KR101997679B1

KR101997679B1 - 표고버섯 품종 산마루 2호 판별용 caps 마커 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101997679B1
Application number: KR1020180032257A
Authority: KR
Inventors: 류호진; 문수윤; 이화용
Original assignee: 충북대학교 산학협력단
Priority date: 2018-03-20
Filing date: 2018-03-20
Publication date: 2019-07-08

Abstract

본 발명은 표고버섯 산마루 2호를 판별할 수 있는 CAPS 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 본 발명은 표고버섯 산마루 2호를 판별할 수 있는 CAPS 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 표고버섯 품종 산마루 2호 판별을 위한 CAPS 마커, 상기 마커를 증폭시킬 있는 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 조성물, 키트 및 CAPS 마커를 이용한 표고버섯 품종 산마루 2호 판별 방법에 관한 것이다. 본 발명의 표고버섯 품종 산마루 2호 판별용 프라이머 세트는 CAPS(cleaved amplified polymorphic sequences) 마커를 효과적으로 증폭할 수 있는 프라이머 세트로서 이를 이용하는 경우 상기 표고 균주를 신속하고 간편하게 판별할 수 있다. CAPS 마커는 PCR로 증폭된 DNA 단편에 제한효소를 처리함으로써 단편의 절단 여부를 확인하기 때문에, SSR 마커의 경우와는 달리 고가의 사이즈 분석 장비가 없이도 아가로오스 젤(agarose gel) 상에서 빠르고 쉽게 결과를 확인할 수 있다. 이에 따라 품종을 구분하는 데에 드는 비용과 시간을 줄일 수 있고, 결과 해석에 고도의 지식을 요하지 않기 때문에 보다 효율적인 품종 판별이 가능하다.

Description

표고버섯 품종 산마루 2호 판별용 CAPS 마커 및 이의 용도{CAPS Marker for Identification of Lentinula edodes Cultivar Sanmaru 2ho and use thereof}

본 발명은 표고버섯 산마루 2호를 판별할 수 있는 CAPS 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 표고버섯 품종 산마루 2호 판별을 위한 CAPS 마커, 상기 마커를 증폭시킬 있는 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 조성물, 키트 및 CAPS 마커를 이용한 표고버섯 품종 산마루 2호 판별 방법에 관한 것이다.

세계 버섯생산액은 1990년대 초 약 85억 달러에서 2010년 약 400억 달러로 4.7배 증가하는 등 꾸준히 확대되는 양상을 보이고, 버섯산업은 1990년대 후반 급속하게 증가하였다. 2014년 현재 양송이, 느타리, 표고, 목이, 팽이버섯류가 전세계 버섯 생산의 약 95%를 차지하고 있고, 표고는 약 17%를 차지하고 있다. 표고는 한국, 중국, 일본 등 아시아국가에서 일반적으로 재배되는 버섯이며, 미국, 캐나다, 네덜란드, 폴란드 등의 서구국가에서도 상업적으로 재배되고 있다. 그리고 항암 효과를 보이는 레티난(lentinan) 등이 있어 식품뿐만 아니라 약학적인 용도로도 사용이 늘어나고 있다.

표고버섯은 2014년 국내 임산버섯 생산량의 약 91%, 약 1,858억 원을 차지하고 있고, 그 독특한 맛과 향기 때문에 동서양의 요리 재료로 사용될 뿐만 아니라 항종양효과, 항바이러스 효과 등 의학적 가치가 입증되고 있다. 국내의 표고버섯의 생산량과 생산액은 그동안 꾸준히 증가해 왔으며, 2011년에는 37,000여 톤 생산으로 약 2,220여억 원의 생산액을 기록하였다.

우리나라는 1997년 종자산업법을 시행하여 국내에서 신품종 육성자를 보호하려 하였고, 이어 2002년에 UPOV에 가입하였다. UPOV의 가입으로 우리나라는 외국 품종을 이용할 때 로열티를 지불하게 되고 이에 따라 많은 품종들이 개발되게 되었다. 이에 우리나라에서는 2016년 6월까지 총 48개의 표고 품종이 출원되었다. 따라서 표고버섯의 품종을 구분하는 것은 국내로 유입되는 국외품종으로부터 국산품종을 보호하고, 차후 수출 시 국산품종의 구분성을 갖게 하는데 중요한 요인이 될 것이다.

최근 분자 생물학의 발달로 DNA를 이용한 분자 마커가 널리 이용되고 있고, 연구목적과 원리, 적용성과 다형성 비율 등에 따라 RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphisms), SSRs (Simple Sequence Repeats, microsatellite), STS (Sequence Tagged Sites), CAPS (Cleaved Amplification Polymorphic Sequence)등의 마커들이 개발되고 있다. 그중 CAPS는 PCR 산물에 존재하는 제한효소의 인식부위를 찾아, 효소 처리 시 절단 위치에 따른 DNA 단편의 크기 차이를 확인하는 방법으로, DNA상에 존재하는 염기 하나가 다른 염기로 치환된 변이인 SNP(Single Nucleotide Polymorphism)를 예측할 수 있다. CAPS는 공우성(co-dominant)이면서 간편성과 재현성이 확보되어 활용도가 높다는 장점을 가지고 있다.

본 발명자들은 표고버섯의 게놈 염기서열을 이용하여 국내에서 개발된 품종 중 산마루 2호를 구분할 수 있는 CAPS 마커를 확인하였다. 이것은 1개의 제한효소를 이용하여 상기 품종을 간단하게 구분할 수 있는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

한국등록특허 제10-1834565호

따라서 본 발명의 목적은 표고버섯 품종 산마루 2호를 효과적으로 판별할 수 있는 조성물 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 표고버섯 품종 산마루 2호 판별용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 표고버섯 품종 산마루 2호 판별용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 이용하여 표고버섯 품종 산마루 2호를 신속하고 간편하게 판별하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서,

본 발명은 서열번호 1의 109번째 위치의 단일염기다형성(SNP) 마커를 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 표고버섯 품종 산마루 2호 판별을 위한 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 단일염기다형성(SNP) 마커를 검출할 수 있는 제제는 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트 또는 프로브일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 2 및 3의 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 2 및 3의 뉴클레오티드로 이루어진 표고버섯 품종 산마루 2호 판별용 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 표고버섯 품종 산마루 2호 판별을 위한 키트를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 키트는 증폭 반응을 수행하기 위한 시약 및 제한효소를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 제한효소는 HhaⅠ일 수 있다.

또한, 본 발명은 (a) 검체 시료로부터 핵산 분자를 분리하는 단계, 및 (b) 상기 분리된 핵산 분자로부터 서열번호 1의 109번째 위치 단일염기다형성(SNP) 마커를 확인하는 단계를 포함하는, 표고버섯 품종 산마루 2호를 판별하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (b) 단계는 분리된 핵산 분자를 주형으로 하고 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행함으로써 표적서열을 증폭한 후, 증폭산물에 제한효소를 처리하여 결과물을 검출하는 과정을 통해 이루어질 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 결과물의 크기가 238bp인 경우 표고버섯 품종 산마루 2호에 해당하는 것으로 판별할 수 있다.

또한, 본 발명은 표고버섯 품종 판별용 프라이머 세트로서, 상기 표고버섯 품종은 산마루 2호이며, 상기 프라이머 세트는 서열번호 2 및 3의 뉴클레오티드로 이루어지고, 상기 프라이머 세트는 CAPS(cleaved amplified polymorphic sequences) 마커를 증폭할 수 있는, 표고버섯 품종 판별용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명의 표고버섯 품종 산마루 2호 판별용 프라이머 세트는 CAPS(cleaved amplified polymorphic sequences) 마커를 효과적으로 증폭할 수 있는 프라이머 세트로서 이를 이용하는 경우 상기 표고 균주를 신속하고 간편하게 판별할 수 있다. CAPS 마커는 PCR로 증폭된 DNA 단편에 제한효소를 처리함으로써 단편의 절단 여부를 확인하기 때문에, SSR 마커의 경우와는 달리 고가의 사이즈 분석 장비가 없이도 아가로오스 젤(agarose gel) 상에서 빠르고 쉽게 결과를 확인할 수 있다. 이에 따라 품종을 구분하는 데에 드는 비용과 시간을 줄일 수 있고, 결과 해석에 고도의 지식을 요하지 않기 때문에 보다 효율적인 품종 판별이 가능하다.

도 1은 본 발명의 CAPS 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드 염기서열 및 이를 증폭할 수 있는 프라이머 세트 서열을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하고 시퀀싱을 하여 변이를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하고 증폭산물에 제한효소 HhaⅠ를 처리한 후 아가로스 겔에서 전기영동하여 분석한 결과이다.

본 발명은 표고버섯 품종 산마루 2호 판별을 위한 바이오커를 제공한다.

본 발명의 단일염기다형성(SNP) 마커는 표고버섯 품종 산마루 2호에 적용된다. 보다 구체적으로, 본 발명은 서열번호 1의 109번째 위치인 표고버섯 품종 산마루 2호 판별용 단일염기다형성(SNP) 마커에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 SNP를 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 표고버섯 품종 산마루 2호 판별을 위한 조성물을 제공한다.

본 명세서에서, 용어“단일염기다형성(SNP)”은 게놈에서 단일염기(A, T, C 또는 G)가 종의 멤버들 간 또는 한 개체(individual)의 쌍 염색체 간에 다른 경우에 발생하는 DNA 서열의 다양성을 의미한다. 단일염기는 폴리뉴클레오티드 서열에 변화(대체), 제거(결실) 또는 첨가(삽입)될 수 있다. SNP는 번역 프레임의 변화를 유발할 수 있다. 단일염기다형성은 유전자의 코딩 서열, 유전자의 비-코딩 부위 또는 유전자 사이의 내부 지역(intergenic regions)에 포함될 수 있다. 유전자의 코딩 서열 내의 SNP는 유전암호의 중복성(degeneracy)으로 인해 반드시 타겟 단백질의 아미노산 서열 상에 변화를 일으키지는 않는다. 동일한 폴리펩타이드 서열을 형성하는 SNP는 동의적(synonymous)이라 하고(침묵 돌연변이라고도 불리움), 다른 폴리펩타이드 서열을 형성하는 SNP의 경우 비-동의적(non-synonymous)이라고 한다. 비-동의적 SNP는 미스센스 또는 넌센스일 수 있으며, 미스센스 변화는 다른 아미노산을 발생시키는 반면에 넌센스 변화는 비성숙 종결코돈을 형성한다. 단백질-코딩 부위가 아닌 곳에 존재하는 SNP는 유전자 사일런싱, 전사인자 결합 또는 비-코딩 RNA 서열을 유발시킬 수 있다.

본 명세서에서, 용어 "단일염기다형성(SNP) 마커를 검출할 수 있는 제제"란, 시료에 포함된 해당 SNP를 확인하는 방법에 사용되는 제제를 의미하는데, 바람직하게는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블럿팅(Northern blotting), 유전자 칩 분석법 등의 방법에 사용되는 표적 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 항체가 될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "프라이머"란, 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxylgroup)를 가지는 핵산서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 15 내지 30개의 염기로 구성된다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "프로브"란, 유전자 또는 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하는데, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고, 보다 용이하게 검출하기 위하여 라벨링될 수 있다.

본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체 (예: 메틸 포스포네이트, 포스소트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체 (예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

본 발명에 이용되는 프라이머 또는 프로브로서, 상기 SNP를 포함하는 서열에 완전하게(perfectly) 상보적인 서열이 이용될 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로(substantially) 상보적인 서열이 이용될 수도 있다. 구체적으로는, 본 발명에 이용되는 프로브는 본 발명의 SNP를 포함하는 10-30개의 연속 뉴클레오타이드 잔기를 포함하는 서열에 혼성화 될 수 있는 서열을 포함한다. 보다 구체적으로는, 상기 프로브의 3’-말단 또는 5’-말단은 상기 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖는다. 일반적으로, 혼성화에 의해 형성되는 듀플렉스(duplex)의 안정성은 말단의 서열의 일치에 의해 결정되는 경향이 있기 때문에, 3’-말단 또는 5’-말단에 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖는 프로브에서 말단 부분이 혼성화되지 않으면, 이러한 듀플렉스는 엄격한 조건에서 해체될 수 있다.

혼성화에 적합한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., et al., Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시된 사항을 참조하여 결정할 수 있다. 혼성화에 이용되는 엄격한 조건(stringent condition)은 온도, 이온세기(완충액 농도) 및 유기용매와 같은 화합물의 존재 등을 조절하여 결정될 수 있다. 이러한 엄격한 조건은 혼성화되는 서열에 의존하여 다르게 결정될 수 있다.

본 명세서에서, 용어 “상보적”은 소정의 어닐링 또는 혼성화 조건하에서 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산 서열에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적(perfectly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 구체적으로는 완전히 상보적인 것을 의미한다. 본 명세서에서, 프라이머 서열과 관련하여 사용되는 용어, “실질적으로 상보적인 서열”은 완전히 일치되는 서열뿐만 아니라, 특정 서열에 어닐링하여 프라이머 역할을 할 수 있는 범위 내에서, 비교 대상의 서열과 부분적으로 불일치되는 서열도 포함되는 의미이다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 프라이머는 서열번호 2 및 3의 서열을 갖는 프라이머 세트일 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 3 및 3의 뉴클레오티드로 이루어진 표고버섯 품종 산마루 2호 판별용 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 표고버섯 품종 산마루 2호 판별용 키트를 제공한다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 키트는 서열번호 1의 109번째 위치하는 단일염기다형성(SNP) 부위를 포함하는 폴리뉴레오티드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트를 포함할 수 있으며, 상기 프라이머 세트는 서열번호 2 및 3의 서열을 가질수 있다.

본 발명의 다른 구체예에서, 상기 키트는 서열번호 2 및 3의 서열을 갖는 프라이머 세트 이외에 PCR 증폭 반응을 수행하기 위한 시약 및 제한효소를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 제한효소는 HhaⅠ일 수 있다.

상기 제한효소 HhaⅠ는 GCG^C 사이트를 인식한다. 서열번호 1의 109번째 뉴클레오티드 위치가 구아닌(guanine, G) 또는 시토신(cytosine, C)인 경우에 HhaⅠ에 의해 절단되고, 아데닌(adenine, A) 또는 티민인 경우에는 절단되지 않는다. 즉, 표고버섯 품종 산마루 2호는 서열번호 1의 109번째 뉴클레오티드 위치가 티민이므로 상기 제한효소에 의해 절단되지 않아, 다른 품종의 표고버섯과 구별할 수 있다.

상기 표고버섯 품종 산마루 2호 판별용 키트는 유전자 증폭 방식에 의해 실시될 수 있다.

본 명세서에서 유전자 증폭 키트를 설명하면서 기재된 용어, "증폭"은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(PCR)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP439,182), 전사-매개 증폭(transcription-mediated amplification; TMA, WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication, WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences, 미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction(CP-PCR), 미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction(AP-PCR), 미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification(NASBA), 미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification)(21, 22) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)(23)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다.

PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR 및 TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)이 특정한 응용을 위해 개발되었다.

PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, SpringerVerlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.

본 발명의 키트가 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우에는, 본 발명의 키트는 선택적으로 PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대 완충액, DNA 중합효소, DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.

다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 "클레나우" 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 구체적으로는, 중합효소는 다양한 박테리아종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함한다.

중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg2+와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 원하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 요구된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서, 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다. 본 발명에 있어서 어닐링은 타깃 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다.

이렇게 증폭된 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열을 제한효소 처리하여 산물의 크기를 비교함으로써 표고버섯 품종을 구별한다. 예를 들어, 상술한 증폭 반응 결과물을 젤 전기영동을 하고, 그 결과 형성되는 밴드를 관찰 및 분석함으로써 본 발명의 마커의 크기를 조사한다.

본 명세서에서 사용되는 용어, “CAPS (cleaved amplified polymorphic sequence) 마커”는 단일염기다형성(SNP) 중 제한효소 자리에 위치한 SNP를 일컫는다. CAPS 마커를 이용하는 경우 유전자좌에 특이적인 프라이머로 PCR 증폭을 한 후 제한효소로 잘라준 뒤 나타나는 다형성을 분석할 수 있다.

본 발명의 상기 (b) 단계는 분리된 핵산 분자를 주형으로 하고 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행함으로써 표적서열을 증폭한 후, 증폭산물에 제한효소를 처리하여 결과물을 검출하는 과정을 통해 이루어질 수 있다.

상기 프라이머 세트는 서열번호 2 및 3의 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있으며, 상기 제한효소는 HhaⅠ일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 표고버섯 품종 산마루 2호는 다음과 같은 과정을 통해 판별할 수 있다.

(Ⅰ) 표고버섯으로부터 핵산 분자를 분리하는 단계;

(Ⅱ) 상기 핵산분자의 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)의 염기 타입을 검출하는 단계로서, 상기 SNP는 서열번호 1의 109번째 뉴클레오타이드 위치에 존재하는 SNP인 단계; 및

(Ⅲ) 상기 검출한 SNP 위치의 염기 타입으로부터 표고버섯 품종 산마루 2호를 판별하는 단계로, 상기 SNP 위치의 염기가 티민(thymine, T)인 경우에 표고버섯 품종 산마루 2호로 판정한다.

본 명세서에서 용어, “핵산 분자”는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 핵산분자는 genomic DNA(gDNA)이다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 genomic DNA는 표고버섯의 배지, 표고버섯 종균 또는 표고버섯 균사체일 수 있다. 구체적으로는, 표고버섯 균사체로부터 얻는다. 핵산분자의 공급원(source)로서의 식물체는 어떠한 발달 단계에 있는 것이든 모두 공급원으로서 이용될 수 있다.

본 발명의 방법에서 출발물질이 gDNA인 경우, gDNA의 분리는 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다(참조: Rogers & Bendich (1994)).

본 발명의 다른 구체예에서, 표고버섯 품종 산마루 2호는 다음과 같은 과정을 통해 판별할 수 있다.

(ⅰ) 표고버섯으로부터 핵산 분자를 분리하는 단계;

(ⅱ) 상기 핵산 분자를 주형으로 사용하고, 서열번호 2 및 3의 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 프라이머 세트를 사용하여 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction)을 실시하는 단계;

(ⅲ) 상기 중합효소연쇄반응의 증폭산물을 서열번호 1의 109번째 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 인식하는 제한효소 처리하는 단계; 및

(ⅳ) 단계 (ⅲ)의 결과물을 분석하는 단계로, 상기 결과물이 제한효소에 의해 절단되지 않으면 표고버섯 품종 산마루 2호로 판정한다.

예를 들어, 분석하고자 하는 표고버섯 품종으로부터 게놈 DNA를 분리한 후 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호 2 및 3로 구성되는 프라이머 세트를 이용하여 CAPS 마커를 포함하는 특정서열을 증폭한 다음, 증폭산물에 제한효소는 HhaⅠ를 처리하여 도출되는 결과물 검출하였을 때, 결과물의 크기가 238bp인 경우 표고버섯 품종 산마루 2호에 해당하는 것으로 판별할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

표고버섯 품종 산마루 2호 판별을 위한 CAPS 마커 발굴

표고버섯 품종 산마루 2호를 다른 품종과 구분할 수 있는 CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence)마커를 개발하기 위하여 국내에서 개발된 43개 표고버섯 품종(하기 표 1 참조)과 표고버섯 표준유전체 분석 균주인 B17(Shim et al., 2016)을 이용하였다.

자세하게는, 시험품종들은 potato dextrose broth (PDB) 배지에서 25 ℃, 암조건에서 약 2주간 110 rpm으로 진탕배양 하였다. 진탕배양 된 균사체들은 미라클로스(miracloth)로 걸러 PBS buffer (135 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na2HPO4및 1.4 mM KH2PO4)로 세척하고 물기를 제거하였다. 물기가 제거된 균사 약 100 mg을 액체질소에 얼려 막자사발로 마쇄한 후, GenEx Plant kit (GeneAll, Seoul, Korea)를 이용하여 genomic DNA를 추출하였다. genomic DNA의 추출은 제조사의 프로토콜에 따라 추출하였다. 추출한 DNA는 Micro-spectrophotometer K5600 (BioFuture Inc., Toyko, Japan)으로 정량 후 20 ng/μL로 희석하여 사용하였다.

표고버섯 품종 산마루 2호의 구분을 위한 CAPS 마커 개발에 적합한 SNP와 Indel의 동정은 Hiseq 2500 platform을 이용하여 분석한 시험품종들의 전장유전체 정보와 Shim 등 (2016)이 분석한 표고버섯 유전체 정보를 비교하여 수행하였다. 표고버섯의 표준유전체 B17 염기서열 정보를 기반으로 alignment를 수행한 결과 산마루 2호에 특이적인 변이가 존재하는 것을 확인할 수 있었다. 산마루 2호에만 존재하는 Indel은 동정이 되지 않았고 SNP는 8개가 동정되었다(하기 표 2 참조).

국내에서 개발된 38개 표고버섯 품종 리스트

No.	Cultivar name	No.	Cultivar name	No.	Cultivar name
1	산림7호	16	균흥135	31	산조704호
2	산림9호	17	유지로	32	산조705호
3	산림10호	18	향고808	33	산조706호
4	여름향	19	천장3호	34	산조707호
5	가을향	20	산조101호	35	산조708호
6	백화향	21	산조102호	36	산조709호
7	다산향	22	산조103호	37	산조710호
8	천백고	23	산조108호	38	참아람
9	풍년고	24	산조109호	39	참송이
10	천장1호	25	산조110호	40	이슬송이
11	천장2호	26	산조111호	41	산조301
12	산마루1호	27	산조501호	42	추산A6
13	산마루 2호	28	산조502호	43	산조302호
14	산백향	29	산조701호
15	송고	30	산조702호

산마루 2호에 존재하는 SNP 리스트

#Chr	POS	REF	ALT	codon	Gene	Desc
Scaffold 6	1212892	G	A	c.*1551G>A	Mbtps2	Membrane-bound transcription factor site-2 protease [Source:UniProtKB/Swiss-Prot Q8CHX6]
Scaffold 2	3676659	G	T	c.-1G>T	GENE10847	-
Scaffold 22	195159	A	C	c.239A>C	GENE00246	hypothetical protein Moror_1619 [Moniliophthora roreri MCA 2997] [Source:NCBI_NR ESK93613.1]
Scaffold 19	119469	T	A	c.-1T>A	malA	NADP-dependent malic enzyme [Source:UniProtKB/Swiss-Prot Q6TU48]
Scaffold 19	119470	G	C	c.-1G>C	malA	NADP-dependent malic enzyme [Source:UniProtKB/Swiss-Prot Q6TU48]
Scaffold 7	3208246	G	A	c.364G>A	LE14B_LITER	LEC14B protein [Source:UniProtKB/Swiss-Prot Q40153]
Scaffold 7	5818871	C	G	c.-1G>C	GENE06197	hypothetical protein Moror_10090 [Moniliophthora roreri MCA 2997] [Source:NCBI_NR ESK85496.1]
Scaffold 2	1803483	C	T	c.-1C>T	TOP2	DNA topoisomerase 2 [Source:UniProtKB/Swiss-Prot Q9Y8G8]
#Chr, number of chromosome; POS, position; REF, reference; ALT, alternative; Desc, description

동정된 SNP들을 중심으로 500 bp의 flanking sequence를 추출하였고, Primer3Plus(http://biotools.umassmed.edu/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi)를 이용하여 이 서열들을 증폭할 수 있는 프라이머를 디자인하였다. 프라이머 디자인 후 표고버섯의 표준유전체 정보를 가지고 있는 B17과 본 연구에서 CAPS 마커를 개발하고자 하는 산마루 2호를 대상으로 genomic DNA 20 ng을 주형으로, 95℃에서 3분, 다시 95℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 20초로 35사이클을 증폭한 후, 추가로 72℃에서 5분간 반응시켰다. 중합효소연쇄반응 후 이 서열들을 sanger sequencing (Cosmogenetech, Seoul, Korea)을 수행하여 변이를 확인하였을 때, 표고버섯 표준유전체의 Scaffold 2번 1803483의 염기서열 C가 산마루 2호에서 T로 변한 SNP를 가장 적합한 서열로 판단하였다 (본 위치서열은 다른 서열보다 많은 품종에서 안정적으로 PCR이 잘 되었고, SNP 부위가 enzyme site를 가지고 있는 것으로 확인됨). 따라서, 상기 SNP를 포함하는 특정 염기서열을 “RL-LE-129”로 명명하고 마커 서열로 이용하였으며, 하기 표 3에서 자세히 나타내었다.

산마루 2호 동정을 위한 PCR용 프라이머 서열

프라이머 서열	Primer sequence	Target DNA sequence	Size (bp)
RL-LE-129 F	TGGGATTGCAGCATAACAAG	TGGGATTGCAGCATAACAAGgactattcaaatgtctcaagcttgcgatacggacgcttaatgatcatgactgatcaggtaagttgaatattgtcacaatatgagggggCgctgagatagaacgactaggatcacgacggatctcatatcaaagggcttttaatcaatttcatcgaccacttttatccgtcactacttaaaatacccgacttcctcgttGAGTTCGTCACGCCGATTAT	238
RL-LE-129 R	ATAATCGGCGTGACGAACTC		238

B17과 산마루 2호에서 증폭한 마커서열 RL-LE-129에 존재하는 특이적인 제한효소를 dCAPS Finder 2.0 (http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)을 이용해 검색하였을 때, 산마루 2호에서는 제한효소 HhaⅠ의 인식부위가 존재하지 않았다(도 2 참조).

< 실시예 2>

본 발명의 CAPS 마커를 이용한 표고버섯 품종 산마루 2호 판별

본 발명의 CAPS 마커(RL-LE-129)가 표고버섯 품종 산마루 2호 판별에 유용한지 살펴보기 위하여 국내 개발된 43개 시험품종으로 확대하여 검증을 실시하였다. 국내 개발된 43개의 표고버섯 품종별 genomic DNA를 추출하여 20 ng의 DNA를 이용하여 PCR을 수행하였다. DNA 추출과 PCR 수행 방법은 다음과 같다.

PDB배지에서 배양한 표고버섯 균사체를 미라클로스에 여과시킨 후 PBS버퍼(NaCl 135mM, KCl 2.7mM, Na2HPO4 4.3mM, KH2PO4 1.4mM)를 부어 씻어내고 키친타올로 물기를 제거한다. 건조된 균사를 액체질소에 얼려 막자사발로 곱게 갈은 후 GeneAll® GenEx™ Plant kit를 이용해 Genomic DNA를 추출하였다. 튜브에 옮겨 담은 균사에 PL버퍼 500ul를 넣고 65℃에서 10분간 가열해준 후 파이펫을 이용해 잘 섞어준다. 13000rpm으로 1분간 원심분리한 후 상층액을 분리하여 새 튜브로 옮겨준 후 PP버퍼를 상층액의 1/3만큼 넣고 볼텍서를 이용해 잘 섞어준다. 얼음에서 5분간 방치 후 13000rpm으로 5분간 원심분리한다. 상층액을 분리하여 새 튜브로 옮기고 동량의 PCI(phenol : Chloroform : isoamylalcohol = 25 : 24: 1)를 넣어준 후 뒤집어 섞어준다. 13000rpm에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 분리하여 새 튜브에 옮기고, 동량의 isopropanol을 넣어준 후 뒤집어 섞어 준다. 얼음에 10분간 방치 후 13000rpm에서 1분간 원심분리한다. 상층액을 제거한 후 70% 에탄올 1ml를 넣어 DNA 펠렛을 살짝 띄우고 13000rpm에서 1분간 원심분리한다. 상층액을 제거한 후 13000rpm에서 1분간 한 번 더 원심분리한다. 남은 에탄올을 전부 제거하고 DNA 펠렛을 상온에서 5분간 건조시킨 후, RE버퍼 100ul를 넣어 DNA 펠렛을 녹인다. 추출한 Genomic DNA 20ng을 주형으로 본 발명에서 제작한 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR은 95℃에서 3분, 다시 95℃에서 30초, 57℃에서 30초, 72℃에서 20초로 35사이클을 증폭한 후, 추가로 72℃에서 5분간 반응시킴으로써 수행되었다.

이후 상기 증폭산물에 제한효소 HhaⅠ를 처리한 다음 아가로스 젤 전기영동을 통해 결과물의 확인하였다.

그 결과 도 3에서 나타낸 바와 같이, 43개의 표고버섯 품종 중 산마루 2호에서만 제한효소 HhaⅠ의 인식부위가 존재하지 않아 산마루 2호의 PCR 증폭산물만 절단되지 않는 것을 확인하였다. 산마루 2호의 구분은 검정색의 밴드패턴으로 확인할 수 있으며, 238bp의 밴드 사이즈를 나타내었다.

따라서 마커서열인 RL-LE-129을 증폭하고, 제한효소 HhaⅠ을 처리하여 산마루 2호를 구분할 수 있는 CAPS 마커를 개발하였다.

CAPS 마커는 공우성 마커로 비교적 간단한 분석을 통해 일정한 결과를 안정적으로 얻어낼 수 있는 장점이 있어(Konieczny and Ausubel, 1993; Kaundun and Matsumoto, 2003), 올리브, 배, 딸기와 같은 작물에서 품종을 판별하는데 사용되고 있다(Kunihisa et al., 2003; Reale et al., 2006; Moriya et al., 2007). 최근 표고버섯의 유전체 정보가 밝혀져, 이를 이용한 분자마커의 개발이 증가할 것이라 생각된다, 본 연구에서는 표고버섯의 전장유전체 정보(Lentinula edodes B17)를 바탕으로 국내에서 개발된 다양한 표고버섯 품종으로부터 산마루 2호의 구분이 가능한 CAPS 마커를 개발하였다. 개발된 CAPS 마커는 산마루 2호를 다른 품종으로부터 보호하는 과학적 근거가 될 것이다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> CAPS Marker for Identification of Lentinula edodes Cultivar Sanmaru 2ho and use thereof <130> NPDC-67826 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 238 <212> DNA <213> Lentinula edodes <400> 1 tgggattgca gcataacaag gactattcaa atgtctcaag cttgcgatac ggacgcttaa 60 tgatcatgac tgatcaggta agttgaatat tgtcacaata tgagggggyg ctgagataga 120 acgactagga tcacgacgga tctcatatca aagggctttt aatcaatttc atcgaccact 180 tttatccgtc actacttaaa atacccgact tcctcgttga gttcgtcacg ccgattat 238 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RL-LE-129 forward primer <400> 2 tgggattgca gcataacaag 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RL-LE-129 reverse primer <400> 3 ataatcggcg tgacgaactc 20

Claims

서열번호 1의 109번째 위치의 단일염기다형성(SNP) 마커를 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 표고버섯 품종 산마루 2호 판별을 위한 조성물.
제1항에 있어서,
상기 단일염기다형성(SNP) 마커를 검출할 수 있는 제제는 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트 또는 프로브인 것을 특징으로 하는 조성물.
제2항에 있어서,
상기 프라이머 세트는 서열번호 2 및 3의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
서열번호 2 및 3의 뉴클레오티드로 이루어지는 표고버섯 품종 산마루 2호 판별용 프라이머 세트.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 표고버섯 품종 산마루 2호 판별을 위한 키트.
제5항에 있어서,
상기 키트는 증폭 반응을 수행하기 위한 시약 및 제한효소를 더 포함하는 키트.
제6항에 있어서,
상기 제한효소는 HhaⅠ인 것을 특징으로 하는 키트.
(a) 검체 시료로부터 핵산 분자를 분리하는 단계, 및
(b) 상기 분리된 핵산 분자로부터 서열번호 1의 109번째 위치 단일염기다형성(SNP) 마커를 확인하는 단계를 포함하는, 표고버섯 품종 산마루 2호를 판별하는 방법.
제8항에 있어서,
상기 b) 단계는 분리된 핵산 분자를 주형으로 하고 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행함으로써 표적서열을 증폭한 후, 증폭산물에 제한효소를 처리하여 결과물을 검출하는 과정을 통해 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제9항에 있어서,
상기 프라이머 세트는 서열번호 2 및 3의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
제9항에 있어서,
상기 제한효소는 HhaⅠ인 것을 특징으로 하는 방법.
제9항에 있어서,
상기 결과물의 크기가 238bp인 경우 표고버섯 품종 산마루 2호에 해당하는 것으로 판별하는 것을 특징으로 하는 방법.
표고버섯 품종 판별용 프라이머 세트로서,
상기 표고버섯 품종은 산마루 2호이며,
상기 프라이머 세트는 서열번호 2 및 3의 뉴클레오티드로 이루어지고,
상기 프라이머 세트는 CAPS(cleaved amplified polymorphic sequences) 마커를 증폭할 수 있는, 표고버섯 품종 판별용 프라이머 세트.