KR101803077B1

KR101803077B1 - 양배추 시들음병 저항성 관련 마커를 표지하는 프라이머 세트 및 이를 이용한 저항성 양배추 품종 선별 방법

Info

Publication number: KR101803077B1
Application number: KR1020170111405A
Authority: KR
Inventors: 정미영; 노일섭; 황인덕; 박종인; 양기웅; 정희정; 정남희; 우딘 아메드 나잘
Original assignee: 순천대학교 산학협력단
Priority date: 2017-08-31
Filing date: 2017-08-31
Publication date: 2017-11-29
Also published as: KR20170102859A

Abstract

본 발명은 양배추 시들음병 저항성 연관 마커를 표지하는 프라이머 세트 및 이를 이용한 저항성 양배추 품종 선별 방법에 관한 것으로, 상기 프라이머 세트는 양배추 시들음병 저항성과 감수성에 있어 염기서열의 차이를 나타내는 다형성 마커, 즉 InDel 마커를 포함한 폴리뉴클레오티드를 증폭시킬 수 있는 바, 상기 프라이머 세트를 이용한 양배추 시들음병 저항성 또는 감수성 품종의 선별방법은 양배추 품종이 완전히 성숙하기 전에 안정적으로 양배추의 시들음병 저항성 품종을 검출 및 선발할 수 있으므로, 실제 시들음병에 대한 저항성을 가지는 품종을 육종하거나 저항성 품종을 분리하여 새로운 품종을 개발하는데 있어서 시간 및 노동력을 절감시킬 수 있을 것으로 기대된다.

Description

양배추 시들음병 저항성 관련 마커를 표지하는 프라이머 세트 및 이를 이용한 저항성 양배추 품종 선별 방법{Primer set and method for selection fusarium wilt resistant in cabbage}

본 발명은 양배추 시들음병 저항성 관련 마커를 표지하는 프라이머 세트 및 이를 이용한 저항성 양배추 품종 선별 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 양배추 시들음병 저항성 품종과 감수성 품종의 FocBo1 유전자에서 특이적으로 차별화되어 나타나는 다형성 부위를 포함하는 양배추 시들음병 저항성 또는 감수성 품종을 판별하기 위한 다형성 마커 조성물 및 상기 다형성 마커 조성물을 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 개발하였으며, 상기 프라이머 세트를 이용하여 양배추 시들음병 저항성 또는 감수성 품종을 선별하는 방법에 관한 것이다.

십자화과에 속하는 채소작물인 양배추(Brassica oleracea var. capitata)는 칼슘, 칼륨, 마그네슘 등의 다양한 미네랄, 비타민(A. B1, B2, C), 엽산, 및 식물 화학물질과 항체, 효소 및 호르몬을 생성하는데 필수 아미노산의 일종인 라이신(lysine)을 함유하고 있어 소비자들에게 건강식품으로 인식되면서 생산량 증대와 품질 향상을 위해 시설재배가 꾸준히 증가하고 있다(National agricultural statistics service, 2013).

그러나 이러한 시설재배는 비료의 과다사용과 시설관리에 대한 특별한 대책 없이 계속적인 연작이 이루어짐으로써 각종 토양병원균에 의한 병해의 발생이 해가 거듭될수록 증가하고 있는 추세이며, 특히 Fusarium oxysporum f. sp. conglutinans에 의해 발생하는 시들음병은 양배추의 연작지에 큰 피해를 주고 있다(Moon et al., 2001, Res. Plant Dis., 7:93-101.; Peterson and pound, 1960, Phytopathology, 50:807-816.). 이에 상기와 같은 문제를 해결하기 위하여 메틸 브로마이드(methyl bromide)를 이용한 무차별적 토양 살균처리, 양배추 이외의 작물과 윤작, 종자 소독 후 파종, 석회 사용 및 질소비료의 과용 금지 등이 이루어지고 있으나, 메틸 브로마이드는 오존층을 파괴하는 물질로 간주되어 현재 사용이 중지된 상태이고, 그 외의 방법들은 효과적인 방제효과를 나타내지 못하는 문제가 있다. 따라서 최근에는 시들음병에 대해 저항성을 가지는 품종을 재배하는 방법을 선호하고 있다(Arden, 1979, Vegetable crops, pp.730; Farnham et al., 2001, Plant Dis., 85:890-894.; Keinath et al., 1998, Biol. cult. tests, 13:155.).

시들음병에 대한 양배추의 저항성은 A 타입(type) 저항성과 B 타입(type)의 저항성이 알려져 있는데, A 타입 저항성은 온도 등의 환경조건에 관계없이 저항성을 나타내는 단인자 우성 유전을 하는 반면에, B 타입 저항성은 다인자의 영향을 받아 25℃까지는 저항성을 나타내나 그 이상의 고온에서는 저항성을 나타내지 못하여 높은 시들음병 발생을 보여 실용성이 없어 국내·외에서는 A 타입 저항성 양배추 품종이 개발되어 사용되어져 왔다(Blank, 1937, J. Agric. Res., 55:497-510.; Walker, 1930, J. Agric. Res., 40:721-745.; Walker, 1958, American Phytopathological Society, St. Paul, MN, 588 pp.). 이후 1980년대 중반에 A 타입 저항성 품종을 침해하는 새로운 균이 나타났으며(Ramirez-Villupadua et al., 1985, Plant Dis., 69:612-613.), 이에 따라 야기되는 시들음병에 대한 저항성을 가지는 품종이 육성되어 판매하고 있다. 그러나, 저항성 품종을 육종하는데 있어서 우수한 저항성 개체를 선별하는 병리검정 과정은 많은 시간과 비용이 소요되며, 전문적인 병리검정 시스템과 전문인력, 그리고 전문 기술이 요구되는 문제가 있었다. 이에 단기간에 시들음병에 대한 저항성 품종을 선별할 수 있는 분자표지(molecular marker)의 개발은 상기 문제점 해결에 있어서 시급하고 중요한 사항이다.

한편, 단일염기다형성(SNP; single nucleotide polymorphism)은 개체마다 차이를 나타내는 외형적 특성, 유전병의 원인, 맞춤약 처방 등 유전정보상의 중요한 실마리를 제공하므로 유전병의 원인을 찾고자 하는 진단의학 분야, 인류의 기원을 밝히고자 하는 유전학 분야 또는 법과학 분야 등에 매우 유용하게 사용될 수 있다고 보고되고 있다(Sachidanandam et al., 2001, Nature, 409:928-933.; Anderson et al., 2006, Genetics, 172:2567-2582.; Bulter et al., 2007, Forensic Sci. Med. Pathol., 3:200-205.; Phillips et al., 2008, Forensic Sci. Int. Gent., 2:198-204.). 그러나 SNP 분석 방법은 하나의 염기 서열 변화를 찾아내기 위해 고가의 시약들과 장비들이 요구되므로 실제 효용성이 떨어지며, SNP로부터 얻는 정보는 DNA 다형성 중 하나인 길이 다형성(shot tandem repeats, STR)으로부터 얻는 정보에 비해 현저히 적어 결과적으로 10개의 STR 좌위를 분석하는 것에 상당한 식별력을 얻기 위해서는 50개 이상의 SNP를 분석해야하는 문제가 있다.

이에 최근에는 상기한 문제를 보완할 수 있는 추가적인 도구로서, 한 개에서 십여 개의 염기가 유전자 전반에 걸쳐 삽입(insertion) 또는 결실(deletion)됨으로써 그 길이의 차이에 의해 발생하는 DNA 다형성인 InDel(insertion and deletion)에 대한 연구가 진행되고 있다. 이러한 InDel은 직접적인 염기서열 분석 방법 대신 PCR 증폭과 모세관 전기영동을 통하여 보다 간단하게 분석이 가능하며, InDel의 돌연변이율이 낮아 보다 정확하고 안정적인 분석이 가능할 뿐만 아니라 PCR 증폭 과정에서 발생하는 Stutter 등의 인공 증폭 산물의 발생이 없어 혼합 유전자형 해석에 있어서 보다 유용하다고 보고되었다(Carvalho et al., 2011, Forensic Sic. Int. Gent. Suppl. Ser., 3:351-352.).

이에 본 발명자들은 양배추 시들음병 저항성 품종과 감수성 품종을 판별할 수 있는 새로운 분자마커를 개발하기 위해 연구하던 중, 양배추 시들음병 저항성 유전자인 FocBo1의 염기서열을 분석하여 시들음병 저항성 품종과 감수성 품종에서 특이적으로 차별화되어 나타나는 신규한 InDel 마커를 확인하고, 상기 InDel 마커를 검출할 수 있는 프라이머 세트를 개발하였으며, 상기 프라이머 세트를 이용하여 양배추 시들음병 저항성 품종을 간단하고 정확하게 선별할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 하나의 목적은 양배추 시들음병 저항성 품종과 감수성 품종의 FocBo1 유전자에서 다형성을 나타내는 마커 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 양배추 시들음병 저항성 품종과 감수성 품종의 FocBo1 유전자에서 다형성을 포함하여 증폭하여 양배추 시들음병 저항성 또는 감수성 품종을 판별할 수 있는 프라이머 세트를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는 양배추 시들음병 저항성 또는 감수성 품종 선별용 키트를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 프라이머 세트 또는 상기 키트를 사용하여 간단하고 정확하게 양배추 시들음병 저항성 품종을 선별하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 프라이머 세트를 이용하여 증폭된 산물을 포함하는 양배추 시들음병 저항성 또는 감수성 품종 선별용 프로브를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 프라이머 세트를 이용하여 증폭된 산물이 고정된 기판을 갖는 양배추 시들음병 저항성 또는 감수성 품종 선별용 마이크로어레이를 제공하는데 있다.

하나의 양태로서, 본 발명은 양배추 시들음병 저항성 품종과 감수성 품종의 FocBo1 유전자에서 다형성을 나타내는 마커 조성물을 제공한다.

구체적으로, 본 발명은 서열번호 1로 이루어진 FocBo1 유전자의 염기서열 중 603번째 염기에 위치하는 InDel 마커를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드와; 서열번호 1로 이루어진 FocBo1 유전자의 염기서열 중 1764 내지 1773번째 염기에 위치하는 InDel 마커를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 다형성 마커 조성물을 제공하는 것이다.

상기 서열번호 1로 이루어진 FocBo1 유전자의 염기서열 중 603번째 염기에 위치하는 InDel 마커는 서열번호 1로 이루어진 FocBo1 유전자의 염기서열 중 603번째 염기에 A 염기의 삽입 유무에 따라 양배추 시들음병 저항성 품종과 감수성 품종의 표현형을 판단할 수 있는 마커이다. 즉, 상기 서열번호 1로 이루어진 FocBo1 유전자의 염기서열 중 603번째 염기에 위치하는 InDel 마커 위치에 A 염기가 삽입된 유전자형을 갖는 품종은 양배추 시들음병 감수성 품종으로, A 염기가 삽입되지 않은 유전자형을 갖는 품종은 양배추 시들음병 저항성 품종으로 판단할 수 있다.

그러나, 실제 상기 서열번호 1로 이루어진 FocBo1 유전자의 염기서열 중 603번째 염기에 위치하는 InDel 마커에 A 염기의 삽입 유무만으로는 저항성 표현형을 나타내는 양배추 품종을 정확하게 선별할 수 없는 문제가 있다.

하나의 구체적 예로서, 상기 서열번호 1로 이루어진 FocBo1 유전자의 염기서열 중 603번째 염기에 위치하는 InDel 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 제조하고 이를 사용하여 특정 양배추 품종으로부터 분리한 게놈 DNA를 증폭한 결과, 서열번호 1로 이루어진 FocBo1 유전자의 염기서열 중 603번째 염기에 위치하는 InDel 마커 위치에서 A 염기가 삽입되지 않은 유전자형을 갖고 있음에도 불구하고 감수성을 나타냄이 확인되었다(실시예 2 참조).

이에 본 발명자들은 상기 서열번호 1로 이루어진 FocBo1 유전자의 염기서열 중 603번째 염기에 위치하는 InDel 마커 위치에서 A 염기가 삽입되지 않은 유전자형을 가지고 있는 양배추 품종으로부터 FocBo1 유전자에 위치하는 유전체 단편을 분리하여 이들의 염기서열을 분석하였고, 그 결과 서열번호 1로 이루어진 FocBo1 유전자의 염기서열 중 1764 내지 1773번째 위치하는 염기가 결실되었음을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 다형성 마커 조성물은 양배추 품종이 완전히 성숙하기 전에 정확하게 저항성 품종과 감수성 품종을 판별하는데 이용할 수 있다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 다형성 마커 조성물을 증폭하여 양배추 시들음병 저항성 또는 감수성 품종을 판별할 수 있는 프라이머 세트를 제공한다.

구체적으로, 본 발명의 프라이머 세트는 서열번호 7 및 8로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 10 및 11로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 서열번호 7 및 8로 이루어진 프라이머 쌍은 서열번호 1로 이루어진 FocBo1 유전자의 염기서열 중 603번째 염기에 위치하는 InDel 마커를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 증폭할 수 있다.

상기 서열번호 10 및 11로 이루어진 프라이머 쌍은 서열번호 1로 이루어진 FocBo1 유전자의 염기서열 중 1764 내지 1773번째 염기에 위치하는 InDel 마커를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 증폭할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 서열번호 7 및 8로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 10 및 11로 이루어진 프라이머 쌍은 양배추 시들음병 저항성 또는 감수성 품종을 선별하기 위한 키트로 이용될 수 있다.

본 발명의 명세서에서, 용어 "프라이머"는 카피하려는 핵산가닥에 상보적인 단일가닥의 올리고뉴클레오티드로서, 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(DNA 중합효소 또는 역전사 효소) 및 상이한 4가지 dNTP(deoxynucleoside triphosphate)의 존재하에서 주형-지시적 DNA 합성을 개시할 수 있는 개시점으로서 작용하는 것을 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 사용하고자 하는 프라이머의 특성에 의해 결정하지만, 통상적으로 18개 이상, 바람직하게는 20 내지 200개, 보다 바람직하게는 20 내지 100개, 보다 더 바람직하게는 20 내지 30개의 연속된 뉴클레오티드로 구성되며, 주형과 충분히 안정된 염기쌍을 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다.

또한, 상기 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예: 아크리딘, 프소랄렌 등), 킬레이트화제(예: 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등), 및 알킬화제를 함유할 수 있다.

또한, 본 발명의 프라이머 핵산 서열은 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소 (예컨대, 호스래디쉬 옥시다제, 알칼린 포스파타아제), 방사성 동위원소(예컨대, ³²P), 형광성 분자, 화학그룹 (예컨대, 바이오틴) 등이 있다.

본 발명의 명세서에서, 용어 "염기"는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide) 또는 리보뉴클레오티드(ribonucleotide)이며, 특별히 다르게 언급되어 있지 않는 한 자연의 뉴클레오티드의 유사체를 포함한다.

본 발명에 있어서, 상기 프라이머 세트를 사용하여 양배추 시료로부터 얻은 DNA를 증폭하는 경우, 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충용액, DNA 중합효소(예를 들어, Thermus aquatiucs(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Phyrococcus furiosis(Pfu)로부터 얻은 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합효소 조인자(Mg² ⁺), dNTPs(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP) 및 물(dH₂O)을 포함할 수 있다. 상기 완충용액은 이에 제한되지는 않으나 적당량의 트리톤 X-100(Triton X-100), 디메틸설폭사이드(dimethylsufoxide, DMSO), Tween20, nonidet P40, PEG 6000, 포름아마이드 및 소혈청 알부민(BSA) 등이 추가로 포함할 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 양배추 시들음병 저항성 또는 감수성 품종을 선별하는 방법을 제공한다:

a) 양배추 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;

b) 상기 a) 단계에서 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 7 및 8로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 10 및 11로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는 프라이머 세트를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; 및

c) 상기 b) 단계에서 증폭된 산물을 동정하여 양배추 시들음병 저항성 또는 감수성 품종을 판별하는 단계;를 포함하는 양배추 시들음병에 대해 저항성을 갖는 품종을 선별하는 방법.

이하에서는, 본 발명에 따른 선별방법을 각 단계에 따라 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

a) 양배추 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계이다.

본 발명에 있어서, 상기 게놈 DNA는 양배추의 종자 또는 양배추 전체, 바람직하게는 양배추 종자를 파종하고 발아한 후 어린 식물체의 잎으로부터 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 따라 분리하거나 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 수행할 수 있다.

b) 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계이다.

상기 a) 단계에서 분리한 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 서열번호 7 및 8로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 10 및 11로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는 프라이머 세트를 사용하여 시들음병에 대해 저항성을 나타내는 품종과 감수성을 나타내는 품종의 FocBo1 유전자에서 특이적으로 차별화되어 나타나는 InDel 마커를 포함하는 표적서열을 증폭하는 단계이다.

상기 표적서열의 증폭은 (ⅰ) 초기 변성(pre-denaturation) 과정; (ⅱ) 변성(denaturation) 과정, 프라이머 대상 핵산결합(annealing) 과정 및 신장(extension) 과정으로 이루어지는 한 싸이클을 수회 내지 수십 회 반복하는 과정; 및 (ⅲ) 최종 열처리 과정 또는 이들 과정을 적합하게 변형한 열 싸이클(thermal cycle) 프로그램을 통해 이루어진다.

본 발명의 명세서에서, 용어 "사이클"은 표적 핵산의 1 카피(copy)를 생성하는 과정을 말한다.

본 발명에 있어서, 상기 변성, 프라이머의 대상 핵산결합단계 및 신장 단계에서의 온도 및 시간 조건은 특정의 범위로 한정되지는 않고, 당업자가 적합한 조건을 선택할 수 있으나, 바람직하게는 (ⅰ) 90 내지 98℃에서 1 내지 7분 동안 게놈 DNA를 충분히 변성하는 개시변성과정, (ⅱ) 90 내지 98℃에서 30 내지 60초 동안의 변성과정, (ⅲ) 50 내지 70℃에서 30 내지 60초 동안 프라이머의 대상 핵산결합과정, (ⅳ) 65 내지 75℃에서 30 내지 60초 동안 신장과정으로 이루어지는 1 사이클을 30회 반복 수행하는 단계, 및 (ⅴ) 65 내지 75℃에서 5 내지 10분 동안 추가 신장단계를 포함할 수 있다. 각 단계의 시간과 사이클 수는 당업계에 일반적으로 행해지는 조건에 따라 정해질 수 있다.

본 발명에 있어서, 중합효소연쇄반응은 본 발명의 프라이머 세트 이외에 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 적당량의 DNA 중합효소(예를 들어, Thermus aquatiucs(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Phyrococcus furiosis(Pfu)로부터 얻은 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합효소 조인자(Mg² ⁺), 완충용액, dNTPs(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP) 및 물(dH₂O)를 포함할 수 있다. 상기 완충용액은 이에 제한되지는 않으나 적당량의 트리톤 X-100(Triton X-100), 디메틸설폭사이드(dimethylsufoxide, DMSO), Tween20, nonidet P40, PEG 6000, 포름아마이드 및 소혈청 알부민(BSA) 등을 추가로 사용하여 이루어질 수 있다.

c) 중합효소연쇄반응에 의해 증폭된 산물을 동정하여 양배추 시들음병 저항성 또는 감수성 품종을 판별하는 단계이다.

상기 b) 단계를 통해 증폭된 표적서열을 동정하고, 상기 동정된 염기서열 중 InDel 마커를 검정함으로써 양배추 시들음병 저항성 또는 감수성 품종을 판별하는 단계이다.

본 발명의 하나의 구현예에 따른 방법에 있어서, 상기 b) 단계에서 증폭된 산물은 서열번호 1로 이루어진 FocBo1 유전자의 염기서열 중 603번째 염기에 해당하는 InDel 마커 위치에 A 염기가 추가로 삽입되어 있지 않고, 1764 내지 1773번째 염기에 해당하는 InDel 마커 위치에 'ATTGTTCGTG'가 존재하는 경우 양배추 시들음병 저항성 품종으로 판별하고, 상기 증폭된 표적서열이 서열번호 1로 이루어진 FocBo1 유전자의 염기서열 중 603번째 염기 위치에 A 염기가 추가로 삽입되었거나 1764 내지 1773번째 염기인 'ATTGTTCGTG'가 결실된 경우 양배추 감수성 품종으로 판별한다.

본 발명에 있어서, 상기 증폭된 표적서열의 동정은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 염기서열 분석 또는 HRM(high resolution melting) 등과 같이 당업계에 공지된 다양한 DNA 분석을 이용하여 이루어질 수 있다.

본 발명의 하나의 구현예로서, 본 발명에 따라 FocBo1 유전자의 염기서열 중 1764 내지 1773번째 염기에 해당하는 InDel 마커를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 이루어진 폴리뉴클레오티드가 증폭된 산물의 경우 겔 전기영동함으로써 동정할 수 있다. 이때 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다.

FocBo1 유전자의 염기서열 중 603번째 염기에 해당하는 InDel 마커를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 이루어진 폴리뉴클레오티드가 증폭된 산물의 경우 HRM 분석함으로써 동정할 수 있다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 프라이머 세트 또는 상기 프라이머 세트를 포함하는 키트를 이용한 선별방법은 양배추 품종이 완전히 성숙하기 전에 간단하고 정확하게 시들음병에 대한 저항성 또는 감수성 품종을 선별 및 특정할 수 있으므로, 실제 저항성을 가지는 양배추를 육종함에 있어서 시간 및 노동력을 절감시킬 수 있는 효과가 있다. 또한, 종래 제한효소의 처리나 염기서열 분석 등의 과정을 추가적으로 수행할 필요가 없기 때문에 시간과 비용을 크게 절약할 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 12, 13, 14 또는 15의 염기서열 또는 이의 상보적인 염기서열을 포함하는 양배추 시들음병 저항성 또는 감수성 품종 선별용 프로브를 제공한다.

본 발명의 명세서에서, 용어 "프로브"란 혼성화 프로브를 의미하는 것으로, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 서열번호 12, 13, 14 또는 15의 염기서열은 본 발명에 따른 서열번호 7 및 8로 이루어진 프라이머 쌍 또는 서열번호 10 및 11로 이루어진 프라이머 쌍에 의해 증폭된 다형성 서열(polymorphic sequence)이다. 상기 다형성 서열이란 서열번호 1로 이루어진 FocBo1 유전자의 염기서열 중 603번째 염기에 위치하는 InDel 마커를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드와; 서열번호 1로 이루어진 FocBo1 유전자의 염기서열 중 1764 내지 1773번째 염기에 위치하는 InDel 마커를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 말하며, 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA가 될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 서열번호 12, 13, 14 또는 15의 염기서열은 양배추 시료로부터 추출한 게놈 DNA와 혼성화시켜 양배추 시들음병 저항성 또는 감수성 품종을 선별할 수 있다.

하나의 구체적 양태로서, 양배추 시료로부터 추출한 게놈 DNA가 서열번호 12와 14의 염기서열에 혼성화되는 경우 양배추 시들음병에 대한 저항성 품종으로 판별하며, 양배추 시료로부터 추출한 게놈 DNA가 서열번호 13과 15의 염기서열에 혼성화되는 경우 양배추 시들음병에 대한 감수성 품종으로 판별할 수 있다.

또한, 상기 서열번호 12, 13, 14 또는 15의 염기서열 또는 이의 상보적인 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 이에 의해 코딩되는 폴리펩타이드 또는 이의 cDNA가 고정화된 기판을 포함하는 양배추 시들음병 저항성 또는 감수성 품종 선별용 마이크로어레이를 제공할 수 있다.

본 발명에 따른 마이크로어레이는 당분야의 당업자에게 알려져 있는 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 예컨대, 상기 뉴클레오티드는 아미노 실란(amino-silane), 폴리-L-리신(poly-L-lysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 활성기가 코팅된 기판 상에 고정될 수 있다. 또한, 상기 기판은 실리콘 웨이퍼, 유리, 석영, 금속 및 플라스틱으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드를 기판에 고정화시키는 방법은 압전(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅법(micropipetting), 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 프라이머 세트는 양배추 시들음병 저항성과 감수성에 있어 염기서열의 차이를 나타내는 다형성 마커, 즉 InDel 마커를 포함한 폴리뉴클레오티드를 증폭시킬 수 있는 바, 상기 프라이머 세트를 이용한 양배추 시들음병 저항성 또는 감수성 품종의 선별방법은 양배추 품종이 완전히 성숙하기 전에 안정적으로 양배추의 시들음병 저항성 품종을 검출 및 선발할 수 있으므로, 실제 시들음병에 대한 저항성을 가지는 품종을 육종하거나 저항성 품종을 분리하여 새로운 품종을 개발하는데 있어서 시간 및 노동력을 절감시킬 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 양배추 시들음병 저항성 품종(AS9462 및 AS9466)과 감수성 품종(AS9456 및 AS9463)으로부터 분리한 RNA를 주형으로 하고, 양배추 시들음병 저항성 형질과 연관된 FocBo1 mRNA 유전자 정보를 바탕으로 설계한 프라이머 세트를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 실시하여 증폭된 산물의 염기서열을 정렬하여 비교한 그림이다.
도 2는 양배추 시들음병 저항성 품종(AS9462 및 AS9466)과 감수성 품종(AS9435 및 AS9439)으로부터 분리한 RNA를 주형으로 하고, 양배추 시들음병 저항성 형질과 연관된 FocBo1 mRNA 유전자 정보를 바탕으로 설계한 프라이머 세트를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 실시하여 증폭된 산물의 염기서열을 정렬하여 비교한 그림이다.
도 3은 양배추 시들음병 저항성 품종과 감수성 품종으로부터 분리한 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따라 제작된 프라이머 세트(서열번호 7 및 서열번호 8)를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 실시한 후, HRM 분석을 통해 시들음병 저항성과 감수성 간의 융해(melting)값을 측정한 결과이다.
도 4는 양배추 시들음병 저항성 품종과 감수성 품종으로부터 분리한 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따라 제작된 프라이머 세트(서열번호 10 및 서열번호 11)를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 실시한 후, 아가로오스 겔에 전기영동한 결과이다.
도 5는 양배추 시들음병 저항성 품종(AS9462 및 AS9466)과 감수성 품종(AS9456 및 AS9463)으로부터 분리한 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따라 제조된 프라이머 세트(서열번호 7 및 서열번호 8)를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 실시하여 증폭시킨 DNA의 염기서열을 정렬하여 비교한 그림이다.
도 6은 양배추 시들음병 저항성 품종(AS9462 및 AS9466)과 감수성 품종(AS9435 및 AS9439)으로부터 분리한 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따라 제조된 프라이머 세트(서열번호 10 및 서열번호 11)를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 실시하여 증폭시킨 DNA의 염기서열을 정렬하여 비교한 그림이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1:양배추 시들음병 저항성 품종 또는 감수성 품종 육종

시들음병에 대해 저항성 표현형을 나타내는 저항성 계통과 시들음병에 대해 감수성 표현형을 나타내는 감수성 계통을 교배하여 얻은 잡종 1세대 F₁을 자가 수정하여 얻은 F₂ 집단의 시들음병 저항성 계통 5종(AS9449, AS9451, AS9458, AS9462 및 AS9466)과 시들음병 감수성 계통 7종(AS9435, AS9439, AS9455, AS9456, AS9460, AS9463 및 AS9465)의 양배추 종자를 각각 여과지(No. 1, Whatman, Germany)가 포함된 페트리 디쉬(petri dish) 안에 넣고 여과지를 덮은 후 여과지가 완전히 젖을 정도로 증류수를 부어 주었다. 그 다음 25℃(16h light/8h dark)가 유지되는 그린하우스에서 종자를 발아시켰다. 그 후 상기 종자를 모종흙이 담긴 플라스틱 화분(지름 7.5cm)에 옮겨 심은 후 4매의 본엽(true leaf)이 나올 때까지 재배하였다.

실시예 2: 양배추 시들음병 저항성 품종 또는 감수성 품종의 FocBo1 mRNA 클로닝 및 염기서열 분석

상기 실시예 1에서 재배한 양배추 시들음병 저항성 품종 및 감수성 품종으로부터 잎을 채취한 후 질소용액을 이용하여 파쇄하였다. 그 다음 RNA 추출 키트(RNA extraction kit, Qiagen, USA)를 사용하여 메뉴얼에 따라 RNA를 추출하였다. 그 다음 상기 추출한 RNA 8㎕(약 2μg)에 oligo dT 프라이머(500 μg/ml) 1㎕를 첨가한 후 65℃에서 10분 동안 처리하여 전체 RNA를 변성시켰다. 그 다음 얼음에서 급속히 냉각시킨 후 역전사 효소를 첨가하고 42℃에서 50분 동안 반응시켜 cDNA를 합성하였다. 그 다음 70℃에서 15분 동안 열처리를 통해 반응 중지시켰다. 합성한 cDNA를 주형으로 사용하고, 양배추의 FocBo1 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 사용하여 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 실시하여 FocBo1 mRNA를 증폭하였다. 이때 상기 프라이머는 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에 공시된 FocBo1 mRNA(NCBI accession no. AB981182.1) 정보를 기반으로 합성하였으며, 그 프라이머에 대한 염기서열은 하기 표 1에 나타내었다. 상기 역전사 중합효소연쇄반응은 95℃에서 5분 동안 변성시킨 다음 95℃에서 30초 동안 변성(denaturation), 60℃에서 30초 동안 증폭(annealing), 72℃에서 2분 동안 연장(extension)을 30 사이클을 실시한 후, 후기 연장(post-extension)을 72℃에서 7분 동안 실시하였다. 그 다음 상기 증폭된 FocBo1 mRNA는 양 끝이 반듯이 절단되어 있는 블런트(blunt) 벡터(TOPcloner™ Blunt kit, EZ002S, Enzynomics, Korea)에 클로닝하여 준비하였다.

유전자	Forward 프라이머(5′→3′)	Reverse 프라이머(5′→3′)
FocBo1	CCCTAAGCTGGAGATACGATGTGT(서열번호 2)	CCTGGGGTAGCCAGTTGGAGGTTCA(서열번호 3)

그 후 상기 실시예 2에서 제조한 각 품종별 FocBo1 mRNA가 포함된 벡터를 막투과성이 증가된 대장균, 즉 형질전환세포에 형질전환시킨 후 플라스미드 DNA 정제 키트(plasmid mini kit, 12125, Qiagen, USA)를 이용하여 FocBo1 mRNA가 포함된 벡터를 추출하였다. 그 다음 상기 추출한 FocBo1 유전자가 포함된 벡터는 마크로젠(macrogen crop., Korea)에 의뢰하여 벡터에 있는 M13 프라이머를 사용하여 염기서열 분석을 의뢰하였다. 그 결과를 도 1 및 도 2에 나타내었다.

Acc. No.	유전자형		표현형
Acc. No.	‘A’삽입	10bp 결실	표현형
AS9435	-/-	결실	감수성
AS9439	-/-	결실	감수성
AS9449	-/-	결실 안됨	저항성
AS9451	-/-	결실 안됨	저항성
AS9455	A/A	결실 안됨	감수성
AS9456	A/A	결실 안됨	감수성
AS9458	-/-	결실 안됨	저항성
AS9460	A/A	결실 안됨	감수성
AS9462	-/-	결실 안됨	저항성
AS9463	A/A	결실 안됨	감수성
AS9465	A/A	결실 안됨	감수성
AS9466	-/-	결실 안됨	저항성

실험결과, 양배추 시들음병 저항성 품종의 FocBo1 유전자 염기서열은 서열번호 4의 염기서열로 분석되었고, 양배추 시들음병 감수성 품종의 FocBo1 유전자 염기서열은 서열번호 5 또는 서열번호 6의 염기서열로 분석되었다.

또한, 도 1 및 도 2에서 보듯이 양배추 시들음병 저항성 및 감수성 품종의 FocBo1 유전자에서 차이가 나는 염기서열을 확인한 결과, 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 양배추 시들음병 저항성 품종의 유전자와 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 양배추 시들음병 감수성 품종의 유전자에서 총 58개의 단일염기다형성(SNP)과 1개의 삽입/결실 다형성(InDel)을 확인할 수 있었으며, 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 양배추 시들음병 저항성 품종의 유전자와 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 양배추 시들음병 감수성 품종의 유전자에서 총 88개의 단일염기다형성(SNP)과 4개의 삽입/결실 다형성(InDel)을 확인할 수 있었다.

본 발명자는 양배추 시들음병 저항성 품종과 감수성 품종의 FocBo1 유전자에서 차이가 나는 염기서열, 즉 다형성 부위에서 서열번호 4로 이루어진 양배추의 FocBo1 유전자 염기서열 중 283번째 염기에 추가로 삽입된 염기(-/-: 시들음병 저항성, A/A: 시들음병 감수성)와 1443~1452번째 염기가 결실된 부위를 InDel 마커로 선발하였다. 이때, 상기 서열번호 4로 이루어진 양배추의 FocBo1 유전자 염기서열 중 1443~1452번째 염기에 위치하는 InDel 마커는 본 발명자가 처음 발견한 양배추 시들음병 저항성과 관련된 다형성 부위이다.

실시예 3: FocBo1 유전자의 InDel 마커를 증폭할 수 있는 프라이머 세트 제작

실시예 2를 통해 확인한 양배추 시들음병에 대한 저항성 품종과 감수성 품종을 판별할 수 있는 InDel 마커를 이용하여 프라이머 세트 및 프로브를 제작하였으며, 이에 대한 염기서열은 표 3과 같다.

	프라이머 명	염기서열(5‘→3’)
283번째 염기 증폭	FocBo1-296bp-aF1	ATTAGAGAATCAAGGATCTCAATCGTCGTCTT(서열번호 7)
	FocBo1-296bp-aR2	ATGGTTGATTCATCACTCCAGTTCCGAGA(서열번호 8)
	FocBo1-296bp-pF2	GTTGAATCAAATGGTGAATTCCGGT(서열번호 9)
1443~1452번째 염기 증폭	FocBo1-10bp-dF1	TGTAAACATGCACAGCCTGCTTCAG(서열번호 10)
1443~1452번째 염기 증폭	FocBo1-10bp-dR1	CTTCACATATATCCTTAGAATCCACCAAG(서열번호 11)

실시예 4: 서열번호 4로 이루어진 양배추의 FocBo1 유전자 염기서열 중 283번째 염기가 증폭되도록 제작된 프라이머 세트를 이용한 양배추 시들음병 저항성 품종과 감수성 품종 판별

상기 실시예 1에서 육종한 각 계통으로부터 잎을 추출한 후 질소용액을 이용하여 파쇄하였다. 그 다음 DNA 추출 키트(plant mini kit, Cat. no. 69104, Qiagen, USA)를 사용하여 메뉴얼에 따라 게놈 DNA(genomic DNA)를 추출하였다. 그 후 상기 각 계통의 게놈 DNA 5㎍에 상기 FocBo1 유전자 염기서열 중 283번째 염기가 증폭되도록 제작된 서열번호 7 및 서열번호 8로 이루어진 프라이머 세트와 서열번호 9로 이루어져 있으며 3′말단이 비표지된 올리고뉴클레오티드 프로브(oligonucleotide probe, luna probe) 및 2×반응용액(LightScanner Master mix)을 넣고 최종 부피가 20㎕가 되도록 증류수를 첨가한 다음 95℃에서 5분 동안 변성시킨 다음 95℃에서 20초 동안 변성(denaturation), 60℃에서 20초 동안 프라이머 결합(annealing), 72℃에서 30초 동안 연장(extension)을 50 사이클을 실시한 후, 후기 연장(post-extension)을 72℃에서 40초 동안 실시하였다. 그 다음 상기 증폭된 시료를 LightScanner(LightScanner^®Instrument System, Idaho Technology, USA)의 프로그램으로 온도 40℃에서 80℃까지 초당 0.2℃ 간격으로 형광량을 측정하여 녹는 곡선(melting curve)을 분석하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에서 보듯이, 양배추 시들음병에 대해 저항성을 나타내는 품종(AS9449, AS9451, AS9458, AS9462 및 AS9466)과 감수성을 나타내는 품종(AS9455, AS9456, AS9460, AS9463 및 AS9465) 간에 약 3.7℃의 융해(Melting) 값의 차이를 보였다. 그러나, 양배추 시들음병에 대해 저항성을 나타내는 품종인 AS9435 및 AS9439는 저항성 품종과 동일한 융해 값을 나타내었다.

이로부터 본 발명의 서열번호 7 및 8로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 양배추 시들음병 저항성 및 감수성 품종을 선별할 수 있음을 알 수 있었다. 그러나, 본 발명의 서열번호 7 및 8로 이루어진 프라이머 세트만으로 양배추 시들음병 저항성 및 감수성 품종을 정확하게 선별하기에는 어려움이 있음을 알 수 있었다.

실시예 5: 서열번호 4로 이루어진 양배추의 FocBo1 유전자 염기서열 중 1443~1452번째 염기가 증폭되도록 제작된 프라이머 세트를 이용한 양배추 시들음병 저항성 품종과 감수성 품종 판별

상기 실시예 4에서 추출한 각 계통의 게놈 DNA 5㎍에 상기 FocBo1 유전자 염기서열 중 1443~1452번째 염기가 증폭되도록 제작된 서열번호 10 및 서열번호 11로 이루어진 프라이머 세트 및 2x DNA 중합효소(Emerald PCR premix, Takara, Japan)를 각각 첨가한 후 중합효소연쇄반응(PCR)을 실시하였다. 이때, 상기 중합효소연쇄반응은 95℃에서 30초 동안 변성(denaturation), 65℃에서 30초 동안 프라이머 결합(annealing), 72℃에서 30초 동안 연장(extension)을 30 사이클을 실시한 후, 후기 연장(post-extension)을 5분 동안 실시하였다. QIAxcel (Qiagen) 장비로 확인하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에서 보듯이, 서열번호 4로 이루어진 양배추의 FocBo1 유전자 염기서열 중 1443~1452번째 염기가 삭제된 유전자형을 가지는 양배추 계통인 AS9435 및 AS9439은 103bp 크기의 밴드가 확인되었고, 나머지 계통은 113bp 크기의 밴드가 확인되었다.

이로부터 서열번호 10 및 서열번호 11로 이루어진 프라이머 세트는 PCR 밴드의 크기만으로 양배추 시들음병 저항성 또는 감수성 표현형을 나타내는 양배추 품종을 구별하는데 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 6 : 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 증폭된 양배추 시들음병 저항성 또는 감수성 품종의 유전자 클로닝 및 염기서열 확인

상기 실시예 4에서 추출한 각 계통의 게놈 DNA와 InDel 마커가 증폭되도록 제작된 서열번호 7 및 8로 이루어진 프라이머 세트, 또는 서열번호 10 및 11로 이루어진 프라이머 세트를 사용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 실시하였다. 이때, 상기 중합효소연쇄반응은 95℃에서 30초 동안 변성(denaturation), 65℃에서 30초 동안 프라이머 결합(annealing), 72℃에서 30초 동안 연장(extension)을 30 사이클을 실시한 후, 후기 연장(post-extension)을 5분 동안 실시하였다. 그 다음 증폭된 DNA는 1.2% 아가로오스 겔에서 전기영동한 후 EDTA로 염색하여 확인한 후 DNA 정제키트(purification kit, Promega)를 사용하여 정제하였다. 그 다음 상기 정제된 DNA를 양 끝이 반듯이 절단되어 있는 블런트(blunt) 벡터(TOPcloner™ Blunt kit, EZ002S, Enzynomics, Korea)에 클로닝 하였다. 그 다음 상기 벡터를 막투과성이 증가된 대장균, 즉 형질전환세포에 형질전환시킨 후 플라스미드 DNA 정제 키트(plasmid mini kit, 12125, Qiagen, USA)를 이용하여 증폭된 DNA가 포함된 벡터를 추출하였다. 그 다음 상기 추출한 증폭된 DNA가 포함된 벡터는 마크로젠(macrogen crop., Korea)에 의뢰하여 벡터에 있는 M13 프라이머를 사용하여 염기서열 분석을 의뢰하였다. 그 결과를 도 5 및 도 6에 나타내었다.

도 5 및 6에서 보듯이, 서열번호 7 및 8로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 증폭시킨 양배추 시들음병 저항성 품종인 AS9462 및 AS9466의 DNA 염기서열은 서열번호 12의 폴리뉴클레오티드로 분석되었고, 양배추 시들음병 감수성 품종인 AS9456 및 AS9463의 DNA 염기서열은 서열번호 13의 폴리뉴클레오티드로 분석되었다.

또한, 서열번호 10 및 11로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 증폭시킨 배추 시들음병 저항성 품종인 AS9462 및 AS9466의 DNA 염기서열은 서열번호 14의 폴리뉴클레오티드로 분석되었고, 시들음병 감수성 품종인 AS9435 및 AS9439의 DNA 염기서열은 서열번호 15의 폴리뉴클레오티드로 분석되었다.

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FocBo1-296bp-aF1 priemr and FocBo1-296bp-aR2 primer <400> 12 attagagaat caaggatctc aatcgtcgtc ttctctaaga attatgcttc ttccagctgg 60 tgcttgaatg agttggtgga gatctacaag tcctttaatg agttgaatca aatggtgatt 120 ccggttttct acaacgttga tccttctgaa gttcgaaaac agaccggaga atttggaaag 180 atctttgaag ggacatgcaa cggcaaaaca gaggatcaga aacaaaggtg gatgcaagct 240 ctagcagagg tcgcaaacat ggctggggag gattctcgga actggagtga tgaatcaacc 300 at 302 <210> 13 <211> 302 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> amplified seqeunce of A9456 and A9463(fusarium wilt susceptible breed) by FocBo1-296bp-aF1 priemr and FocBo1-296bp-aR2 primer <400> 13 attagagaat caaggatctc aatcgtcgtc ttctctaaga attatgcttc ttccagctgg 60 tgcttgaatg agttggtgga gatctacaag tcctttaatg agttgaatca aatggtgaat 120 tccggttttc tacaacgttg atccttctga agttcgaaaa cagaccgaaa atttggaaag 180 atctttgaag ggacatgcaa cggaaaaaca gaagatcaga aacaaaggtg gatgcaagct 240 ctagcagagg tcgcaaacat ggctggggag gattctcgga actggagtga tgaatcaacc 300 at 302 <210> 14 <211> 113 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> amplified seqeunce of A9462 and A9466(fusarium wilt resistant breed) by FocBo1-10bp-dF1 priemr and FocBo1-10bp-dR1 primer <400> 14 tgtaaacatg cacagcctgc ttcagaagtt gggtaaagaa attgttcgtg cagagtccat 60 ttacaatcct ggaaaccggc ggttcttggt ggattctaag gatatatgtg aag 113 <210> 15 <211> 103 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> amplified seqeunce of A9435 and A9439(fusarium wilt susceptible breed) by FocBo1-10bp-dF1 priemr and FocBo1-10bp-dR1 primer <400> 15 tgtaaacatg cacagcctgc ttcagaagtt gggtaaagaa cagagtccat ttacaatccc 60 ggaaaacggc ggttcttggt ggattctaag gatatatgtg aag 103

Claims

서열번호 1로 이루어진 FocBo1 유전자의 염기서열 중 603번째 염기에 위치하는 InDel 마커를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드와; 서열번호 1로 이루어진 FocBo1 유전자의 염기서열 중 1764 내지 1773번째 염기에 위치하는 InDel 마커를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 양배추 시들음병 저항성 품종 또는 감수성 품종을 판별하기 위한 다형성 마커 조성물.
서열번호 7 및 8로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 10 및 11로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는, 양배추 시들음병 저항성 품종 또는 감수성 품종을 판별하기 위한 프라이머 세트.
제2항에 있어서, 상기 서열번호 7 및 8로 이루어진 프라이머 쌍은 서열번호 1로 이루어진 FocBo1 유전자의 염기서열 중 603번째 염기에 위치하는 InDel 마커를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 증폭하는 것을 특징으로 하는 양배추 시들음병 저항성 품종 또는 감수성 품종을 판별하기 위한 프라이머 세트.
제2항에 있어서, 상기 서열번호 10 및 11로 이루어진 프라이머 쌍은 서열번호 1로 이루어진 FocBo1 유전자의 염기서열 중 1764 내지 1773번째 염기에 위치하는 InDel 마커를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 증폭하는 것을 특징으로 하는 양배추 시들음병 저항성 품종 또는 감수성 품종을 판별하기 위한 프라이머 세트.
서열번호 7 및 8로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 10 및 11로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 양배추 시들음병 저항성 또는 감수성 품종 선별용 키트.
a) 양배추 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
b) 상기 a) 단계에서 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 7 및 8로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 10 및 11로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는 프라이머 세트를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; 및
c) 상기 b) 단계에서 증폭된 산물을 동정하여 양배추 시들음병 저항성 또는 감수성 품종을 판별하는 단계;를 포함하는 양배추 시들음병에 대해 저항성을 갖는 품종을 선별하는 방법.
제6항에 있어서, 상기 c)단계에서 증폭된 산물의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 염기서열 분석 또는 HRM(high resolution melting) 분석을 통해 이루어지는 것을 특징으로 하는 양배추 시들음병에 대해 저항성을 갖는 품종을 선별하는 방법.
서열번호 12, 13, 14 또는 15의 염기서열 또는 이의 상보적인 염기서열을 포함하는 양배추 시들음병 저항성 또는 감수성 품종 선별용 프로브.
서열번호 7 및 8로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 10 및 11로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는 프라이머 세트를 이용하여 증폭된 산물이 고정된 기판을 갖는 양배추 시들음병 저항성 또는 감수성 품종 선별용 마이크로어레이.