KR101673293B1

KR101673293B1 - 벼 또는 쌀 품종 판별용 프라이머 세트, 이를 이용한 벼 또는 쌀 품종 판별방법 및 이를 포함하는 키트

Info

Publication number: KR101673293B1
Application number: KR1020140156832A
Authority: KR
Inventors: 김남국; 장은희; 이진호
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2014-11-12
Filing date: 2014-11-12
Publication date: 2016-11-08
Also published as: KR20160056523A

Abstract

본 발명은 단일염기 다형성 마커를 이용하여 국내산 벼 또는 쌀 품종인 황금노들과 보람찬을 판별하기 위한 프라이머 세트, 이를 이용하여 대립유전자 특이 중합효소연쇄반응(Allele Specific-PCR)법으로 상기 품종을 판별하는 방법 및 상기 프라이머 세트를 포함하는 상기 품종 판별용 키트에 관한 것이다.

Description

벼 또는 쌀 품종 판별용 프라이머 세트, 이를 이용한 벼 또는 쌀 품종 판별방법 및 이를 포함하는 키트{Primer sets for determining identity of rice, method of determining identity of rice using the same and kit using the same}

본 발명은 벼 또는 쌀 품종 판별용 프라이머 세트, 이를 이용한 벼 또는 쌀 품종 판별방법 및 이를 포함하는 키트에 관한 것으로, 보다 상세하게는 단일염기 다형성(Single nucleotide polymorphism, 이하 :"SNP") 마커를 이용하여 국내산 벼 또는 쌀 품종인 황금노들과 보람찬을 판별하기 위한 프라이머 세트, 이를 이용하여 대립유전자 특이 중합효소연쇄반응(Allele Specific-PCR; 이하, "AS-PCR")법으로 상기 품종을 판별하는 방법 및 상기 프라이머 세트를 포함하는 상기 품종 판별용 키트에 관한 것이다.

황금노들(익산 488호) 벼 품종은 밥쌀용으로, 보람찬(익산 514호) 벼 품종은 가공용(쌀가루용)으로 주로 경기, 충남북 지역을 중심으로 재배되고 있다.

상기 황금노들과 보람찬 벼는 육종계통(교배조합)이 유사하여, 유전적으로 매우 유사한 특성을 가지고 있어 유전자 마커를 활용한 구별이 쉽지 않다.

또한, 최근 황금노들과 보람찬 벼의 재배면적이 증가되면서 값싼 가공용 보람찬 벼(쌀)가 값비싼 황금노들 품종으로 부정 유통되는 사례가 증가되고 있다.

이러한 상황에서 밥쌀용 황금노들 생산 농가의 소득 보전과 양곡 부정유통 방지를 위해 황금노들과 보람찬 벼(쌀) 품종 구별을 위한 판별법 개발이 시급한 실정이다.

농산물의 원산지 판별법은 유기무기 성분의 함량 등을 비교분석하여 판별하는 이화학적인 분석방법을 활용하여 개발되어 왔다. 그러나 이화학적 분석방법의 대상이 되는 생물체의 대사산물이나 유기무기성분들은 생물체의 생육환경에 따라 차이를 나타낼 수 있는 단점이 있다.

그러므로 생물체 내 환경에 따라 변화되지 않고 전달되는 유전물질인 핵산(DNA)의 분석이 품종 또는 원산지 등을 구별하는 좋은 도구로 활용될 수 있다.

최근 분자유전학 및 유전자 분석기술의 발달로 DNA 분자수준에서 단일염기 다형성(SNP), 단순염기 반복다형성(Simple Sequence Repeat; SSR) 등을 포함한 유전자 마커(genetic marker)의 개발이 활발히 진행되고 있다.

또한, DNA 등 유전물질을 대상으로 한 PCR(Polymorase chain reaction)기술을 이용하는 RAPD(random amplified polymorphic DNA), SSCP(single strand conformation polymorphisms) 기법 및 마이크로새틀라이트(microsatellite; MS 또는 simple sequence repeat이라고도 함) 등 다양한 분석 기법을 이용하여 종판별 및 개체식별 등 다양한 산업 전반에 걸쳐 본 기술이 활용되고 있다.

현재까지 DNA 수준에서 벼(쌀)의 품종 판별법은 단일염기 다형성(SNP)과 단순염기 반복다형성(SSR)을 이용한 방법이 보고된 바 있다.

그러나, 상기 단순염기 반복다형성의 경우, 고가의 분석 장비를 필요로 하며, 분석기법이 복잡하고, 비용이 비싸 SNP를 활용한 판별법에 비해 현장적용에 어려움이 많다. 따라서, 보다 쉽고 빠른 방법을 통해 품종을 구별할 수 있는 유전자 마커(SNP marker)의 개발이 절실히 요구되고 하다.

단일염기 다형성(SNP) 및 단순반복 염기서열(SSR)을 활용한 벼 품종 구별과 관련된 종래기술로는 벼 품종 식별용 프라이머 조합 및 이를 이용한 식별 방법(한국등록특허 제10-0974264호), 국내외산 벼 품종 식별 SNP 마커(한국등록특허 제10-0713669호), 벼 품종을 식별하기 위한 다중 실시간 PCR 방법(한국공개특허 제10-2012-0078193호, 한국공개특허 제10-2012-0078221호), 품종 판별을 위한 마이크로새틀라이트 마커 조합 및 그에 의한 품종별 고유코드번호(한국공개특허 제10-2002-0095794호) 등이 개시되어 있다.

그러나, 최근 밥쌀용 품종인 황금노들과 가공용 품종인 보람찬 벼(쌀) 품종의 재배면적 증가와 가격 차이로 인하여 혼합 및 품종 둔갑 등 부정유통 사례가 증가되고 있는데, 상기 종래기술의 경우 황금노들과 보람찬 벼(쌀) 품종을 판별하는 방법을 제시하지 못하고 있는 실정이다.

이러한 상황에서 황금노들과 보람찬 벼(쌀) 품종의 정확한 구별을 통해 국내 생산 농가의 소득 보전과 부정유통 방지를 위한 판별법 개발이 시급한 실정이다.

본 발명자들은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여, 분석이 용이한 단일염기 다형성(SNP) 마커를 이용하여 황금노들과 보람찬 벼(쌀) 품종을 구별하기 위한 유전자 분석법 개발을 추진한 결과, 차세대염기서열분석(Next generation sequencing) 기술, 생물정보 분석 기법, 그리고 대립유전자 특이 중합효소연쇄반응(AS-PCR)기법을 활용하여, 이를 해결할 수 있음을 알아내고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 기존의 단일염기 다형성 마커로 구별이 불가한 황금노들과 보람찬 벼 품종을 판별할 수 있는 유전자 마커(프라이머 세트)를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 유전자 마커를 이용하여 벼 또는 쌀 품종을 판별하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전 마커를 포함하는 벼 또는 쌀 품종 판별용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명은 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머쌍 및 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머쌍을 포함하는 벼 또는 쌀 품종 판별용 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용하여 벼 또는 쌀 품종을 판별하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 벼 또는 쌀 품종 판별용 키트를 제공한다.

본 발명에 의하면, 단일염기 다형성 마커(SNP marker)를 이용하여 기존의 방법으로는 구별이 불가한 황금노들과 보람찬 벼(쌀) 품종의 판별이 가능하며, 이를 통하여 양곡 부정유통 방지 등 양곡표시제 관리 업무에 활용이 가능하고, 또한 우수한 국내 벼 품종에 대한 유전자원 보존과 개량에 효과를 얻을 수 있을 수 있다.

또한, 본 발명에 의하면, 황금노들과 보람찬 벼(쌀) 품종 판별을 위한 프라이머를 포함, 대립유전자 특이 중합효소연쇄반응법에 의한 단일 및 다중 PCR법을 포함하는 품종 판별용 키트를 제공할 수 있다.

도 1은 황금노들과 보람찬 벼(쌀) 품종 판별을 위한 다중 PCR (multiplex PCR) 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 활용된 대립유전자 특이 중합효소연쇄반응법(Allele- specific PCR)의 모식도를 나타낸 것이다.
도 3은 서열번호 7의 PCR 증폭산물(SNP: T/C)을 나타낸 것이다.
도 4는 서열번호 8의 PCR 증폭산물(SNP: G/T)을 나타낸 것이다.
도 5는 서열번호 9의 PCR 증폭산물(내재 유전자)을 나타낸 것이다.

본 발명은 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머쌍 및 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머쌍을 포함하는 벼 또는 쌀 품종 판별용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명에서, "프라이머"는 단일가닥의 올리고뉴클레오티드로서, 적합한 조건 (4 가지의 상이한 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 DNA 또는 RNA 폴리머라아제와 같은 중합효소의 존재), 적합한 온도 및 적합한 버퍼하에서 주형-지시적 DNA 합성을 개시할 수 있는 개시점으로서 작용하는 것을 의미한다.

상기 프라이머의 적합한 길이는 사용하고자 하는 프라이머의 특성에 의해 결정하지만, 통상적으로 15 내지 30 bp의 길이로서 사용한다. 프라이머는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만, 주형과 혼성복합체(hybrid-complex)를 형성할 수 있을 정도로 상보적이어야만 한다.

본 발명의 상기 벼 또는 쌀 품종 판별용 프라이머 세트에서, 상기 단일염기 다형성 마커(SNP marker)는 종간 또는 연령간, 성별간, 염색체가 갖고 있는 염기서열 중 개인편차를 나타내는 염기변이를 말하며, 한 염기쌍(single base-pare variation)의 차이로 DNA 서열 다형성 중에서 가장 많이 존재한다.

본 발명의 상기 벼 또는 쌀 품종 판별용 프라이머 세트에서, 상기 프라이머 세트(SNP 마커)는 이러한 특징 때문에 종 및 개체의 분류에 많이 이동 되고 있는 SNP를 이용하여 개체 식별을 위한 유전자 마커를 선별하고, 상기 선별된 마커들 중에서 변별력이 있고 특이도 및 민감도에서 우수한 결과를 나타내는 SNP 마커들을 사용하여 다중 대립유전자 특이 중합효소연쇄반응(multiplex AS-PCR) 검사 시스템을 확립할 수 있다.

본 발명의 상기 벼 또는 쌀 품종 판별용 프라이머 세트는 대립유전자 특이 중합효소연쇄반응(AS-PCR)법으로 황금노들과 보람찬 벼 품종을 판별할 수 있다.

본 발명의 상기 벼 또는 쌀 품종 판별용 프라이머 세트에서, 상기 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머쌍은 황금노들 벼품종 식별용일 수 있다.

본 발명의 상기 벼 또는 쌀 품종 판별용 프라이머 세트에서, 상기 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머쌍은 보람찬 벼품종 식별용일 수 있다.

본 발명의 상기 벼 또는 쌀 품종 판별용 프라이머 세트에서, 상기 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머쌍은 서열번호 7의 22번째 염기인 단일염기 다형성(SNP) 티민(T)과 시토신(c)를 구별할 수 있다 (도 3 참조).

본 발명의 상기 벼 또는 쌀 품종 판별용 프라이머 세트에서, 상기 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머쌍은 서열번호 8의 20번째 염기인 단일염기 다형성(SNP) 구아닌(G)과 티민(T)을 구별할 수 있다 (도 4 참조).

본 발명의 상기 벼 또는 쌀 품종 판별용 프라이머 세트는 서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머로 이루어진 슈퍼옥사이드 디스뮤타제의 구리 샤페론(copper chaperone for superoxide dismutase) 내재 유전자(CCS1)를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 벼 또는 쌀 품종 판별용 프라이머 세트에서, 상기 서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍은 서열번호 9의 디스뮤타제의 구리 샤페론(copper chaperone for superoxide dismutase) 내재 유전자(CCS1)를 구별할 수 있다 (도 5 참조).

본 발명의 상기 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머쌍이 벼 또는 쌀 품종, 바람직하게는 황금노들의 판별에 사용할 수 있는 것은 각 SNP 변이 위치에서 특정의 염기가 상기 황금노들 품종에 특이적으로 높은 빈도로 나타나는 것에 근거하는 것이다.

마찬가지로, 상기 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머쌍이 벼 또는 쌀 품종, 바람직하게는 황보람찬의 판별에 사용할 수 있는 것은 각 SNP 변이 위치에서 특정의 염기가 상기 보람찬 품종에 특이적으로 높은 빈도로 나타나는 것에 근거하는 것이다.

본 발명의 상기 벼 또는 쌀 품종 판별용 프라이머 세트는 종래기술 상의 단일염기 다형성 프라이머 세트(마커)로는 구별이 불가능한 황금노들과 보람찬 벼 품종을 구별하고, 분석이 단순하며 비용이 저렴하기 때문에, 현장 적용에 용이한 품종 판별법을 위한 단일염기 다형성 마커(SNP marker)와 대립유전자 특이 중합효소연쇄반응법을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트(마커)를 이용하여 벼 또는 쌀 품종을 판별하는 방법을 제공한다.

본 발명의 상기 벼 또는 쌀 품종을 판별하는 방법은 (a) 시료로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계, (b) 상기 프라이머 세트를 이용하여 상기 단계에서 추출한 주형 DNA를 대립유전자 특이 중합효소연쇄반응시켜 증폭하는 단계, 및 (c) 상기 (b) 단계에 의해 생성된 증폭산물을 분획하여 벼 또는 쌀 품종을 판별하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 벼 또는 쌀 품종을 판별하는 방법에서, 상기 벼 또는 쌀 품종이 황금노들 및 보람찬으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.

본 발명의 상기 벼 또는 쌀 품종을 판별하는 방법에서, 상기 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍은 서열번호 7의 22번째 염기인 단일염기 다형성(SNP) 티민(T)과 시토신(c)를 구별할 수 있다.

본 발명의 상기 벼 또는 쌀 품종을 판별하는 방법에서, 상기 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍에 의해 서열번호 7의 284bp 크기의 PCR 증폭산물이 생성된다 (도 3 참조).

본 발명의 상기 벼 또는 쌀 품종을 판별하는 방법에서, 상기 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머쌍은 서열번호 8의 20번째 염기인 단일염기 다형성(SNP) 구아닌(G)과 티민(T)을 구별할 수 있다.

본 발명의 상기 벼 또는 쌀 품종을 판별하는 방법에서, 상기 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍에 의해 서열번호 8의 165bp 크기의 PCR 증폭산물이 생성된다 (도 4 참조).

본 발명의 상기 벼 또는 쌀 품종을 판별하는 방법에서, 상기 서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머쌍은 서열번호 9의 디스뮤타제의 구리 샤페론(copper chaperone for superoxide dismutase) 내재 유전자(CCS1)를 구별할 수 있다 (도 5 참조).

도 5에서, 밑줄친 부분이 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머 위치이고, 상기 서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍에 의해 서열번호 9의 123bp 크기의 PCR 증폭산물이 생성된다.

본 발명의 상기 벼 또는 쌀 품종을 판별하는 방법은 대립유전자 특이 중합효소연쇄반응(AS-PCR)법으로 황금노들과 보람찬 벼 품종을 판별할 수 있다.

본 발명의 상기 벼 또는 쌀 품종을 판별하는 방법에서, 상기 "대립유전자 특이 중합효소연쇄반응법(Allele-specific PCR; AS-PCR)"은 유전자 증폭을 위하여 사용되는 프라이머 말단에 SNP가 위치하도록 디자인하여 프라이머 끝(3' 말단) 부분의 단일 염기가 결합되거나, 결합되지 못하는 특징을 이용하여 유전자 증폭산물의 형성 유무를 확인함으로써, 개체별 SNP형을 확인하는 방법이다

예컨대, 도 2는 본 발명의 SNP 대립유전자 특이적 프라이머의 작용 메카니즘 모식도로서, 도 2의 프라이머는 주형 DNA 염기에 대해 미스매치(mismatch) 염기(G)를 포함하고 있어, SNP 염기인 T 염기에 대한 검출 특이도가 향상된다.

본 발명의 상기 벼 또는 쌀 품종을 판별하는 방법에서, 상기 중합효소연쇄반응은 특정 DNA 단편을 선별적으로 증폭하는 방법으로서, 이에 대한 내용은 Miller, H. I. (WO 89/06700) 및 Davey, C. et al. (EP 329,822))에 개시되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로써 삽입된다.

본 발명의 상기 벼 또는 쌀 품종을 판별하는 방법에서, 중합효소연쇄반응에서 다양한 DNA 중합효소가 증폭 반응에 이용될 수 있으며, 예컨대 E. coli DNA 중합효소 I의 "클레나우(Klenow) 단편", 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다.

본 발명의 상기 벼 또는 쌀 품종을 판별하는 방법에서, 바람직하게는, 상기 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus (Pfu)를 포함한다.

본 발명의 상기 벼 또는 쌀 품종을 판별하는 방법에서, 증폭 반응액에는 dNTP 혼합물(dATP, dCTP, dGTP, dTTP), PCR 완충액 및 DNA 중합 효소 조인자를 포함할 수 있다.

한편, 본 발명의 상기 벼 또는 쌀 품종을 판별하는 방법에서, 중합효소연쇄반응에 의한 증폭 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다.

본 발명의 상기 벼 또는 쌀 품종을 판별하는 방법에서, Mg² ⁺와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 소망하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 요구된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 하는 것이 바람직하다.

따라서, 본 발명의 상기 벼 또는 쌀 품종을 판별하는 방법에서, 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.

본 발명의 상기 벼 또는 쌀 품종을 판별하는 방법에서, 중합효소에 의한 증폭 반응은 통상적인 (ⅰ) 초기 변성 (pre-denaturation) 과정, (ⅱ) 어닐링(annealing), 연장(elongation) 및 변성(denaturation)으로 이루어지는 한 싸이클을 수회 내지 수십 회 반복하는 과정 및 (ⅲ) 최종 열처리 과정 또는 이들 과정을 적합하게 변형한 열 싸이클(thermal cycle) 프로그램을 통해 행할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, SNP 마커인 HGND를 검출하기 위한 프라이머 쌍을 이용한 유전자 증폭산물의 확인을 통해 황금노들 벼(쌀) 품종을 판정할 수 있으며, SNP 마커 BRC을 검출하기 위한 프라이머 쌍을 이용한 유전자 증폭산물의 확인을 통해 보람찬 벼(쌀) 품종을 판정하는 것을 특징으로 하는 황금노들, 보람찬 벼(쌀) 품종 판별 방법을 제공할 수 있다 (도 1 참조).

또한, 본 발명의 상기 벼 또는 쌀 품종을 판별하는 방법은 상기의 프라이머 세트를 이용하여 황금노들과 보람찬 벼(쌀) 품종을 판별하는 다중 PCR 방법을 이용하여 벼 또는 쌀 품종을 판별할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트(유전자 마커)를 포함하는 벼 또는 쌀 품종 판별용 키트를 제공한다.

본 발명의 상기 벼 또는 쌀 품종 판별용 키트가 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermisflavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 벼 또는 쌀 품종 판별용 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

본 발명의 상기 쇠고기의 동일성 여부 판별용 키트는 상기 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머쌍 및 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머쌍을 포함함으로써, 다중 대립유전자 특이 중합효소연쇄반응(multiplex AS-PCR)법을 이용하여 벼 또는 쌀 품종을 판별할 수 있다.

본 발명의 상기 벼 또는 쌀 품종을 판별용 키트에서, 상기 벼 또는 쌀 품종은 황금노들 또는 보람찬일 수 있다.

또한, 본 발명의 상기 벼 또는 쌀 품종을 판별용 키트는 상기 서열번호 1 내지 6으로 이루어지는 3개의 프라이머 쌍을 한 번에 분석하기 위한 다중 PCR 방법을 통하여, 벼 또는 쌀 품종을 판별할 수 있다.

이하, 하기의 실시예를 통하여 본 발명을 황금노들과 보람찬 벼(쌀) 품종 판별을 위한 단일염기 다형성 마커와 대립유전자 특이 중합효소반응법을 이용한 다중 PCR 방법을 중심으로 하기의 실시예를 통하여 보다 상세히 설명한다.

<실시예>

이하의 실시예에서 공시 재료로는 황금노들과 보람찬 벼(쌀) 품종 구별을 위한 단일염기 다형성 마커(SNP marker)의 개발을 위하여, 농촌진흥청 국립식량과학원으로부터 벼 기본 식물종을 분양받아 사용하였다.

< 실시예 1> 벼(쌀)로부터 게놈 DNA 의 추출

벼(쌀)에서의 게놈 DNA 추출은 CTAB을 이용한 추출법을 이용하였다.

시료 1립을 곱게 마쇄하고 CTAB buffer 400㎕와 RNase(100 mg/ml) 15㎕를 첨가하고, 잘 혼합되도록 섞어준 후, 65℃ 항온 수조에서 30분간 반응시켰다.

상기 CTAB buffer는 9ml의 DNA extration buffer(증류수 500 ml에 솔비톨 63.75 g, 트리스-베이스(Tris-base) 12.1 g, EDTA-Na2 1.68 g을 넣고 완전히 용해한 후, 증류수로 1 L를 맞춘 다음, 고압 멸균하여 제조), 9 ml의 Nuclei lysis buffer(증류수 200 ml에 CTAB 20 g을 완전히 용해한 후 1M Tris(pH 8.0) 200 ml, 0.25M EDTA 200 ml, 5M NaCl 400 ml를 넣은 후 고압 멸균하여 제조), 3.6 ml의 10% sarkosyl(C₁₅H₂₈NO₃Na), 3.9 ml의 증류수에 0.034 g의 sodium bisulfite, 0.25 ml의 2-머캡토에탄올(2-mercaptoethanol)을 첨가하여 제조하였다.

반응이 끝난 후, 10분간 15,000 rpm에서 10분간 원심분리하고, 상층액을 새로운 튜브로 옮겼다. 상층액에 Proteinase K(20 mg/ml) 10㎕를 첨가하고 다시 65℃의 항온 수조에서 10분간 반응시켰다.

반응이 끝난 튜브에 동일한 양의 페놀:클로로포름:이소아밀알코올(25:24:1) 용액을 넣고 실온에서 5분간 로터리 쉐이커 등을 이용하여 혼합한 후, 실온에서 5분간 15,000 rpm로 원심분리하였다.

상층액을 새로운 튜브로 옮기고, 동일한 양의 클로로포름:이소아밀알코올 (24:1) 혼합액을 넣은 후 잘 혼합하고, 실온에서 5분간 15,000rpm으로 원심분리하였다.

여기서 얻어진 상층액을 다시 새로운 튜브로 옮기고, 동량의 이소프로판올(isopropanol)을 넣고 잘 혼합한 후, -20℃에서 20분간 방치하였다.

혼합액을 4℃에서 10분간 15,000 rpm으로 원심분리한 후, 상층액을 버리고 DNA 펠렛을 취하여 에탄올 400㎕를 첨가하고, 4℃에서 5분간 15,000rpm으로 원심분리한 후, 상층액을 제거하고, 남아 있는 에탄올을 실온에서 건조시켜 완전히 제거하였다.

건조된 DNA 펠렛에 멸균 증류수 70㎕를 넣어 DNA를 녹인 후 게놈 DNA로 사용하였다.

추출된 게놈 DNA는 ND-1000 UV-Vis Spectrophotometer(NanoDrop Technologies, USA)을 이용하여 농도와 순도를 확인한 후, 차세대 염기서열 분석에 사용하였다.

< 실시예 2> 차세대 염기서열 분석법을 이용한 벼(쌀) 염기서열 분석 및 유전자변이 탐색

황금노들과 보람찬 벼(쌀) 품종을 구별하기 위한 단일염기 다형성 마커를 개발하기 위하여, 대용량 염기서열 분석(차세대 염기서열 분석)은 HiSeqTM 2000(Illumina, USA) 플랫폼을 활용하였으며, 염기서열 분석은 각 회사에서 제공하는 표준 매뉴얼에 따라 분석하였다.

각각의 차세대 염기서열 분석을 통해 얻어진 염기서열 중 Q-value값이 최소 20 이상인 경우, 이를 염기서열 비교 및 유전자변이 탐색에 활용하였다.

탐색된 유전자 변이중 황금노들과 보람찬 벼(쌀) 품종에서 특이적으로 나타나는 SNP를 1차 선발하였고, 선발된 SNP는 Sanger method를 이용한 직접 염기서열 분석을 통해 재확인하였다.

염기서열의 비교, 유전자 변이의 선발 등은 bwa(Burrows-Wheeler Aligner), Picard, GenomeAnalysisTK 및 Samtools 등을 활용하여 분석하였다.

< 실시예 3> 대립유전자 특이 중합효소연쇄반응

직접 염기서열 분석을 통해 재확인된 SNP 중 최종 2개를 선발하였고, 대립유전자 특이 중합효소연쇄반응법을 이용하였다.

황금노들과 보람찬 벼(쌀) 품종을 판별하기 위하여, 하기 표 1과 같이 서열번호 1부터 6까지의 프라이머를 이용하였다.

하기 표 1에서, 서열번호 5와 6은 대립유전자 특이 중합효소연쇄반응의 이상 유무를 확인하기 위한 슈퍼옥사이드 디스뮤타제의 구리 샤페론(copper chaperone for superoxide dismutase) 내재 유전자(CCS1)를 증폭하기 위한 프라이머이다.

2개의 황금노들, 보람찬 벼(쌀) 품종 특이 SNP 마커와 대립유전자 특이 중합효소연쇄반응의 이상 유무를 확인하기 위한 내재 유전자를 한 번에 분석하기 위하여 필요한 다중 PCR 방법을 위해 혼합 프라이머를 제조 하였다.

다중 PCR을 위한 혼합 프라이머는 3개의 프라이머 세트(황금노들, 보람찬 및 내재 유전자 증폭을 위한 프라이머 세트)를 각 15, 20 및 3 pmol의 농도가 되도록 혼합하여 제조하였다.

다중 PCR은 게놈 DNA 50ng에 2x Multi PCR Premix(Inclone, Korea) 10㎕와 혼합 프라이머 2㎕를 첨가한 후, 멸균 증류수로 총 20㎕가 되도록 증액하여 반응 혼합물을 제조하였다.

유전자의 증폭반응은 GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems, USA)을 이용하였으며, 95℃에서 10분간 변성 후 95℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 1분 20초 반응을 30회 반복 수행하였다.

PCR 증폭 산물은 3% 아가로스 겔 상에서 증폭산물 10㎕를 이용하여 전기영동을 통해 확인하였는 바, 다중 PCR의 결과는 도 1과 같다.

본 발명의 검출방법, 즉 대립유전자 특이 중합효소연쇄반응법에 있어서, 생성되는 유전자 증폭산물(PCR product)은, SNP 마커 HGND의 경우, 서열번호 1과 2를 이용하여 황금노들 벼(쌀) 품종의 T 유전자형이 증폭되어 284bp 크기의 서열번호 7의 염기서열에 해당된다 (SNP:T/C).

또한, SNP 마커 BRC의 경우, 서열번호 3과 4를 이용하여 보람찬 벼(쌀) 품종의 G 유전자형에서 증폭되어 165bp 크기의 서열번호 8의 염기서열에 해당된다 (SNP:G/T).

한편, 대립유전자 특이 중합효소연쇄반응(AS-PCR)법을 통해 SNP 마커 HGND과 내재 유전자(CCS1)의 유전자 증폭산물인 284bp, 123bp 크기의 증폭산물이 나타나는 경우, 황금노들 벼(쌀) 품종으로 판정하고, SNP 마커 BRC과 내재 유전자(CCS1)의 유전자 증폭산물인 165bp, 123bp 크기의 증폭산물이 나타나는 경우, 보람찬 벼(쌀) 품종으로 판정할 수 있다.

여기에서, 상기 내재 유전자(CCS1)는 황금노들과 보람찬 벼(쌀) 품종 모두에서 항상 유전자 증폭산물(123bp 크기)을 나타낸다

이상에서 구체적인 실시예를 들어 본 발명을 상세하게 설명하였으나, 본 발명은 상술한 실시예에 한정되지 않으며, 본 발명의 기술적 사상의 범위 내에서 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 많은 변형이 가능함은 자명할 것이다.

본 발명에 의하면, 밥쌀용 품종인 황금노들과 가공용(쌀가루용) 품종인 보람찬 벼(쌀) 품종 판별을 위한 단일염기 다형성 마커와 대립유전자 특이 중합효소연쇄반응법 및 이를 이용한 판별 키트로 황금노들과 보람찬 벼(쌀) 품종 판별에 활용할 수 있기 때문에, 본 발명이 속하는 기술분야에 유용하게 적용될 수 있다.

<110> Republic of Korea (National Agricultural Products Quality Management Service) <120> Primer sets for determining identity of rice, method of determining identity of rice using the same and kit using the same <130> 9902 <160> 9 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of HGND <400> 1 ggttgtatat acatgcagga at 22 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of HGND <400> 2 aatggtacac aaatctcttg c 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of BRC <400> 3 gcatggtgat tgagaacatt g 21 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of BRC <400> 4 tgctatgaca tctgcaaggg 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of CCS1 <400> 5 caacgcaacg tcttgtatgg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of CCS1 <400> 6 tgaaccctga gttcctctcg 20 <210> 7 <211> 284 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> amplified product of HGND <400> 7 ggttgtatat acatgcaggt aytgtacagg atgtcgatcc gctaatatta aagcctgctc 60 tttcagctcc agttgttgca gtagcttctc cttctgctct ccggtaatat ataatgtgtc 120 tatggctgcc tcggaacaaa tttaaaaccg tgttcatata ataataatgg tatgctagta 180 ctccctaatt agatggttca ggtaaagtac gtatgtggga gagatcacaa attctgcatt 240 gaaacatttt ttttttggaa tacgcaagag atttgtgtac catt 284 <210> 8 <211> 165 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> amplified product of BRC <400> 8 catggtgatt gagaacatck catcgcaaaa aatctgactg aagtacagaa tgttcttttt 60 tccaacgagc atatcgcaat gatagcagag ttcaagttaa gcttgaatgc ttatttgtcc 120 gacttgttgt attccccagt tcgttccctt gcagatgtca tagca 165 <210> 9 <211> 123 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> amplified product of CCS1 <400> 9 caacgcaacg tcttgtatgg ttgtagtcgg atcgtcaacg tttctcccaa atcgtagtta 60 tcacaactca ccgaaagatc gggccaacaa cagccttgag tgtcgagagg aactcagggt 120 tca 123

Claims

서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 황금노들 벼품종 식별용 프라이머쌍, 및 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어진 보람찬 벼품종 식별용 프라이머쌍을 포함하는 벼 또는 쌀 품종 판별용 프라이머 세트로서,
상기 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머쌍은 서열번호 7의 22번째 염기인 단일염기 다형성(SNP) 티민(T)과 시토신(C)을 구별하고,
상기 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머쌍은 서열번호 8의 20번째 염기인 단일염기 다형성(SNP) 구아닌(G)과 티민(T)을 구별하며,
상기 벼 또는 쌀 품종이 황금노들 및 보람찬으로 이루어진 프라이머 세트.
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제1항에 있어서, 서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머로 이루어진 슈퍼옥사이드 디스뮤타제의 구리 샤페론(copper chaperone for superoxide dismutase) 내재 유전자(CCS1)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 벼 또는 쌀 품종 판별용 프라이머 세트.
제1항 또는 제5항의 프라이머 세트를 이용하여 벼 또는 쌀 품종을 판별하는 방법으로서, 상기 벼 또는 쌀 품종이 황금노들 및 보람찬으로 이루어진 방법.
제6항에 있어서,
(a) 시료로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 프라이머 세트를 이용하여 상기 단계에서 추출한 주형 DNA를 대립유전자 특이 중합효소연쇄반응시켜 증폭하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계에 의해 생성된 증폭산물을 분획하여 벼 또는 쌀 품종을 판별하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 벼 또는 쌀 품종을 판별하는 방법.
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제1항 또는 제5항의 프라이머 세트를 포함하는 벼 또는 쌀 품종 판별용 키트로서, 상기 벼 또는 쌀 품종이 황금노들 및 보람찬으로 이루어진 키트.
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