KR20140134869A

KR20140134869A - 한국산 황기의 마이크로새틀라이트 마커 및 이를 증폭하기 위한 프라이머 세트

Info

Publication number: KR20140134869A
Application number: KR20130054799A
Authority: KR
Inventors: 최병희; 최인수
Original assignee: 인하대학교 산학협력단
Priority date: 2013-05-15
Filing date: 2013-05-15
Publication date: 2014-11-25
Also published as: KR101481734B1

Abstract

본 발명은 한국에서 재배되는 황기의 마이크로새틀라이트 마커 및 이를 증폭하기 위한 프라이머 세트에 관한 것이다. 본 발명에 따른 한국에서 재배되는 황기의 마이크로새틀라이트 마커는 한국에서 재배되는 황기(Astragalus mongholicus var. dahuricus)와 멸종위기 식물인 제주황기(A. mongholicus var. nakaianus)에서 다형성을 나타냄으로써 상기 마이크로새틀라이트 마커를 이용하면 동아시아 황기의 분자적 판별과 생물계통학적 연구에 유용하게 이용될 수 있고, 또한 한라산에서 자생하는 제주황기의 보전전략을 수립하기 위한 유전적 도구로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

한국산 황기의 마이크로새틀라이트 마커 및 이를 증폭하기 위한 프라이머 세트{Microsatellite marker of Korean Astragalus mongholicus and primer set for amplifying the same}

본 발명은 한국산 황기의 마이크로새틀라이트 마커 및 이를 증폭하기 위한 프라이머 세트에 관한 것이다.

개체군 유전학은 최근 비약적 발전을 경험하고 있다. 1960년대에는 알로자임과 같은 분자마커를 이용하여 자연집단 내에 존재하는 이형접합자의 빈도(frequency of heterozygosity)와 유전적 다형성 (genetic polymorphism)을 측정하는 것이 주된 연구 분야이었다. 하지만 1980년대 중반에 들어서면서부터 PCR(polymerase chain reaction)을 비롯한 정교한 분자생물학적 기법이 개발되면서 마이크로새틀라이트(microsatellite) 및 AFLP(amplified fragment length polymorphism)와 같이 풍부한 변이를 지닌 DNA 기반의 분자마커가 개발 및 적용되어 왔다. 특히 마이크로새틀라이트는 간단한 PCR과 전기영동과정을 통해 유전자형 결정이 가능하고, 매우 높은 다형성을 지니고 있어 개체군 유전학에서 가장 많이 이용되는 분자마커이다. 이를 이용하여 개체식별, 개체군의 구조 및 크기 변동 등 다양한 개체군 유전학적 분석이 수행되고 있다.

한편, 황기(Astragalus mongholicus Bunge)는 콩과(Leguminosae) 황기속(Astragalus L.)에 속하는 약용식물로 중국, 일본, 한국 등에서 분포하며 다양한 변종을 포함하고 있다. 우리나라 내륙지역에서 널리 재배하고 있는 한국에서 재배되는 황기의 학명은 A. mongholicus var. dahuricus Podlech로 최근 까지 사용된 비합법명인 A. membranaceus Bunge라는 학명을 대신해서 Choi et al.(2013)에 의해 제시되었다.

황기는 건조된 뿌리를 약으로 이용하며 뿌리에는 아스트라갈로사이드(astragaloside) I~VII 등의 사포닌, 이소플라보노이드류와 아미노산인 v-아미노부티르산 등이 함유되어 있다. 황기의 약리효과로는 심작수축운동 및 강심작용, 신장혈관 및 전신 말초혈관을 확장시켜 혈압을 낮추고 이뇨, 진정작용 및 자궁수축작용을 하는 등이 알려져 있으며, 최근에는 간질환 및 항암치료에도 탁월한 효과가 있는 것으로 보고되고 있다.

이러한 황기의 상업적인 가치에 따라서 황기뿌리의 위장품(adulterant)으로서 동일 속의 A. hoangchy, A. chinesis, A. adsurgens, A. complantanus 등이 유통되기도 한다. 또한 황기는 변종별, 산지별로 함유된 성분이나 효능에서 차이가 있는 것으로 알려져 있고, 한국산 황기는 중국산 황기보다 시장에서 높은 가격에 거래되고 있다. 따라서 이들의 구별은 경제 및 약리적 측면에서 중요한 의미를 갖는다.

황기에 대한 대부분의 연구는 형태적인 형질(Lee and Chung, 2004), 리보솜 DNA 시퀀스(Ma et al., 2000; Yip and Kwan, 2006; Gao et al., 2010), SCAR 마커(Lim et al., 2007; Yang et al., 2011) 그리고 화합물 분석(Ma et al. 2002) 등을 이용해 황기를 다른 식물로부터 판별해내는 것이었다. 이러한 접근방법들은 다른 종들로부터 황기를 구별해내는데 있어서 유용하였으나 지역적인 변종들을 파악하는데 있어서는 충분한 판단력을 보이지 않았다.

한편, 제주황기(A. mongholicus var. nakaianus Choi & Choi)는 제주도 한라산의 고산 초지에 자라는 한국특산식물이다. 한라산내의 매우 좁은 지역에 소수의 개체들이 남아 있기 때문에 이 종은 산림청 지정 CR등급의 멸종위기식물로 지정되었다(Korea National Arboretum, 2008). 또한 최근 한라산의 서식지 파편화 (Kang et al., 2008) 및 아고산 초지대 나지의 확대(Kim, 2006)는 이 식물의 생존에 큰 위험요소로서 작용하고 있다. 그러나 이 식물의 개체군에 대한 기본적인 유전정보조차 알려진 바가 없기 때문에 적합한 보전전략을 수립하는 것은 어려운 실정이다.

따라서, 본 발명자는 한국에서 재배되는 황기(A. mongholicus var. dahuricus)와 멸종위기 식물인 제주황기(A. mongholicus var. nakaianus)에서 다형성을 나타내는 10종의 새로운 마이크로새틀라이트 마커와 이를 증폭하기 위한 프라이머 세트를 제공함으로써, 상기 마이크로새틀라이트 마커를 이용하여 동아시아 황기의 분자적 판별과 생물계통학적 연구에 유용하게 이용될 수 있도록, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 서열번호 21 내지 30 중에서 선택된 어느 하나의 염기서열로 이루어지는, 한국산 황기의 마이크로새틀라이트 마커를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 서열번호 1 및 서열번호 2; 서열번호 3 및 서열번호 4; 서열번호 5 및 서열번호 6; 서열번호 7 및 서열번호 8; 서열번호 9 및 서열번호 10; 서열번호 11 및 서열번호 12; 서열번호 13 및 서열번호 14; 서열번호 15 및 서열번호 16; 서열번호 17 및 서열번호 18; 서열번호 19 및 서열번호 20;으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 프라이머쌍으로 구성된 한국산 황기의 마이크로새틀라이트 마커를 증폭하기 위한 프라이머 세트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는, 한국산 황기 선별용 PCR 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 21 내지 30 중에서 선택된 어느 하나의 염기서열, 또는 이의 상보적인 염기서열을 포함하는 한국산 황기 선별용 프로브를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 21 내지 30 중에서 선택된 어느 하나의 염기서열로 이루어진 뉴클레오타이드, 그에 의해 코딩되는 폴리펩다이드 또는 그의 cDNA를 포함하는, 한국산 황기 선별용 마이크로어레이를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 쌍으로 구성된 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행한 후, 증폭된 DNA를 시퀀싱하여 서열번호 21 내지 30 중 어느 하나의 마이크로새틀라이트 마커와 비교하여 분석하는 단계를 포함하는, 한국산 황기의 선별방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 서열번호 21 내지 30 중에서 선택된 어느 하나의 염기서열로 이루어지는, 한국산 황기의 마이크로새틀라이트 마커를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2; 서열번호 3 및 서열번호 4; 서열번호 5 및 서열번호 6; 서열번호 7 및 서열번호 8; 서열번호 9 및 서열번호 10; 서열번호 11 및 서열번호 12; 서열번호 13 및 서열번호 14; 서열번호 15 및 서열번호 16; 서열번호 17 및 서열번호 18; 서열번호 19 및 서열번호 20;으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 프라이머쌍으로 구성된 한국산 황기의 마이크로새틀라이트 마커를 증폭하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는, 한국산 황기 선별용 PCR 키트를 제공한다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 21 내지 30 중에서 선택된 어느 하나의 염기서열, 또는 이의 상보적인 염기서열을 포함하는 한국산 황기 선별용 프로브를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 21 내지 30 중에서 선택된 어느 하나의 염기서열로 이루어진 뉴클레오타이드, 그에 의해 코딩되는 폴리펩다이드 또는 그의 cDNA를 포함하는, 한국산 황기 선별용 마이크로어레이를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 쌍으로 구성된 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행한 후, 증폭된 DNA를 시퀀싱하여 서열번호 21 내지 30 중 어느 하나의 마이크로새틀라이트 마커와 비교하여 분석하는 단계를 포함하는, 한국산 황기의 선별방법을 제공한다.

본 발명에 따른 한국산 황기의 마이크로새틀라이트 마커는, 한국에서 재배되는 황기(Astragalus mongholicus var. dahuricus)와 멸종위기 식물인 제주황기(A. mongholicus var. nakaianus)에서 다형성을 나타냄으로써 상기 마이크로새틀라이트 마커를 이용하면 동아시아 황기의 분자적 판별과 생물계통학적 연구에 유용하게 이용될 수 있고, 또한 한라산에서 자생하는 제주황기의 보전전략을 수립하기 위한 유전적 도구로서 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명은 서열번호 21 내지 30 중에서 선택된 어느 하나 이상의 염기서열로 이루어지는, 한국산 황기의 마이크로새틀라이트 마커를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 한국에서 재배되는 황기(Astragalus mongholicus var. dahuricus)와 멸종위기 식물인 제주황기(A. mongholicus var. nakaianus)에서 다형성을 나타내는 10종의 새로운 마이크로새틀라이트 마커와 이를 증폭하기 위한 프라이머 세트에 관한 것으로, 상기 마이크로 새틀라이트를 포함하는 DNA 절편을 클로닝하고, 상기 마이크로새틀라이트를 증폭하기 위한 프라이머 설계 및 PCR 조건의 최적화를 통해 10개의 마이크로새틀라이트 유전자 좌위를 확인하였고, 상기 마이크로새틀라이트의 유전자형을 분석하여, 상기 마이크로새틀라이트 마커 및 프라이머가 동아시아 황기의 분자적 판별과 생물계통학적 연구에 유용하게 이용될 수 있고, 또한 한라산에서 자생하는 제주황기의 보전전략을 수립하기 위한 유전적 도구로서 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용하는 용어인 '마이크로새틀라이트'는 1-5개의 짧은 염기서열이 반복되어 나타나는 것을 말하는데, 반복서열의 개수에 있어 매우 높은 다형성(polymorphism)을 나타내는 특징을 갖고 있어서 최근 개체군 유전적 구조 분석에 가장 선호되는 마커로 인정받고 있다. 이 분자마커는 간단한 PCR 기술을 적용하여 멘델의 유전법칙을 따르는 수많은 유전자 좌위(locus)를 이용할 수 있기 때문에 신뢰도가 높은 다양한 분석을 수행할 수 있다. 따라서 과거 연구에 이용되었던 동위효소(isozyme), 단백질 다형 등에 비교하여 매우 높은 식별력과 정보력을 갖는다. 특히 스코어링(scoring)과 지노타이핑(genotyping)과 같은 과정을 반자동화할 수 있어 대량의 데이터를 처리하는 것이 가능하다는 장점 또한 지니고 있다.

본 발명에서 사용하는 용어인 '프라이머'란 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(DNA 중합효소 또는 역전사 효소) 및 상이한 4가지 dNTP(deoxynucleoside triphosphate)의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.

프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예: 아크리딘, 프소랄렌 등), 킬레이트화제(예: 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등), 및 알킬화제를 함유할 수 있다.

또한, 본 발명의 프라이머 핵산 서열은 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소 (예컨대, 호스래디쉬 옥시다제, 알칼린 포스파타아제), 방사성 동위원소(예컨대, ³²P), 형광성 분자, 화학그룹 (예컨대, 바이오틴) 등이 있다.

본 발명에서 "선별"은 한국산 황기의 마이크로새틀라이트 마커 유전자를 포함하는 클로닝된 콜로니를 선택하는 것을 의미한다.

상기 한국산 황기 선별용 PCR 키트는 상기의 프라이머 세트 이외에, PCR 키트에 포함되는 통상적인 구성성분을 포함할 수 있다. 상기 키트에 포함되는 통상적인 구성성분은 반응완충액, 중합효소, dNTP(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP) 및 Mg²⁺와 같은 조인자 등일 수 있다. 다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭 단계에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 클레나우 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus (Pfu)를 포함한다. 상기 중합효소 대부분은 박테리아 그 자체로부터 분리될 수 있고 또는 상업적으로 구입할 수 있다. 또한, 본 발명에 이용되는 중합효소는 중합효소를 암호화하는 클로닝 유전자의 높은 레벨을 발현하는 세포로부터 획득할 수 있다. 중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다.

증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서, 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 21 내지 30 중에서 선택된 어느 하나의 염기서열, 또는 이의 상보적인 염기서열로 구성된 한국산 황기의 선별용 프로브를 제공한다.

본 발명에서 '프로브'란 혼성화 프로브를 의미하는 것으로, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 이를 이용하여, 황기의 게놈 DNA를 추출하여, 상기 서열번호 21 내지 30 중에서 선택된 어느 하나의 염기서열 또는 이의 상보적인 염기서열을 프로브로, 황기의 게놈 DNA와 혼성화시킬 수 있다.

상기 서열번호 21 내지 30의 염기서열은 다형성 서열(polymorphic sequence)이다. 다형성 서열이란 폴리뉴클레오티드 서열 중에서 SNP를 나타내는 다형성 부위(polymorphic site)를 포함하는 서열을 말한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA가 될 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 21 내지 30 중에서 선택된 어느 하나의 염기서열 또는 이의 상보적인 염기서열을 포함하는 마이크로어레이를 제공할 수 있다.

본 발명에 따른 마이크로어레이는 당분야의 당업자에게 알려져 있는 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.

예컨대, 상기 뉴클레오티드는 아미노 실란, 폴리-L-리신(poly-L-lysine) 및 알데히드로 이루어진 군에서 선택되는 활성기가 코팅된 기판 상에 고정될 수 있다. 또한, 상기 기판은 실리콘 웨이퍼, 유리, 석영, 금속 및 플라스틱으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드를 기판에 고정화시키는 방법은 압전(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅법(micropipetting), 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용할 수 있다.

또한 본 발명은

1) 서열번호 1 및 서열번호 2; 서열번호 3 및 서열번호 4; 서열번호 5 및 서열번호 6; 서열번호 7 및 서열번호 8; 서열번호 9 및 서열번호 10; 서열번호 11 및 서열번호 12; 서열번호 13 및 서열번호 14; 서열번호 15 및 서열번호 16; 서열번호 17 및 서열번호 18; 서열번호 19 및 서열번호 20로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 프라이머 쌍으로 구성된 프라이머 세트와 황기로부터 추출한 전체 DNA 시료를 혼합하여 PCR 반응을 수행하는 단계;

2) 상기 1)단계의 증폭된 DNA 시료를 이용하여 DNA 시퀀싱을 하는 단계; 및

3) 상기 2)단계의 DNA 시퀀싱을 분석하여 서열 번호 21 내지 30 중 어느 하나의 마이크로새틀라이트 마커와 비교하여 분석하는 단계;

를 포함하는, 한국산 황기의 선별방법을 제공한다.

본 발명의 한국산 황기의 선별방법에 대해 상세히 설명하면 다음과 같다.

상기 1) 단계는 황기로부터 추출한 전체 DNA를 PCR반응을 수행하는 단계로, 상기 "PCR 반응"은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고 되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(이하 PCR이라 한다)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(이하 RT-PCR로 표기한다)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등 (EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-매개 증폭(transcription-mediated amplification; TMA)(19) (WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication)(20)(WO 90/06995), 타겟 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences)(미국 특허 제6,410,276호), 공통 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR)(미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR)(미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA)(미국 특허 제5,130,238호, 제 5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification)(21, 22) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)(23)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제 09/854,317호에 기술되어 있다.

상기 2) 단계는 증폭된 DNA를 이용하여 DNA를 시퀀싱하는 단계로, DNA 시퀀싱은 현재 널리 이용되고 있는 DNA 염기서열(adenine, cytosine, guanine, thymine의 배열순서)을 결정하는 방법에는 화학적 분석법(Maxam-Gilbert법)과 사슬종결법(chain termination법, Sanger법)이 있으나, 이에 한하지 않고, 당업계에 널리 알려진 방법에 의한다.

상기 3) 단계는 DNA 시퀀싱 분석 결과를 비교하는 단계로, 본 발명의 프라이머쌍을 이용하여 증폭된 마이크로새틀라이트 DNA 마커는 적합한 방법으로 분석된다. 예를 들어, 상술한 증폭 반응 결과물을 젤 전기영동을 하고, 그 결과 형성되는 밴드를 관찰 및 분석함으로써 증폭된 마이크로새틀라이트 DNA 마커의 특성을 분석한다.

본 발명에서는 증폭된 마이크로새틀라이트 DNA 마커의 단편을 분석하여 이의 유전자형을 결정한다. 예를 들어, 마이크로새틀라이트 DNA 마커의 반복 서열의 수에 따라 달라지는 증폭산물의 크기를 분석하여 다양한 유전자형을 분류하고, 분류된 유전자형의 통계 자료에 기초하여 한국산 황기를 식별한다. 즉, 황기에 고빈도로 나타나거나 특이적으로 나타나는 마이크로새틀라이트 DNA 마커의 유전자형에 대한 정보를 축적하고, 축적된 정보에 근거하여 식별하려는 시료로부터 얻는 유전자형을 기존 축적된 유전자형 정보와 비교함으로써 한국산 황기의 품종을 높은 신뢰도로 식별하는 것이 가능하다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

[실시예 1] 시료 준비 및 DNA 추출

실험재료는 제주도 한라산(33°21′36″N, 126°31′14″E)에서 자생하는 제주황기 30개체와 강원도 정선군 북동리(37°23′15″N, 128°47′12″E)에서 재배되고 있는 황기 13개체, 총 43개체로부터 샘플을 수집하였다.

본 발명자는 식물체를 위한 G-spin^TMIIp Kit(iNtRON, Seongnam, Korea)를 이용하여, 한라산 개체군의 야생형 식물체로부터 게놈 DNA를 추출하였다.

[실시예 2] 마이크로새틀라이트를 포함하는 DNA 절편의 클로닝 및 염기서열 분석

마이크로새틀라이트의 대립유전자 좌위를 분리하기위해, Hammond et al. (1998)의 풍부화 프로토콜(enrichment protocol)을 일부 수정하여 실행하였다. 즉, 게놈 DNA를 MboI(Promega, Madison, WI, USA)으로 분해하여 획득된 DNA 절편들을 T4 DNA 라이게이즈(ligase)(Promega)를 이용하여 SAUL linker(Hammond et al. 1998)로 연결(ligation)시켰다. 상기 DNA 절편을 (AG)₁₅, (AT)₁₅, (AC)₁₅, (ATG)₁₀, (AGC)₁₀, (CAA)₁₀ 및 (ACAT)₇와 같은 7개의 바이오틴 표지된 프로브와 결합시킨 후, 마그네틱 비드(Streptavidin MagneSphere Paramagnetic Particles)(Promega)에 부착하였다.

DNA 절편을 증폭하였고 PCR 2.1-TOPO 벡터(Invitrogen, Carlsbad,CA,USA)를 이용하여 클로닝 하였다.

이후, 400 내지 800 bp(염기쌍) 삽입 부위를 갖는 클론을 선별하였다. 전체 중에서 선별된 196 클론들을 대상으로 마이크로새틀라이트를 갖고 있는지 여부를 확인하기 위해 BigDye Terminator version 3.1을 이용해서 ABI 3730xl sequencer (Applied Biosystems)로 염기서열을 분석하였다.

[실시예 3] 프라이머 설계 및 PCR 조건 최적화

본 발명자는 짧은 반복 부위 또는 짧은 삽입 부위를 갖는 프라이머 또는 그 벡터와 가까운 프라이머를 배제하였다. 왜냐하면 상기 프라이머들은 본 발명의 기준에 맞지 않았기 때문이다. 마이크로새틀라이트 반복 부위 및 충분한 삽입 부위를 갖는 46개의 염기서열로부터 프라이머쌍을 FastPCR version 5.4.51 software (Kalendar et al. 2009)을 이용하여 설계하였다.

M13(-21)(5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3') 서열-태그 방법을 상기 프라이머를 표지하기 위하여 이용하였다(Schuelke 2000). 대립유전자 좌위를 제주황기의 30 개체를 이용하여 초기에 스크리닝하였고 이후 북동리에서 재배되고 있는 황기에 적용하였다. DNA를 상술된 방법에 따라 추출하였고, GeneAmp^®PCR System 2700 Thermal Cycler(Applied Biosystems)을 이용하여 PCR을 수행하였다.

각각의 반응 혼합물은 200μM의 dNTP(GeneCraft, Ludinghausen, Germany), 1.5 mM MgCl₂를 포함하는 1x PCR 완충액, 1 U의 Taq DNA 중합효소(TaKaRa, Seoul, Korea), 10 ng의 DNA 및 전체 부피 30㎕에서 적절한 농도의 프라이머를 포함하였다. 혼합물은 또한 0.08μM의 M13(-21)-태그 정방향 프라이머, 0.3μM의 역방향 프라이머 및 0.3μM의 M13 (-21)-표지된 6-FAM 형광 염료를 포함하였다. PCR 조건은 94℃에서 2 분 동안 초기 변성; 94℃에서 30초 동안 38회; 54 내지 61℃에서 45초(유전자 좌위에 따른 회복 온도) 및 72℃에서 1분; 72℃에서 10분의 최종 신장을 수행하였다.

상기 프라이머를 Astna1-F(서열번호 1), Astna1-R(서열번호 2), Astna2-F(서열번호 3), Astna2-R(서열번호 4), Astna3-F(서열번호 5), Astna3-R(서열번호 6), Astna4-F(서열번호 7), Astna4-R(서열번호 8), Astna5-F(서열번호 9), Astna5-R(서열번호 10), Astna6-F(서열번호 11), Astna6-R(서열번호 12), Astna7-R(서열번호 13), Astna7-F(서열번호 14), Astna8-R(서열번호 15), Astna8-F(서열번호 16), Astna9-F(서열번호 17), Astna9-R(서열번호 18), Astna10-F(서열번호 19) 및 Astna10-R(서열번호 20)로 표 1의 프라이머 염기서열에 나타내었다.

상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 모든 정방향 프라이머를 5' 말단에 M13(5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3')을 태그(tag)하였다. 반복적인 실험으로 수정 후, Hardy-Weinberg 평형(Hardy-Weinberg equilibrium; HWE)으로부터의 유의한 편차를 나타내었다(P < 0.005). HWE에 대한 P값을 각각의 마커에 대해 나타내었다. [T _a: PCR 회복 온도(annealing temperature); N _a:: 개체군 집단에서 대립유전자의 수; H _o: 관찰된 이형접합도(heterozygosity); H _e: 예상된 이형접합도].

46쌍의 프라이머 쌍 중에서 36쌍의 프라이머를 PCR 증폭 실패 또는 자료 해석의 어려움 때문에 배제하였다. 본 발명자는 한라산에서 자생하는 제주황기(A. mongholicus var. nakaianus) 식물체로부터 각각의 대립유전자에 대해 명확하고 강한 밴드를 갖는, 10개의 다형성(polymorphism)을 나타내는 마이크로새틀라이트를 제조하였다. 이를 이용하여 한국산 황기(A. mongholicus var. dahuricus) 및 제주황기(A. mongholicus var. nakaianus)에 대한 유전자형 자료를 획득하였다. 각각의 개체군에서 유전적 다양성에 대한 파라미터를 상기 표 1에 나타내었다. 이들 중에서, Astna3는 한국에서 재배되는 황기에서는 증폭되지 않았다. 종합적으로, 대립유전자의 수는 10 에서 22(평균 16.4) 이었으며, 대립유전자의 관찰된 이형접합도(observed heterozygosity; H _o)와 예측된 이형접합도(expected heterozygosity; H _e)는 각각 0.385 에서 0.900 및 0.432 에서 0.942로 나타났다(P < 0.005).

[실시예 4] 마이크로새틀라이트의 유전자형 분석

형광 표지된 PCR 생성물을 GeneScan^TM- 500LIZ^TMSize Standard(AppliedBiosystems)와 ABI 3730xl sequencer로 분석하였다. 대립유전자의 길이는 GENEMAPPER version 3.7(Applied Biosystems)을 이용하여 결정하였다. 다양성 통계자료(Diversity statistics), Hardy-Weinberg 평형(HWE)으로부터 얻은 편차, 및 연관 불균형(linkage disequilibrium; LD)을 GENEPOP version 4.0 software를 이용하여 평가하였다(Rousset 2008). 완전 결실 대립유전자(null allele) 빈도를 MICRO-CHECKER version 2.2.3에 의해 계산하였다(Van Oosterhout et al. 2004). 상기 실험결과로서, 한국에서 재배되는 황기의 마이크로새틀라이트 대립유전자 좌위의 반복 모티프([Astna1(서열번호 21), Astna2(서열번호 22), Astna2(서열번호 23), Astna4(서열번호 24), Astna5(서열번호 25), Astna6(서열번호 26) Astna7(서열번호 27) Astna8(서열번호 28), Astna9(서열번호 29) 및 Astna10(서열번호 30)); 및 대립유전수의 수(N _a )를 상기 표 1에 나타내었다.

상기 10개의 대립유전자 좌위 중 3개(Astna2, Astna5, and Astna8)는 한라산 개체군내에서 Bonferroni correction을 수행한 후, 수정된 Hardy-Weinberg 평형(Hardy-Weinberg equilibrium; HWE)에서 유의한 편차를 보였다(P < 0.005; 표 1). Hardy-Weinberg 평형(Hardy-Weinberg equilibrium; HWE)에 기초하여 한라산 개체군 내에서 의미있는 편차를 나타내었다. Hardy-Weinberg 평형으로부터의 모든 편차는 이형접합체의 결함에 기인한다. 이는 제한되고 분열된 개체군 구조로 인해 높은 근친교배율이 유도된 결과인 것으로 해석된다. 심각한 연관 불균형(linkage disequilibrium; LD)은 유전자 좌위 쌍 내에서 전혀 관찰되지 않았다. 상세한 대립유전자 좌위 특성 분석 및 GenBank 등록 번호(GenBank Accession Number)를 상기 표 1에 나타내었다.

상기 한국에서 재배되는 황기의 마이크로새틀라이트 마커들은 동아시아의 한국에서 재배되는 황기 종집단(complex) 내의 그룹을 식별하기 위한 과정에 대한 이해를 개선하는 귀중한 도구가 될 것이다. 또한 본 발명자는 한라산에서 자생하는 제주 황기의 보존에 아주 중요하게 될 유전적 정보를 획득함으로써 본 발명을 완성하였다.

<110> INHA-INDUSTRY PARTNERSHIP INSTITUTE <120> Microsatellite marker of Korean Astragalus mongholicus and primer set for amplifying the same <130> INHA-P92 <160> 30 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Astna1-Forword primer <400> 1 ggaatctgaa tagacgggaa a 21 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Astna1-Reverse primer <400> 2 ccagcactcg tacgcttttt 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Astna2-Forword primer <400> 3 cgaaggtagg ggaaacatga 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Astn2-Reverse primer <400> 4 aaaaacgaag ctcccacttg 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Astna3-Forword primer <400> 5 gcgaactaga gagggggttg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Astna3-Reverse primer <400> 6 atgtaggcac actgttcatc 20 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Astna4-Forword primer <400> 7 ctacaccatc cttagaca 18 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Astna4-Reverse primer <400> 8 aagaacaaga cacagtgc 18 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Astna5-Forword primer <400> 9 cgccagtgtg agcaaaag 18 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Astna5-Reverse primer <400> 10 cacgcattcc atcatgtttc 20 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Astna6-Forword primer <400> 11 cgagcagtct gaccaggtg 19 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Astna6-Reverse primer <400> 12 tcacactccc tttcgctctc 20 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Astna7-Forword primer <400> 13 acatgtgccg tttggtctc 19 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Astna7-Reverse primer <400> 14 cctctccatc tccgaaaact t 21 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Astna8-Forword primer <400> 15 gacagttctg accgcttgac 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Astna8-Reverse primer <400> 16 ctggtattcc cgttgcacac 20 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Astna9-Forword primer <400> 17 tggtggatac tcacgtatcc tg 22 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Astna9-Reverse primer <400> 18 tgcaggcagt tgactttggg t 21 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Astna10-Forword primer <400> 19 tttgatggac gcgaaaggtt 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Astna10-Reverse primer <400> 20 tgccacaaag agcaactcaa 20 <210> 21 <211> 39 <212> DNA <213> Astragalus mongholicus <400> 21 atgatgatga tgatgatgat gatgatgatg atgatgatg 39 <210> 22 <211> 46 <212> DNA <213> Astragalus mongholicus <400> 22 agagagagag agagagagag agagagagag agagagagag agagag 46 <210> 23 <211> 56 <212> DNA <213> Astragalus mongholicus <400> 23 gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagaga 56 <210> 24 <211> 44 <212> DNA <213> Astragalus mongholicus <400> 24 tctctctctc tctctctctc tctctctctc tctctctctc tctc 44 <210> 25 <211> 60 <212> DNA <213> Astragalus mongholicus <400> 25 gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga 60 60 <210> 26 <211> 54 <212> DNA <213> Astragalus mongholicus <400> 26 gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga gaga 54 <210> 27 <211> 56 <212> DNA <213> Astragalus mongholicus <400> 27 gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagaga 56 <210> 28 <211> 52 <212> DNA <213> Astragalus mongholicus <400> 28 tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tg 52 <210> 29 <211> 50 <212> DNA <213> Astragalus mongholicus <400> 29 tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 50 <210> 30 <211> 46 <212> DNA <213> Astragalus mongholicus <400> 30 gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagaga 46

Claims

서열번호 21 내지 30 중에서 선택된 어느 하나 이상의 염기서열로 이루어지는, 한국에서 재배되는 황기의 마이크로새틀라이트 마커.
서열번호 1 및 서열번호 2; 서열번호 3 및 서열번호 4; 서열번호 5 및 서열번호 6; 서열번호 7 및 서열번호 8; 서열번호 9 및 서열번호 10; 서열번호 11 및 서열번호 12; 서열번호 13 및 서열번호 14; 서열번호 15 및 서열번호 16; 서열번호 17 및 서열번호 18; 서열번호 19 및 서열번호 20으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 프라이머쌍으로 구성된 한국에서 재배되는 황기의 마이크로새틀라이트 마커를 증폭하기 위한 프라이머 세트.
제 2항의 프라이머 세트를 포함하는 한국에서 재배되는 황기 선별용 PCR 키트.
서열번호 21 내지 30 중에서 선택된 어느 하나의 염기서열, 또는 이의 상보적인 염기서열을 포함하는 한국에서 재배되는 황기 선별용 프로브.
제 4항에 있어서, 상기 21 내지 30 중에서 선택된 어느 하나의 염기서열은 서열번호 1 및 서열번호 2; 서열번호 3 및 서열번호 4; 서열번호 5 및 서열번호 6; 서열번호 7 및 서열번호 8; 서열번호 9 및 서열번호 10; 서열번호 11 및 서열번호 12; 서열번호 13 및 서열번호 14; 서열번호 15 및 서열번호 16; 서열번호 17 및 서열번호 18; 서열번호 19 및 서열번호 20으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 프라이머쌍에 의하여 증폭되는 염기서열인 것을 특징으로 하는, 한국에서 재배되는 황기 선별용 프로브.
서열번호 21 내지 30 중에서 선택된 어느 하나의 염기서열로 이루어진 뉴클레오타이드, 그에 의해 코딩되는 폴리펩다이드 또는 그의 cDNA를 포함하는, 한국에서 재배되는 황기 선별용 마이크로어레이.
1) 서열번호 1 및 서열번호 2; 서열번호 3 및 서열번호 4; 서열번호 5 및 서열번호 6; 서열번호 7 및 서열번호 8; 서열번호 9 및 서열번호 10; 서열번호 11 및 서열번호 12; 서열번호 13 및 서열번호 14; 서열번호 15 및 서열번호 16; 서열번호 17 및 서열번호 18; 서열번호 19 및 서열번호 20;으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 프라이머 쌍으로 구성된 프라이머 세트와 황기로부터 추출한 전체 DNA 시료를 혼합하여 PCR을 수행하는 단계;
2) 상기 1)단계의 증폭된 DNA 시료를 이용하여 DNA 시퀀싱을 하는 단계; 및
3) 상기 2)단계의 DNA 시퀀싱을 분석하여 서열 번호 21 내지 30 중 어느 하나의 마이크로새틀라이트 마커와 비교하여 분석하는 단계;
를 포함하는, 한국에서 재배되는 황기의 선별방법.