCR热变性过程，不需要每个循环额外添加新的聚合酶；因此该酶后面被广泛应用于各种PCR技术。它具有5'-3'聚合活性，5'-3'外切活性，无3'-5'外切活性；同时具备在PCR产物3'末端加A的特性。STR常用的检测手段是PCR扩增之后跑毛细管电泳；毛细管电泳分辨率高可以区分1bp的产物。一般的Taq DNA聚合酶在跑毛细管电泳时会呈现一个碱基差异的分裂峰，一个加A一个不加A产物；这是由于TaqDNA聚合酶对于产物加A不完全导致的；这种有时候会影响对结果的判读。为了解决此问题，一般会在扩增结束之后增加60℃/72℃的延伸时间，确保产物的完全加A；但是这种方法会增加扩增时间。
STR作为法庭医学常用的检测手段之一，其常见的样本是血液或者血卡，为了缩短检测时间，会直接进行血液样本或者血卡的直扩而不对样本进行提取；这需要PCR所用的Taq DNA聚合酶拥有耐受血液的能力。另一方面从犯罪现场收集的DNA样本很多与泥土，沙石，腐烂树叶等混合在一起，提取的时候会有相对应抑制物的残留；抑制剂会阻碍目的片段的扩增导致扩增结果出现STR等位基因的丢失或者直接导致所有基因座扩增失败。因此这也要求用于STR的Taq DNA聚合酶具备一定的耐抑制能力。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效末端加A的突变型Taq DNA聚合酶，不但加A效率高，对血液和抑制剂的耐受能力也强。
本发明采用的技术方案为：
一种高效末端加A的突变型Taq DNA聚合酶，其蛋白质序列为在如SEQ ID NO：1所示的野生型Taq DNA聚合酶基础上进行如下四个位点的突变：D188K、T506R、T710R和A744K。其中D188K，即野生型Taq酶氨基酸序列中第188位的天冬氨酸突变为赖氨酸； T506R，即野生型Taq酶氨基酸序列中第506位的苏氨酸突变为精氨酸；T710R，即野生型Taq酶氨基酸序列中第710位的苏氨酸突变为精氨酸；A744K，即野生型Taq酶氨基酸序列中第744位的丙氨酸突变为赖氨酸。
上述的高效末端加A的突变型Taq DNA聚合酶的编码DNA，其序列如SEQ ID NO：2所示。
上述的高效末端加A的突变型Taq DNA聚合酶在STR检测中的应用。
本发明的Taq DNA聚合酶突变体，在加A效率上显著提高；能够耐受血液、腐殖酸、靛蓝这些常见的抑制剂；能直接进行PCR扩增，不需对DNA样本进行提取；显著缩短扩增时间，能更快获得STR检测结果。
附图说明
图1是本发明实施例1扩增产物的毛细管电泳结果。其中左边4个为野生型Taq酶的扩增结果，ATGC分别代表扩增引物5端碱基分别为ATGC；右边为本发明突变型Taq酶B-Taq扩增5末端碱基为ATGC的引物的扩增结果。
图2是本发明实施例2 扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果。通道1-5分别为血液百分比0，2.5%，5%，8%，10%的模板的扩增结果。
图3是本发明实施例2中，全血百分比为0%的1ng/ulg DNA的模板的扩增产物毛细管电泳的结果。
图4是本发明实施例2中，全血百分比为10%的血液模板的扩增产物毛细管电泳的结果。
图5是图5是本发明实施例3中扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果。通道1-5分别是体系中加入0，5，10，15，20ng/ul 腐殖酸的扩增结果。
图6是本发明实施例4中扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果。通道1-5分别是体系中加入0，5，10，20，30mM靛蓝的扩增结果。
具体实施方式
实施例1 5'端ATGC加A测试
合成引物序列如下
基因座名称 引物序列（5'-3'）
5T-F TCACTCATTAGGCACCGGG
5T-R TCAACGACAGGAGCACGAT
5A-F ACCAGACACCCATCAACAGT
5A-R ATCGTTGGCAACCAGCATCG
5C-F CTCACTCATTAGGCACCGGG
5C-R CTCAACGACAGGAGCACGAT
5G-F GACCAGACACCCATCAACAGT
5G-R GATCGTTGGCAACCAGCATCG
以PET28a载体质粒为模板，利用PCR对目的序列进行扩增，扩增分4个反应，分别以5A-F 5A-R, 5T-F 5T-R, 5G-F 5G-R, 5C-F 5C-R4对引物进行扩增。同时对比本发明的突变型Taq DNA聚合酶（B-Taq）与野生型Taq酶的加A情况。5'末端为G/C时，B-Taq对比野生型Taq酶，无双峰情况，加A完全。说明该突变型Taq酶的加A效率优于野生型Taq酶。
表1：PCR检测体系示例
组分 浓度 25ul体系加入体积（μL）
Tris-HCl(pH8.8) 1M 1
MgCl2 25mM 2.0
KCl 2M 2
dNTP Each 10μM 0.5
Primer-F 10μM 0.5
Primer-R 10μM 0.5
质粒模板 1ng/μl 1
B-Taq/Canaces 5U/ul 0.5
ddH2O - 17
表2：PCR循环过程示例
Figure DEST_PATH_IMAGE001
将PCR反应产物跑毛细管电泳，示例性结果显示在图1。从图1可以看出：野生型Taq酶和突变型Taq酶B-Taq在扩增5'末端为A，G的引物时，加A情况一致，但是扩增引物末端为T，C的引物时，野生型Taq酶的产物表现为明显的双峰，加A不完全；而突变型Taq酶的产物是单一峰，加A完全。这表明，本发明的突变型Taq酶比野生型Taq酶有更好的加A能力。
实施例2 血液样本耐受性测试
以新鲜采集的人血样本为模板，测试Taq DNA聚合酶的扩增20重STR位点的能力。为了测定B-Taq的血液耐受情况，每个反应中全血投入量不同，以25ul反应为例子，分别投入0(模板为1ng/ul gDNA 1ul),0.625ul,1.25ul,2ul,2.5ul;其全血百分比分别为0，2.5%,5%,8%,10%.本发明采用20重STR 引物，简称STR 20重引物。
合成STR 20重引物序列
Figure 603157DEST_PATH_IMAGE002
表3：PCR体系
组分 浓度 25ul体系加入体积（μL）
Tris-HCl(pH8.8) 1M 1
MgCl2 25mM 2.0
KCl 2M 2
dNTP Each 10μM 0.5
STR 20重引物 10μM 0.5
全血模板 - 0(1ng/ulgDNA 1uL),0.625,1.25,2,2.5
B-Taq 5U/ul 0.5
ddH2O - 18.5，17.875，17.25，16.5，16
表4：PCR循环过程示例
Figure DEST_PATH_IMAGE003
将PCR扩增产物，取10ul跑2%琼脂糖凝胶，结果显示在图2。从图2可以看出：不同血液百分比的模板，扩增结果一致，都没有条带丢失，表明本发明的突变型Taq酶可以耐受10%的血液。
同时选取全血百分比分别为0和10%的PCR产物进行毛细管电泳，结果显示在图3和图4。从图3和图4可以看出：本发明的突变型Taq酶在进行血液模板的20重Y-STR扩增时，血液投入量高达10%依然能正常扩增，不存在点位丢失情况。
实施例3 抑制剂腐殖酸耐受度测试
在存在不同浓度腐殖酸的情况下，在PCR反应中以1ng/ul gDNA为模板，测试B-Taq扩增STR 20重引物的能力。为了测定B-Taq的腐殖酸耐受情况，每个反应中腐殖酸投入量不同，以25ul反应为例子，250ng/ul腐殖酸分别投入0，0.5，1，1.5，2ul；其腐殖酸终浓度为0，5，10，15，20ng/ul。
表5： PCR体系
组分 浓度 25ul体系加入体积（μL）
Tris-HCl(pH8.8) 1M 1
MgCl2 25mM 2.0
KCl 2M 2
dNTP Each 10μM 0.5
STR 20重引物 10μM 0.5
gDNA模板 1ng/ul 1
B-Taq 5U/ul 0.5
腐殖酸 250ng/ul 0，0.5，1，1.5，2
ddH2O - 17.5，17，16.5，16，15.5
表6：PCR循环过程示例
Figure 815832DEST_PATH_IMAGE004
将PCR扩增产物，取10ul跑2%琼脂糖凝胶，结果显示在图5。从图5可以看出：本发明突变型Taq酶可以完全耐受10ng/ul的腐殖酸，部分耐受20ng/ul的腐殖酸。
实施例4 抑制剂靛蓝耐受度测试
在存在不同浓度靛蓝的情况下，在PCR反应中以1ng/ul gDNA为模板，测试B-Taq扩增STR 20重引物的能力。为了测定B-Taq的腐殖酸耐受情况，每个反应中靛蓝投入量不同，以25ul反应为例子，100mM靛蓝分别投入0，1.25，2.5，5，7.5ul；其腐殖酸终浓度为0，5，10，20，30mM。
表7： PCR体系
组分 浓度 25ul体系加入体积（μL）
Tris-HCl(pH8.8) 1M 1
MgCl2 25mM 2.0
KCl 2M 2
dNTP Each 10μM 0.5
STR 20重引物 10μM 0.5
gDNA模板 1ng/ul 1
B-Taq 5U/ul 0.5
靛蓝 100mM 0，1.25，2.5，5，7.5
ddH2O - 17.5，16.25，15，12.5，10
表8：PCR循环过程示例
Figure DEST_PATH_IMAGE005
将PCR扩增产物，取10ul跑2%琼脂糖凝胶，结果显示在图6。从图6可以看出：本发明突变型Taq酶可以完全耐受10mM的靛蓝，部分耐受20mM的靛蓝，30mM的靛蓝对体系抑制严重，基本不耐受。
序列表
<110> 武汉翌圣生物科技有限公司
<120> 高效末端加A的突变型Taq DNA聚合酶及其编码DNA
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 832
<212> PRT
<213> Thermus aquaticm
<400> 1
Met Arg Gly Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu
1 5 10 15
Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe His Ala Leu Lys Gly
20 25 30
Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala
35 40 45
Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Asp Ala Val Ile Val
50 55 60
Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Gly Gly
65 70 75 80
Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln Leu
85 90 95
Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Leu Ala Arg Leu Glu
100 105 110
Val Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Ser Leu Ala Lys Lys
115 120 125
Ala Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Lys Asp
130 135 140
Leu Tyr Gln Leu Leu Ser Asp Arg Ile His Val Leu His Pro Glu Gly
145 150 155 160
Tyr Leu Ile Thr Pro Ala Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg Pro
165 170 175
Asp Gln Trp Ala Asp Tyr Arg Ala Leu Thr Gly Asp Glu Ser Asp Asn
180 185 190
Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Arg Lys Leu Leu
195 200 205
Glu Glu Trp Gly Ser Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg Leu
210 215 220
Lys Pro Ala Ile Arg Glu Lys Ile Leu Ala His Met Asp Asp Leu Lys
225 230 235 240
Leu Ser Trp Asp Leu Ala Lys Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val
245 250 255
Asp Phe Ala Lys Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Arg Leu Arg Ala Phe
260 265 270
Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu
275 280 285
Glu Ser Pro Lys Ala Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly
290 295 300
Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp
305 310 315 320
Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Arg Gly Gly Arg Val His Arg Ala Pro
325 330 335
Glu Pro Tyr Lys Ala Leu Arg Asp Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu
340 345 350
Ala Lys Asp Leu Ser Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu Pro
355 360 365
Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn
370 375 380
Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu
385 390 395 400
Glu Ala Gly Glu Arg Ala Ala Leu Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu
405 410 415
Trp Gly Arg Leu Glu Gly Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu
420 425 430
Val Glu Arg Pro Leu Ser Ala Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly
435 440 445
Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala
450 455 460
Glu Glu Ile Ala Arg Leu Glu Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His
465 470 475 480
Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp
485 490 495
Glu Leu Gly Leu Pro Ala Ile Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg
500 505 510
Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile
515 520 525
Val Glu Lys Ile Leu Gln Tyr Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr
530 535 540
Tyr Ile Asp Pro Leu Pro Asp Leu Ile His Pro Arg Thr Gly Arg Leu
545 550 555 560
His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser
565 570 575
Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln
580 585 590
Arg Ile Arg Arg Ala Phe Ile Ala Glu Glu Gly Trp Leu Leu Val Ala
595 600 605
Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly
610 615 620
Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Arg Asp Ile His Thr
625 630 635 640
Glu Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Arg Glu Ala Val Asp Pro
645 650 655
Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly
660 665 670
Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu
675 680 685
Ala Gln Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg
690 695 700
Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Arg Arg Gly Tyr Val
705 710 715 720
Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Glu Ala Arg
725 730 735
Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro
740 745 750
Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu
755 760 765
Phe Pro Arg Leu Glu Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln Val His
770 775 780
Asp Glu Leu Val Leu Glu Ala Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ala Val Ala
785 790 795 800
Arg Leu Ala Lys Glu Val Met Glu Gly Val Tyr Pro Leu Ala Val Pro
805 810 815
Leu Glu Val Glu Val Gly Ile Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Glu
820 825 830
<210> 2
<211> 2496
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
atgcgcggca tgctgccgct gtttgaaccg aaaggccgcg tgctgctggt ggatggccat 60
catctggcgt atcgcacctt tcatgcgctg aaaggcctga ccaccagccg cggcgaaccg 120
gtgcaggcgg tgtatggctt tgcgaaaagc ctgctgaaag cgctgaaaga agatggcgat 180
gcggtgattg tggtgtttga tgcgaaagcg ccgagctttc gccatgaagc gtatggcggc 240
tataaagcgg gccgcgcgcc gaccccggaa gattttccgc gccagctggc gctgattaaa 300
gaactggtgg atctgctggg cctggcgcgc ctggaagtgc cgggctatga agcggatgat 360
gtgctggcga gcctggcgaa aaaagcggaa aaagaaggct atgaagtgcg cattctgacc 420
gcggataaag atctgtatca gctgctgagc gatcgcattc atgtgctgca tccggaaggc 480
tatctgatta ccccggcgtg gctgtgggaa aaatatggcc tgcgcccgga tcagtgggcg 540
gattatcgcg cgctgaccgg caaagaaagc gataacctgc cgggcgtgaa aggcattggc 600
gaaaaaaccg cgcgcaaact gctggaagaa tggggcagcc tggaagcgct gctgaaaaac 660
ctggatcgcc tgaaaccggc gattcgcgaa aaaattctgg cgcatatgga tgatctgaaa 720
ctgagctggg atctggcgaa agtgcgcacc gatctgccgc tggaagtgga ttttgcgaaa 780
cgccgcgaac cggatcgcga acgcctgcgc gcgtttctgg aacgcctgga atttggcagc 840
ctgctgcatg aatttggcct gctggaaagc ccgaaagcgc tggaagaagc gccgtggccg 900
ccgccggaag gcgcgtttgt gggctttgtg ctgagccgca aagaaccgat gtgggcggat 960
ctgctggcgc tggcggcggc gcgcggcggc cgcgtgcatc gcgcgccgga accgtataaa 1020
gcgctgcgcg atctgaaaga agcgcgcggc ctgctggcga aagatctgag cgtgctggcg 1080
ctgcgcgaag gcctgggcct gccgccgggc gatgatccga tgctgctggc gtatctgctg 1140
gatccgagca acaccacccc ggaaggcgtg gcgcgccgct atggcggcga atggaccgaa 1200
gaagcgggcg aacgcgcggc gctgagcgaa cgcctgtttg cgaacctgtg gggccgcctg 1260
gaaggcgaag aacgcctgct gtggctgtat cgcgaagtgg aacgcccgct gagcgcggtg 1320
ctggcgcata tggaagcgac cggcgtgcgc ctggatgtgg cgtatctgcg cgcgctgagc 1380
ctggaagtgg cggaagaaat tgcgcgcctg gaagcggaag tgtttcgcct ggcgggccat 1440
ccgtttaacc tgaacagccg cgatcagctg gaacgcgtgc tgtttgatga actgggcctg 1500
ccggcgattg gcaaacgcga aaaaaccggc aaacgcagca ccagcgcggc ggtgctggaa 1560
gcgctgcgcg aagcgcatcc gattgtggaa aaaattctgc agtatcgcga actgaccaaa 1620
ctgaaaagca cctatattga tccgctgccg gatctgattc atccgcgcac cggccgcctg 1680
catacccgct ttaaccagac cgcgaccgcg accggccgcc tgagcagcag cgatccgaac 1740
ctgcagaaca ttccggtgcg caccccgctg ggccagcgca ttcgccgcgc gtttattgcg 1800
gaagaaggct ggctgctggt ggcgctggat tatagccaga ttgaactgcg cgtgctggcg 1860
catctgagcg gcgatgaaaa cctgattcgc gtgtttcagg aaggccgcga tattcatacc 1920
gaaaccgcga gctggatgtt tggcgtgccg cgcgaagcgg tggatccgct gatgcgccgc 1980
gcggcgaaaa ccattaactt tggcgtgctg tatggcatga gcgcgcatcg cctgagccag 2040
gaactggcga ttccgtatga agaagcgcag gcgtttattg aacgctattt tcagagcttt 2100
ccgaaagtgc gcgcgtggat tgaaaaacgc ctggaagaag gccgccgccg cggctatgtg 2160
gaaaccctgt ttggccgccg ccgctatgtg ccggatctgg aagcgcgcgt gaaaagcgtg 2220
cgcgaagcga aagaacgcat ggcgtttaac atgccggtgc agggcaccgc ggcggatctg 2280
atgaaactgg cgatggtgaa actgtttccg cgcctggaag aaatgggcgc gcgcatgctg 2340
ctgcaggtgc atgatgaact ggtgctggaa gcgccgaaag aacgcgcgga agcggtggcg 2400
cgcctggcga aagaagtgat ggaaggcgtg tatccgctgg cggtgccgct ggaagtggaa 2460
gtgggcattg gcgaagattg gctgagcgcg aaagaa 2496

Claims (3)

1.一种高效末端加A的突变型Taq DNA聚合酶，其蛋白质序列为在如SEQ ID NO：1所示的野生型Taq DNA聚合酶基础上进行如下四个位点的突变：D188K、T506R、T710R和A744K。
2.权利要求1所述的高效末端加A的突变型Taq DNA聚合酶的编码DNA，其序列如SEQ IDNO：2所示。
3.权利要求1所述的高效末端加A的突变型Taq DNA聚合酶在STR检测中的应用。
CN202110677296.0A 2021-03-11 2021-06-18 高效末端加A的突变型Taq DNA聚合酶及其编码DNA Active CN113388595B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110264910 2021-03-11
CN2021102649100 2021-03-11

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113388595A CN113388595A (zh) 2021-09-14
CN113388595B true CN113388595B (zh) 2022-07-15

Family

ID=77621930

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110677296.0A Active CN113388595B (zh) 2021-03-11 2021-06-18 高效末端加A的突变型Taq DNA聚合酶及其编码DNA

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113388595B (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020228757A1 (en) * 2019-05-14 2020-11-19 Wuhan Abclonal Biotechnology Co., Ltd Mutant taq polymerase resistant to inhibition of amplification in the presence of cyanine dye
CN111996179A (zh) * 2020-08-21 2020-11-27 成都汇瑞新元生物科技有限责任公司 一种dna聚合酶及其在pcr检测中的应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020228757A1 (en) * 2019-05-14 2020-11-19 Wuhan Abclonal Biotechnology Co., Ltd Mutant taq polymerase resistant to inhibition of amplification in the presence of cyanine dye
CN111996179A (zh) * 2020-08-21 2020-11-27 成都汇瑞新元生物科技有限责任公司 一种dna聚合酶及其在pcr检测中的应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Mutants of Taq DNA polymerase resistant to PCR inhibitors allow DNA amplification from whole blood and crude soil samples;Milko B. Kermekchiev等;《Nucleic Acids Research》;20090210;第1-14页 *
Taq DNA polymerase slippage mutation rates measured by PCR and quasi-likelihood analysis:(CA/GT)n and (A/T)n microsatellites;Deepali Shinde等;《Nucleic Acids Research》;20031231;第974-980页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN113388595A (zh) 2021-09-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7322063B2 (ja) 新規なプライマーおよびその使用
KR101327376B1 (ko) 폴리뉴클레오티드 증폭
JP2843675B2 (ja) メッセンジャーｒｎａの同定、単離およびクローニング
US9506110B2 (en) Processing of amplified DNA fragments for sequencing
JP5526326B2 (ja) 核酸配列増幅方法
CN112029748B (zh) 一种Taq DNA聚合酶突变体Mut4及其应用
EP1546345B1 (en) Genome partitioning
CA2318760C (en) Method for determining dna nucleotide sequence
NZ334426A (en) Characterising cDNA comprising cutting sample cDNAs with a first endonuclease, sorting fragments according to the un-paired ends of the DNA, cutting with a second endonuclease then sorting the fragments
EP1138764A2 (en) Two-step reverse transcription
CN108138175A (zh) 用于分子条形码编码的试剂、试剂盒和方法
CN109402082A (zh) 一种Taq DNA聚合酶突变体及其应用
CN113388595B (zh) 高效末端加A的突变型Taq DNA聚合酶及其编码DNA
CN109486919B (zh) 一种pcr扩增试剂及其应用
EP4092136B1 (en) Capture probes and uses thereof
CN112063690A (zh) 单分子探针多重靶向捕获文库的构建方法及应用
CN111733256A (zh) 一种基于Cytb基因片段的蛇鮈和长蛇鮈的分子鉴别方法
JP2002000275A (ja) 新規な定量的多型解析方法
CN112301136B (zh) 一种基于线粒体coi基因鉴别花鰶和斑鰶的分子标记及其应用
KR20140134869A (ko) 한국산 황기의 마이크로새틀라이트 마커 및 이를 증폭하기 위한 프라이머 세트
KR102236770B1 (ko) 개별꽃을 분별하기 위한 바이오마커 조성물, 이를 포함하는 키트 및 이를 이용하여 개별꽃을 분별하는 방법
CN110438212B (zh) 用于特定基因片段富集检测的酶切pcr试剂盒和方法
WO2009079733A1 (en) Determination of variants produced upon replication or transcription of nucleic acid sequences
AU2003254445B2 (en) Nucleic acid amplification method
CN112646809A (zh) 用于检测酶末端修复能力的核酸序列、方法及试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant