KR101760056B1

KR101760056B1 - 평강옥 품종 판별용 프라이머 세트 및 판별방법

Info

Publication number: KR101760056B1
Application number: KR1020150157595A
Authority: KR
Inventors: 이진석; 김상곤; 손범영; 서민정; 김정태; 배환희; 백성범; 박장환; 이점호
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2015-11-10
Filing date: 2015-11-10
Publication date: 2017-07-24
Also published as: KR20170055071A

Abstract

본 발명은 평강옥 품종 판별용 프라이머 세트 및 판별방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 평강옥의 효과적인 품종 판별, 평강옥 품종보호 및 F1 종자의 순도를 효과적으로 검정할 수 있는 평강옥 품종 판별용 프라이머 세트와 상기 평강옥 품종 판별용 프라이머 세트를 이용하여 평강옥 품종 판별에 유용한 판별방법에 관한 것이다.

Description

평강옥 품종 판별용 프라이머 세트 및 판별방법{Primer set for Pyeonggangok identification and method for identification}

본 발명은 평강옥 품종 판별용 프라이머 세트 및 판별방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 평강옥의 효과적인 품종 판별, 평강옥의 품종보호 및 F1 종자의 순도를 효과적으로 검정할 수 있는 평강옥 품종 판별용 프라이머 세트와 상기 평강옥 품종 판별용 프라이머 세트를 이용하여 평강옥 판별에 유용한 판별방법에 관한 것이다.

옥수수(Zea mays L.)는 세계적으로 재배되고 있는 중요 3대 작물 중의 하나로 세계적으로 중요한 작물이지만 우리나라에서 소비되는 사료용 옥수수는 외국에서 수입에 의존하고 있는 상황이다. 사료용 옥수수는 단위면적당 건물생산성이 높고 가소화영양소총량이 높기 때문에 경지 면적이 좁은 우리나라에서는 어느 작물보다 수량과 품질이 우수한 옥수수를 재배하는 것이 중요하다.

최근 옥수수 국제곡물가격의 상승에 따른 배합사료 및 조사료 수입 가격이 급등하여 축산농가의 어려움이 가중되고 있어 사료비용 절감을 위해 옥수수 등 사료작물 재배가 늘어나는 추세이다. 국내에서 재배되는 사일리지용 옥수수는 P3394 등 수입종이 70% 이상이며, 광평옥 등 국내 육성 품종은 2010년 총종자공급량 265톤 중 78톤이 보급되어 29% 정도 점유하고 있다. 그 동안 국산 사료용 옥수수는 수량이 적고 품질이 좋지 않다는 인식이 축산농가에 팽배해 있었다. 하지만 최근에는 국내 육성 품종인 광평옥, 강다옥 등은 기존 수입 사일리지용 옥수수에 비해 쓰러짐에 강하고 건물수량이 많을 뿐만 아니라 사료가치도 높다는 것이 밝혀지면서 국내 육성 품종의 재배면적이 증가하고 있다. 그러나 사료용 옥수수로 개발된 신품종 평강옥을 쉽고 빠르게 판별할 수 있는 방법이 개발되지 않아, F1 종자의 순도측정하고 품종을 보존 및 개량하는데 있어서 어려움이 있어왔다.

한편, 오늘날 DNA에 기초한 분자마커 기술은 작물의 유전-육종연구에서 유전적 다양성과 계통유연관계 분석 그리고 식물유전자원의 보존과 관리 등에 유용한 정보를 제공하고 있다. 그 중에서 특히 SNP(Single Nucleotide Polymorphism) 분석법은 옥수수의 유전적 다양성을 분석하는데 널리 이용되고 있다. SNP에 의한 분자마커는 옥수수의 육종연구에서 작물의 품종보호에 효율적으로 이용될 수 있으며 많은 연구자들이 옥수수 유전적 다양성을 평가와 판별을 위해 이용하고자 하였다.

종래 기술들 중 등록특허 10-0723069(공개일자: 2006년05월18일)에는 유전자 변형 농산물에 대한 정성 및 정량 분석용 특이 프라이머, 프로브 및 표준 플라스미드와 이를 이용한 검정 방법에 관한 것으로서, 외래에서 도입된 목적 유전자 전체 또는 일부와 다른 발현조절부위의 DNA 영역의 전부 또는 일부를 포함한 영역을 증폭하도록 하는 프라이머(Primer), 프로브(Probe) 및 표준 플라스미드(Standard plasmid)를 사용함으로써 다양한 계통의 재조합 유전자를 판별하여 검출할 수 있는 PCR 프라이머 세트에 관하여 기재하고 있다.

종래에는 개발된 신품종 평강옥을 쉽고 빠르게 판별할 수 있는 방법이 개발되지 않아, F1 종자의 순도측정하고 품종을 보존 및 개량하는데 있어서 어려움이 있어왔다.

상기 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 평강옥 품종의 효과적인 품종 판별, 평강옥 품종보호 및 F1 종자의 순도를 효과적으로 검정할 수 있는 평강옥 품종 판별용 프라이머 세트와 상기 평강옥 판별용 프라이머 세트를 이용하여 평강옥 판별에 유용한 판별방법을 제공하려는 목적이 있다.

상기의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어지는 IBM 440 프라이머 세트; 및 서열번호 3 및 서열번호 4로 이루어지는 IBM 1269 프라이머 세트를 포함하는 평강옥 판별용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 IBM 440 프라이머 세트는 옥수수 B73 표준 게놈(genome)의 2번 염색체의 염기서열과 상보적일 수 있으며, IBM 1269 프라이머 세트는 옥수수 B73 표준 게놈(genome)의 6번 염색체의 염기서열과 상보적인 것일 수 있다.

본 발명은 또한, (a) 옥수수에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; (b) 상기 (a)단계에서 분리된 게놈 DNA를 주형으로 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어지는 IBM 440 프라이머 세트; 및 서열번호 3 및 서열번호 4로 이루어지는 IBM 1269 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 (b)단계에서 증폭된 산물을 확인하는 단계;를 포함하는 평강옥 품종 판별 방법을 포함한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 (c) 단계는 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어지는 IBM 440 프라이머 세트를 이용하여 증폭된 산물 중 크기가 288bp인 산물이 검출되지 않으면서; 동시에 서열번호 3 및 서열번호 4로 이루어지는 IBM 1269 프라이머 세트를 이용하여 증폭된 산물 중 크기가 228bp인 산물이 검출되지 않으면 평강옥 품종인 것으로 판별하는 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 증폭 반응은 40 내지 66 ℃의 온도로 어닐링(annealing)하는 공정을 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 IBM 440 프라이머 세트는 옥수수 B73 표준 게놈(genome)의 2번 염색체의 염기서열과 상보적이고, IBM 1269 프라이머 세트는 옥수수 B73 표준 게놈(genome)의 6번 염색체의 염기서열과 상보적인 것일 수 있다.

이하, 본 발명의 용어를 설명한다.

본 발명의 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 이때, PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

또한, 본 발명의 용어 "뉴클레오타이드"는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이며, 다르게 특별하게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오타이드의 유사체를 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

본 발명은 평강옥의 효과적인 품종 판별, 평강옥 품종보호 및 F1 종자의 순도를 효과적으로 검정할 수 있는 평강옥 품종 판별용 프라이머 세트와 상기 평강옥 품종 판별용 프라이머 세트를 이용하여 평강옥 품종 판별에 유용한 판별방법을 제공하는 효과가 있다.

도 1은 실시예 1에서 3'말단 불일치 프라이머 제작 모식도이다.
도 2는 실시예 1에서 특이적 반응 프라이머를 탐색한 결과이다.
도 3은 선발한 프라이머를 통한 품종과 그의 모·부본간의 일치도를 검정한 결과이다.
도 4는 16개의 프라이머 조합 중 비특이적 반응을 나타내지 않고, 교배친과 품종간 증폭반응이 일치하는 평강옥 품종 판별용 마커를 선발하기 위한 전기영동 사진이다.
도 5는 사료용 옥수수 품종 50 품종을 나타낸 품종 계통수이다.
도 6은 사료용 옥수수 품종 50 품종에 대하여, 평강옥 품종을 판별할 수 있는 프라이머 IBM 440과 IBM 1269를 이용하여 전기영동을 실시한 사진이다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

상술한 바와 같이 사료용 옥수수로 개발된 신품종 평강옥을 쉽고 빠르게 판별할 수 있는 방법이 개발되지 않아, F1 종자의 순도측정하고 품종을 보존 및 개량하는데 있어서 어려움이 있어왔다.

이에 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어지는 IBM 440 프라이머 세트; 및 서열번호 3 및 서열번호 4로 이루어지는 IBM 1269 프라이머 세트를 포함하는 평강옥 품종 판별용 프라이머 세트를 제공함으로써 상술한 문제의 해결을 모색하였다.

이를 통해, 평강옥의 효과적인 품종 판별, 평강옥의 품종보호 및 F1 종자의 순도를 효과적으로 검정할 수 있는 평강옥 품종 판별용 프라이머 세트와 상기 평강옥 품종 판별용 프라이머 세트를 이용하여 평강옥 품종 판별에 유용한 판별방법을 제공하는 효과가 있다.

상기 뉴클레오타이드는 옥수수 B73 표준 게놈(genome)의 일부 또는 전체와 상보적이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 IBM 440 프라이머 세트는 옥수수 B73 표준 게놈(genome)의 2번 염색체의 염기서열과 상보적이고, IBM 1269 프라이머 세트는 옥수수 B73 표준 게놈(genome)의 6번 염색체의 염기서열과 상보적일 수 있다.

상기 옥수수 B73 표준 게놈은 2011년 Ganal 등이 발표한(Ganal et al., 2011. PloS ONE 6: e28334) 것으로서, MaizeGDB website(http://www.maizegdb.org/sequence.php)에 기재되어 있는 것일 수 있다.

상기 "상보"는 뉴클레오타이드와 염색체 전체 또는 일부가 특이적으로 결합하는 것을 의미한다.

상기 "옥수수 B73 표준 게놈"은 다형성 부위를 포함하는 다형성 서열(polymorphic sequence)이다. 다형성 서열이란 폴리뉴클레오티드 서열 중에 SNP를 포함하는 다형성 부위(polymorphic site)를 포함하는 서열을 의미한다. 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 DNA 또는 RNA가 될 수 있다.

상기 프라이머는 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어지는 IBM 440 프라이머 세트; 및 서열번호 3 및 서열번호 4로 이루어지는 IBM 1269 프라이머 세트로 표시되는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 적절한 버퍼 중의 적절한 조건(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드가 될 수 있는데, 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다.

상기 프라이머 서열은 상기 SNP 마커와 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 상기 옥수수 B73 표준 게놈과 혼성화 할 정도로 충분히 상보적이어야 한다.

상기 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

또한, 본 발명은 (a) 옥수수에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; (b) 상기 (a)단계에서 분리된 게놈 DNA를 주형으로 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어지는 IBM 440 프라이머 세트; 및 서열번호 3 및 서열번호 4로 이루어지는 IBM 1269 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 (b)단계에서 증폭된 산물을 확인하는 단계; 를 포함하는 평강옥 품종 판별 방법을 제공한다.

먼저, 옥수수에서 게놈 DNA를 분리한다.

상기 옥수수에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수 있고, wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수 있으며, Dellaporta 등(Dellaporta et al., 1983. Plant Mol. Biol. Rep. 1: 19-211983)의 방법을 이용할 수 있다.

또한, 상기 옥수수는 옥수수 식물체 중 일부 또는 전부를 이용하는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 옥수수의 뿌리, 줄기, 잎 및 과실로 이루어진 군 중 1종 이상의 부분을 이용할 수 있다.

다음, 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어지는 IBM 440 프라이머 세트; 및 서열번호 3 및 서열번호 4로 이루어지는 IBM 1269 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭한다.

상기 표적 핵산을 증폭하는 방법은 통상적으로 핵산 서열 증폭에 사용하는 방법이라면 특별히 제한하지 않으며, 예를 들면 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 방법을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 PCR을 수행할 수 있다.

상기 PCR은 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용 가능한 키트를 이용할 수도 있다.

또한, 상기 증폭 반응은 통상적으로 핵산 서열 증폭에 사용하는 조건이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 40 ~ 66 ℃의 온도로 어닐링(annealing) 하는 것을 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 43 ~ 63 ℃의 온도로 어닐링(annealing) 하는 것을 포함할 수 있다.

어닐링 온도는 사용하는 프라이머 세트 특이적으로 결정할 수 있으며, 이로 인해 분리된 게놈 DNA의 표적 서열 증폭 효과에 영향을 미칠 수 있다.

상기 증폭한 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지할 수 있다.

상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지할 수 있다.

또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지할 수 있다.

상기 뉴클레오타이드는 옥수수 B73 표준 게놈(genome)의 일부 또는 전체와 상보적이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 상기 IBM 440 프라이머 세트는 옥수수 B73 표준 게놈(genome)의 2번 염색체의 염기서열과 상보적이고, IBM 1269 프라이머 세트는 옥수수 B73 표준 게놈(genome)의 6번 염색체의 염기서열과 상보적일 수 있다.

상기 프라이머 세트는 서열번호 1 내지 4로 이루어진 군 중 2종 이상의 뉴클레오타이드로 표시되는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 적절한 버퍼 중의 적절한 조건(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드가 될 수 있는데, 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다.

상기 프라이머 세트는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

다음으로, 상기 증폭 산물을 검출한다.

상기 검출은 통상적으로 증폭한 표적 서열을 포함하는 증폭 산물을 검출하는데 사용하는 방법이라면 특별히 제한하지 않으며, 예를 들면 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지하며, 이렇게 표지한 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.

나아가, 상기 검출은 증폭한 표적 서열을 포함하는 증폭 산물을 검출하는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어지는 IBM 440 프라이머 세트를 이용하여 증폭된 산물 중 크기가 288bp인 산물이 검출되지 않으면서; 동시에 서열번호 3 및 서열번호 4로 이루어지는 IBM 1269 프라이머 세트를 이용하여 증폭된 산물 중 크기가 228bp인 산물이 검출되지 않으면 평강옥 품종인 것으로 판별하는 것일 수 있다.

상기 "증폭 산물의 크기"는 표적 서열의 위치 및 크기에 따라 상이하며, 증폭에 사용한 프라이머 세트에 따라서도 상이할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

평강옥 품종 준비

하기 실시예의 평강옥과 그의 모본과 부본은 농촌진흥청 국립식량과학원에서 유지하고 있는 종자를 사용하였고 2015년에 농촌진흥청 국립식량과학원 밭작물시험연구포장에서 재배한 후 잎을 채취하여 사용하였다.

2-1: DNA 추출

옥수수 게놈(Genomic) DNA는 Dellaporta 등(Dellaporta et al., 1983. Plant Mol. Biol. Rep. 1: 19-211983)의 방법을 약간 수정하여 준비예 1에서 수득한 평강옥 옥수수의 어린잎으로부터 추출하였다.

구체적으로, 평강옥의 어린잎 조직을 0.1g 잘라내어 유발 액체질소에 첨가하고 유봉으로 완전히 분쇄한 후 2.0 ㎖ 튜브에 담았다. 이후 65℃ 수조에 넣어 준비한 추출 버퍼(1M Tris-HCl pH 8.0, 0.5M EDTA, 5M NaCl, 20% SDS)에 0.16g의 소듐 비설페이트를 넣은 후 튜브에 소듐 비설페이트를 포함하는 추출 버퍼 660 ㎕를 넣고 탭핑(tapping)하였다. 이후 튜브에 다시 660 ㎕의 페놀:클로로포름:이소아밀알콜(25:24:1, v/v/v)을 첨가하고 탭핑한 후 65℃ 수조에서 15분간 인큐베이션하고, 그 후 바로 13,000 rpm에서 20분간 원심분리한 후 상층액을 새 튜브에 옮겼다.

이후 상층액이 클로로포름:이소아밀알콜(24:1 = v:v) 용액을 660㎕을 첨가한 후 탭핑하고 다시 14,400 rpm에서 20분간 원심분리하였다. 이후 상층액을 새 튜브에 옮기고, 95% 에탄올 660㎕와 3M 소듐아세테이트 66㎕를 첨가한 후 -20 ℃에서 2 시간 동안 인큐베이팅하고 14,400 rpm에서 20분간 원심분리 하였다.

이후 침전된 펠렛이 떨어지지 않게 모든 용액을 버린 후 70% 에탄올 660㎕를 넣고 가볍게 탭핑한 후, 10,000 rpm으로 원심분리하고 에탄올을 버린 후 공기 중에 건조하였다. 그 후 30㎕의 증류수를 첨가하여 녹이고, 리보누클레아제1(Ribonuclease; Rnase)(Thermo Scientific사의 제품명: RNase I)을 1㎕ 첨가하여 RNA를 완전히 제거하여 옥수수 DNA를 수득하였다.

2-2: 프라이머 제작

평강옥 품종 판별용 프라이머를 선발하기 위해, 2011년 Ganal 등이 발표한(Ganal et al., 2011. PloS ONE 6: e28334) 옥수수 B73 표준 게놈을 이용한 SNP 어레이(array)정보를 통하여 800,000개 이상 SNP 사이트(site)가 존재하고 있음을 밝혔고 이 정보를 통하여 염색체(chromosome)당 200개의 SNP site(20 SNP site/chromosome)를 선발하였다. 이렇게 선발한 SNP site을 MaizeGDB website(http://www.maizegdb.org/)을 이용하여 시퀀스 정보를 확보하였다.

이후 PCR 수행시 전방(Forward) 프라이머 3' 말단이 불일치로 인하여 PCR 생성물이 생기지 않는 원리를 이용한 서울대학교 이석하교수 실험실에서 발표한 3'말단 불일치 프라이머 제작 방법을 통하여 프라이머 200개를 제작하였다(Kim et al., 2005. Theor. AppL. Genet. 110:1003-1010)(도면 1 참조).

구체적으로, SNP site에서 3'말단의 2번째 염기서열을 불일치시켜 SNP site가 존재 시에는 PCR 생성물이 생성되지 않고 SNP site 존재하지 않을 경우에는 PCR생성물이 생기게 하는 방식으로 보다 쉽게 SNP site의 존재 유무를 검정코자 하였으며, 품종판별을 간편하게 하고자 하였다. 프라이머는 Primer3 프로그램을 이용하였으며, PCR 생성물은 200 ~ 400bp에서 생성되도록 제작하였다.

2-3: 특이적 반응 프라이머 선별

실시예 2-2에서 제작한 전방 프라이머 3'말단의 2번째 염기가 불일치된 200개의 프라이머 세트의 조합 중 평강옥 품종 DNA에 특이적으로 반응하는 프라이머 조합을 선발하기 위하여 국내에서 널리 재배되고 있는 국내육성 품종, 수입품종 등 50 품종의 DNA를 PCR을 수행한 후 단일밴드로 증폭되거나 증폭이 되지 않는 프라이머 조합을 1차로 선발하였다. 1차 선발 과정을 도면 2에 나타냈다.

그 후, 평강옥 품종과 평강옥 품종의 교배친에서 증폭반응과 일치하지 않는 프라이머일 경우 2차적으로 제거하여, 평강옥 품종에 특이적으로 선별가능한 프라이머를 선발하였다(도 3 참조).

결과적으로, 각 염색체당 20개씩의 실시예 2-2에서 제작한 프라이머를 이용하여 PCR 증폭시킨 후, 그 중에서 증폭 양상이 명확한 프라이머 16개를 선발하여 분석에 사용하였다(도 4 참조).

상기 PCR 증폭에서 용액의 조성은 총 20㎕로 구성되며 실시예 2-1의 평강옥 DNA 20ng, 실시예 1-2에서 제작한 프라이머 0.3M 및 2×Polymerase(Promega사 제품)로 하였다.

PCR 반응은 95℃에서 5분간 인큐베이션하고, 95℃에서 1분간 변성, 45 ~ 65℃에서 1분간 어닐링, 72℃에서 2분간 연장을 하고, 이 과정을 29 사이클을 반복하였으며, 사이클 완료 후 72℃에 10분간 연장하였고 4℃에서 PCR 증폭반응을 종결시켰다. 이후 증폭된 PCR 산물 18㎕를 1% 아가로오스 겔(agarose gel)에 로딩(loading)한 후 100V(볼트)에서 40분 동안 전기영동을 수행하였으며, 전기영동이후 에티듐 브로마이드(EtBr; Ethidium bromide)로 염색한(staining) 후 UV를 이용하여 밴드를 확인하였다.

도 2에서 확인되는 바와 같이, 예상하지 않은 PCR 밴드가 생기는 프라이머 조합을 제외하고 SNP site에 특이적으로 반응하는 프라이머 조합만을 선발하였다.

이후 프라이머 조합이 자식계통과 품종 간에 불일치되는 프라이머 조합을 제거하기 위하여 평강옥 모·부본의 DNA를 실시예 2-1의 방법과 동일한 방법으로 DNA를 추출하여 이들 간에 상호 구별 가능성을 검정하였다.

구체적인 검정 방법은 2015년에 수확한 평강옥 DNA를 F1으로 하고, 교배친인 모본은 (KS160)를 사용하였고 부본은 (KS155)를 사용하였으며(F1 종자와 모부본은 농촌진흥청 국립식량과학원에 분양을 요청할 경우 분양받을 수 있다), 품종은 실시예 2-1에서 수득한 평강옥 DNA를 이용하였다. 또한, DNA 추출방법을 실시예 2-1과 동일한 방법으로 수행하였고, PCR 증폭방법은 상술한 바와 같이 수행하였으며, 결과는 도 3에 나타났다.

도 3에서 확인되는 바와 같이, 모본과 부본에서는 PCR 밴드가 있으나 품종에서는 생성되지 않은 프라이머 조합은 품종을 판별할 수 있는 프라이머 조합으로는 적합하지 않아 선발에서 제외하였다. 이후 선발한 프라이머 세트 2개는 하기 표 1에 기재하였다.

Primer name	서열 번호	Forward sequence	서열 번호	Reverse sequence	Tm (℃)	Product Size(bp)	Location of chromosome
IBM 440	1	GCAGCTCTTAAAGATGGAGTGGGA	2	TGACCGCCGATCAGCTTCAT	60	288	2
IBM 1269	3	CACCTGTAGCTGTAGCTACC	4	TACCGAGGTGGTAAGTCTTG	46	228	6

상기 표 1에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 프라이머는 2번 염색체(chromosome)에서 1개, 6번 염색체에서 1개의 프라이머 조합을 선발하였다. 선발한 프라이머 조합은 46 ~ 60℃의 어닐링(annealing) 온도를 가졌다.

본 발명의 두 프라이머의 조합이 사료용 옥수수 50 품종 중에서 평강옥을 특이적으로 선별할 수 있는지 판단하기 위하여, 도 5에 나타난 옥수수 품종을 상기 두 프라이머 세트를 이용하여 PCR 분석하였다.

그 결과 도 6에 나타난 바와 같이, 평강옥 품종에서만 IBM440 프라이머세트로 PCR을 실시할 때 밴드가 형성되지 않으면서, IBM1269 프라이머 세트로 PCR을 실시할 때 밴드가 형성되지 않았다.

정리하자면, IBM 440 프라이머 세트를 이용한 PCR 증폭 산물이 288bp에서 확인되지 않아야 하고, 동시에 IBM 1269 프라이머 세트를 이용한 PCT 증폭 산물이 228bp에서 밴드로 확인되지 않아야 평강옥 품종으로 판별할 수 있다.

상기 실시예를 통해 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 프라이머 세트는 여러 품종 중에서 평강옥 품종을 효과적으로 판별, 평강옥 품종보호 및 F1 종자의 순도를 효과적으로 검정할 수 있음을 알 수 있었다. 또한, 본 발명은 상기 평강옥 판별용 프라이머 세트를 이용하여 평강옥 판별에 유용한 판별방법을 제공함을 알 수 있었다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Primer set for Pyeonggangok identification and method for identification <130> 1042415 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IBM 440 Forward sequence <400> 1 gcagctctta aagatggagt ggga 24 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IBM 440 Reverse sequence <400> 2 tgaccgccga tcagcttcat 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IBM 1269 Forward sequence <400> 3 cacctgtagc tgtagctacc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IBM 1269 Reverse sequence <400> 4 taccgaggtg gtaagtcttg 20

Claims

(a) 서열번호 1로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 2로 표시되는 역방향 프라이머의 프라이머 세트; 및
(b) 서열번호 3으로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 4로 표시되는 역방향 프라이머의 프라이머 세트;를 포함하는 평강옥 판별용 프라이머 조성물.
제1항에 있어서, 상기 (a)의 프라이머 세트는 옥수수 B73 표준 게놈(genome)의 2번 염색체의 염기서열과 상보적이고,
상기 (b)의 프라이머 세트는 옥수수 B73 표준 게놈(genome)의 6번 염색체의 염기서열과 상보적인 것을 특징으로 하는 평강옥 판별용 프라이머 조성물.
(i) 옥수수에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
(ii) 상기 (i)단계에서 분리된 게놈 DNA를 주형으로
(a) 서열번호 1로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 2로 표시되는 역방향 프라이머의 프라이머 세트; 및
(b) 서열번호 3으로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 4로 표시되는 역방향 프라이머의 프라이머 세트;를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
(iii) 상기 (ii)단계에서 증폭된 산물을 확인하는 단계;
를 포함하는 평강옥 품종 판별 방법.
제3항에 있어서, 상기 (iii) 단계는 서열번호 1로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 2로 표시되는 역방향 프라이머의 프라이머 세트를 이용하여 증폭된 산물 중 크기가 288bp인 산물이 검출되지 않으면서; 동시에 서열번호 3로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 4로 표시되는 역방향 프라이머의 프라이머 세트를 이용하여 증폭된 산물 중 크기가 228bp인 산물이 검출되지 않으면 평강옥 품종인 것으로 판별하는 평강옥 품종 판별 방법.
제3항에 있어서, 상기 증폭 반응은 40 내지 66 ℃의 온도로 어닐링(annealing)하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 평강옥 품종 판별 방법.
제3항에 있어서, 상기 단계 ii)에서 (a)의 프라이머 세트는 옥수수 B73 표준 게놈(genome)의 2번 염색체의 염기서열과 상보적이고, (b)의 프라이머 세트는 옥수수 B73 표준 게놈(genome)의 6번 염색체의 염기서열과 상보적인 것을 특징으로 하는 평강옥 품종 판별 방법.