KR101972081B1 - 쓴메밀 유전자원 분류용 프라이머 세트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 쓴메밀(Fagopyrum tartaricum) 유전자원을 분류하기 위한 마커 및 프라이머 세트에 관한 것이다. 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 이용하여 PCR에 의한 밴드 패턴으로 간편하고 정확하게 쓴메밀 유전자원의 유전자 다형성 부분을 식별할 수 있고, 이를 통해서 쓴메밀 유전자원의 분류가 가능하여 국내 쓴메밀 육성 품종의 지식재산권 보호에 효과적으로 활용할 수 있다.

Description

쓴메밀 유전자원 분류용 프라이머 세트{MARKERS FOR CLASSIFICATION OF FAGOPYRUM TATARICUM CULTIVARS}

본 발명은 쓴메밀(Fagopyrum tartaricum) 유전자원의 분류를 위한 마커, 상기 마커를 증폭하기 위한 프라이머 세트 및 이를 이용한 분류방법에 관한 것이다.

육종에 이용되고 있는 대부분의 주요 작물 및 소재배 작물에서 해마다 많은 양의 유전자원이 수집되고 있다. 그러나, 이에 반해 유전자원에 대한 평가는 충분히 이루어지지 않고 있는 실정이다. 수집된 유전자원의 종간 및 아종간 품종의 신속한 판별은 정확한 유전자원의 관리 및 보호를 위하여 매우 중요하다. 또한 품종의 판별과 함께 유전자원의 유형 형질 탐색과 분류, 그리고 유연관계의 규명은 유전자원의 보존이나 신품종의 창출 및 작물의 개량에 있어서 매우 중요하다.

이에 따라, 염색체 내 제한효소 인식부위의 변이의 의해 발생하는 염기서열 길이 차이를 이용한 RFLPs(Restriction Fragment Length Polymorphisms) 방법이 개발되었으나 이 방법은 방사선 동위원소를 사용해야 하는 번거로움이 있다. 이후 PCR(Polymerase Chain Reaction)을 이용한 핵산지문법(fingerprinting)으로서, RAPD(randomly amplified polymorphic DNA) 방법 등이 개발되었다. PCR 방법은 10~20여 개의 뉴클레오티드로 구성된 작은 올리고뉴클레오타이드(이하 프라이머)을 생물체의 DNA 또는 RNA와 결합(annealing)시킨 후, 내열성 DNA 중합 효소(Tag DNA Polymerase)를 첨가하여 합성반응이 반복적으로 이루어지게 하는 방법이다. 이것은 다른 방법에 비해 소량의 DNA(1-50ng)만을 요구하며, 간편하고 빠르게 결과를 확인할 수 있다는 장점을 갖고 있다. PCR 방법으로 분석하는 상기 방법 중 RAPD 방법은 비특이적 PCR 산물이 증폭되므로 재현성이 떨어지는 단점이 있고, AFLP(Amplified Fragment Length polymorphism) 방법은 높은 DNA 다형성(polymorphism)검출로 각광을 받고 있지만 재현성이 떨어지는 밴드의 출현과 분석이 복잡하며, SSR (single sequence repeat)방법은 DNA 반복 배열인 초위성체(microsatellite) 영역의 염기배열 정보를 근거로 PCR 프라이머를 제작하여 개체 내의 초위성체를 분석하는 방법으로 상기 단순염기서열의 반복수는 품종 간 또는 개체 간에 다르게 때문에 이 부분을 PCR 반응으로 증폭하였을 때 다형화 현상이 나타나게 되며 이를 동물과 식물의 유전 연구에 활발히 이용하고 있으나 벼에서 기 개발된 SSR 마커의 수가 고밀도 유전자지도 제작에는 충분하지 않는 단점이 있다.

이에 반해 In/del(insertion　or deletion) 마커는 PCR 반응으로 증폭하였을 때 다형화 현상이 나타나게 하는 장점을 유지하며 고밀도 유전자지도 제작에는 충분하지 않는 SSR 마커의 단점을 보완하는 것으로 특정 위치에 있는 DNA의 염기서열 분석을 통해 품종간 염기서열의 삽입 또는 결실을 기반으로 PCR 프라이머를 제작하는 방법이다.

대한민국 공개특허 제2012-0123360호는 보통계 밀을 정성적 및 정량적으로 검출하는 방법을 개시하나, 지금까지 쓴메밀의 유전자원을 분류하기 위한 분자 마커에 대한 기술은 전무한 실정이다. 이에, 본 발명자들은 쓴메밀의 유전자원 각각을 분류하기 위한 In/del 마커를 발명하기에 이르렀다.

대한민국 공개특허 제2012-0123360호

본 발명의 목적은 쓴메밀(Fagopyrum tartaricum) 유전자원을 분류하기 위한 분자마커를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 쓴메밀의 유전자원을 분류하기 위한 프라이머 세트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 쓴메밀의 유전자원을 분류하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 7 및 서열번호 8; 서열번호 9 및 서열번호 10; 서열번호 11 및 서열번호 12; 서열번호 13 및 서열번호 14; 서열번호 15 및 서열번호 16; 서열번호 17 및 서열번호 18; 서열번호 19 및 서열번호 20; 서열번호 21 및 서열번호 22; 서열번호 23 및 서열번호 24; 서열번호 25 및 서열번호 26; 서열번호 27 및 서열번호 28; 서열번호 29 및 서열번호 30; 서열번호 31 및 서열번호 32; 서열번호 33 및 서열번호 34; 서열번호 35 및 서열번호 36; 및 서열번호 37 및 서열번호 38로 표시되는 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나이상의 프라이머 세트를 포함하는 쓴메밀(Fagopyrum tartaricum)의 유전자원 분류용 프라이머 세트를 제공한다.

구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 7 및 서열번호 8; 서열번호 9 및 서열번호 10; 서열번호 11 및 서열번호 12; 서열번호 13 및 서열번호 14; 서열번호 15 및 서열번호 16; 서열번호 17 및 서열번호 18; 서열번호 19 및 서열번호 20; 서열번호 21 및 서열번호 22; 서열번호 23 및 서열번호 24; 서열번호 25 및 서열번호 26; 서열번호 27 및 서열번호 28; 서열번호 29 및 서열번호 30; 서열번호 31 및 서열번호 32; 서열번호 33 및 서열번호 34; 서열번호 35 및 서열번호 36; 및 서열번호 37 및 서열번호 38로 표시되는 프라이머 세트를 이용하여 하기 쓴메밀 유전자원 26종을 모두 분류할 수 있다. 상기에서 사용된 쓴메밀 유전자원은 HL1001 (기탁번호, IT224676), HL1002 (IT225083), HL1003 (IT225084), HL1004 (IT225085), HL1005 (IT225086), HL1006(IT225087), HL1007 (IT225088), HL1008 (IT225089), HL1009 (IT225090), HL1010 (IT226673), HL1011 (IT226674), HL1012 (IT226675), HL1013 (IT226676), HL1014 (IT226677), HL1015 (IT226678), HL1016 (IT226679), HL1017 (IT226680), HL1018 (IT226681), HL1019 (IT226682), HL1020 (IT261917), HL1021 (IT261922), HL1022 (IT261924), HL1023 (IT278316), HL1024 (IT278317), HL1025 (IT278318), HL1026 (IT278319)이며 농업유전자원센터에서 분양을 받아 세대 진전 후 분석에 사용하였다.

본 명세서에서 사용되는 용어, "쓴메밀"은 "보통메밀"(학명: Fagopyrum esculentum)과 구별되는 것으로, 그 학명은 Fagopyrum tataricum 이다. 메밀의 종(species)에는 재배종과 야생종을 포함하여 20여종이 지구상에 분포하고 있다. 재배종에는 보통메밀(단메밀)과 쓴메밀 두 종이 주류를 이루고 있다. 우리나라에 도입되어 지금까지 재배 이용되는 것은 보통메밀(단메밀, sweet buckwheat)이며 보통메밀이라고 불리어지기도 한다. 반면 쓴메밀(bitter buckwheat)은 중국, 네팔 등지에 많이 자생하거나 재배되는 종으로서 달단종이라고도 한다. 학명은 Fagopyrum tartaricum이며 타타리메밀이라고도 한다.

본 발명의 구체예에서, 상기 프라이머 세트는 쓴메밀 유전자원들의 게놈DNA 간의 다형성마커를 식별하는 것일 수 있고, 상기 다형성 마커는 삽입/결실(In/del) 마커일 수 있다. 상기 용어 "In/del(Insertion Deletion) 마커"는 메밀 유전체에서 염기의 삽입 또는 결실이 일어난 부위를 말하며, 본 발명의 쓴메밀과 보통메밀을 구별하기 위한 분자 지표로 사용된다. 본 명세서에서 In/del 또는 Indel 로 혼용되어 사용될 수 있다.

상기 프라이머 세트는 상기 In/del 마커를 증폭하기 위한 정방향 및 역방향

본 명세서에서 사용되는 용어, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도 (complexity) 뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 발명의 상기 In/del(insertion deletion) 마커 및 상기 마커를 증폭하기를 위한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭하는 경우, 다형화 현상을 나타나게 함으로써 고밀도 유전자지도 제작에는 충분하지 않은 SSR 마커의 단점을 보완하면서 쓴메밀 유전자원들을 쉽게 분류할 수 있는 장점을 갖는다.

또한 본 발명은,

i) 각각의 쓴메밀(Fagopyrum tartaricum) 유전자원으로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;

ii) 상기 분리된 각각의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항 또는 제2항의 프라이머 세트를 이용하여 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및

iii) 각 프라이머 세트에 의해 증폭된 산물을 동정하고 밴드 크기를 비교하는 단계;

를 포함하는, 쓴메밀 유전자원을 분류하는 방법을 제공한다.

본 발명의 상기 방법을 이용하는 경우, 쓴메밀의 유전자원을 분류할 수 있으며, 구체적으로 하기 26개의 쓴메밀 유전자원을 분류할 수 있다.

상기 단계 (iii) 에서 밴드 크기를 비교하는 단계는, 쓴메밀 유전자원 중 하나에 대한 밴드 크기를 기준으로 선정하고, 나머지 각각의 쓴메밀 유전자원에 대한 밴드 크기를 기준이 되는 쓴메밀 유전자원의 밴드 크기와 비교하여 유전자형을 결정하는 단계일 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 19쌍의 프라이머 세트에 대한 쓴메밀 유전자원의 유전자형을 결정함으로써, 상기 쓴메밀 유전자원의 유전자형에 따라 26종의 쓴메밀 유전자원을 모두 분류할 수 있었다.

상기 방법에서 게놈 DNA의 추출은 당업계에서 통상적으로 사용되는 클로로포름/이소아밀알코올(Chloroform/isoamyl alcohol) 추출법(Saghai Maroof 등(1984), SDS 추출법 (Tai et al., Plant Mol. Biol. Reporter, 8: 297-303, 1990), CTAB 분리법(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al., Nuc. Res., 4321-4325, 1980) 또는 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 수행할 수 있다.

상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기한 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다. PCR은 PCR 반응에 필요한 당업계에 공지된 여러 성분을 포함하는 PCR 반응 혼합액을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 PCR 반응 혼합액에는 분석하고자 하는 인삼에서 추출된 게놈 DNA와 본 발명에서 제공되는 프라이머 세트 이외에 적당량의 DNA 중합효소, dNTP, PCR 완충용액 및 물을 포함한다. 상기 PCR 완충용액은 트리스-HCl(Tris-HCl), MgCl2, KCl 등을 포함한다.

상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시　32P 또는　35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 하나 이상의 프라이머 세트는 상기에 기재된 바와 같다.

본 발명의 방법은 상기 증폭 산물을 동정하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 동정은 In/del 마커의 경우에는 증폭 산물을 겔 전기영동함으로써 수행될 수 있다. 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다.

또한 본 발명은, 본 발명의 프라이머 세트를 포함하는 쓴메밀 유전자원 분류용 키트를 제공한다. 상기 키트는 증폭 반응을 수행하기 위한 시약 및 필요에 따라 제한효소를 포함할 수 있으며, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 내열성 DNA 중합효소, dNTPs, 및 버퍼를 포함할 수 있다. 상기 dNTP 혼합물은 dATP, dCTP, dGTP, dTTP를 포함하며, 내열성 DNA 중합효소는 Taq DNA 중합효소, Tth DNA 중합효소 등 시판되는 내열성 중합효소를 이용할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 설명서를 추가로 포함할 수 있다.

또한 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 쓴메밀 유전자원을 분류하기 위한 조성물을 제공한다.

본 발명의 구체예에서, 본 발명의 프라이머 세트 및 상기 방법을 이용하여 PCR을 수행함으로써 쓴메밀 각각의 유전자원마다 상기 각 프라이머 세트에 대한 특이적인 밴드가 검출되는 것을 확인함으로써 26종의 쓴메밀 유전자원을 모두 분류할 수 있었다.

본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 이용하여 PCR에 의한 밴드 패턴으로 간편하고 정확하게 쓴메밀 유전자원의 유전자 다형성 부분을 식별할 수 있고, 이를 통해서 쓴메밀 유전자원의 분류가 가능하여 국내 쓴메밀 육성 품종의 지식재산권 보호에 효과적으로 활용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 구체예에 따른 denovo sequencing을 이용한 쓴메밀 유전체 해독 방법에 대한 모식도를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 구체예에 따른 쓴메밀 유전자원 분류에 사용된 26종의 유전자원NGS를 종자 모양 및 유전체 해독 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 구체예에 따른 생물정보분석을 활용하여 쓴메일 26종을 분류할 수 있는 선발된 InDel 마커 지역을 나타낸다.
도 4는 선발된 19개 InDel 마커를 증폭할 수 있는 19쌍의 프라이머 세트를 제작하여 26종의 쓴메일 유전자원에 게놈에 대하여 PCR을 수행한 결과를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 구체예에 따른 19쌍의 프라이머 세트와 PCR 방법을 이용해 얻은쓴메밀결과를 통해 각 쓴메밀 유전자원의 유전형 지도를 작성한 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 쓴메밀 유전체 해독용 순계 작성 및 해독

쓴메밀(대관3-3) 유전체 해독용 순계 작성을 위해 표 1과 같이 세대를 진전시켰다. 세대진전은 8세대까지 진행하였으며 모두 7계통을 작성하였다. 이중에서 유전체 크기의 정확한 측정을 위해 flowcytometry와 핵형분석을 통한 배수성 검정으로 5-1 계통을 선발하여 유전체 해독에 사용하였다(표 1).

쓴메밀(대관3-3) 유전체 해독용 식물체 세대진전 내역

계통 번호	세대진전								해독
	S1	S2	S3	S4	S5	S6	S7	S8
1-1	(대관3-3) -1	(대관3-3) -1-5	(대관3-3) -1-5-1	(대관3-3) -1-5-1-1	(대관3-3) -1-5-1-1-1	(대관3-3) -1-5-1-1-1-1	(대관3-3) -1-5-1-1-1-1-1	(대관3-3) -1-5-1-1-1-1-1-1
2-1			(대관3-3) -1-5-2	(대관3-3) -1-5-2-1	(대관3-3) -1-5-2-1-1	(대관3-3) -1-5-2-1-1-1	(대관3-3) -1-5-2-1-1-1-1	(대관3-3) -1-5-2-1-1-1-1-1
3-1			(대관3-3) -1-5-3	(대관3-3) -1-5-3-1	(대관3-3) -1-5-3-1-1	(대관3-3) -1-5-3-1-1-1	(대관3-3) -1-5-3-1-1-1-1	(대관3-3) -1-5-3-1-1-1-1-1	○
5-1			(대관3-3) -1-5-5	(대관3-3) -1-5-5-1	(대관3-3) -1-5-5-1-1	(대관3-3) -1-5-5-1-1-1	(대관3-3) -1-5-5-1-1-1-1	(대관3-3) -1-5-5-1-1-1-1-1	○
6-1			(대관3-3) -1-5-6	(대관3-3) -1-5-6-1	(대관3-3) -1-5-6-1-1	(대관3-3) -1-5-6-1-1-1	(대관3-3) -1-5-6-1-1-1-1	(대관3-3) -1-5-6-1-1-1-1-1
7-1			(대관3-3) -1-5-7	(대관3-3) -1-5-7-1	(대관3-3) -1-5-7-1-1	(대관3-3) -1-5-7-1-1-1	(대관3-3) -1-5-7-1-1-1-1	(대관3-3) -1-5-7-1-1-1-1-1

우선, de novo sequencing으로 쓴메밀의 표준게놈을 작성하였다.

본 발명의 일 구체예에서는 대관3-3의 5-1 계통을 이용하여 쓴메밀 표준 게놈 서열을 작성하였다. PacBio (SMART) Sequencing 데이터에 대해 OLC (Overlap Layout Consensus) 알고리즘을 사용하여 도 1과 같이 contig assembly를 수행하였다. Illumina Sequencing 데이터(Paired-end)에 대해 DBG (De Bruijin Graph) 알고리즘을 사용한 SOAPdenovo assembler를 사용하여 contig assembly를 수행하였다. 앞서 수행된 assembly 결과에 대해 overlapping merge assembly 기법을 이용한 HaploMerger2 소프트웨어를 사용하여 merge assembly를 수행하였다. 최종 만들어진 merge contig 서열에 대해 scaffolding tool인 SSPACE와 gapfilling tool인 GapFiller를 사용하여 최종 draft genome 서열을 조립하였다(도 1).

그리고, 선별한 대상 쓴메밀 26개 유전자원으로부터 구축한 DNA 라이브러리를 PacBio (SMART) Sequencer을 이용하여 24~27배 depth에서 재시퀀싱하였다(도 2).

실시예 2: 표준게놈 및 삽입/결실 마커 탐색

시퀀스 리드를 BWA 알고리즘 ver. 0.5.9를 이용하여 쓴메밀 표준 게놈으로 맵핑하였다. 맵핑 정보로부터 염기서열변이 정보를 추출하기 위하여 표준포맷으로 sam, bam 등의 표준포맷으로 변화하고, 염색체상의 위치에 따라 맵핑된 시퀸스 리드를 sorting하고, 빠른 검색을 위해 indexing 한다. 이때 SAMtools를 사용하였으며, PICARD 등 다양한 프로그램을 이용하여 수행할 수 있다. 표준화된 리드의 맵핑 파일들은 GATK InDelRealinger 알고리즘으로 인델 위치에 재구성하여 지도 퀼리티를 강화시키고, GATK TableRecalibrartion 알고리즘을 염기 퀄리티 접수 구성에 이용하였다.

많은 소프트웨어들이 개발되었지만 최근 염기서열변이 정보를 추출할 때나 추출 후에 임의의 선택기준을 정하여 선택기준을 만족하는 염기서열변이 정보만을 추출할 수 있다. GATK를 이용하여 추출할 수 있는 염기서열변이 정보는 단일염기서열변이와 짧은 삽입/결실 정보이다. 본 발명의 일 실시예에서도 GATK를 이용하여 작은 삽입/결실 변이 정보를 수득하였다.

실시예 3: 쓴메밀 유전자원으로부터 DNA 추출

공시재료로 사용된 대관3-3을 포함한 쓴메밀 유전자원 26종의 DNA를 추출하기 위하여 파종상자에 파종 후 30일 된 어린잎으로부터 Saghai Maroof 등(1984)의 방법으로 DNA추출을 수행하였다. -70℃에서 동결 보존한 잎(0.2g)을 막자사발에 넣어서 액체질소로 냉각하면서 분말 상태로 분쇄하였으며 분말을 1.5 ㎖ 튜브에 옮겨 담았다. 이 시료에 500 ㎕의 CTAB(cetyl trimethyl ammonium bromide) 추출 버퍼를 첨가하여 충분히 썩어 준 후 65℃ 수조에서 30분 간 배양하였다. 클로로포름/이소아밀알코올(Chloroform/isoamyl alcohol, 24:1) 용액 500㎕을 각각의 시료에 첨가한 후, 손으로 뒤집어 주면서 섞어 주었다. 원심분리(12,000rpm, 4℃, 15분) 후 상층액을 새 튜브에 옮긴 뒤 RNase A 10 ㎕(10mg/㎖)를 첨가하였다. 30분 후 아이소프로판올을 350 ㎕를 넣고 DNA를 침전시켰다. DNA 펠럿을 새 튜브로 옮겨 담은 후 70 % 에탄올 세척을 두 번 반복하여 수행하였다. DNA 펠럿을 건조한 후 멸균 증류수 300㎕을 첨가하여 DNA 펠럿을 충분히 녹였다. DNA는 나노드랍으로 정량 하였으며 10 ng/㎕ 농도로 조정하여 실험에 사용하였다.

실시예 4. 쓴메밀 유전자원 분류 InDel 마커 탐색

해독된 쓴메밀 26종의 유전체 정보를 이용하여 탐색된 삽입/결실(insertion/deletion) 변이 정보를 이용하여 쓴메밀의 표준염기서열 기준으로 10 bp 이상의 삽입/결실(insettion/deletion) 변이를 탐색하였다(도 3).

상기 InDel 중 PIC 값을 기준으로 26개를 선발하였으며 Primer3 프로그램을 이용하여 프라이머 세트를 디자인하였다. PCR을 수행하여 확인한 결과 26개 InDel 중 19개를 선발할 수 있었다. 본 발명의 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트는 “TB1”, 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트은 “TB2”, 서열번호 5 및 6의 프라이머 세트는 “TB3”, 서열번호 7 및 8의 프라이머 세트는 “TB4”, 서열번호 9 및 10의 프라이머 세트는 “TB5”,서열번호 11 및 12의 프라이머 세트는 “TB6”,서열번호 13 및 14의 프라이머 세트는 “TB7”,서열번호 15 및 16의 프라이머 세트는 “TB8”,서열번호 17 및 18의 프라이머 세트는 “TB9”,서열번호 19 및 20의 프라이머 세트는 “TB10”,서열번호 21 및 22의 프라이머 세트는 “TB11”, 서열번호 23 및 24의 프라이머 세트은 “TB12”, 서열번호 25 및 26의 프라이머 세트는 “TB13”, 서열번호 27 및 28의 프라이머 세트는 “TB14”, 서열번호 29 및 30의 프라이머 세트는 “TB15”,서열번호 31 및 32의 프라이머 세트는 “TB16”,서열번호 33 및 34의 프라이머 세트는 “TB17”,서열번호 35 및 36의 프라이머 세트는 “TB18”,서열번호 37 및 38의 프라이머 세트는 “TB19”로 각각 명명하였다(표 2).

쓴메밀 유전자원 분류 InDel 식별용 프라이머 세트

Name of primer set	Location	Forward primer (5`→3`)	No.	Reverse primer (5`→3`)	No.
TB01	Scaffold10	CACGCGTGAAAGTTGTTACC	1	CTAGTCCGAACACACAAGCAAC	2
TB02	Scaffold83	GTGCCAGGACAAACAGAATC	3	GTGCTACATGGAGGAGTCCTTA	4
TB03	Scaffold38	GTCGGTAGGTTGGTGTCCTA	5	AGTGTTAGGGTGTCGTTGAC	6
TB04	Scaffold311	ACTCCAGTCCTTGAAGACACG	7	GTGTACTTGTGTAGTTGACCGC	8
TB05	Scaffold813	GGCAAGCAGTGACCATATAGAG	9	GGCCACAATACCGTGATGATAG	10
TB06	Scaffold49	GTGGAGTTCATCCTACACCCTA	11	GTAACCCACACCCTTTCACTTC	12
TB07	Scaffold58	GGACCCTCTTGTCACCTCTTAC	13	GAGAGGAGTTTGGACTAGGGTT	14
TB08	Scaffold331	AACTAGGGACAGGACTCTGAGG	15	TCTGTCACATACTCTTGAGCCC	16
TB09	Scaffold4	GGTACATATCAGGGGTCCGT	17	AGAATCTGCCTAGCTTAGTCCC	18
TB10	Scaffold7	GGGGTGTAGATTACTCGCTACA	19	ACTCTTCTGATCTCTCCCCATC	20
TB11	Scaffold57	GTGTTCTTCTGGGTAGGTTACG	21	CGTCTTCTTGTGATGAGGTG	22
TB12	Scaffold5	CTCCTCACTGATCTTCTAGTCTGC	23	GCAGGGAGGTTGATTAACTGAG	24
TB13	Scaffold11	ATCCTAACCTCTTCAGTGGTCG	25	GAAAACAACGTTCCCCTCTC	26
TB14	Scaffold77	CGCACTTACCCCATGTTT	27	ACTGTTGGAGCCAGTGATACTC	28
TB15	Scaffold223	ACGGGTACCACACAAACTGA	29	ACTAGTGTGCTCGAATCCAACC	30
TB16	Scaffold137	CCAGACTCAAGTTCTGGTCTTC	31	CTCAGTTACCCAGTGAATCTGC	32
TB17	Scaffold32	AGCTACGGAAGTTTCTCTCTCC	33	GCCCCTTTCGAATCCATA	34
TB18	Scaffold320	CTCCAAACACCTCCACAGAT	35	TCCACAAAAGAGGTAAGGGG	36
TB19	Scaffold145	GAGGACTTTAGGGTTAGGAGGAG	37	GAGACATGGACTTACTGGGGTA	38

실시예 5. PCR 반응

PCR 반응의 혼합액은 8 ㎕로 수행을 하였으며, 그 안에는 콩 품종의 20 ng 게놈 DNA, 각각의 2 pmole 프라이머 세트(표 2) 및 5 ㎕의 2X DNA free-Taq PCR Master Mix(CellSafe, Suwon, Korea)로 구성하였다. PCR 증폭은 Mastercycler pro384 (Eppendorf, Hamburg, Germany)를 사용하여 초기 변성(denaturation)을 95℃에서 5분간 수행하였고, 94℃에서 30초간 변성한 후, 53℃의 온도에서 30초간 어닐링(annealing)하였고, 72℃에서 30초간 증폭(extension) 과정을 총 35사이클을 반복했으며, 72℃에서 5분간 최종적인 증폭하였고, 10℃에서 PCR 증폭반응을 종결시켰다. 증폭된 PCR 산물은 6X LoadingSTAR(DyneBio, Seongnam-si, Korea)를 첨가한 후 3% 아가로스 겔을 이용하여 120V에서 150분가량 진행하였으며, 전기영동이 끝난 뒤 UV를 이용하여 밴드를 확인하였다(도 4).

실시예 6. 쓴메밀 유전자원 26종을 대상으로 PCR 결과 및 이에 따른 유전자형 분석

PCR 밴드 패턴을 바탕으로 작은 밴드크기를 보이는 결과는 "a(붉은색)", 큰 경우 "b(파란색)"로 표기하여 각각의 쓴메밀 유전자원에 대한 유전자형을 결정하였다(도 5). 이 중 도 4에 명기된 19개 프라이머 세트의 경우 쓴메밀 26종의 유전자원을 명확히 구분하였다(도 5). HL1001 및 표준 게놈은 동일한 시료로 19종의 선발된 마커에 의해 동일하게 분류됨을 확인할 수 있었다. 특히, TB19 프라이머 세트는 유전자원 HL1005을 특이적으로 구분할 수 있는 InDel 마커로 생물정보분석으로 선발된 마커의 정확성이 높다는 것을 확인할 수 있었다.

<110> Republic of Korea <120> MARKERS FOR CLASSIFICATION OF FAGOPYRUM TATARICUM CULTIVARS <130> P17R12C1555 <160> 38 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TB01 Forward primer <400> 1 cacgcgtgaa agttgttacc 20 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TB01 Reverse primer <400> 2 ctagtccgaa cacacaagca ac 22 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TB02 Forward primer <400> 3 gtgccaggac aaacagaatc 20 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TB02 Reverse primer <400> 4 gtgctacatg gaggagtcct ta 22 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TB03 Forward primer <400> 5 gtcggtaggt tggtgtccta 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TB03 Reverse primer <400> 6 agtgttaggg tgtcgttgac 20 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TB04 Forward primer <400> 7 actccagtcc ttgaagacac g 21 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TB04 Reverse primer <400> 8 gtgtacttgt gtagttgacc gc 22 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TB05 Forward primer <400> 9 ggcaagcagt gaccatatag ag 22 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TB05 Reverse primer <400> 10 ggccacaata ccgtgatgat ag 22 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TB06 Forward primer <400> 11 gtggagttca tcctacaccc ta 22 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TB06 Reverse primer <400> 12 gtaacccaca ccctttcact tc 22 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TB07 Forward primer <400> 13 ggaccctctt gtcacctctt ac 22 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TB07 Reverse primer <400> 14 gagaggagtt tggactaggg tt 22 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TB08 Forward primer <400> 15 aactagggac aggactctga gg 22 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TB08 Reverse primer <400> 16 tctgtcacat actcttgagc cc 22 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TB09 Forward primer <400> 17 ggtacatatc aggggtccgt 20 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TB09 Reverse primer <400> 18 agaatctgcc tagcttagtc cc 22 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TB10 Forward primer <400> 19 ggggtgtaga ttactcgcta ca 22 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TB10 Reverse primer <400> 20 actcttctga tctctcccca tc 22 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TB11 Forward primer <400> 21 gtgttcttct gggtaggtta cg 22 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TB11 Reverse primer <400> 22 cgtcttcttg tgatgaggtg 20 <210> 23 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TB12 Forward primer <400> 23 ctcctcactg atcttctagt ctgc 24 <210> 24 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TB12 Reverse primer <400> 24 gcagggaggt tgattaactg ag 22 <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TB13 Forward primer <400> 25 atcctaacct cttcagtggt cg 22 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TB13 Reverse primer <400> 26 gaaaacaacg ttcccctctc 20 <210> 27 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TB14 Forward primer <400> 27 cgcacttacc ccatgttt 18 <210> 28 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TB14 Reverse primer <400> 28 actgttggag ccagtgatac tc 22 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TB15 Forward primer <400> 29 acgggtacca cacaaactga 20 <210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TB15 Reverse primer <400> 30 actagtgtgc tcgaatccaa cc 22 <210> 31 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TB16 Forward primer <400> 31 ccagactcaa gttctggtct tc 22 <210> 32 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TB16 Reverse primer <400> 32 ctcagttacc cagtgaatct gc 22 <210> 33 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TB17 Forward primer <400> 33 agctacggaa gtttctctct cc 22 <210> 34 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TB17 Reverse primer <400> 34 gcccctttcg aatccata 18 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TB18 Forward primer <400> 35 ctccaaacac ctccacagat 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TB18 Reverse primer <400> 36 tccacaaaag aggtaagggg 20 <210> 37 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TB19 Forward primer <400> 37 gaggacttta gggttaggag gag 23 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TB19 Reverse primer <400> 38 gtgccaggac aaacagaatc 20

Claims (5)

1. 삭제
2. 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 7 및 서열번호 8; 서열번호 9 및 서열번호 10; 서열번호 11 및 서열번호 12; 서열번호 13 및 서열번호 14; 서열번호 15 및 서열번호 16; 서열번호 17 및 서열번호 18; 서열번호 19 및 서열번호 20; 서열번호 21 및 서열번호 22; 서열번호 23 및 서열번호 24; 서열번호 25 및 서열번호 26; 서열번호 27 및 서열번호 28; 서열번호 29 및 서열번호 30; 서열번호 31 및 서열번호 32; 서열번호 33 및 서열번호 34; 서열번호 35 및 서열번호 36; 및 서열번호 37 및 서열번호 38로 표시되는 프라이머 세트를 포함하는, 쓴메밀(Fagopyrum tartaricum)의 유전자원 분류용 프라이머 세트.
   
3. 제2항에 있어서,
   상기 프라이머 세트들은 쓴메밀(Fagopyrum tartaricum) 유전자원간에 나타나는 삽입/결실(InDel) 마커를 식별하는 것인, 쓴메밀(Fagopyrum tartaricum)의 유전자원 분류용 프라이머 세트.
   
4. i) 각각의 쓴메밀(Fagopyrum tartaricum) 유전자원으로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
   ii) 상기 분리된 각각의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제2항의 프라이머 세트를 이용하여 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
   iii) 각 프라이머 세트에 의해 증폭된 산물을 동정하고 밴드 크기를 비교하는 단계;
   를 포함하는, 쓴메밀 유전자원을 분류하는 방법.
   
5. 제2항의 프라이머 세트를 포함하는 쓴메밀 유전자원 분류용 키트.
   

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