KR102291826B1 - 잔디품종 및 제초제 저항성 유전자 변형 판별용 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명의 잔디 품종 판별용 조성물은 들잔디 및 금잔디 품종을 판별하는 프라이머 세트를 포함하여, 제초제 저항성 유전자 변형 판별용 프라이머 세트를 더 포함할 수 있다. 따라서 들잔디(Zoysia japonica)와 금잔디(Zoysia matrella)를 특이적으로 검출하고 동시에 제초제 저항성 유전자 변형 잔디를 특이적으로 검출하는 것이 가능하고, 특히 제초제 저항성 유전자 변형 잔디 및 이를 모본으로 하는 파생 품종에 대한 검정이 가능하므로 육종 모본 확인에 활용할 수 있다. 따라서 제초제 저항성 잔디를 정성적, 품종별로 검정할 수 있다.

Description

잔디품종 및 제초제 저항성 유전자 변형 판별용 조성물 및 이의 용도{Composition for herbicide-resistant gene modified grass dertermination and grass-breed determination and uses thereof}

본 발명은 잔디품종 및 제초제 저항성 유전자 변형 판별용 조성물 및 이의 용도에 에 관한 것이다.

유전자 변형 작물(Genetically Modified Organism, GMO)이란 기존의 작물 육종에 의한 품종 개발과는 달리, 동식물 또는 미생물의 유용 유전자를 인공적으로 분리, 결합시켜 생산성이 증가 되도록 한 생물체를 총칭하는 것이다. 일반적으로 유전자 변형 작물의 생산성을 증가시키기 위하여 제초제 저항성, 내충성, 내병성, 내한성 등에 관련된 유전자를 작물에 도입하고 있다. 유전자 변형(Genetically Modified, GM) 작물은 1994년에 토마토가 처음으로 미국에서 상업화 되었고, 1996년부터는 GM 옥수수와 콩이 미국, 캐나다 및 아르헨티나에서 재배되기 시작하였다. 그 후 세계의 여러 나라들이 GM작물의 재배를 시작하여 2018년 기준, GM 작물을 재배하는 나라는 26개국으로 증가하였고, 그 재배 면적도 190만 헥타르이며, 이중 제초제 저항성 작물은 46%를 차지하고 있다.

한편, 유전자 변형 작물의 상업화를 위해서는 환경위해성, 인체 및 식품안정성평가가 요구되고 있고, 개발자는 유전자 변형 작물의 안전성 측면에서 다양한 검출 마커를 개발하고 있으며, 유전자 변형 농산물을 수입하는 관련 국가에서는 유전자 변형 작물과 식품의 표시에 실질적으로 적용에 가능한 검사법을 개발하고 있다.

유전자 변형 작물을 확인 방법은 유전자 변형체의 단백질을 검출하는 방법과 DNA를 검출하는 방법이 있다. 단백질을 이용한 검정방법은 도입유전자에 의해서 생산된 단백질에 특이적으로 인지하는 항체단백질을 이용하는 원리로, 검출지(strip) 키트와 효소면역학적 방법(Enzyme Linked Immunosobent Assay, ELISA) 등이 이에 속하고 있다. 그러나 단백질의 발현양은 유전자 변형 작물에 따라 다르고, 검사체의 상태, 즉 보관상태 또는 가공품의 경우 가공과정에서 가열 등의 처리에 의해 단백질이 파괴될 수 있어 검정에 한계가 있다. DNA를 이용한 분석방법은 핵산중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)에 의한 검정법으로 현재 가장 보편화 되어 있으며, 유전자 변형체로부터 DNA를 분리하고 도입유전자에 대하여 상보적인 염기를 갖는 특이 프라이머를 이용하여 검출하는 원리이다.

한편, 세계적으로 다수의 유전자 변형 작물이 상업화되어 있고 유전자 변형 작물의 개발에 많은 노력이 이루어지고 있으나, 국내에서는 아직 상업화된 유전자 변형 작물은 없고, 최근에 국내 주요작물을 대상으로 실용화 추진을 진행하고 있다. 유전자 변형 작물의 상업화를 위해서는 유전자 변형 작물의 용도에 따라 환경 및 인체에 미치는 영향과 유전자 변형에 관한 전문적이고 세부적인 내용을 포함하는 자료를 제출해야 한다. 환경 및 인체 안전성평가심사 자료에는 유전자 변형 작물의 안전성 확보 및 농산물 유통에 따른 이력추적을 위해서 검정할 수 있는 검출법의 제시가 요구되고 있다.

조이시아(Zoysia) 속 잔디류는 전 세계에 걸쳐 재배되는 중요한 지피식물로서 가정 및 아파트의 정원이나 학교운동장, 공원, 묘지 등에 다양하게 이용되고 있는 환경 친화적 식물이다. 잔디는 기능적으로 토양침수 및 유실방지, 지표면 온도 상승완화, 먼지 및 소음감소, 공기정화능력이 있고, 환경적으로 조경 및 공원조성을 통한 정서적 안정성과 체육활동 및 레크리에이션 등을 위한 휴식공간을 제공하는 등 우리 생활에 없어선 안 될 매우 중요한 유전자원 중의 하나이다.

산림청 자료에 의하면 관상 산림식물류에 속하는 잔디는 생산액이 약 349억 원으로 야생화나 분재보다 높다. 2011년 잔디 생산면적은 3,056ha로 2001년에 비해서 약 17.8%가 증가하였고, 잔디산업의 성장에 따라 잔디의 수요는 매년 증가하고 있는 추세이다. 이러한 잔디의 급격한 수요 증가와 더불어 잔디와 관련된 사업규모가 확대되고 있으나 병해충 저항성, 제초제 저항성, 내음지성, 녹기 연장 등 소비자 요구에 충족할 만한 잔디의 종류는 미비한 실정이다. 지금까지 잔디는 전통적인 육종방법(교배육종)을 이용하여 개발되어 왔으며, 전통적 육종기술로 개발할 수 없는 형질들은 최근 분자생물학적 방법을 이용하여 신품종 잔디를 개발하고 있다.

이에 본 발명자들은 제초제 저항성 유전자 변형 잔디의 품종별, 정성적으로 검출할 수 있는 방법을 찾기 위해 연구를 거듭한 결과, 본 발명에 따른 프라이머를 이용하면 제초제 저항성 유전자 변형 잔디를 정성적으로 검정할 수 있을 뿐만 아니라, 품종별 검정도 가능함을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.

대한민국 공개특허 특1997-0021314

본 발명의 해결하고자 하는 과제는 서열번호1 및 서열번호2의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는 잔디 품종 판별용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 과제는 상기 프라이머 세트를 포함하는 잔디 품종 판별용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 과제는 상기 조성물을 포함하는 잔디 품종 판별용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 과제는 잔디 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계, 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍을 이용하여, 증폭반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계 및 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는 잔디 품종의 판별방법을 제공하는 것이다.

본 발명자는 잔디의 품종과 제초제 저항성 유전자 변형 여부를 검정 방법을 개발하고자, 제초제 저항성 유전자 변형 잔디의 내재유전자, 도입유전자 염기서열을 바탕으로 특이 프라이머를 제작하여 제초제 저항성 유전자 변형 잔디의 정성적, 품종별 분석에 활용 가능함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명에서는 제초제 저항성 유전자 변형 잔디를 특이적으로 검출 및 들잔디(Zoysia japonica)와 금잔디(Zoysia matrella)를 특이적으로 검출하는 것이 가능하고, 특히 제초제 저항성 유전자 변형 잔디 및 이를 모본으로 하는 파생 품종에 대한 검정이 가능하므로 육종 모본 확인에 활용할 수 있다. 따라서 제초제 저항성 잔디를 정성적, 품종별로 검정할 수 있다.

상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로 서열번호1 및 서열번호2의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는 잔디 품종 판별용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명에서 “잔디”는 조이시아(Zoysia) 속의 식물이며, 상기 잔디 품종은 들잔디(Zoysia japonica) 또는 금잔디(Zoysia matrella)를 포함한다.

본 발명의 실시예에서 일반잔디인 들잔디(Zoysia japonica), 금잔디(Zoysia matrella), 제초제 저항성 유전자 변형 잔디인 JG21(들잔디 모본의 제초제 저항성 유전자 변형 잔디) 및 JG21-MJ(JG21과 금잔디의 교잡종)에서 게놈 DNA를 분리하고, ZJM 정방향 프라이머(서열번호1) 및 ZJM 역방향 프라이머(서열번호2)의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 분석을 수행하여 잔디의 품종을 판별하였다.

분석결과, JG21와 들잔디에서 약 359bp(서열번호4) 크기의 특이적인 PCR 산물이 나타났으며, 금잔디에서 약 1,465bp(서열번호3) 크기의 특이적인 PCR 산물이 확인하였다. 또한, JG21와 금잔디 교잡종인 JG21-MJ에서 360bp(서열번호4)와 1,465bp(서열번호3) 크기의 두 개의 PCR 증폭 산물을 확인하였다.

즉, ZJM 정방향 프라이머(서열번호1) 및 ZJM 역방향 프라이머(서열번호2)의 프라이머 쌍이 들잔디(Zoysia japonica), 금잔디(Zoysia matrella), 제초제 저항성 유전자 변형 잔디인 JG21(들잔디 모본의 제초제 저항성 유전자 변형 잔디) 및 JG21-MJ(JG21과 금잔디의 교잡종)에서 내재 유전자를 특이적으로 검출함을 확인하였으며, 구체적으로 들잔디 품종 또는 이의 교잡종(들잔디, JG21, JG21-MJ)에서 서열번호4(359bp)의 유전자를 검출함을 확인하였고, 금잔디 품종 또는 이의 교잡종(금잔디, JG21-MJ)에서 서열번호3(1,465bp)의 유전자를 검출함을 확인하였다.

따라서 본 발명의 서열번호1 및 서열번호2의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍은 잔디 품종 판별용 프라이머 세트로 이용할 수 있다. 구체적으로 들잔디(Zoysia japonica) 또는 금잔디(Zoysia matrella)의 품종 판별용 조성물로 이용할 수 있다.

구체적으로, 상기 프라이머 세트는 들잔디(Zoysia japonica) 또는 이를 모본으로 하는 품종의 내재 유전자인 서열번호4(359bp)의 유전자를 검출할 수 있으며, 또한, 금잔디(Zoysia matrella) 또는 이를 모본으로 하는 품종의 내재 유전자인 서열번호3(1,465bp)를 검출할 수 있다.

본 발명에서 “프라이머(primer)”는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로 작용한다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 하며, 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity) 뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 발명에서 상기 프라이머는 DNA 삽입(intercalating) 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질을 더 포함할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

상기 표지 물질은 FAM 또는 HEX일 수 있다. 표적 서열의 증폭 시 대립유전자(allele) 특이적인 프라이머의 5'-말단에 FAM 또는 HEX를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다.

본 발명에서 용어 "프라이머 세트"는 복수의 프라이머를 의미한다. 또한, 프라이머 세트는 프라이머를 수용하기 위한 컨테이너를 더 포함할 수 있다. 프라이머는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 염기 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약과 4가지 뉴클레오사이트 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 프라이머는 올리고뉴클레오티드일 수 있으며, 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들어, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 헥산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 삽입물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다. 프라이머는 포스포르아미다이트법, 포스포디 에스테르법, 디에틸포스모르아미다이트법 등을 이용하는 화학 합성법을 통하여 제조될 수 있다. 또한, 프라이머 염기서열은 당해 분야에 공지된 수단에 의해 변형될 수 있다.

상기의 과제를 해결하기 위해 본 발명은 다른 양태로 상기 프라이머 세트를 포함하는 잔디 품종 판별용 조성물을 제공한다.

본 발명의 잔디 품종 판별용 조성물은 서열번호1 및 서열번호2의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는 잔디 품종 판별용 프라이머 세트를 포함한다.

본 발명에서 잔디“프라이머 세트”, “잔디 품종”에 대한 설명은 전술한 바와 같다.

본 발명의 실시예에서 제초제 저항성 유전자 도입여부를 확인하기 위해 Ubipo 정방향 프라이머(서열번호5)와 Bar 역방향 프라이머(서열번호6)를 제조하였으며, 상기 Ubipo 정방향 프라이머(서열번호5)와 Bar 역방향 프라이머(서열번호6)를 이용하여 일반잔디인 들잔디(Zoysia japonica), 금잔디(Zoysia matrella)와 제초제 저항성 유전자 변형 잔디인 JG21(들잔디 모본의 제초제 저항성 유전자 변형 잔디) 및 JG21-MJ(JG21과 금잔디의 교잡종)에서 게놈 DNA를 분리하고, PCR 분석하여 제초제 저항성 유전자 변형 품종을 판별하였다.

분석결과, 일반잔디인 들잔디와 금잔디에서는 PCR 산물이 검출되지 않았으나, 제초제 저항성 유전자 변형 잔디(JG21, JG21-MJ)에서 서열번호7(507bp)의 유전자가 검출되었다. 즉, Ubipo 정방향 프라이머(서열번호5)와 Bar 역방향 프라이머(서열번호6)를 제초제 저항성 유전자 변형 잔디 판별에 이용할 수 있음을 확인하였다.

따라서 서열번호5 및 서열번호6의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는 조성물은 제초제 저항성 유전자 변형 잔디 판별에 이용할 수 있다.

따라서 본 발명의 조성물은 서열번호5 및 서열번호6의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍을 더 포함하며, 동시에 제초제 저항성 유전자 변형 잔디를 판별하기 위한 것일 수 있다.

상기 서열번호5 및 서열번호6의 염기서열로 이우러진 프라이머 쌍은 서열번호7(507bp)의 유전자를 검출하기 위한 것일 수 있다.

본 발명의 “제초제”는 잡초를 제거하는 데 사용되는 화학약제로 적용범위에 따라 비선택성 제초제와 선택성 제초제가 있다. 상기 비선택적 제초제는 식물의 종류에 관계없이 살초 작용을 나타내는 것으로 일예로, 글루포시네이트(glufosinate)가 있다. 선택적 제초제는 식물의 종류에 따라서 살초 작용을 달리하는 것으로 2,4-D(2, 4-디클로로페녹시아세트산)이 활엽 식물에 대해 선택적인 살초 효과를 나타낸다.

본 발명에서 “제초제 저항성 유전자 변형 잔디”은 제초제 저항성을 가진 유전자를 도입하여 제조된 유전자 변형 잔디를 의미한다. “유전자 변형 잔디”는 일반적으로 생산량 증대 또는 유통, 가공 상의 편의를 위하여 유전공학기술을 이용, 기존의 육종방법으로는 나타날 수 없는 형질이나 유전자를 지니도록 개발된 잔디를 말한다.

상기 유전자 변형 잔디는 글루포시네이트의 주성분인 포스피노트리신(phosphinotricin)에 저항성이 있는 잔디로서, 포스피노트리신 아세틸전달효소(phosphinotricin acetyltransferase, PAT)를 코딩하는 포스피노트리신 아세틸전달효소(Phosphinothricin acetyltransferase; PAT) 유전자나 bialaphos resistance (bar) 유전자가 도입되어 있다.

상기의 과제를 해결하기 위해 본 발명은 또 다른 양태로 상기 조성물을 포함하는 잔디 품종 판별용 키트를 제공한다.

본 발명에서 “잔디 품종 판별용 조성물”에 대한 설명은 전술한 바와 같다.

본 발명의 키트는 서열번호1 및 서열번호1의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는 잔디 품종 판별용 조성물을 포함한다. 또한 서열번호5 및 서열번호6의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍을 더 포함하는 잔디 품종 판별용 조성물을 포함할 수 있다.

전술한 실시예에서 서열번호5 및 서열번호6의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍을 이용하여 제초제 저항성 유전자 변형 잔디를 판별할수 있음을 확인하였는바, 본 발명의 키트는 서열번호5 및 서열번호5의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍을 포함하는 조성물을 포함할수 있으며, 동시에 제초제 저항성 유전자 변형 잔디를 판별하기 위한 것일 수 있다.

본 발명의 판별용 키트는 PCR 분석 또는 multiplex-PCR 분석을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. 상기 키트는, 상기 각 폴리뉴클레오티드에 대한 특이적인 각각의 프라이머 세트 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한, PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성성분 또는 공지된 유전자에 대한 동정 기준표들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.

또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

상기의 과제를 해결하기 위해 본 발명은 또 다른 양태로 잔디 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계, 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호1 및 2로 표시되는 프라이머 쌍을 이용하여, 증폭반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계 및 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는 잔디 품종의 판별방법을 제공한다.

본 발명의 판별방법은 잔디 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계, 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호1 및 2로 표시되는 프라이머 쌍을 이용하여, 증폭반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계 및 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함한다.

전술한 실시예에서 서열번호5 및 6의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍이 제초제 저항성 유전자 도입 잔디 품종에서 서열번호7(507bp)의 유전자를 특이적으로 검출함을 확인하였는바, 본 발명의 판별방법은 서열번호5 및 6의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍을 이용하여, 증폭반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계를 더 포함하며, 동시에 제초제 저항성 유전자 변형 잔디를 판별하는 것 일수 있다.

본 발명에서 DNA 분리는 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 수행할 수 있다. 예컨대, CRAB 방법, 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법 등을 이용하거나 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 분리된 잔디 시료의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일실시예에 따른 하나 이상의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다.

이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용 가능한 키트를 이용할 수도 있다. PCR은 PCR 반응에 필요한 당업계에 공지된 여러 성분을 포함하는 PCR 반응 혼합액을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 PCR 반응 혼합액에는 분석하고자 하는 잔디 시료에서 추출된 게놈 DNA와 본 발명에서 제공되는 프라이머 세트 이외에 적당량의 DNA 중합효소, dNTP, PCR 완충용액 및 물을 포함한다. 상기 PCR 완충용액은 트리스-HCl(Tris-HCl), MgCl₂, KCl 등을 포함한다.

본 발명에서 PCR 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 가장 바람직하게는, 6% 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5, Cy-3 또는 6-FAM을 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행 시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다

본 발명의 조성물은 잔디 품종을 판별하는 프라이머 세트 및 제초제 저항성 판별하는 프라이머 세트를 포함한다. 따라서 제초제 저항성 유전자 변형 잔디를 특이적으로 검출 및 들잔디(Zoysia japonica)와 금잔디(Zoysia matrella)를 특이적으로 검출하는 것이 가능하고, 특히 제초제 저항성 유전자 변형 잔디 및 이를 모본으로 하는 파생 품종에 대한 검정이 가능하므로 육종 모본 확인에 활용할 수 있다. 따라서 제초제 저항성 잔디를 정성적, 품종별로 검정할 수 있다.

도 1은 금잔디(ZM), JG21-MJ, 들잔디(ZJ) 및 JG21의 게놈 DNA를 주형으로 ZJM 정방향 프라이머(ZJM Forward primer, 서열번호1) 및 ZJM 역방향 프라이머(ZJM Reverse primer, 서열번호2)를 이용하여 PCR 수행한 결과이다.
도 2는 도 1에서 금잔디와 JG21-MJ에서 검출되는 약 1,465bp의 밴드를 클로닝하여 염기서열을 분석한 결과이다.
도 3은 도 1에서 들잔디와 JG21에서 검출되는 약 359bp의 밴드를 클로닝하여 염기서열을 분석한 결과이다.
도 4는 금잔디(ZM), JG21-MJ, 들잔디(ZJ) 및 JG21의 게놈 DNA를 주형으로 Ubipo 정“‡항 프라이머(서열번호5) 및 Bar 역방향 프라이머(서열번호6)를 이용하여 PCR 수행한 결과이다.
도 5는 도 4에서 JG21와 JG21-MJ에서 검출되는 약 507bp의 밴드를 클로닝하여 염기서열 분석한 결과이다.
도 6은 들잔디의 형질전환에 이용된 pGPTV-HB 플라스미드 벡터 지도이다. 구체적으로 A, 플라스미드 지도 및 B, 유전자의 위치와 방향성을 알기 쉽게 나타낸 선형지도이다.
도 7은 Southern blot 분석에서 전체적으로 빠진 유전자 없이 probing 한 유전자 확인 모식도이다. ①, bar DNA; ②, ubiquitin promoter(Pubi) DNA; ③, Arabidopsis rbcS terminator(TArbcS) DNA; ④, hygromycin phosphotransferase(hpt)와 nos promoter(Pnos) DNA; backbone 1, ori와 ParB를 포함하는 DNA; backbone 2, aadA를 포함하는 DNA. B, BamHI. E, EcoRI. H, HindIII. X, XhoI. LB, T-DNA의 left border. RB, T-DNA의 right border이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

1. 잔디 품종별 판별 및 검출용 프라이머의 제작

들잔디(Zoysia japonica)와 금잔디(Zoysia matrella)을 내재적 유전자에 특이적인 ZJM 정방향 프라이머(ZJM Forward primer, 서열번호1) 및 ZJM 역방향 프라이머(ZJM Reverse primer, 서열번호2)를 제조하였다. 상기 프라이머 쌍을 이용하며 PCR을 수행하면 들잔디는 359bp의 증폭산물이, 금잔디는 1,465bp의 증폭산물이 검출될 것으로 예상하였다.

2. ZJM 정방향 프라이머 및 ZZJM 역방향 프라이머를 이용한 잔디 품종 판별

일반잔디인 들잔디, 금잔디와 제초제 저항성 유전자 변형 잔디인 JG21(들잔디 모본의 제초제 저항성 유전자 변형 잔디) 및 JG21-MJ(JG21과 금잔디의 교잡종)에서 게놈 DNA를 분리하고, 상기 ZJM 정방향/역방향 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하여 잔디 품종을 판별하였다.

2.1. 식물의 게놈 DNA 분리

일반잔디(들잔디, 금잔디), 제초제 유전자가 형질전환된 잔디(JG21, JG21-MJ)에서 게놈 DNA를 분리하였다. 각 잔디들의 신선한 잎을 유발에 액체질소를 넣고 미세하게 마쇄한 다음, 식물체 분쇄분 1g을 15 ㎖ 튜브에 넣고 Qiagen DNeasy Plant Maxi Kit(Qiagen 68163)를 이용하여 게놈 DNA를 분리 정제하였다. 추출된 DNA는 NanoDrop Spectrohotometer ND-1000(NanoDrop Technologies Inc., USA)를 이용하여 A260/A280 nm값이 1.8 ~ 2.0 사이인 DNA액을 사용하였다. 또한 각 식물체 게놈 DNA는 20 ng 농도로 일정하게 희석하여 사용하였다.

2.2. PCR 분석

상기에서 분리한 각 잔디들의 게놈 DNA 20 ng을 주형으로 하여 PCR 반응을 실시하였다. 기본적인 PCR 반응은 한 시료 당 총 25 ㎕로 하여, 2.5 ㎕의 10×PCR buffer(Ampliqon, Herlev, Denmark) 2 ㎕의 dNTP(2.5 mM each, Ampliqon), 1.5 ㎕의 1.5 mM MgCl2(Ampliqon), 각각 10 μM의 정방향(forward)와 역방향(reverse) 프라이머, Taq DNA 폴리머라아제는 TEMPase Hot Start DNA 폴리머라아제(Ampliqon)를 1.25 unit 첨가하한 반응 조성액으로 하고, Dyad Peltier Thermal cycler(Bio-Rad, Hercules, USA) PCR 기기를 이용하여 수행하였다.

PCR 반응은 1단계(95℃ 5분), 2단계(95℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 30초) 35회 반복, 3단계 (72℃ 5분)의 조건으로 수행하였다. 각각의 실험은 실험군 및 타 비교군과 함께 NTC(non template control)를 고려하여 수행하였다. 상기 얻어진 증폭된 PCR 산물은 1.2% 아가로즈 젤로 전기 영동하여 UV로 반응 양상을 분석하였다.

2.3. 잔디 품종판별 분석

도 1을 참고하며, JG21와 들잔디의 게놈 DNA를 주형으로 한 PCR에서는 약 359bp 크기의 특이적인 PCR 산물이 나타났으며, 금잔디의 게놈 DNA를 주형으로 한 PCR에서는 약 1,465bp 크기의 특이적인 PCR 산물이 확인하였다. JG21-금잔디 교잡종인 JG21-MJ의 게놈 DNA를 주형으로 한 PCR에서는 359bp 크기와 1,465bp 크기의 두 개의 PCR 증폭 산물을 확인하였다.

즉, 상기 ZJM 정방향 프라이머(ZJM Forward primer, 서열번호1) 및 ZJM 역방향 프라이머(ZJM Reverse primer, 서열번호2)를 이용하여 금잔디 또는 들잔디 품종을 판별할 수 있음을 확인하였다.

2.4. PCR 산물의 염기서열 분석

pGEMT-easy vector 시스템(Promega)을 이용하여 금잔디와 JG21-MJ에서 검출되는 약 1,465bp의 밴드와 들잔디와 JG21에서 검출되는 약 359bp의 밴드를 클로닝하여 염기서열 분석을 수행하였다. 분석결과는 표 2와 같다.

유전자	염기서열
금잔디(ZM)와 JG21-MJ의 염기서열 (1,465bp) 서열번호3	gaaacgggtg gcttgagcac cttctcgagg gttgcatcca cgactggacc gacctccgtt 60 gcatcttcgt cgacaacttt caggggacct acacacgccc gcggaactct tgggatctga 120 agagctgcaa gcagcagcct ggtgaatcgc tccgcgacta catccttttc acgcaagtga 180 aacgagctgc ccacgtgagc gacgccgatg tcatcaacgt cttcacctgc gacacgacat 240 ctaaggcgct cgttcacaag ctggggtgta aaaagcctcg gacggcacgc gctcttctca 300 acatcacccc cacattcgcc actagggagg aggctgtcca agccaacttc gaccgggacc 360 ggggcaagga caaggagaag tccaagcccg actgcaaaac tgacaaccgc tctgaccggc 420 actcctatcg caggacgacs gatccggggg cggctcgagc agcaagaaat acaagaacca 480 gcggcaagat aatgagatca tgggcgtcac cgagcaacag cctcgacccc aagcaagaaa 540 gccgactgac cacaacaacc acttcgagaa gatgctcgac aaccctacca tcatccactc 600 gaccctttgt caagcacacc ctttagagac tgccacctga tgcggatgtt cttcaaaggt 660 aacttccgat ccgactcccg tcaacctccg catcctgacc cttctgtgaa ggaagccgag 720 ggcaacgccg acaatgcctt ctccgagccg gaggactgcc tgggtggcct atgagtcacg 780 acgccaccag aagcagacct ggcgaggggt caacatcgct gaccccgcca ttcatatcta 840 cctcaagtgg tcgaaagccc cgatcacctt tgacagatcc gaccatcctg actacatacc 900 ccagccgggg cgcctgcctc tggtgctcga tccgatcatc ggcaccacgc acctcactaa 960 ggtcttcatg gatggcggca gtgccctcaa catcttctac atcgacacct ttaaggccat 1020 gaagctctcg gtgttcggcc tccatccaag ccactcccca ttccacgagg tcattctcta 1080 gattagcgcg atgcccctag gttagattac cctcctggtc accttcggca accacgacaa 1140 cttcaggacc aagaaacgcc ccttcgaggt ggtttatttc gccagcacct accacgccgt 1200 cctcggtcaa ccctgctaca ccaagttcat ggctatcccc ggctacatct acctaaagct 1260 aaagatgcca agacccaagg gcatcatcac tgtggcgtcc cgcttcaagc atgcgctcgc 1320 ctgcgagcag gaaagctttg agctagacgt caccctcgca gggtcggccc agcttgaaga 1380 gatttgaaag accaaggact cggcctcgac cctcaattcc aatccttcaa cctctacgtc 1440 cttcgagcca gcgaacacca ctaga
들잔디(ZJ)와 JG21의 염기서열 (359bp) 서열번호4	gaaacgggtg gcttgagctt gccagtcgac gaagcgtgga tcgacgtagc cggacgatgg 60 cgcaggcgca accagaccca gtcgcccacc gcgaagctga gcgcccggtg atgcttgtcg 120 tagtggcgct tgtacaccgc ctgtgcctgt tccagccgat agcggacgtc ggcgaggaac 180 tcatcgcgtt cctccatggt cttggccacc gcggcgactc gcgtttcacc cggctcgtat 240 gagcggatgg acggaggatc tcggccatag acgatgcgga atggcgtgtc acggagcgcg 300 gtctggaacg cggtgttgta gacgtactcc gcccacggaa gccagcgaac accactaga

3. 제초제 저항성 유전자 변형 잔디 특이적 프라이머 제작

본 발명에서는 제초제 저항성 유전자 변형 여부를 확인하고자, 들잔디의 제초제 저항성 품종인 JG21과 이의 금잔디 교잡종인 JG21-MJ를 이용하였다. 들잔디 저항성 품종인 JG21는 들잔디에 pGPTV-HB 플라스미드(도 6)를 이용하여 형질도입 하여 제조되었다. 형질전환에 사용된 벡터는 아그로박테리움에 의존하는 바이너리 플라스미드 벡터 pGPTV-HB이다.

JG21의 도입유전자 및 좌우 주변 염기서열 좌측 주변염기서열(볼드체) 436 bp, 우측 주변염기서열(볼드체) 738 bp 및 그 외의 도입유전자 염기서열(4780 bp)
염기 서열 (5‘ to 3’)	유전자명
GTGGTTGACGACATCTATGGACCACTTAAGTTGTACTGCGATAACGAACCCGCAGTAACATATGCACACAACAATAAATCAAGTGGTGCTGCCAAGCACATTGACATAAAGTACTATGTTGTGAAAGATAAAGTTCGGGATCAAATCATAAGTCTTGAGCATATAAGCACCGCAAAGATGCTAGCGGATCCGCTTACTAAAGGCTTACCACCCAGAGTATTTATTGAACATGTTGCCGGCATGGGTTTAAGGGAAAGCCTGTGACTCCTGAACTAAAAGATGGCTCAAAATGTATAATAACTATTTTAGAACAGAAAAATGTATTGTAGCTGTTAAGTCTATCGGCGATTGACCGTGACGATGAGGCAGTTCTACGTATTAATCTGTAATGAAATGAGTGAAGTTAAAAGTAGTAAAGATAAAAGTAAAAAGTTGA	왼쪽 (좌측) 주변 염기서열 (436 bp)
TCCGGGCGTATATGCTCCGCATTGGTCTTGACCAACTCTATCAGAGCTTGGTTGACGGCAATTTCGATGATGCAGCTTGGGCGCAGGGTCGATGCGACGCAATCGTCCGATCCGGAGCCGGGACTGTCGGGCGTACACAAATCGCCCGCAGAAGCGCGGCCGTCTGGACCGATGGCTGTGTAGAAGTACTCGCCGATAGTGGAAACCGACGCCCCAGCACTCGTCCGAGGGCAAAGGAATAGAGTAG	truncated hpt ORF
ATGCCGACCGGGATCCCCTTTCTGGAATATTCAGCGTTGATTATTCTGGAACCCATTTCTATGTGGTCAATGCAAATTTAAGAAATTATTTGCCGACTTAAAAGTTGAGGAACTATTGTTTGAAAGTGAAAATGTTATTCCTATCAGTTTCTCTATAATTATAGTTATCATTTCATTTCATTTTTGCCCTTAGCTCTTTGAAATCTTATTTTTCGTTTAGCTCCTTTAAACAACATTGTGGCTCCTTTAAATTATCCTCATAATTCTTGCTTTTGACTCCCTAGACTAACCAATAAACTCTAATAAAAAAAGAAAAACTTGCTACATTGTTTTAAGAAATTTTGCACATGAAAGCAATCAATCAAACCTCGATATTTAAAGAAAAGTTTATGTAAGGGAGTGTAACCATTTTTCAGATGACATAGCCATTGGAGATTTGGAAAAGGTAGTATATACAGAAAATTCAAATGCATCTTTTAAAATTATAAACATAAAACATGTATTCCAAACCCCTAAGTGGGATATTAAGTCAAGAAATAGCATTACATAAAGCAAGGATCGACAAAGACTGAAATTTGTCAAGCATGAAGTTACTAAATTTTGGAAATTTTGTTTACGTTAAATTTGATCATTGGTTATGCATTAAAAGCTGAAACAGTTATTTAGAAGGAAAAGTAGTTAACGTTCCCAAAAAGTTCTAAATAAAACTAGATTCCAAATGATAATGAAAACGTCGCATCTACTATATGTTTG	Arabidopsis rbcS (ArbcS) terminator
AAGCTTGCATGCCTGCAGTGCAGCGTGACCCGGTCGTGCCCCTCTCTAGAGATAATGAGCATTGCATGTCTAAGTTATAAAAAATTACCACATATTTTTTTTGTCACACTTGTTTGAAGTGCAGTTTATCTATCTTTATACATATATTTAAACTTTACTCTACGAATAATATAATCTATAGTACTACAATAATATCAGTGTTTTAGAGAATCATATAAATGAACAGTTAGACATGGTCTAAAGGACAATTGAGTATTTTGACAACAGGACTCTACAGTTTTATCTTTTTAGTGTGCATGTGTTCTCCTTTTTTTTTTTGCAAATAGCTTCACCTATATAATACTTCATCCATTTTATTAGTACATCCATTTAGGGTTTAGGGTTAATGGTTTTTATAGACTAATTTTTTTAGTACATCTATTTTATTCTATTTTAGCCTCTAAATTAAGAAAACTAAAACTCTATTTTAGTTTTTTTATTTAATAATTTAGATATAAAATAGAATAAAATAAAGTGACTAAAAATTAAACAAATACCCTTTAAGAAATTAAAAAAACTAAGGAAACATTTTTCTTGTTTCGAGTAGATAATGCCAGCCTGTTAAACGCCGTCGACGAGTCTAACGGACACCAACCAGCGAACCAGCAGCGTCGCGTCGGGCCAAGCGAAGCAGACGGCACGGCATCTCTGTCGCTGCCTCTGGACCCCTCTCGAGAGTTCCGCTCCACCGTTGGACTTGCTCCGCTGTCGGCATCCAGAAATTGCGTGGCGGAGCGGCAGACGTGAGCCGGCACGGCAGGCGGCCTCCTCCTCCTCTCACGGCACGGCAGCTACGGGGGATTCCTTTCCCACCGCTCCTTCGCTTTCCCTTCCTCGCCCGCCGTAATAAATAGACACCCCCTCCACACCCTCTTTCCCCAACCTCGTGTTGTTCGGAGCGCACACACACACAACCAGATCTCCCCCAAATCCACCCGTCGGCACCTCCGCTTCAAGGTACGCCGCTCGTCCTCCCCCCCCCCCCCTCTCTACCTTCTCTAGATCGGCGTTCCGGTCCATGGTTAGGGCCCGGTAGTTCTACTTCTGTTCATGTTTGTGTTAGATCCGTGTTTGTGTTAGATCCGTGCTGCTAGCGTTCGTACACGGATGCGACCTGTACGTCAGACACGTTCTGATTGCTAACTTGCCAGTGTTTCTCTTTGGGGAATCCTGGGATGGCTCTAGCCGTTCCGCAGACGGGATCGATTTCATGATTTTTTTTGTTTCGTTGCATAGGGTTTGGTTTGCCCTTTTCCTTTATTTCAATATATGCCGTGCACTTGTTTGTCGGGTCATCTTTTCATGCTTTTTTTTGTCTTGGTTGTGATGATGTGGTCTGGTTGGGCGGTCGTTCTAGATCGGAGTAGAATTCTGTTTCAAACTACCTGGTGGATTTATTAATTTTGGATCTGTATGTGTGTGCCATACATATTCATAGTTACGAATTGAAGATGATGGATGGAAATATCGATCTAGGATAGGTATACATGTTGATGCGGGTTTTACTGATGCATATACAGAGATGCTTTTTGTTCGCTTGGTTGTGATGATGTGGTGTGGTTGGGCGGTCGTTCATTCGTTCTAGATCGGAGTAGAATACTGTTTCAAACTACCTGGTGTATTTATTAATTTTGGAACTGTATGTGTGTGTCATACATCTTCATAGTTACGAGTTTAAGATGGATGGAAATATCGATCTAGGATAGGTATACATGTTGATGTGGGTTTTACTGATGCATATACATGATGGCATATGCAGCATCTATTCATATGCTCTAACCTTGAGTACCTATCTATTATAATAAACAAGTATGTTTTATAATTATTTTGATCTTGATATACTTGGATGATGGCATATGCAGCAGCTATATGTGGATTTTTTTAGCCCTGCCTTCATACGCTATTTATTTGCTTGGTACTGTTTCTTTTGTCGATGCTCACCCTGTTGTTTGGTGTTACTTCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCC	Maize Ubiquitin promoter
ATGAGCCCAGAACGACGCCCGGCCGACATCCGCCGTGCCACCGAGGCGGACATGCCGGCGGTCTGCACCATCGTCAACCACTACATCGAGACAAGCACGGTCAACTTCCGTACCGAGCCGCAGGAACCGCAGGAGTGGACGGACGACCTCGTCCGTCTGCGGGAGCGCTATCCCTGGCTCGTCGCCGAGGTGGACGGCGAGGTCGCCGGCATCGCCTACGCGGGCCCCTGGAAGGCACGCAACGCCTACGACTGGACGGCCGAGTCGACCGTGTACGTCTCCCCCCGCCACCAGCGGACGGGACTGGGCTCCACGCTCTACACCCACCTGCTGAAGTCCCTGGAGGCACAGGGCTTCAAGAGCGTGGTCGCTGTCATCGGGCTGCCCAACGACCCGAGCGTGCGCATGCACGAGGCGCTCGGATATGCCCCCCGCGGCATGCTGCGGGCGGCCGGCTTCAAGCACGGGAACTGGCATGACGTGGGTTTCTGGCAGCTGGACTTCAGCCTGCCGGTACCGCCCCGTCCGGTCCTGCCCGTCACCGAGATCTGA	bar ORF
ACGGAGTGCGCGTGGCATCGCCCGAGTTGGAGCTGGTACGGGAACTCATCGAACTCAACTGGCATACCCGCAATGGTGAGGTGGAACCGCGGCGGATCGCGTACGACCGTGCCCAGGAGGGGGTACCGAGCTCTCCCCTTTCTGGAATATTCAGCGTTGATTATTCTGGAACCCATTTCTATGTGGTCAATGCAAATTTAAGAAATTATTTGCCGACTTAAAAGTTGAGGAACTATTGTTTGAAAGTGAAAATGTTATTCCTATCAGTTTCTCTATAATTATAGTTATCATTTCATTTCATTTTTGCCCTTAGCTCTTTGAAATCTTATTTTTCGTTTAGCTCCTTTAAACAACATTGTGGCTCCTTTAAATTATCCTCATAATTCTTGCTTTTGACTCCCTAGACTAACCAATAAACTCTAATAAAAAAAGAAAAACTTGCTACATTGTTTTAAGAAATTTTGCACATGAAAGCAATCAATCAAACCTCGATATTTAAAGAAAAGTTTATGTAAGGGAGTGTAACCATTTTTCAGATGACATAGCCATTGGAGATTTGGAAAAGGTAGTATATACAGAAAATTCAAATGCATCTTTTAAAATTATAAACATAAAACATGTATTCCAAACCCCTAAGTGGGATATTAAGTCAAGAAATAGCATTACATAAAGCAAGGATCGACAAAGACTGAAATTTGTCAAGCATGAAGTTACTAAATTTTGGAAATTTTGTTTACGTTAAATTTGATCATTGGTTATGCATTAAAAGCTGAAACAGTTAT	Arabidopsis rbcS (ArbcS) terminator
TTAGAAGGAAAAGTAGTTAACGTTCCCAAAAAGTTCTAAATAAAACTAGATTCCAAATGATAATGAAAACGTCGCATCTACTATATGTTTGGAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGAGCTTGCATGCCGGTCGGCTGAGTGGCTCCTTCAACGTTGCGGTTCTGTCAGTTCCAAACGTAAAACGGCTTGTCCCGCGTCATCGGCGGGGGTCATAACGTGACTCCCTTAATTCTCCGCTCATGATCAGATTGTCGTTTCCCGCCTTCAGTTTAAACTATCAGTGTTT	vector DNA
AAAGCGTCCTTTGTGTTGGATCGATGGGACGAGGGCGACAGCAGAATGCAGTGACCACCACGTGCCGGTCTCTTTCTCTCTTCCGCGCGGCGCCGCAACCCCCGGACGCTTCCCTTCCTTATCCCGTTACGGCCCGGTGACCACAGAACGGGATCACCCGTCCGCGGCATGCGACGATGATGCCGTGGATAGGGAGACACATCACACACAGCGCCGAGGCCCGCAGTCGGATGCCATCGAGTAGGAGGCGTAAAGGCCCTAAAGGCTGAAGGGCCCCCCCCATGCATCACCGGAGACGCAGGCCTGTACCAAGATACTAGTAGAATAGACGATGGTCCAGAGAAGCACGTGCGGCCCATCTTGCATCGCAACTTTGCGGGCCACAATGAACGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGGCCTGCAGCTTTCTGAGCTTTCCGGTCATCTGCACCACCTCTTTCTGCGGCTGCTTTATTTTTATTGTTGTGGTATAAACTTTCAAAAGAGATTTTTTTTTCTTTTCGATTCTACCACTAGGTGCTTCATCAGAGCCGCATGGAGGCGAAGCTAGCAGTAGGATGATTACATTACACACGGAGCAAGAGTCATGGTGGCGTCTATACGGTGGAACTGAAATTTCGATTTTTCCTTGATGCCATGGCGCTCGGGCGTGTCCACCTAGCTTCGCCCTGGTCCCTACGTGACCGTGACGAGTGGCTCAGCTCAGTCAAACCGATCTT	오른쪽 (우측) 주변 염기서열 (738 bp)

Left border(LB)와 right border(RB)를 포함한 T-DNA 영역 5,954 bp와 T-DNA 바깥 backbone 영역 8,045 bp를 합한 전체 크기는 13,999 bp이다. Southern blot 분석을 위한 probe는 T-DNA와 backbone을 포함한 벡터 내의 전체 유전자를 커버할 수 있도록 설계하여 유전자 중심으로 제작하였다(도 7).

상기의 분석결과를 바탕으로 하여 제초제 저항성 유전자 변형 잔디를 판별할 수 있는 Ubipo 정방향 프라이머(서열번호5)와 Bar 역방향 프라이머(서열번호6)를 제조하였다.

4. 제초제 저항성 유전자 변형 잔디에 대한 특이성 확인

상기 Ubipo 정방향 프라이머와 Bar 역방향 프라이머를 이용하여 들잔디, 금잔디, JG21, JG21-MJ의 유전자의 PCR 분석을 수행하고, Ubipo 정방향 프라이머와 Bar 역방향 프라이머의 유전자 변형 잔디 품종 특이성을 확인하였다. 게놈 유전자의 분리 및 PCR 분석은 전술한 바와 동일한 방법으로 수행하였다.

4.1. Ubipo 정방향 프라이머와 Bar 역방향 프라이머의 PCR 분석

도 4의 PCR 결과, JG21와 JG21-MJ의 게놈 DNA를 주형으로한 PCR에서는 약 507bp 크기의 특이적인 PCR 산물이 나타났으며, 금잔디와 들잔디의 게놈 DNA를 주형으로 한 PCR에서는 PCR 증폭산물을 확인할 수 없었다. 즉, Ubipo 정방향 프라이머와 Bar 역방향 프라이머를 제초제 저항성 유전자 변형 잔디를 판별 유전자분석에 사용할 수 있음을 확인하였다.

4.2. PCR 산물의 염기서열 분석

pGEMT-easy vector 시스템(Promega)을 이용하여 JG21와 JG21-MJ에서 검출되는 밴드 약 507bp(서열번호7)를 클로닝하여 염기서열 분석을 수행하였다. 염기서열 분석 결과는 다음과 같다.

유전자

염기서열

JG21와 JG21-MJ의염기서열 (507bp) 서열번호7

atccatgagc ccagaacgac gcccggccga catccgccgt gccaccgagg cggacatgcc 60 ggcggtctgc accatcgtca accactacat cgagacaagc acggtcaact tccgtaccga 120 gccgcaggaa ccgcaggagt ggacggacga cctcgtccgt ctgcgggagc gctatccctg 180 gctcgtcgcc gaggtggacg gcgaggtcgc cggcatcgcc tacgcgggcc cctggaaggc 240 acgcaacgcc tacgactgga cggccgagtc gaccgtgtac gtctcccccc gccaccagcg 300 gacgggactg ggctccacgc tctacaccca cctgctgaag tccctggagg cacagggctt 360 caagagcgtg gtcgctgtca tcgggctgcc caacgacccg agcgtgcgca tgcacgaggc 420 gctcggatat gccccccgcg gcatgctgcg ggcggccggc ttcaagcacg ggaactggca 480 tgacgtgggt ttctggcagc tggactt

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Composition for herbicide-regiftant gene modified grass dertermination and grass-breed determination and uses thereof <130> DP20190323 <160> 7 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ZJM Forward primer <400> 1 gaaacgggtg gcttgagc 18 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ZJM Reverse primer <400> 2 tctagtggtg ttcgctggct 20 <210> 3 <211> 1465 <212> DNA <213> Zoysia matrella <400> 3 gaaacgggtg gcttgagcac cttctcgagg gttgcatcca cgactggacc gacctccgtt 60 gcatcttcgt cgacaacttt caggggacct acacacgccc gcggaactct tgggatctga 120 agagctgcaa gcagcagcct ggtgaatcgc tccgcgacta catccttttc acgcaagtga 180 aacgagctgc ccacgtgagc gacgccgatg tcatcaacgt cttcacctgc gacacgacat 240 ctaaggcgct cgttcacaag ctggggtgta aaaagcctcg gacggcacgc gctcttctca 300 acatcacccc cacattcgcc actagggagg aggctgtcca agccaacttc gaccgggacc 360 ggggcaagga caaggagaag tccaagcccg actgcaaaac tgacaaccgc tctgaccggc 420 actcctatcg caggacgacs gatccggggg cggctcgagc agcaagaaat acaagaacca 480 gcggcaagat aatgagatca tgggcgtcac cgagcaacag cctcgacccc aagcaagaaa 540 gccgactgac cacaacaacc acttcgagaa gatgctcgac aaccctacca tcatccactc 600 gaccctttgt caagcacacc ctttagagac tgccacctga tgcggatgtt cttcaaaggt 660 aacttccgat ccgactcccg tcaacctccg catcctgacc cttctgtgaa ggaagccgag 720 ggcaacgccg acaatgcctt ctccgagccg gaggactgcc tgggtggcct atgagtcacg 780 acgccaccag aagcagacct ggcgaggggt caacatcgct gaccccgcca ttcatatcta 840 cctcaagtgg tcgaaagccc cgatcacctt tgacagatcc gaccatcctg actacatacc 900 ccagccgggg cgcctgcctc tggtgctcga tccgatcatc ggcaccacgc acctcactaa 960 ggtcttcatg gatggcggca gtgccctcaa catcttctac atcgacacct ttaaggccat 1020 gaagctctcg gtgttcggcc tccatccaag ccactcccca ttccacgagg tcattctcta 1080 gattagcgcg atgcccctag gttagattac cctcctggtc accttcggca accacgacaa 1140 cttcaggacc aagaaacgcc ccttcgaggt ggtttatttc gccagcacct accacgccgt 1200 cctcggtcaa ccctgctaca ccaagttcat ggctatcccc ggctacatct acctaaagct 1260 aaagatgcca agacccaagg gcatcatcac tgtggcgtcc cgcttcaagc atgcgctcgc 1320 ctgcgagcag gaaagctttg agctagacgt caccctcgca gggtcggccc agcttgaaga 1380 gatttgaaag accaaggact cggcctcgac cctcaattcc aatccttcaa cctctacgtc 1440 cttcgagcca gcgaacacca ctaga 1465 <210> 4 <211> 359 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Zoysia japonica <400> 4 gaaacgggtg gcttgagctt gccagtcgac gaagcgtgga tcgacgtagc cggacgatgg 60 cgcaggcgca accagaccca gtcgcccacc gcgaagctga gcgcccggtg atgcttgtcg 120 tagtggcgct tgtacaccgc ctgtgcctgt tccagccgat agcggacgtc ggcgaggaac 180 tcatcgcgtt cctccatggt cttggccacc gcggcgactc gcgtttcacc cggctcgtat 240 gagcggatgg acggaggatc tcggccatag acgatgcgga atggcgtgtc acggagcgcg 300 gtctggaacg cggtgttgta gacgtactcc gcccacggaa gccagcgaac accactaga 359 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ubipo Forward primer <400> 5 atccatgagc ccagaacgac 20 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bar reverse primer <400> 6 aagtccagct gccagaaacc cac 23 <210> 7 <211> 507 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JG21 or JG21-MJ gene <400> 7 atccatgagc ccagaacgac gcccggccga catccgccgt gccaccgagg cggacatgcc 60 ggcggtctgc accatcgtca accactacat cgagacaagc acggtcaact tccgtaccga 120 gccgcaggaa ccgcaggagt ggacggacga cctcgtccgt ctgcgggagc gctatccctg 180 gctcgtcgcc gaggtggacg gcgaggtcgc cggcatcgcc tacgcgggcc cctggaaggc 240 acgcaacgcc tacgactgga cggccgagtc gaccgtgtac gtctcccccc gccaccagcg 300 gacgggactg ggctccacgc tctacaccca cctgctgaag tccctggagg cacagggctt 360 caagagcgtg gtcgctgtca tcgggctgcc caacgacccg agcgtgcgca tgcacgaggc 420 gctcggatat gccccccgcg gcatgctgcg ggcggccggc ttcaagcacg ggaactggca 480 tgacgtgggt ttctggcagc tggactt 507

Claims (8)

1. 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 들잔디 및 금잔디 판별용 프라이머 쌍; 및
   서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 제초제 저항성 유전자 변형잔디 판별용 프라이머 쌍;을
   포함하는 조성물.
2. 삭제
3. 삭제
4. 제 1항에서, 상기 조성물은 들잔디 및 금잔디 판별과 동시에 제초제 저항성 유전자 변형잔디를 판별하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
5. 제1항의 조성물을 포함하는 들잔디 및 금잔디 판별용 키트.
6. 제 5항에서, 상기 키트는 동시에 제초제 저항성 유전자 변형 잔디를 판별하는 것을 특징으로 하는, 키트.
7. 잔디 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
   상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍, 및 서열번호5 및 6의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍을 이용하여, 증폭반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
   상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 잔디 품종의 판별방법으로서,
   상기 잔디 품종의 판별은 들잔디 및 금잔디 판별과 동시에 제초제 저항성 유전자 변형잔디를 판별하는 것을 특징으로 하는, 판별방법.
8. 삭제

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