CN112646809A - 用于检测酶末端修复能力的核酸序列、方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于检测酶末端修复能力的核酸序列，包括双链区域和非双链区域，所述非双链区域位于所述核酸序列的末端，具有末端修复能力的酶作用于所述非双链区域。一种采用上述核酸序列的酶活检测方法及试剂盒。从而提供了一种更为快速、便捷和安全的用于检测酶的检测试剂和检测。

Description

用于检测酶末端修复能力的核酸序列、方法及试剂盒

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种用于检测酶末端修复能力的核酸序列、方法和试剂盒。

背景技术

近些年日益成熟的高通量测序技术(Generation Sequencing，NGS)因通量高、准确性高、灵敏性高、自动化程度高和运行低成本等突出的优势，使其应用于多个研究领域，比如无创产前检测、染色体异常检测、基因组测序、外显子测序、转录组测序、表观基因组测序、染色体三维结构测序等。二代测序的主流平台一般均采用边合成边测序(SequencingBy Synthesis,SBS)技术进行核酸测序。测序前，需要对核酸(DNA或RNA)样本进行测序文库的构建，基本流程如下：步骤A:将片段化后的DNA进行片段的末端修复，步骤B：在修复后的片段3'端加“A”碱基，步骤C：将上述DNA片段与含有测序引物结合位点的DNA接头(Adapter)连接，步骤D：通过PCR进行扩增，完成测序文库构建。在文库构建方法中通常需要采用4-6种主要的酶，以及与这些酶活性相适应的反应体系，其中任何一种酶的活性存在问题，都会对建库实验的结果产生直接的影响，以及造成不必要的时间成本和经济成本的浪费。

在测序文库构建过程中，对DNA片段具有末端修复能力的酶起到了关键作用，例如，采用具有末端修复能力的酶将片段化的DNA片段进行末端修复，得到平末端DNA片段，此时，具有末端修复能力的酶的活性是影响末端修复的关键因素，而在DNA测序文库构建过程中，末端修复步骤是建库成功的基础步骤。

目前，对酶的活性检测需要通过同位素技术和专门仪器，但由于其对同位素和仪器的依赖而费时较多和不便于操作，同时，同位素多存在放射性，会对有机体造成不同程度的损伤。因此，亟需一种更为快速、便捷和安全的用于检测酶的，特别是对具有末端修复能力的酶的检测方法和检测试剂。

发明内容

鉴于上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种用于检测酶末端修复能力的核酸序列。

1.用于检测酶末端修复能力的核酸序列，包括双链区域和非双链区域，所述非双链区域位于所述核酸序列的末端，具有末端修复能力的酶作用于所述非双链区域。

2.根据项1所述核酸序列，所述非双链区域为一个或两个。

3.根据项1所述核酸序列，所述非双链区域为一段单链核酸序列或两段非互补的单链核苷酸序列。即所述非双链区域可以以单链形式存在，也可以以非互补的双链形式存在。也即所述核酸序列可以是包含在5'-和/或3'-端具有一段突出的核苷酸序列(核苷酸单链)的核酸序列，也就是说，所述核酸序列可以是具有一个或两个粘性末端的DNA片段；或者，所述核酸序列也可以是在5'-和/或3'-端具有一段非互补序列的两条单链形成的非双链区域，如Y型DNA片段。

4.用于检测酶末端修复能力的方法，所述方法采用项1-3任一项所述核酸序列作为测试底物。

5.根据项4所述方法，包括：

采用具有末端修复能力的酶对测试底物进行末端修复，以便获得修复的核酸片段；

对所述测试底物和修复的核酸片段的特征进行检测，以便基于所述测试底物和修复的核酸片段的特征，评估具有末端修复能力的酶的活性。

6.根据项5所述方法，所述特征为双链区域的碱基数目和/或位于双链区域5'端的非双链区域的碱基数目。

7.用于检测酶对DNA片段末端修复能力的试剂盒，其包括项1-3任一项所述核酸序列。

8.根据项1-3任一项所述核酸序列，项4-6任一项所述方法，或项6或7所述试剂盒，所述具有末端修复能力的酶具有3'→5'外切酶活性和/或5'→3'聚合活性。

9.根据项1-3任一项所述核酸序列，项4-6任一项所述方法，或项6或7所述试剂盒，所述具有末端修复能力的酶为具有3'→5'外切酶活性和/或5'→3'聚合活性的聚合酶。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：提供了一种用于检测酶末端修复能力的核酸序列，本发明的核酸序列能够对具有末端修复能力的酶的至少两项能力进行检测。进一步提供了用于检测酶末端修复能力的检测方法和试剂盒，其操作步骤人工参与少，流程简便快捷，检测结果准确稳定，无放射性有害物质，安全性更高。

附图说明

图1是采用阴性对照进行酶活检测的结果示意图；

图2是采用一列具有末端修复能力的酶样本进行酶活检测的结果示意图；

图3是采用另一列具有末端修复能力的酶样本进行酶活检测的结果示意图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

在一方面，本发明提供了一种用于检测酶末端修复能力的核酸序列(本发明的核酸序列)，包括双链区域和非双链区域，所述非双链区域位于所述核酸序列的末端，用于末端修复的酶作用于所述非双链区域。所述核酸序列优选为脱氧核糖核苷酸。具体的用于检测酶末端修复能力的核酸序列可以是用于检测酶对DNA片段末端修复能力的核酸序列

在本发明的具体实施例中，末端修复能力是指将带有非双链区域的双链核苷酸的非双链区域恢复为双链区域的能力。如，将非双链区域的碱基序列去掉的能力，以及将非双链区域的碱基序列增加互补配对的碱基从而形成双链区域的能力。具体可以是，例如，将3'→5'方向突出的碱基去掉的能力，以及将5'→3'方向突出的碱基序列增加互补配对的碱基从而形成双链区域的能力。

在本发明的具体实施例中，本发明的核酸序列可以包括一种核酸序列或者两种以上核酸序列的组合。具体的，包括一种核酸序列可以是一种在一端带有非双链区域的双链核苷酸分子，具体可以是如“Y”型的DNA片段。包括两种核酸序列可以是一种在3'端带有一段单链的双链核苷酸分子和一种在5'端带有一段单链的双链核苷酸分子的组合。

在本发明具体实施例中，双链区域可以是双链DNA，即dsDNA(double-strandedDNA)，dsDNA具体是指DNA分子是由两条链组成，这两条链通过碱基配对结合在一起。所述双链区域的碱基数目可以是任何数量，优选是与目标测试酶相适应的实验步骤需要采用的片段的碱基数目相一致。如在二代测序文库构建过程中，如果目标测试酶为末端修复酶，则双链区域的碱基数目是二代测序文库构建需要进行末端修复的片段的大小。具体可以是，需要进行末端修复的片段的碱基数目，例如为20～300bp。优选地，需要进行末端修复的片段的碱基数目为25～200bp。更优选地，需要进行末端修复的片段的碱基数目为50-100bp。

在本发明的核酸序列的具体实施例中，非双链区域可以是一个或两个。非双链区域也可以是一条单链核酸序列或两条非互补的单链核苷酸序列。具体来说，本发明的核酸序列可以是具有5'-和/或3'-突出核苷酸序列的核酸序列，如具有两个粘性末端的DNA片段；所述核酸序列也可以是在其一端或两端具有非互补序列的两条单链，如“Y”型的DNA片段。

在另一方面，本发明提供了一种用于检测酶末端修复能力的方法(本发明的方法)。具体的，本发明的方法采用本发明的核酸序列作为测试底物。

本发明中，底物是指参与末端修复反应的物质，具体可为需要进行末端修复核酸分子或化合物，作用可形成产物，即被末端修复的核酸分子或化合物。测试底物在本发明中是指用于酶末端修复能力的检测的底物。

本发明提供的一种用于检测酶末端修复能力的方法，包括：

采用具有末端修复能力的酶对测试底物进行末端修复，以便获得修复的核酸片段；对所述测试底物和修复的核酸片段的特征进行检测，以便基于所述测试底物和修复的核酸片段的特征，评估具有末端修复能力的酶的活性。

在本发明的方法的具体实施例中，上述特征为双链区域的碱基序列数目和/或位于双链区域5'端的非双链区域的碱基数目。在双链区域的核酸序列中，碱基数目为碱基对序列的数目。可以通过本领域常用的检测仪器实现对碱基数目的检测，也即实现对测试底物和修复的核酸片段特征的检测，可以采用例如Caliper或Aligent对核酸序列的特征进行峰图检测。

在本发明的方法的具体实施例中，末端修复反应的条件可以是20℃，25分钟-35分钟；此外，反应条件也可以选择以下任意温度与时间的组合，如末端修复反应的温度为20℃，对应末端修复反应的时间为27、30、31和33分钟，优选地，末端修复反应的条件为：20℃，30分钟。

在又一方面，本发明提供了一种用于检测酶末端修复能力的试剂盒(本发明的试剂盒)，包括本发明的核酸序列。在本发明中，具有末端修复能力的酶具有3'→5'外切酶活性和/或5'→3'聚合活性。优选地，具有末端修复能力的酶为具有3'→5'外切酶活性和/或5'→3'聚合活性的聚合酶。

在本发明的具体实施例中，具有3'→5'外切酶活性和5'→3'聚合活性的聚合酶可以选自以下任一种：T4 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶和klenow片段。优选地，可以是T4 DNA聚合酶。

T4 DNA聚合酶，即T4 DNA Polymerase，是一种模板依赖的DNA聚合酶，可以在结合有引物的单链DNA模板上，从5'→3'方向催化DNA合成反应，具有5'→3'DNA聚合酶活性，同时具有3'→5'外切酶活性，但不具有5'→3'外切酶活性。可以用于将5'端突出末端补平或3'端突出末端削平。

在本发明的试剂盒的具体实施例中，所述试剂盒还可以包括用于具有末端修复能力的酶的目标反应的试剂，如末端修复反应使用的缓冲液等。具体可以是选自dNTP，T4 PNKbuffer，灭菌纯化水，EDTA试剂和SDS试剂等本领域常用于进行末端修复反应的试剂。

在本发明的具体实施例中，还可以包括对本发明的核酸序列进行制备的步骤，如先合成能构成本发明的核酸序列的单链核苷酸，再通过退火反应使单链核苷酸通过在双链区域互补配对而形成本发明的核酸序列。退火反应的可以采用本领域技术人员通常采用的程序，如95℃，10分钟；70℃，10分钟；65℃，10分钟；60℃，10分钟；55℃，10分钟；50℃，10min；25℃保存。

实施例

选取两例具有末端修复能力的酶作为测试底物，本实施例中具有末端修复能力的酶是T4 DNA Polymerase(诺唯赞)，分别标记为酶A和酶B，其中，酶A在外包装记载效期内，酶B超过外包装记载效期1年9个月。

对酶A和酶B的末端修复能力进行检测，具体方法如下：

步骤A设计与合成用于检测酶末端修复能力的核酸序列(测试底物)

SEQ ID NO 1:5'-GATCGAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTC-3'；

SEQ ID NO 2:5'-CACTCTTTCCCTACACGACGCTCTCGATC-3'。

设计与合成的核酸序列(测试底物)为“Y”型DNA片段。其碱基数目为29bp，其中，双链区域的碱基数目为10bp，非双链区域的碱基数目为19bp。非双链区域为两条碱基序列无法互补配对连接的单链。

步骤B末端修复反应

a)按照下表所示的试剂用量进行配制。

b)20℃条件下温育30分钟。

将反应完成后的混合物中添加1mL EDTA(0.5M)，震荡混匀，2000rpm离心10s，室温静置5min。

将静置完成的混合物中添加10mL SDS(1％)，震荡混匀，2000rpm离心10秒，室温过夜。得到修复的DNA片段(修复产物)。

步骤C测定修复产物的量

实验员对修复的DNA片段进行Caliper检测。Caliper能够检测双链或单链核酸片段的片段长度，但当检测体系中同时存在单链和双链的核酸片段时，检测结果会出现与待检测片段的片段长度不一致的主峰、杂峰等异常峰。

Caliper检测结果如图1-图3所示，

由图1可见，当添加酶的量为0时(此时酶以5μL灭菌纯化水替代)，检测结果图中有一条主峰在86bp附近，以及一些片段大小不等的杂峰，由于Caliper无法准确检测“Y”型DNA片段(测试底物)的片段大小，因此检测结果图呈现多种片段大小及杂峰的情况。由图2可见，在效期内的酶A，检测结果图中有一条单一的主峰在29bp，没有其他杂峰，这与加入的测试底物的片段大小一致。由此可知，酶A修复了全部的测试底物的片段，修复效果好。由图3可见。超过效期内的酶B，检测结果图中存在多个片段长度的峰，杂峰多且不单一，由此可知，说明测试底物的片段没有被全部修复。

综上，采用本发明的用于检测酶对DNA片段末端修复能力的核酸序列、以及用于检测酶对DNA片段末端修复能力的方法，可以同时检测具有末端修复能力的酶的两种能力，具体为对核酸单链的外切能力和对核酸单链的互补链修复能力。本发明的方法操作步骤人工参与少，流程简便快捷，检测结果准确，无放射性有害物质，安全性更高。

上述说明示出并描述了本发明的优选实施例，如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 安诺优达基因科技（北京）有限公司

<120> 用于检测酶末端修复能力的核酸序列、方法及试剂盒

<130> 1907-4IREC

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 测试底物序列1

GATCGAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTC 29

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 测试底物序列2

CACTCTTTCCCTACACGACGCTCTCGATC 29

Claims (9)

1.用于检测酶末端修复能力的核酸序列，其特征在于，包括双链区域和非双链区域，所述非双链区域位于所述核酸序列的末端，具有末端修复能力的酶作用于所述非双链区域。

2.根据权利要求1所述核酸序列，其特征在于，所述非双链区域为一个或两个。

3.根据权利要求1所述核酸序列，其特征在于，所述非双链区域为一段单链核酸序列或两段非互补的单链核苷酸序列。

4.用于检测酶末端修复能力的方法，其特征在于，所述方法采用权利要求1-3任一项所述核酸序列作为测试底物。

5.根据权利要求4所述方法，包括：

采用具有末端修复能力的酶对测试底物进行末端修复，以便获得修复的核酸片段；

对所述测试底物和修复的核酸片段的特征进行检测，以便基于所述测试底物和修复的核酸片段的特征，评估具有末端修复能力的酶的活性。

6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述特征为双链区域的碱基数目和/或位于双链区域5'端的非双链区域的碱基数目。

7.用于检测酶末端修复能力的试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1-3任一项所述核酸序列。

8.根据权利要求1-3任一项所述核酸序列，权利要求4-6任一项所述方法，或权利要求6或7所述试剂盒，其特征在于，所述具有末端修复能力的酶具有3'→5'外切酶活性和/或5'→3'聚合活性。

9.根据权利要求1-3任一项所述核酸序列，权利要求4-6任一项所述方法，或权利要求6或7所述试剂盒，其特征在于，所述具有末端修复能力的酶是具有3'→5'外切酶活性和/或5'→3'聚合活性的聚合酶。

Images