KR102487648B1 - 중국 접종배지 표고버섯 품종 판별용 caps 마커 및 이의 용도 - Google Patents

중국 접종배지 표고버섯 품종 판별용 caps 마커 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 표고버섯 품종 판별용 CAPS 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하면 표고버섯 품종을 빠르고 간편하게 확인할 수 있으며, 본 발명의 프라이머를 이용하여 PCR로 분리된 CAPS 마커를 이용해 표고 균주를 구분할 수 있다. 우리나라 표고버섯 유전자원을 보호하는 한편 수입품종과의 구별할 수 있어, 해외로 건표고나 생표고로 수출될 때에도 국산품종임을 입증할 수 있는 구별 방법으로 매우 유용하게 활용될 수 있다.

Description

중국 접종배지 표고버섯 품종 판별용 CAPS 마커 및 이의 용도 {Development of CAPS marker for discrimination of Lentinula edodes for cultivation on chinese medium cultivar and use thereof}
본 발명은 중국 접종배지 표고버섯 (Lentinula edodes) 품종 판별용 CAPS 마커 및 이의 용도에 관한 것이다.
세계 버섯생산액은 1990년대 초 약 85억 달러에서 2010년 약 400억 달러로 4.7배 증가하는 등 꾸준히 확대되는 양상을 보이고, 버섯산업은 1990년대 후반 급속하게 증가하였다. 표고버섯은 세계 버섯 생산의 약 17%를 차지하고 있는 표고버섯은 한국, 중국, 일본 등 아시아국가에서 주로 재배되며, 미국, 캐나다, 네덜란드, 폴란드 등의 서구국가에서도 상업적으로 재배되고 있다. 그리고 항암효과를 보이는 렌티난 (lentinan) 등이 있어 식품뿐만 아니라 약학적인 용도로도 사용이 늘어나고 있다.
표고버섯은 1980년대 까지 일본이 전세계적인 주요 생산국이었으나, 1990년 중국이 주요 생산국이다. 2012년 중국은 전세계 생산의 90%이상인 400만톤 이상을 생산하고 있다. 2013년 국내의 버섯 총 생산액은 전체 농산물 생산액 1.1%차지하고 품목별 생산비율은 느타리 34%, 새송이 24%, 팽이 17%, 표고 16%, 양송이4% 이다. 국내에서 생산되는 버섯 중 농산버섯의 수출액과 수출량은 꾸준히 증가하고 있으나, 임산 버섯인 표고버섯은 수입의 비중이 높아 2015년 표고버섯의 수입량은 수출량에 비하여 약 21배 많았고 수입액은 약 7배 많았다.
우리나라는 1997년 종자산업법을 시행하여 국내에서 신품종 육성자를 보호하고 있고, 2002년에 UPOV에 가입하였다. UPOV의 가입으로 우리나라는 외국 품종을 이용할 때 로열티를 지불하고, 국외에 수출되는 국내 품종들도 보호받게 된다.
표고버섯의 주요 생산국이자 소비국인 동북아 3국의 표고버섯 시장이 급속히 변화하고 있다. 현재의 상황에서 품종 구분마커의 개발은 국외 품종에 대한 국산 품종의 구별성을 확보하여 국내에서 개발된 품종들을 보호하는데 도움을 줄 수 있다.
현재 우리나라의 표고버섯 품종 구별은 산림청에서 제작한 표고버섯 특성조사요령에 의하여 이루어지고 있지만, 분자마커를 이용한다면 더욱 효율적일 수 있다. 현재까지 개발되어 이용되고 있는 분자 마커의 종류로는 RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphisms), SSRs (Simple Sequence Repeats, microsatellite), STS (Sequence Tagged Sites), CAPS (Cleaved Amplification Polymorphic Sequence) 등이 있다. 그 중 CAPS는 유전체 내 하나의 염기서열이 치환된 변이인 SNP나 하나 이상의 염기서열이 삽입 또는 결실된 변이인 Indel의 검출이 가능한 마커로, PCR 산물에 제한효소를 처리하여 DNA 단편의 크기 차이를 확인하는 방법이다. 대부분의 CAPS 마커는 공우성 (co-dominant)이고, 쉽게 결과를 해석할 수 있다는 장점을 가지고 있다.
한편, 현재 한중 FTA의 영향으로 중국산 표고의 수입이 증가하고 있고, 표고의 생산량보다 소비량이 많은 일본에서 중국산 표고보다 한국산을 선호하고 있어, 동북아 3국의 표고버섯 시장이 급속히 변화하고 있다. 이에 따라 직접적인 버섯의 수출입 이외에 품종의 수출도 이루어질 것으로 판단된다. 그리고 2010년 10월 제 10차 생물다양성 협약 당사국 총회를 통해 나고야 의정서가 채택됨에 따라 각국은 현재 보유하고 있는 유전자원에 대한 보호를 강화할 것으로 생각된다. 현재 국내의 국립산림품종관리센터에 품종보호출원 및 등록된 표고버섯 품종은 53개이고 이중 산림조합중앙회 산림버섯연구센터에서 출원한 품종은 총 24개로 약 45%를 차지하고 있다. 따라서 국내에서 보급되고 있는 표고버섯 품종 중 산림버섯연구센터에서 개발한 품종을 CAPS 마커로 구분하는 것은 우리나라 표고버섯 유전자원을 보호하는 한편 수입품종과의 구별에 있어 매우 중요하다. 한편, 해외로 건표고나 생표고로 수출될 때에도 국산품종임을 입증할 수 있는 구별 방법으로 매우 유용하게 활용될 것이다.
대한민국 공개특허 제10-2019-0008461호
본 발명의 목적은 표고버섯 품종 참아람, 산조708호, 산조707호, 산조302호, 산조701호, 산조108호, 모리290, 유지로, 향고808 또는 추재2호 판별용 프라이머 세트를 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는 표고버섯 품종 판별용 키트를 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 이용하여 표고버섯 품종을 판별하는 방법을 제공하는 데 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍; 또는 서열번호 3 및 4의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍;을 포함하는 표고버섯 품종 참아람 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 5 및 6의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍; 또는 서열번호 7 및 8의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍;을 포함하는 표고버섯 품종 산조708호 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 서열번호 9 및 10의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍; 또는 서열번호 11 및 12의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍;을 포함하는 표고버섯 품종 산조707호 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 13 및 14의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍; 서열번호 15 및 16의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍; 또는 서열번호 17 및 18의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍;을 포함하는 표고버섯 품종 산조302호 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 19 및 20의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍; 또는 서열번호 21 및 22의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍;을 포함하는 표고버섯 품종 산조701호 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 23 및 24; 서열번호 25 및 26; 서열번호 27 및 28; 서열번호 29 및 30; 또는 서열번호 31 및 32의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍;을 포함하는 표고버섯 품종 산조108호 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 33 및 34의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍;을 포함하는 표고버섯 품종 모리290 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 35 및 36의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍;을 포함하는 표고버섯 품종 유지로 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 37 및 38의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍;을 포함하는, 표고버섯 품종 향고808 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 39 및 40; 서열번호 41 및 42; 서열번호 43 및 44; 또는 서열번호 45 및 46의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍;을 포함하는, 표고버섯 품종 향고808 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 표고버섯 품종 판별을 위한 CAPS (cleaved amplified polymorphic sequences) 마커 증폭용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트; 증폭 반응을 수행하기 위한 시약; 및 제한효소를 포함하는 표고버섯 품종 판별용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 표고버섯 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제3항의 프라이머 쌍을 시용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 상기 증폭 단계 산물을 제한효소로 절단하는 단계; 및 상기 제한효소 절단 산물을 전기영동하여 절단 산물의 크기를 분석하는 단계;를 포함하는 표고버섯 품종을 판별하는 방법을 제공한다.
전술한 바와 같은 본 발명에 따르면, 표고버섯 품종을 빠르고 간편하게 확인할 수 있으며, 본 발명의 프라이머를 이용하여 PCR로 분리된 CAPS 마커를 이용해 표고 균주를 구분할 수 있다. 우리나라 표고버섯 유전자원을 보호하는 한편 수입품종과의 구별할 수 있어, 해외로 건표고나 생표고로 수출될 때에도 국산품종임을 입증할 수 있는 구별 방법으로 매우 유용하게 활용될 수 있다. 또한, CAPS 마커는 PCR로 증폭된 DNA 단편에 제한효소를 처리함으로써 단편의 절단 여부를 확인하기 때문에, SSR 마커의 경우와는 달리 고가의 사이즈 분석 장비가 없이도 아가로즈 겔 상에서 빠르고 쉽게 결과를 확인할 수 있다. 이에 따라 품종을 구분하는 데에 드는 비용과 시간을 줄일 수 있고, 결과 해석에 고도의 지식을 요하지 않기 때문에 보다 효율적인 품종 판별이 가능하다는 장점이 있다.
도 1은 특이 유전변이 발굴을 위한 생물정보분석 파이프라인을 간단히 도식화하여 나타낸 도이다.
도 2는 표고버섯 참아람 품종 특이적 CAPS 마커 적용 결과이다.
도 3은 표고버섯 산조708호 품종 특이적 CAPS 마커 적용 결과이다.
도 4는 표고버섯 산조707호 품종 특이적 CAPS 마커 적용 결과이다.
도 5는 표고버섯 산조302호 품종 특이적 CAPS 마커 적용 결과이다.
도 6은 표고버섯 산조701호 품종 특이적 CAPS 마커 적용 결과이다.
도 7은 표고버섯 산조108호 품종 특이적 CAPS 마커 적용 결과이다.
도 8은 표고버섯 모리290 품종 특이적 CAPS 마커 적용 결과이다.
도 9는 표고버섯 유지로 품종 특이적 CAPS 마커 적용 결과이다.
도 10은 표고버섯 향고808 품종 특이적 CAPS 마커 적용 결과이다.
도 11은 표고버섯 추재2호 품종 특이적 CAPS 마커 적용 결과이다.
이하, 본 발명에 대하여 보다 상세하게 설명하도록 한다.
본 발명자들은 국내 유통중인 주요 표고 품종의 판별을 위한 분자생물학적 진단법 개발을 위하여 국내에서 유통중인 주요 표고 품종 10종에 대한 비교유전체 분석을 통하여 특이적인 유전변이를 10,904개 발굴하였다. 이어서, 해당 단일염기다형성 (SNP)을 포함하면서 증폭산물의 길이가 300-600bp 정도로서 극단적인 Tm 값을 갖지 않고 (약 40~60C 범위), 증폭산물에 단일 제한효소로 절단되는 부분을 포함한 CAPS 마커 후보군을 설계하였으며, 설계한 마커 후보군의 판별 민감도를 유전자증폭반응과 제한효소 처리에 의하여 재확인 하였고, 최종적으로 정확하고 신속하게 표고버섯 품종 판별에 사용할 수 있는 23개의 CAPS 마커를 선발하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명에서 사용되는 용어 “다형성 (polymorphism)”이란 하나의 유전자 좌위 (locus)에 두 가지 이상의 대립 유전자 (allele)가 존재하는 경우를 말하며 다형성 부위 중에서, 사람에 따라 단일 염기만이 다른 것을 단일 염기 다형성 (single nucleotide polymorphism, SNP)이라 한다. 바람직한 다형성 마커는 선택된 집단에서 1% 이상, 더욱 바람직하게는 5% 또는 10% 이상의 발생 빈도를 나타내는 두 가지 이상의 대립 유전자를 가진다. 따라서, 다형성 마커에 대한 유전적 연관 (genetic association)은 특정한 다형성 마커의 하나 이상의 특정한 대립형질에 대해 연관이 있다는 것을 의미한다. 마커는 단일 염기 다형성 (SNP), 마이크로새틀라이트 (microsatellite), 삽입, 결실, 중복 및 전위 (translocation)를 포함한, 게놈에서 발견되는 임의의 변이 형태의 대립형질을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 “단일염기다형성 (SNP)”은 게놈에서 단일염기 (A, T, C 또는 G)가 종의 멤버들 간 또는 한 개체 (individual)의 쌍 염색체 간에 다른 경우에 발생하는 DNA 서열의 다양성을 의미한다. 단일염기는 폴리뉴클레오티드 서열에 변화 (대체), 제거 (결실) 또는 첨가 (삽입)될 수 있다. SNP는 번역 프레임의 변화를 유발할 수 있다. 단일염기다형성은 유전자의 코딩 서열, 유전자의 비-코딩 부위 또는 유전자 사이의 내부 지역 (intergenic regions)에 포함될 수 있다. 유전자의 코딩 서열 내의 SNP는 유전암호의 중복성 (degeneracy)으로 인해 반드시 타겟 단백질의 아미노산 서열상에 변화를 일으키지는 않는다. 동일한 폴리펩타이드 서열을 형성하는 SNP는 동의적 (synonymous)이라 하고 (침묵 돌연변이라고도 불리움), 다른 폴리펩타이드 서열을 형성하는 SNP의 경우 비-동의적 (non-synonymous)이라고 한다. 비-동의적 SNP는 미스센스 또는 넌센스일 수 있으며, 미스센스 변화는 다른 아미노산을 발생시키는 반면에 넌센스 변화는 비성숙 종결코돈을 형성한다. 단백질-코딩 부위가 아닌 곳에 존재하는 SNP는 유전자 사일런싱, 전사인자 결합 또는 비-코딩 RNA 서열을 유발시킬 수 있다.
이어서, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍; 또는 서열번호 3 및 4의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍;을 포함하는 표고버섯 품종 참아람 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 프라이머 쌍은 제한효소에 의한 특이적인 절단이 일어날 수 있는 부위를 증폭하는 것일 수 있다.
상기 서열번호 1 및 2의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍에 의한 증폭 산물은 제한효소 AccI (Xmil)에 의해 특이적으로 절단되는 제한효소 자리를 포함하는 것일 수 있다.
상기 서열번호 3 및 4의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍에 의한 증폭 산물은 제한효소 AvaII (Eco48I)에 의해 특이적으로 절단되는 제한효소 자리를 포함하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 5 및 6의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍; 또는 서열번호 7 및 8의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍;을 포함하는 표고버섯 품종 산조708호 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
상기 서열번호 5 및 6의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍에 의한 증폭 산물은 제한효소 AfeI에 의해 특이적으로 절단되는 제한효소 자리를 포함하는 것일 수 있다.
상기 서열번호 7 및 8의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍에 의한 증폭 산물은 제한효소 NcoI에 의해 특이적으로 절단되는 제한효소 자리를 포함하는 것일 수 있다.
또한, 서열번호 9 및 10의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍; 또는 서열번호 11 및 12의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍;을 포함하는 표고버섯 품종 산조707호 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
상기 서열번호 9 및 10의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍에 의한 증폭 산물은 제한효소 AvaII (Eco48I)에 의해 특이적으로 절단되는 제한효소 자리를 포함하는 것일 수 있다.
상기 서열번호 11 및 12의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍에 의한 증폭 산물은 제한효소 BfaI (FspBI)에 의해 특이적으로 절단되는 제한효소 자리를 포함하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 13 및 14의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍; 서열번호 15 및 16의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍; 또는 서열번호 17 및 18의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍;을 포함하는 표고버섯 품종 산조302호 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
상기 서열번호 13 및 14의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍에 의한 증폭 산물은 제한효소 AccI (Xmil)에 의해 특이적으로 절단되는 제한효소 자리를 포함하는 것일 수 있다.
상기 서열번호 15 및 16의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍에 의한 증폭 산물은 제한효소 AvaII (Eco48I)에 의해 특이적으로 절단되는 제한효소 자리를 포함하는 것일 수 있다.
상기 서열번호 17 및 18의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍에 의한 증폭 산물은 BfaI (FspBI)에 의해 특이적으로 절단되는 제한효소 자리를 포함하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 19 및 20의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍; 또는 서열번호 21 및 22의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍;을 포함하는 표고버섯 품종 산조701호 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
상기 서열번호 19 및 20의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍에 의한 증폭 산물은 AvaI (Eco88I)에 의해 특이적으로 절단되는 제한효소 자리를 포함하는 것일 수 있다.
상기 서열번호 21 및 22의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍에 의한 증폭 산물은 BfaI (FspBI)에 의해 특이적으로 절단되는 제한효소 자리를 포함하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 23 및 24; 서열번호 25 및 26; 서열번호 27 및 28; 서열번호 29 및 30; 또는 서열번호 31 및 32의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍;을 포함하는 표고버섯 품종 산조108호 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
상기 서열번호 23 및 24의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍에 의한 증폭 산물은 제한효소 AvaII (Eco48I)에 의해 특이적으로 절단되는 제한효소 자리를 포함하는 것일 수 있다.
상기 서열번호 25 및 26의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍에 의한 증폭 산물은 제한효소 AfeI에 의해 특이적으로 절단되는 제한효소 자리를 포함하는 것일 수 있다.
상기 서열번호 27 및 28의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍은 제한효소 NcoI에 의해 특이적으로 절단되는 제한효소 자리를 포함하는 것일 수 있다.
상기 서열번호 29 및 30의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍에 의한 증폭 산물은 제한효소 ClaI에 의해 특이적으로 절단되는 제한효소 자리를 포함하는 것일 수 있다.
상기 서열번호 31 및 32의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍에 의한 증폭 산물은 제한효소 BfaI (FspBI)에 의해 특이적으로 절단되는 제한효소 자리를 포함하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 33 및 34의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍;을 포함하는 표고버섯 품종 모리290 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
상기 서열번호 33 및 34의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍에 의한 증폭 산물은 제한효소 NcoI에 의해 특이적으로 절단되는 제한효소 자리를 포함하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 35 및 36의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍;을 포함하는 표고버섯 품종 유지로 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
상기 서열번호 35 및 36의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍에 의한 증폭 산물은 제한효소 AccI (Xmil)에 의해 특이적으로 절단되는 제한효소 자리를 포함하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 37 및 38의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍;을 포함하는, 표고버섯 품종 향고808 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
상기 서열번호 37 및 38의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍에 의한 증폭 산물은 제한효소 BfaI (FspBI)에 의해 특이적으로 절단되는 제한효소 자리를 포함하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 39 및 40; 서열번호 41 및 42; 서열번호 43 및 44; 또는 서열번호 45 및 46의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍;을 포함하는, 표고버섯 품종 추재2호 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
상기 서열번호 39 및 40의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍에 의한 증폭 산물은 제한효소 BanII (Eco24I)에 의해 특이적으로 절단되는 제한효소 자리를 포함하는 것일 수 있다.
상기 서열번호 41 및 42의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍에 의한 증폭 산물은 제한효소 AccI (Xmil)에 의해 특이적으로 절단되는 제한효소 자리를 포함하는 것일 수 있다.
상기 서열번호 43 및 44의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍에 의한 증폭 산물은 제한효소 ClaI (Bsu17I)에 의해 특이적으로 절단되는 제한효소 자리를 포함하는 것일 수 있다.
상기 서열번호 45 및 46의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍에 의한 증폭 산물은 제한효소 BfaI (FspBI)에 의해 특이적으로 절단되는 제한효소 자리를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "프라이머"란 짧은 자유 수산화기를 가지는 핵산서열로서 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 의미하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 하며, 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도 (complexity)뿐만 아니라, 온도 및 이온 강도와 같은 이용 조건에 의존할 것이다. 구체적 예로, 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 Guanine 및 cytosine의 함량 (GC contents), GC배열, 어닐링 (annealing) 온도 및 이온 강도 등 여러 조건을 고려하여 결정할 수 있다.
또한, 본 발명의 프라이머는 예를 들면, 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법과 같은 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다.
또한, 본 발명에서 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체 (analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트 (phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산 (peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질 (intercalating agent)를 포함할 수 있다.
아울러, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 표고버섯 품종 판별을 위한 CAPS (cleaved amplified polymorphic sequences) 마커 증폭용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 상기 CAPS 마커는 제한효소에 의해 특이적인 절단이 일어날 수 있는 부위를 프라이머로 증폭하는 것일 수 있다.
하기 실시예에서 확인하는 바와 같이, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하면 시료로부터 표고버섯 품종 참아람, 산조708호, 산조707호, 산조302호, 산조701호, 산조108호, 모리290, 유지로, 향고808 및 추재2호를 쉽고 빠르게 판별할 수 있다.
나아가, 본 발명은 상기 프라이머 세트; 증폭 반응을 수행하기 위한 시약; 및 제한효소를 포함하는 표고버섯 품종 판별용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명의 특징인 서열번호 1 내지 46의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프라이머를 포함하는 CAPS 마커를 이용하여 표고버섯 품종을 판별할 수 있다.
또한, 프라이머를 이용한 특정 핵산의 검출은 PCR과 같은 증폭 방법을 사용하여 목적 유전자의 서열을 증폭한 다음 당 분야에 공지된 방법으로 유전자의 증폭여부를 확인함으로써 수행될 수 있다.
또한, 상기 증폭 반응은 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 중합효소 연쇄반응 (PCR), DNA 시퀀싱, RT-PCR, 프라이머 연장법 (Nikiforeov et al., Nucl Acids Res 22, 4167-4175, 1994), 올리고뉴클레오타이드 연장 분석 (Nickerson et al., Pro Nat Acad Sci USA, 87, 8923-8927, 1990), 대립형질 특이적 PCR법 (Rust et al., Nucl Acids Res, 6, 3623-3629, 1993), RNase 불일치절단 (RNase mismatch cleavage, Myers et al., Science, 230, 1242-1246, 1985), 단일가닥 입체 다형화 (single strand conformation lymorphism, Orita et al., Pro Nat Acad Sci USA, 86, 2766-2770, 1989), SSCP 및 헤테로두플렉스 동시 분석법 (Lee et al., Mol Cells, 5:668-672, 1995), 변성 구배 젤 전기영동 (DGGE, Cariello et al., Am J Hum Genet, 42, 726-734, 1988), 변성 고압 액체 크로마토그래피 (Underhill et al., Genome Res, 7, 996-1005, 1997), 혼성화 반응, DNA 칩 등의 방법으로 수행될 수 있다. 상기 혼성화 반응의 예로는 노던 하이브리다이제이션 (Maniatis T. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Habor Laboratory, NY, 1982), 인시츄 하이브리다이제이션 (Jacquemier et al., Bull Cancer, 90:31-8, 2003), 마이크로어레이 (Macgregor, Expert, Rev Mol Diagn 3:185-200, 2003) 방법 등이 있다.
또한, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 증폭 반응에 일반적으로 사용되는 시약을 모두 포함할 수 있다. 본 발명의 키트가 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우에는, 본 발명의 키트는 선택적으로 PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대 버퍼, DNA 중합효소, DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.
또한, 상기 증폭 반응에 의한 증폭 산물은 표고버섯 품종 특이적인 단일염기다형성 (SNP) 및 특정 제한효소에 의해 절단이 일어나는 제한효소 인식 부위가 포함되는 것일 수 있다.
또한, 상기 제한효소는 AccI, AvaII, AfeI, NcoI, BfaI, ClaI 및 BanII 으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
마지막으로, 본 발명은 표고버섯 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항 내지 제10항의 프라이머 세트를 이용해 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 상기 증폭 단계 산물을 제한효소로 절단하는 단계; 및 상기 제한효소 절단 산물을 분석하는 단계;를 포함하는 표고버섯 품종을 판별하는 방법을 제공한다.
또한, 상기 시료는 표고버섯 배지, 표고버섯 종균 또는 표고버섯일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 게놈 DNA는 당업계에서 통상적으로 사용되는 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법 (Tai et al., Plant Mol. Biol. Reporter, 8: 297-303, 1990), CTAB 분리법 (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al., Nuc. Res., 4321-4325, 1980) 또는 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 추출될 수 있다.
또한, 상기 증폭 반응은 앞서 기술한 방법을 사용하여 수행될 수 있으나, 바람직하게는 중합효소 연쇄반응 (PCR)을 수행하여 이루어지는 것일 수 있다.
또한, 상기 제한효소는 AccI, AvaII, AfeI, NcoI, BfaI, ClaI 및 BanII 으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "제한효소"란 DNA의 특정한 염기배열을 식별하고 이중사슬을 절단하는 엔도뉴클레아제로서 특수한 효소를 의미한다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는, 선택되어진 프라이머 세트를 기반으로 PCR를 수행하고 PCR 정제 키트로 정제한 후 프라이머와 조합인 제한효소를 이용하여 활성 온도 내에서 처리하였다.
또한, 상기 절단 산물은 당업계에서 널리 공지된 방법에 따라 PCR 산물의 DNA를 크기별로 분리할 수 있다. 바람직하게는 아가로스 겔 (agarose gel) 또는 폴리아크릴아미드 겔 (polyacrylamide gel) 전기영동 또는 형광분석장치 (ABI prism 3100 genetic analyzer-electropherogram)에 의해 확인할 수 있다.
또한, 각각의 제한효소를 처리하였을 시 상기 절단 산물이 두 개 이상의 단편으로 구성된 경우, 사용된 프라이머 및 제한효소에 따라 표고버섯의 품종을 판별하는 것일 수 있다 (하기 표 4 참조).
전술한 바와 같은 본 발명에 따르면, 표고버섯 품종을 빠르고 간편하게 확인할 수 있으며, 본 발명의 프라이머를 이용하여 PCR로 분리된 CAPS 마커를 이용해 표고 균주를 구분할 수 있다. 우리나라 표고버섯 유전자원을 보호하는 한편 수입품종과의 구별할 수 있어, 해외로 건표고나 생표고로 수출될 때에도 국산품종임을 입증할 수 있는 구별 방법으로 매우 유용하게 활용될 수 있다. 또한, CAPS 마커는 PCR로 증폭된 DNA 단편에 제한효소를 처리함으로써 단편의 절단 여부를 확인하기 때문에, SSR 마커의 경우와는 달리 고가의 사이즈 분석 장비가 없이도 아가로즈 겔 상에서 빠르고 쉽게 결과를 확인할 수 있다. 이에 따라 품종을 구분하는 데에 드는 비용과 시간을 줄일 수 있고, 결과 해석에 고도의 지식을 요하지 않기 때문에 보다 효율적인 품종 판별이 가능하다는 장점이 있다.
이하, 본 발명의 실시예를 첨부된 도면을 참고하여 보다 상세하게 설명하도록 한다. 그러나, 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 구체화 하기 위한 것일 뿐, 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아닐 것이다.
<실시예 1> 표고버섯 국내 유통품종 유전체 데이터 확보
표고버섯 품종 구분을 위한 마커를 개발하기 위해 표고버섯 국내 유통품종 유전체 데이터 확보하고자 하였다. 분석시료로는 표고 톱밥배지 재배용 품종 (참아람, 산조 701호, 산조 708호, 산조 707호), 원목재배용 품종 (산조 108호, 302호, 502호, 모리290), 중국 접종배지 품종 (추제2호, 향고808) 총 10균주를 이용하였다.
분자계통분석을 통해 시료의 종 동정을 확인하고, 시료별 핵산 대량 추출 및 QC를 진행하였으며, 일정 quality 이상의 G-DNA를 대상으로 300bp insert size의 paired end library 구축하고 표고 표준유전체 정보를 기준으로 100-150X depth의 Illumina Hiseq 데이터를 생산하였다. 생산된 read는 Phred score 30 이상, read length 100bp 이상의 조건으로 선별하고, 세균이나 바이러스 데이터베이스에 맵핑 작업을 통해 사후 분석에 불필요한 정보를 제거하는 정제 과정 수행하였다. 표고버섯 공시균주의 NGS데이터 생산 결과는 표 1에 나타내었다.
Figure 112022053507378-pat00001
<실시예 2> 표고버섯 품종별 특이 유전변이 탐색
도 1을 참조하여 표고버섯 품종별 특이 유전변이 탐색과 분자 마커를 설계하였다. 핵산 표준유전체로서 L. edodes B17 ver2 (Chen et al. 2016. PLos One 1 (8): e0160336) 정보를 활용하고, 미토콘드리아 표준유전체로서 NC_018365 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/ 400201826)를 선발하였다. 이어서, Trimmomatic을 이용하여 어댑터 시퀀스를 가지거나, Phred Score 20 이하이거나, 길이 50bp 이하의 리드를 한 번 더 배제하였다. Burrows-Wheeler transform (BWT) 알고리즘에 의하여 Hiseq 리드를 각각의 레퍼런스 유전체 정보에 정렬하였다. Samtools mpileup을 통하여 가능한 모든 genotype의 likelihood를 계산하고 가장 신뢰도 높은 SNP와 Indel을 선발하였다. Picard 툴을 이용하여 PCR duplicate나 다중 맵핑된 리드들을 제거하였고, GATK HaplotypeCaller를 이용하여 indel 주변의 local realignment를 실시하여 잘못 맵핑된 부분을 수정하였다. 유전변이가 발견된 부위는 SnpEff 툴을 이용하여 어노테이션 (annotation)하였다. 샘플별 시퀀싱 read의 맵핑율과 커버리지는 표 2에 나타내었다.
Figure 112022053507378-pat00002
<실시예 3> 품종 특이적 CAPS 마커 설계
기존에 확보한 NGS 데이터를 기반으로 bwa 맵핑을 시도하고 picard 프로그램에서 소팅하여 샘플별 특이적인 단일염기서열변이 후보군을 선발하였다. 10개의 균주에서 발굴한 SNP 개수는 표 3에 나타내었다.
샘플 (품종명) SNP# 샘플 (품종명) SNP#
OK229 (참아람) 66개 OK234 (산조108호) 2,263개
OK230 (산조708호) 1,078개 OK255 (모리290) 2개
OK231 (산조707호) 706개 OK256 (유지로) 699개
OK232 (산조302호) 601개 OK563 (향고808) 648개
OK233 (산조701호) 151개 OK564 (추재2호) 4,690개
총합 10,904개
상기 표 3의 SNP를 포함하면서 증폭산물의 길이가 300-600bp 정도로서 극단적인 Tm 값을 갖지 않고 (약 40~60℃ 범위), 증폭산물에 단일 제한효소로 절단되는 부분을 포함한 마커 후보군을 선발하였다. 이어서, Primer3 프로그램을 이용하여 SNP 부위 주변을 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 설계하였다. 본 발명에서 설계된 프라이머 쌍은 표 4에 나타내었다.
서열번호 마커 제한효소 품종 프라이머 염기서열 Size
1 AccI_229_02_L AccI (Xmil) 참아람 left CCAGTATGTCTTCAGCTCATCA 582
2 AccI_229_02_R right TAGAGAACAGCTAACCCACCAT
3 AvaII_229_03_L AvaII (Eco48I) 참아람 left GGAAGAAACATAGCATTGAAGC 648
4 AvaII_229_03_R right CATGATTATCGAGAGCTTGTGA
5 AfeI_230_01_L AfeI 산조
708호		 left CAATAATAAGCGCAAATTCCTC 591
6 AfeI_230_01_R right TATGTCCAACCAGGGTTTAGTC
7 NcoI_230_04_L NcoI 산조
708호		 left GAGCATCCTATTCTATGCGAAC 372
8 NcoI_230_04_R right CATCATATGTAATGATGCGGAC
9 AvaII_231_L AvaII (Eco48I) 산조
707호		 left ACCTGTTCCATTAGTTCCTGTG 306
10 AvaII_231_R right TTCAGAAAGCTAAGCACAAACA
11 BfaI_231_02_L BfaI (FspBI) 산조
707호		 left TTGAGTACTGATTTGAACGTCG 579
12 BfaI_231_02_R right CGCCTACATATATTGGGTCACT
13 AccI_232_L AccI (Xmil) 산조
302호		 left CAATGTCATCATATCACTTGCC 472
14 AccI_232_R right AACAGCAGAACTCCAACAATCT
15 AvaII_232_L AvaII (Eco48I) 산조
302호		 left AACCAAACAGCAAGTATGATCC 616
16 AvaII_232_R right ACGCTGCATTGAAGGTACTATT
17 BfaI_232_01_L BfaI (FspBI) 산조
302호		 left ATAGTACGCGCCAGTCATATTT 654
18 BfaI_232_01_R right AATTTATCGACAAAGCCAGAAA
19 AvaI_233_01_L AvaI (Eco88I) 산조
701호		 left CCACTCCCTATCTATTCCTTCC 581
20 AvaI_233_01_R right TGGAAGGCTCCTAGATCAATAA
21 BfaI_233_02_L BfaI (FspBI) 산조
701호		 left TATCCAACAACAACAAGAGCAG 458
22 BfaI_233_02_R right GATCAAAGTCGGATCATCGTAT
23 AvaII_234_L AvaII (Eco48I) 산조
108호		 left AAGATGAGCAATTGAGACTGGT 506
24 AvaII_234_R right CATACTATCCATTACAGCCGGT
25 AfeI_234_04_L AfeI 산조
108호		 left TTTGAAGAACATCCCTTTCAGT 517
26 AfeI_234_04_R right CCTTCCTTCAGCGTAACTACAG
27 NcoI_234_04_L NcoI 산조
108호		 left TGCTCTACTTCGGGTTGTAAGT 594
28 NcoI_234_04_R right GAGTTCATTGACGAGACAGACA
29 ClaI_234_01_L ClaI 산조
108호		 left TCGAGAATGGCTTCTATGAGTT 642
30 ClaI_234_01_R right TGTATATGTAGTGGCACACGGT
31 BfaI_234_07_L BfaI (FspBI) 산조
108호		 left TGTCATTGACGGACTTATTGAA 331
32 BfaI_234_07_R right AACATGCGCATAACAGTGTAAG
33 NcoI_255_L NcoI 모리
290		 left GATCATTAGTCCCAATCCAAGA 343
34 NcoI_255_R right GTTACATTCCGTGGTCGATAGT
35 AccI_256_L AccI (Xmil) 유지로 left CAGTGACATATGACGGTGTAGG 453
36 AccI_256_R right CTCTCAACTCGTTTCAACATGA
37 BfaI_563_01_L BfaI (FspBI) 향고
808		 left CATCGTCCTTGTTGTACTTGAA 308
38 BfaI_563_01_R right TGGTATGCATTATCTCCCTTTC
39 BanII_564_12_L BanII (Eco24I) 추재
2호		 left TGCTCAGTTCTTCAACATTGTC 427
40 BanII_564_12_R right AGTCAGGAGAGAGGATGTACGA
41 AccI_564_06_L AccI (Xmil) 추재
2호		 left TATTTCCCAGGCTGTTGATAGT 546
42 AccI_564_06_R right GGCATAACAATCAAGTCCATTT
43 ClaI_564_08_L ClaI (Bsu17I) 추재
2호		 left TTTCTCCCTGACTTTGAAGTGT 540
44 ClaI_564_08_R right GAGATGTCGGTCATAGGATGTT
45 BfaI_564_04_L BfaI (FspBI) 추재
2호		 left CGAAGAAATGGGTCTAAAGTTG 377
46 BfaI_564_04_R right GCCTATAGATTGTTTGAATCGC
<실시예 4> 표고버섯 품종별 CAPS 마커 적용 결과
각 품종별로 상기 표 4의 프라이머 및 제한효소를 이용하여 유전자증폭반응 (PCR)을 실시하였으며, 증폭산물에 대한 제한효소 반응은 제공사의 매뉴얼에 따라 수행하였다. 증폭 및 절단 반응의 확인을 위하여 아가로스겔 전기영동을 실시하였으며 그 결과는 도 2 내지 도 11에 나타내었다.
도 2 내지 도 11에 나타낸 바와 같이, 참아람 품종 특이적 프라이머 쌍을 이용하여 증폭 반응을 수행하고, 전기영동으로 증폭 산물의 크기를 분석한 결과, 참아람 품종 (229) 특이적인 마커 (서열번호 1 및 2, 서열번호 3 및 4)의 경우, 참아람 품종 이외 품종은 아가로스 겔 상에서 한 가지 크기의 band만 관찰된 반면에 참아람 품종은 제한효소에 의해 절단되어 두 가지 크기의 band가 관찰되었다. 참아람 품종은 제한효소 AccI에 의해 절단되는 경우 582 bp, 제한효소 AvaII에 의해 절단되는 경우 648 bp 크기의 특이적인 band가 관찰되었다. 마찬가지로, 산조708호, 산조707호, 산조302호, 산조701호, 산조108호, 모리290, 유지로, 향고808 또는 추재2호 품종 특이적인 마커를 사용하여 증폭 산물의 크기를 분석 한 결과, 각 품종의 특이적인 마커는 타겟 품종만 특이적으로 절단하여 해당 품종에서만 두 가지 크기의 band가 관찰되었으며, 이외 다른 품종은 한 가지 크기의 band만이 관찰되었다.
이러한 결과는 본 발명에서 설계된 CAPS 마커는 표고버섯 품종별로 다른 품종과 구별할 수 있으며, 상기 각 품종별 CAPS 마커를 종합하여 사용할 경우 표고버섯의 품종을 신속하고 정확하게 판별할 수 있다는 것을 의미한다.
이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 구체적인 실시예를 상세하게 설명되었으나, 본 발명의 사상을 이해하는 당업자는 동일한 사상의 범위 내에서 다른 구성요소를 추가, 변경, 삭제 등을 통하여, 퇴보적인 다른 발명이나 본 발명 사상의 범위 내에 포함되는 다른 실시예를 용이하게 제안할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상술한 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구의 범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구의 범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Development of CAPS marker for discrimination of Lentinula edodes culivar and use thereof <130> 2022-0163-10-C <160> 46 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AccI_229_02_L <400> 1 ccagtatgtc ttcagctcat ca 22 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AccI_229_02_R <400> 2 tagagaacag ctaacccacc at 22 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AvaII_229_03_L <400> 3 ggaagaaaca tagcattgaa gc 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AvaII_229_03_R <400> 4 catgattatc gagagcttgt ga 22 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AfeI_230_01_L <400> 5 caataataag cgcaaattcc tc 22 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AfeI_230_01_R <400> 6 tatgtccaac cagggtttag tc 22 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NcoI_230_04_L <400> 7 gagcatccta ttctatgcga ac 22 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NcoI_230_04_R <400> 8 catcatatgt aatgatgcgg ac 22 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AvaII_231_L <400> 9 acctgttcca ttagttcctg tg 22 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AvaII_231_R <400> 10 ttcagaaagc taagcacaaa ca 22 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BfaI_231_02_L <400> 11 ttgagtactg atttgaacgt cg 22 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BfaI_231_02_R <400> 12 cgcctacata tattgggtca ct 22 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AccI_232_L <400> 13 caatgtcatc atatcacttg cc 22 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AccI_232_R <400> 14 aacagcagaa ctccaacaat ct 22 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AvaII_232_L <400> 15 aaccaaacag caagtatgat cc 22 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AvaII_232_R <400> 16 acgctgcatt gaaggtacta tt 22 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BfaI_232_01_L <400> 17 atagtacgcg ccagtcatat tt 22 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BfaI_232_01_R <400> 18 aatttatcga caaagccaga aa 22 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AvaI_233_01_L <400> 19 ccactcccta tctattcctt cc 22 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AvaI_233_01_R <400> 20 tggaaggctc ctagatcaat aa 22 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BfaI_233_02_L <400> 21 tatccaacaa caacaagagc ag 22 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BfaI_233_02_R <400> 22 gatcaaagtc ggatcatcgt at 22 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AvaII_234_L <400> 23 aagatgagca attgagactg gt 22 <210> 24 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AvaII_234_R <400> 24 catactatcc attacagccg gt 22 <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AfeI_234_04_L <400> 25 tttgaagaac atccctttca gt 22 <210> 26 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AfeI_234_04_R <400> 26 ccttccttca gcgtaactac ag 22 <210> 27 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NcoI_234_04_L <400> 27 tgctctactt cgggttgtaa gt 22 <210> 28 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NcoI_234_04_R <400> 28 gagttcattg acgagacaga ca 22 <210> 29 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ClaI_234_01_L <400> 29 tcgagaatgg cttctatgag tt 22 <210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ClaI_234_01_R <400> 30 tgtatatgta gtggcacacg gt 22 <210> 31 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BfaI_234_07_L <400> 31 tgtcattgac ggacttattg aa 22 <210> 32 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BfaI_234_07_R <400> 32 aacatgcgca taacagtgta ag 22 <210> 33 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NcoI_255_L <400> 33 gatcattagt cccaatccaa ga 22 <210> 34 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NcoI_255_R <400> 34 gttacattcc gtggtcgata gt 22 <210> 35 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AccI_256_L <400> 35 cagtgacata tgacggtgta gg 22 <210> 36 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AccI_256_R <400> 36 ctctcaactc gtttcaacat ga 22 <210> 37 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BfaI_563_01_L <400> 37 catcgtcctt gttgtacttg aa 22 <210> 38 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BfaI_563_01_R <400> 38 tggtatgcat tatctccctt tc 22 <210> 39 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BanII_564_12_L <400> 39 tgctcagttc ttcaacattg tc 22 <210> 40 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BanII_564_12_R <400> 40 agtcaggaga gaggatgtac ga 22 <210> 41 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AccI_564_06_L <400> 41 tatttcccag gctgttgata gt 22 <210> 42 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AccI_564_06_R <400> 42 ggcataacaa tcaagtccat tt 22 <210> 43 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ClaI_564_08_L <400> 43 tttctccctg actttgaagt gt 22 <210> 44 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ClaI_564_08_R <400> 44 gagatgtcgg tcataggatg tt 22 <210> 45 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BfaI_564_04_L <400> 45 cgaagaaatg ggtctaaagt tg 22 <210> 46 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BfaI_564_04_R <400> 46 gcctatagat tgtttgaatc gc 22

Claims (6)

  1. 서열번호 37 및 38의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍; 서열번호 39 및 40의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍; 서열번호 41 및 42의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍; 서열번호 43 및 44의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍; 및 서열번호 45 및 46의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍;으로 이루어진 프라이머 세트, 제한효소 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 중국 접종배지 표고버섯 품종 판별용 키트에서,
    상기 중국 접종배지 표고버섯 품종은, 향고808, 추재2호이고,
    상기 제한효소는, AccI, BfaI, ClaI, BanII 중 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 키트.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은, dNTPs (deoxynulceotide triphosphate), DNA 중합효소 (polymerase) 및 버퍼를 포함하는 것인, 키트.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 표고버섯 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 1단계;
    상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 프라이머 세트를 이용해 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 2단계;
    상기 증폭 단계의 산물을 제한효소로 절단하는 3단계;
    상기 절단 산물을 전기영동하여 밴드(band)의 크기를 분석하는 4단계; 및
    두 가지 크기의 밴드가 관찰되면 해당 품종의 표고버섯으로 판별하는 5단계;를 포함하는, 중국 접종배지 표고버섯 품종 판별 방법에서,
    상기 중국 접종배지 표고버섯 품종은 향고808, 추재2호이고,
    상기 제한효소는, AccI, BfaI, ClaI, BanII 중 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 방법은,
    (1) 서열번호 37 및 38의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍을 사용하여 표적 서열을 증폭시키고, BfaI 제한효소를 사용하여 밴드가 절단되는 경우 향고808로 판별하고,
    (2) 서열번호 39 및 40의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍을 사용하여 표적 서열을 증폭시키고, BanII 제한효소를 사용하여 밴드가 절단되는 경우 추재2호로 판별하고,
    (3) 서열번호 41 및 42의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍을 사용하여 표적 서열을 증폭시키고, AccI 제한효소를 사용하여 밴드가 절단되는 경우 추재2호로 판별하고,
    (4) 서열번호 43 및 44의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍을 사용하여 표적 서열을 증폭시키고, ClaI 제한효소를 사용하여 밴드가 절단되는 경우 추재2호로 판별하고,
    (5) 서열번호 45 및 46의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍을 사용하여 표적 서열을 증폭시키고, BfaI 제한효소를 사용하여 밴드가 절단되는 경우 추재2호로 판별하는 것인, 방법.
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