KR101546428B1 - 국내 육성밀 품종 판별용 scar 마커 및 이의 용도 - Google Patents

국내 육성밀 품종 판별용 scar 마커 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 서열번호 1 내지 12의 올리고뉴클레오티드의 프라이머 세트의 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 KWSM001 프라이머 세트, KWSM002 프라이머 세트, KWSM003 프라이머 세트, KWSM004 프라이머 세트, KWSM005 프라이머 세트 및 KWSM006 프라이머 세트 등 6개 국내 밀 품종 판별용 프라이머 세트 및 이를 이용한 국내 밀 품종 판별 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하면 올, 다홍, 청계, 조경, 탑동, 남해, 올그루, 고분, 조품, 연백, 신미찰 1호, 적중, 한백 등 국내 밀 13개 품종을 명확히 판별할 수 있으므로, 품종 육성권자에 대한 보호를 강화할 수 있고, 품종혼입 문제를 해결하는데 기여할 수 있으며, 국내 밀 품종의 분자 유전학적 연구 및 주요 형태적 특성 분석에도 이용될 수 있다.

Description

국내 육성밀 품종 판별용 SCAR 마커 및 이의 용도{SCAR marker for cultivar discrimination in Korean breeding wheat and use thereof}
본 발명은 서열번호 1 내지 12의 올리고뉴클레오티드의 프라이머 세트의 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 국내 밀 품종 판별용 프라이머 세트 및 이를 이용한 국내 밀 품종 판별 방법에 관한 것이다.
1970년대 이후 국민 1인당 곡물 소비량은 지속적으로 증가하고 있는 추세이나, 1980년대 중반 이후 밀 수요량의 99% 이상이 수입밀에 의존되고 있다. 이에, 현재 국산밀 자급률 확보와 생산량 증대를 위한 노력이 지속적으로 이루어지고 있으며, 용도에 맞는 품종이 개발되고 있다. 국립식량과학원에서 개발된 밀 품종들은 용도별로 다양화되었으며, 구체적 예로 빵용으로 금강밀과 탑동밀, 국수용으로 서둔밀과 알찬밀 등이 개발되었다. 이와 같이 국내 밀 품종들이 다양하게 개발되고 있기 때문에, 이들을 구분할 수 있는 분자 마커 개발이 더욱 필요하게 되었다. 상기 개발된 마커들은 국내 밀 품종 구분뿐만 아니라 국내 품종의 보호와 밀의 유전자원 보호 등에도 유용하게 사용할 수 있다.
한편, 분자 마커들은 작물의 재배 환경이나 성장 시기에 영향을 받지 않고 신속하게 품종을 구별할 수 있으므로 유용하게 사용될 수 있다. 주로 반복 단순 염기서열로 이루어진 마이크로새털라이트(microsatellite) 또는 SSR(simple sequence repeat), 유전자 염기서열을 이용한 마커 또는 RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism) 프로브, 스카(SCAR; Sequence Characterised Amplified Region) 마커 등이 이용되고 있다. SCAR 마커는 RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)나 AFLP(Amplification Fragment Length Polymorphism) 마커 등의 밴드 염기서열을 분석하여 제작한 것으로 ASAP(Allele-Specific Associated Primer) 방식으로 밴드의 유무를 확인하는 방식으로 이용된다. SCAR 마커는 다른 분자 마커에 의해 증폭 환경에 비교적 둔감하고 용이하게 결과를 판독할 수 있기 때문에, 재현성, 보편성 및 간편성을 갖춘 효율적인 품종구별용 분자 마커로 인식되고 있다.
이에 본 발명자들은, 국내 밀의 품종 구별을 위해 효율적으로 이용될 수 있는 분자 마커의 개발 연구를 수행하여, 보다 정확하고 재현성 있게 이용할 수 있는 SCAR 마커 세트를 개발하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은, 서열번호 1 내지 12의 올리고뉴클레오티드의 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 국내 밀 품종 판별용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 품종을 판별할 국내 밀로부터 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트를 이용하여 게놈 DNA를 증폭하는 단계; 및 상기 증폭된 산물을 국내 밀 품종 표준의 증폭된 산물과 비교하여 품종을 결정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 국내 밀의 품종 판별 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 프라이머 세트, DNA 중합효소, dNTPs 및 완충용액을 포함하는 국내 밀 품종 판별용 키트를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 서열번호 1 내지 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 국내 밀 품종 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
구체적으로, 본 발명에 따른 프라이머 세트는, 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드의 KWSM001 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드의 KWSM002 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드의 KWSM003 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드의 KWSM004 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드의 KWSM005 프라이머 세트; 및 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드의 KWSM006 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 국내 밀 품종 판별용 프라이머 세트이다. 상기 프라이머 세트는 국내 밀 품종 판별을 위한 SCAR 마커를 증폭시키기 위한 프라이머 세트에 해당한다.
본 발명에서 용어, “SCAR(Sequence Characterised Amplified Region) 마커”는 RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)나 AFLP(Amplification Fragment Length Polymorphism) 등의 분자 마커 밴드의 염기서열을 분석하여 제작한 것이며, ASAP(Allele-Specific Associated Primer) 방식으로 밴드의 유무를 확인하는 방식으로 이용된다. SCAR 마커는 다른 분자 마커에 비해 증폭 환경에 비교적 둔감하고, 용이하게 결과를 판독할 수 있기 때문에, 재현성, 보편성 및 간편성을 갖춘 효율적인 품종 판별용 분자 마커로서, 보다 정확하고 세밀한 마커로 사용이 가능하다. 본 발명에서 용어,“마커(marker)”는 유전적으로 불특정 연관된 유전자좌를 동정할 때 참고점으로 사용되는 염기서열을 의미하며, 상기 용어, “유전자좌”는 분자 마커의 유전자 지도상의 위치를 의미한다.
본 발명에서 용어, “프라이머(primer)”는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 의미하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 하며, 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라, 온도 및 이온 강도와 같은 이용 조건에 의존할 것이다. 구체적 예로, 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 Guanine 및 cytosine의 함량(GC contents), GC배열, 어닐링(annealing) 온도 및 이온 강도 등 여러 조건을 고려하여 결정해야 한다.
본 발명에서 프라이머로 이용된 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 유사체(analogue), 구체적인 예로써 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent) 등을 포함할 수 있다.
국내 밀 품종 판별을 위한 본 발명의 프라이머 세트는 ISSR(Inter Simple Sequence Repeat) 분석에 의해 개발되었다.
본 발명에서 용어, “ISSR”은 2 내지 4bp 크기의 반복 단위가 있는 DNA 염기서열을 프라이머로 사용하여 PCR 분석을 수행하여 DNA를 분석하는 방법으로, 이 기술은 프라이머의 높은 결합 온도와 긴 염기서열 때문에 RAPD 방법보다 재현성 및 신뢰성이 더 높으며, 각 프라이머당 많은 다형성(Polymorphism)을 형성한다. 또한 분석이 매우 신속하고, AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism) 방법에 비해 간단하며, 전통적인 SSR 기술처럼 사전에 염기서열 정보가 필요하지 않으므로 개발비용이 많이 들지 않는 커다란 장점을 갖는다. 따라서, 본 발명은 ISSR 분석을 통하여 SCAR 마커를 개발함으로써, 국내 밀 품종에 보다 특이적인 마커를 적용하여 간단하고 신속하게 국내 밀 품종을 판별할 수 있다.
본 발명의 국내 밀 품종 판별용 프라이머 세트는, DNA 증폭을 위하여 이용될 수 있으며, 바람직하게는 국내 밀 품종 판별을 위한 SCAR 마커의 증폭을 위하여 이용될 수 있다. 구체적으로, 하기 표 1에 기재된 세트로 이용될 수 있다. 또한 하나 이상의 프라이머 세트를 조합하여 이용하면 보다 정확하게 국내 밀 품종을 구별할 수 있다.
본 발명의 프라이머 세트가 국내 밀 품종을 판별하는데 이용되는 경우, 상기 프라이머 세트는 바람직하게는 KWSM001 프라이머 세트; KWSM002 프라이머 세트; KWSM003 프라이머 세트; KWSM004 프라이머 세트; KWSM005 프라이머 세트; 및 KWSM006 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트, 더욱 바람직하게는 상기 6개 프라이머 세트를 조합하여 사용하는 것이 좋다.
마커명 서열번호 프라이머 서열 어닐링 온도(℃) 산물
크기(bp)		 다형성
밴드의 수
KWSM001 1
2		 F: AAGAAGAAAAAGAAAGAGAGTTGAG
R: GTTGTGTTTTTATTTGTTTTTGAC		 55 359 1
KWSM002 3
4		 F: GCCGAGATTAAATTTGTTACTACT
R: AACATTTATGTTTGGTAAATTGAC		 55 312 1
KWSM003 5
6		 F: TGCTGAGGGCATATCTCAACA
R: GTGTTGCACGACGCTGTACT		 58 682 1
KWSM004 7
8		 F: TGCTGAGGGCATATCTCAACG
R: GTGTTGCACGACGCTGTACT		 58 682 1
KWSM005 9
10		 F: GGCTTACTACCTACACTTGACC
R: GCAACAACAACCTTCTCCCAAT		 58 392 1
KWSM006 11
12		 F: GGCTTACTACCTACACTTGACC
R: AACAACCTTCTCCCAATCCCCT		 58 392 1
본 발명에 따른 프라이머 세트에 의해 판별될 수 있는 국내 밀 품종은 국립식량과학원에서 육성된 32개 품종 중 13종을 포함할 수 있으며, 상기 판별 가능한 국내 밀 품종은 하기 표 2에 나타낸 바와 같이 올, 다홍, 청계, 조경, 탑동, 남해, 올그루, 고분, 조품, 연백, 신미찰 1호, 적중 또는 한백일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
번호 품종 번호 품종
1 올 8 고분
2 다홍 9 조품
3 청계 10 연백
4 조경 11 신미찰 1호
5 탑동 12 적중
6 남해 13 한백
7 올그루
본 발명의 구체적 일 실시예에서는, 국내 밀 품종의 DNA를 추출하여 ISSR 분석에 의해 품종별 특이 밴드를 검출하였고(실시예 1 및 2), 상기 특이 밴드(SCAR 마커)를 클로닝하여 이를 증폭시킬 수 있는 프라이머를 제작하였다(실시예 3). 그 결과, KWSM001, KWSM002, KWSM003, KWSM004, KWSM005 및 KWSM006를 증폭시키는 서열번호 1 내지 12의 6개 프라이머 세트를 조합하여 이용하면 상기 표 2의 13종의 국내 밀 품종을 판별할 수 있음을 확인하였다(실시예 4).
또 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 품종을 판별할 국내 밀로부터 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 게놈 DNA를 증폭하는 단계; 및 (b) 상기 증폭된 산물을 국내 밀 품종 표준의 증폭된 산물과 비교하여 품종을 결정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 국내 밀의 품종 판별 방법을 제공한다.
상기 (a) 단계에서 국내 밀의 게놈 DNA(genomic DNA)를 추출하는 방법은, 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 수행할 수 있다. 예컨대, CRAB 방법, 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법 등을 이용하거나 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 사용할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 (a) 단계에서 프라이머 세트는, 상기 표 1에 기재된 13개의 국내 밀 품종을 구별할 수 있는, 서열번호 1 내지 12의 올리고뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 프라이머 세트를 의미한다. 상기 국내 밀 품종 판별용 프라이머 세트는 1세트 이상이 사용될 수 있고, 다수의 프라이머 세트가 동시에 사용됨으로써 보다 정확하게 품종을 구별할 수 있다. 가장 바람직하게는 상기 KWSM001 프라이머 세트, KWSM002 프라이머 세트, KWSM003 프라이머 세트, KWSM004 프라이머 세트, KWSM005 프라이머 세트 및 KWSM006 프라이머 세트를 모두 조합하여 사용될 수 있다.
또한, 상기 (a) 단계에서 게놈 DNA의 증폭은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법을 제한없이 사용할 수 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이며, 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있고, 상업적으로 이용 가능한 키트를 사용할 수도 있다. 상기 PCR 반응 혼합액은 국내 밀 품종에서 추출된 게놈 DNA와 본 발명에 따른 프라이머 세트, 적당량의 DNA 중합효소, dNTP, PCR 완충용액 및/또는 물을 포함할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 PCR 완충용액은 Tris-HCl, MgCl2, KCl 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 (b) 단계는 상기 증폭 산물을 분석하는 단계를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 증폭된 산물의 분석은 DNA 칩, 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정 방법으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행 시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다. 또한, 은염색 키트(Bioneer, Daejeon, Korea)를 사용하여 가시화될 수 있다.
본 발명의 (b) 단계에서는 상기 분석된 증폭 산물을 국내 밀 품종 표준의 증폭 산물과 비교하여 품종을 결정할 수 있다.
본 발명에 따른 분자 마커에 의해 구별될 수 있는 13개의 국내 밀 품종은 각각 사용되는 SCAR 분자 마커에 의한 증폭 여부가 상이하고, 각 분자 마커에 의한 증폭 여부는 하기 표 3에 표시된 바와 같다. 품종을 구별하고자 하는 국내 밀 품종의 게놈 DNA로부터의 증폭 결과를 하기 표 3에 표시된 결과를 표준으로 하여 이와 비교함으로써 품종을 판별할 수 있다.
No. Cultivars SCAR marker name
KWSM001 KWSM002 KWSM003 KWSM004 KWSM005 KWSM006
1 Ol + + - + - -
2 Geuru - - - - + +
3 Dahong + - - + - -
4 Chungkye - - + - + +
5 Eunpa - - - + + +
6 Tapdong - - - + - -
7 Namhae + - + + - -
8 Uri - - - - + +
9 Olgeuru - + - - + +
10 Alchan - - - - + +
11 Gobun - + + + + +
12 Keumkang - - - - - +
13 Seodun - - + + + +
14 Saeol - - - - + +
15 Jinpum + + - - + +
16 Milseong - - + + + +
17 Joeun - - - + + +
18 Anbaek + - - - + +
19 Jopoom + + - + + +
20 Sinmichal - - - - + +
21 Jonong - - - - + +
22 Jokyoung + + - - - -
23 Younbaek - - - - - -
24 Sinmichal 1 + + - - - -
25 Baegjung - - - - - +
26 Jeokjoon + - - - - +
27 Sugang - - - - + +
28 Hanbaek - - + + - -
29 Sooan - - - - + +
30 Dajung + + - - + +
31 Goso + - - - + +
32 Joah + + - - + +
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 프라이머 세트, DNA 중합효소, dNTPs 및 완충용액을 포함하는 국내 밀 품종 판별용 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 키트에서, 상기 국내 밀 품종 판별용 프라이머 세트는 표 2에 기재된 서열번호 1 내지 12의 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 세트로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종 이상의 프라이머 세트일 수 있다. 또한 완충용액은 PCR 반응에 필요할 수 있고, 이는 당업계에서 통상적으로 공지된 조성을 가지며, 예를 들면 Tris-HCl, MgCl2, KCl 등을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 국내 밀 품종 판별용 키트는 PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동에 필요한 성분들을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하면 국내 밀 품종을 명확히 판별할 수 있으므로 품종 육성권자에 대한 보호를 강화할 수 있고, 품종혼입 문제를 해결하는데 기여할 수 있으며, 국내 밀 품종의 분자유전학적 연구 및 주요 형태적 특성 분석에도 이용될 수 있다.
도 1은 ISSR 분석 결과를 나타낸 도이다. 200 내지 1,000bp 사이에서 형성된 밴드만을 나타낸 것으로, 화살표는 품종 특이적 밴드이다. A 내지 N은 ISSR 프라이머에 해당한다(A; UBC807, B; UBC808, C; UBC812, D; UBC813, E; UBC816, F; UBC815, G; UBC819, H; UBC823, I; UBC836, J; UBC840, K; UBC844, L; UBC846, M; UBC849, N; UBC880).
도 2는 새로 개발된 국내 밀 품종 판별용 마커 시험 결과를 나타낸 도이다. +는 밴드가 발현된 것을 표시한 것이고, -는 밴드가 발현되지 않은 것을 표시한다. 빨간색으로 표시된 것은 이들 6개 프라이머 세트의 조합으로 구분이 가능한 13개 품종을 표시한 것으로서, 1번 올, 3번 다홍, 4번 청계, 6번 탑동, 7번 남해, 9번 올그루, 11번 고분, 19번 조품, 22번 조경, 23번 연백, 24번 신미찰 1호, 26번 적중, 28번 한백에 해당한다. 하기 A 내지 F는 SCAR 마커를 증폭시키기 위한 프라이머 세트에 해당한다(A; KWSM001, B; KWSM002, C; KWSM003, D; KWSM004, E; KWSM005, F; KWSM006).
이하, 본 발명을 하기 예에서 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 이들에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 국내 밀 품종의 DNA 추출
상기 표 1에 기재된 32개 품종의 국내 밀로부터 게놈 DNA(genomic DNA) 추출은 어린잎을 채취하여 마쇄 후 mini prep을 하였다. 식물체의 어린잎을 잘라내어 액체질소로 급랭 후에 고운 가루가 될 때까지 분쇄하였다. 분쇄 후 바로 추출 완충액(extraction buffer) 300 ㎕를 넣어주고 분쇄 가루와 잘 섞어주었다. 그 뒤 65℃ 수조(water bath)에 30분간 배양(incubation)한 후 13,000rpm, 4℃에서 20분간 원심분리 하였다. 원심분리 후 상층액을 새 시험관(tube)에 옮기고 아이스프로필(isopropyl) 300 ㎕ 첨가 후 천천히 invert하여 팰럿(pellet)이 뭉치게 하였다. 다시 13,000rpm, 5분간 원심분리한 뒤 펠럿(pellet)을 제외한 상층액을 제거 한 뒤 80% 에탄올 50 ㎕를 넣고 세척하였다. 세척 후 13,000rpm, 5분간 원심분리 하고 펠럿(pellet)을 제외한 에탄올을 제거한 후 펠럿(pellet)을 상온에서 건조 후에 멸균 증류수를 넣어 펠럿(pellet)을 녹였다. 추출한 DNA는 NanoDrop을 이용하여 정량을 하였다.
실시예 2: ISSR 분석에 의한 품종별 특이 밴드의 검출
서열
번호		 Primer Sequence 서열
번호		 Primer Sequence
13 UBC801 ATATATATATATATATT 40 UBC828 TGTGTGTGTGTGTGTGA
14 UBC802 ATATATATATATATATG 41 UBC829 TGTGTGTGTGTGTGTGG
15 UBC803 ATATATATATATATATC 42 UBC830 TGTGTGTGTGTGTGTGC
16 UBC804 TATATATATATATATAA 43 UBC831 ATATATATATATATATYA
17 UBC805 TATATATATATATATAC 44 UBC832 ATATATATATATATATYC
18 UBC806 TATATATATATATATAG 45 UBC831 ATATATATATATATATYA
19 UBC807 AGAGAGAGAGAGAGAGT 46 UBC832 ATATATATATATATATYC
20 UBC808 AGAGAGAGAGAGAGAGC 47 UBC833 ATATATATATATATATYG
21 UBC809 AGAGAGAGAGAGAGAGG 48 UBC834 AGAGAGAGAGAGAGAGYT
22 UBC810 GAGAGAGAGAGAGAGAT 49 UBC835 AGAGAGAGAGAGAGAGYC
23 UBC811 GAGAGAGAGAGAGAGAC 50 UBC836 AGAGAGAGAGAGAGAGYA
24 UBC812 GAGAGAGAGAGAGAGAA 51 UBC837 TATATATATATATATART
25 UBC813 CTCTCTCTCTCTCTCTT 52 UBC838 TATATATATATATATARC
26 UBC814 CTCTCTCTCTCTCTCTA 53 UBC839 TATATATATATATATARG
27 UBC815 CTCTCTCTCTCTCTCTG 54 UBC840 GAGAGAGAGAGAGAGAYT
28 UBC816 CACACACACACACACAT 55 UBC841 GAGAGAGAGAGAGAGAYC
29 UBC817 CACACACACACACACAA 56 UBC842 GAGAGAGAGAGAGAGAYG
30 UBC818 CACACACACACACACAG 57 UBC843 CTCTCTCTCTCTCTCTRA
31 UBC819 GTGTGTGTGTGTGTGTA 58 UBC844 CTCTCTCTCTCTCTCTRC
32 UBC820 GTGTGTGTGTGTGTGTC 59 UBC845 CTCTCTCTCTCTCTCTRG
33 UBC821 GTGTGTGTGTGTGTGTT 60 UBC846 CACACACACACACACART
34 UBC822 TCTCTCTCTCTCTCTCA 61 UBC847 CACACACACACACACARC
35 UBC823 TCTCTCTCTCTCTCTCC 62 UBC848 CACACACACACACACARG
36 UBC824 TCTCTCTCTCTCTCTCG 63 UBC849 GTGTGTGTGTGTGTGTYA
37 UBC825 ACACACACACACACACT 64 UBC850 GTGTGTGTGTGTGTGTYC
38 UBC826 ACACACACACACACACC 65 UBC876 GATAGATAGACAGACA
39 UBC827 ACACACACACACACACG 66 UBC880 GGAGAGGAGAGGAGA
상기 표 4에서 나타낸 바와 같이, 품종 특이적 밴드가 증폭되는 ISSR 프라이머를 선별하기 위하여, 총 54개 ISSR 프라이머를 사용하여 PCR 반응을 통해 분석하였다.
PCR 증폭은 정량 분석된 게놈 DNA(genomic DNA) 3 ㎕에, 5 μM primer, 10X buffer, 2.5 mM dNTPs, 5 U/㎕ i-StarMAX II Taq DNA polymerase(iNtRON, Korea)를 첨가하여 25 ㎕ 부피로 하였고, PCR 반응 조건은 94℃, 3분간 pre-denature, 95℃(30초), 55℃(30초), 72℃(1분)을 1 cycle로 하여 35 cycle 반복 후, 72℃에서 5분간 반응시켰다. 증폭된 산물을 확인하기 위하여 5 ㎕를 electrophoresis 6X loading buffer 5 ㎕(5:1)로 섞어주어 1.5% 아가로스 겔에서 전기영동한 후 UV 아래에서 확인하였다.
그 결과, 상기 54개 프라이머 중 9개 ISSR 프라이머(UBC807에서 2개 밴드, UBC808에서 1개 밴드, UBC812에서 3개 밴드, UBC813에서 3개 밴드, UBC816에서 1개 밴드, UBC815에서 1개 밴드, UBC819에서 3개 밴드, UBC823에서 1개 밴드, UBC840에서 1개 밴드)의 결과로부터 품종 특이 밴드를 16개 확인하였다(도 1).
실시예 3: 선발된 품종 특이 ISSR 마커의 클로닝와 염기서열 분석
상기 실시예 2에서의 품종별 특이 밴드는 아가로스 겔로부터 분리되어 클로닝되었다. 아가로스 겔로부터 순수 분리된 DNA를 T-easy vector(Promega, USA)와 연결하여 Competent cell(E. coli, DH5α)에 삽입하였다. 그 후 LB 배지에서 나타난 백색(white) 콜로니는 다시 액상 배양하여 플라스미드 DNA(plasmid DNA)만을 추출하여 염기서열을 결정하였다. 결정된 염기서열은 NCBI에서 정보를 분석하였고, 그 염기서열을 이용하여 SCAR 마커를 증폭시킬 수 있는 프라이머를 디자인하였다(표 1). 프라이머 디자인은 primer3 프로그램을 이용하였다.
실시예 4: 품종 특이적 분자 마커 개발
총 16개의 프라이머 세트를 디자인하여 국내 밀 32개 품종에 PCR 적용하였다. PCR 증폭은 정량 분석된 게놈 DNA 3 ㎕에, 5 μM primer, 10X buffer, 2.5 mM dNTPs, 5 U/㎕ i-StarMAX II Taq DNA polymerase(Intron, Korea)를 첨가하여 25 ㎕ 부피로 하였고, PCR 반응 조건은 94℃, 3분간 pre-denature, 95℃;(30초), 55℃~60℃(30초), 72℃(1분)을 1 cycle로 하여 35 cycle반복 후 72℃에서 5분간 반응시켰다. 특히, 어닐링(annealing) 온도는 프라이머에 따라 55℃~60℃까지 각각 다르게 적용하였다. 증폭된 산물을 확인하기 위하여 5 ㎕를 electrophoresis 6X loading buffer 5 ㎕(5:1)로 섞어주어 1.5% 아가로스 겔 에서 전기영동 하였고, UV 아래에서 확인하였다.
그 결과, 본 발명의 SCAR 마커를 증폭시키는 서열번호 1 내지 12의 올리고뉴클레오티드의 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 이용한 품종 판별 결과를 상기 표 1 및 표 3에 나타내었다.
구체적으로, KWSM001은 올, 다홍, 남해, 진품, 안백, 조품, 조경, 연백, 신미찰 1호, 적중, 다중, 고소, 조아 등 13개 품종에서 증폭되었다. KWSM002는 올, 올그루, 고분, 진품, 조품, 조경, 신미찰 1호, 다중, 조아 등 9개 품종에서 증폭되었다. KWSM003은 청계, 남해, 고분, 서둔, 밀성, 한백 등 6개 품종에서 증폭되었고, KWSM004는 올, 다홍, 은파, 탑동, 남해, 고분, 서둔, 밀성, 조은, 조품, 한백 등 11개 품종에서 증폭되었다. KWSM005은 그루, 청계, 은파, 우리, 올그루, 알찬, 고분, 서둔, 새울, 진품, 밀성, 조은 안백, 조품, 신미찰, 조농 등 21개 품종에서 증폭되었다. KWSM006는 그루, 청계, 은파, 우리, 올그루 등 25개 품종에서 증폭되었다.
따라서, 이들 6개의 프라이머 세트 조합을 사용하였을 경우, 올밀은 KWSM001, KWSM002, KWSM004의 3개 프라이머에서 증폭되었다. 다홍밀은 KWSM001과 KWSM003에서 증폭되었다. 청계밀은 KWSM003, KWSM005, KWSM006에서 증폭되었다. 남해밀은 KWSM001, KWSM003, KWSM004의 3개 프라이머에서 증폭되었다. 올그루밀은 KWSM002와 KWSM005에서 증폭되었다. 고분밀은 KWSM002, KWSM003, KWSM004, KWSM005의 4개 프라이머에서 증폭되었다. 조품밀은 KWSM001, KWSM002, KWSM004, KWSM005의 4개 프라이머에서 증폭되었다. 조경밀은 KWSM001, KWSM002, KWSM006의 3개 프라이머에서 증폭되었다. 신미찰 1호밀은 KWSM001와 KWSM002의 2개 프라이머에서 증폭된다. 연백밀은 6개 프라이머 모두에서 증폭이 되지 않아 다른 품종들로부터 구분될 수 있다. 적중밀은 KWSM001만 증폭되었다. 한백밀은 KWSM003과 KWSM004의 2개 프라이머에서 증폭되었기 때문에 다른 품종으로부터 구분될 수 있다.
상기 6개의 프라이머 세트로부터 선택된 하나 이상의 세트를 조합하여 이용하면 보다 정확하게 국내 밀 품종을 구별할 수 있다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위의 의미 및 범위, 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> SACR marker for cultivar discrimination in Korean breeding wheat and use thereof <130> PA130759/KR <160> 66 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KWSM001 forward primer <400> 1 aagaagaaaa agaaagagag ttgag 25 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KWSM001 reverse primer <400> 2 gttgtgtttt tatttgtttt tgac 24 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KWSM002 forward primer <400> 3 gccgagatta aatttgttac tact 24 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KWSM002 reverse primer <400> 4 aacatttatg tttggtaaat tgac 24 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KWSM003 forward primer <400> 5 tgctgagggc atatctcaac a 21 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KWSM003 reverse primer <400> 6 gtgttgcacg acgctgtact 20 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KWSM004 forward primer <400> 7 tgctgagggc atatctcaac g 21 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KWSM004 reverse primer <400> 8 gtgttgcacg acgctgtact 20 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KWSM005 forward primer <400> 9 ggcttactac ctacacttga cc 22 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KWSM005 reverse primer <400> 10 gcaacaacaa ccttctccca at 22 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KWSM006 forward primer <400> 11 ggcttactac ctacacttga cc 22 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KWSM006 reverse primer <400> 12 aacaaccttc tcccaatccc ct 22 <210> 13 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC801 primer <400> 13 atatatatat atatatt 17 <210> 14 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC802 primer <400> 14 atatatatat atatatg 17 <210> 15 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC803 primer <400> 15 atatatatat atatatc 17 <210> 16 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC804 primer <400> 16 tatatatata tatataa 17 <210> 17 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC805 primer <400> 17 tatatatata tatatac 17 <210> 18 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC806 primer <400> 18 tatatatata tatatag 17 <210> 19 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC807 primer <400> 19 agagagagag agagagt 17 <210> 20 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC808 primer <400> 20 agagagagag agagagc 17 <210> 21 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC809 primer <400> 21 agagagagag agagagg 17 <210> 22 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC810 primer <400> 22 gagagagaga gagagat 17 <210> 23 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC811 primer <400> 23 gagagagaga gagagac 17 <210> 24 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC812 primer <400> 24 gagagagaga gagagaa 17 <210> 25 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC813 primer <400> 25 ctctctctct ctctctt 17 <210> 26 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC814 primer <400> 26 ctctctctct ctctcta 17 <210> 27 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC815 primer <400> 27 ctctctctct ctctctg 17 <210> 28 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC816 primer <400> 28 cacacacaca cacacat 17 <210> 29 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC817 primer <400> 29 cacacacaca cacacaa 17 <210> 30 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC818 primer <400> 30 cacacacaca cacacag 17 <210> 31 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC819 primer <400> 31 gtgtgtgtgt gtgtgta 17 <210> 32 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC820 primer <400> 32 gtgtgtgtgt gtgtgtc 17 <210> 33 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC821 primer <400> 33 gtgtgtgtgt gtgtgtt 17 <210> 34 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC822 primer <400> 34 tctctctctc tctctca 17 <210> 35 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC823 primer <400> 35 tctctctctc tctctcc 17 <210> 36 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC824 primer <400> 36 tctctctctc tctctcg 17 <210> 37 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC825 primer <400> 37 acacacacac acacact 17 <210> 38 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC826 primer <400> 38 acacacacac acacacc 17 <210> 39 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC827 primer <400> 39 acacacacac acacacg 17 <210> 40 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC828 primer <400> 40 tgtgtgtgtg tgtgtga 17 <210> 41 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC829 primer <400> 41 tgtgtgtgtg tgtgtgg 17 <210> 42 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC830 primer <400> 42 tgtgtgtgtg tgtgtgc 17 <210> 43 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC831 primer <400> 43 atatatatat atatatya 18 <210> 44 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC832 primer <400> 44 atatatatat atatatyc 18 <210> 45 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC831 primer <400> 45 atatatatat atatatya 18 <210> 46 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC832 primer <400> 46 atatatatat atatatyc 18 <210> 47 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC833 primer <400> 47 atatatatat atatatyg 18 <210> 48 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC834 primer <400> 48 agagagagag agagagyt 18 <210> 49 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC835 primer <400> 49 agagagagag agagagyc 18 <210> 50 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC836 primer <400> 50 agagagagag agagagya 18 <210> 51 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC837 primer <400> 51 tatatatata tatatart 18 <210> 52 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC838 primer <400> 52 tatatatata tatatarc 18 <210> 53 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC839 primer <400> 53 tatatatata tatatarg 18 <210> 54 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC840 primer <400> 54 gagagagaga gagagayt 18 <210> 55 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC841 primer <400> 55 gagagagaga gagagayc 18 <210> 56 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC842 primer <400> 56 gagagagaga gagagayg 18 <210> 57 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC843 primer <400> 57 ctctctctct ctctctra 18 <210> 58 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC844 primer <400> 58 ctctctctct ctctctrc 18 <210> 59 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC845 primer <400> 59 ctctctctct ctctctrg 18 <210> 60 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC846 primer <400> 60 cacacacaca cacacart 18 <210> 61 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC847 primer <400> 61 cacacacaca cacacarc 18 <210> 62 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC848 primer <400> 62 cacacacaca cacacarg 18 <210> 63 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC849 primer <400> 63 gtgtgtgtgt gtgtgtya 18 <210> 64 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC850 primer <400> 64 gtgtgtgtgt gtgtgtyc 18 <210> 65 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC876 primer <400> 65 gatagataga cagaca 16 <210> 66 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC880 primer <400> 66 ggagaggaga ggaga 15

Claims (7)

  1. 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 KWSM001 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 KWSM002 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 KWSM003 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 KWSM004 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 KWSM005 프라이머 세트; 및 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 KWSM006 프라이머 세트가 조합된 국내 밀 품종 판별용 프라이머 세트.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 국내 밀 품종은 올, 다홍, 청계, 조경, 탑동, 남해, 올그루, 고분, 조품, 연백, 신미찰 1호, 적중 및 한백으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 프라이머 세트.
  3. 삭제
  4. (a) 품종을 판별할 국내 밀로부터 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 게놈 DNA를 증폭하는 단계; 및
    (b) 상기 증폭된 산물을 국내 밀 품종 표준의 증폭된 산물과 비교하여 품종을 결정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 국내 밀의 품종 판별 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 국내 밀 품종은 올, 다홍, 청계, 조경, 탑동, 남해, 올그루, 고분, 조품, 연백, 신미찰 1호, 적중 및 한백으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 국내 밀의 품종 판별 방법.
  6. 삭제
  7. 제1항에 따른 프라이머 세트, DNA 중합효소, dNTPs 및 완충용액을 포함하는 국내 밀 품종 판별용 키트.
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