CN112813180B - 一种用于鉴定甘蓝叶片蜡粉性状的分子标记、引物对及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于鉴定甘蓝叶片蜡粉性状的分子标记、引物对及其应用，属于分子辅助育种技术领域。本发明公开的分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.：1所示，所述引物对的序列如SEQ ID NO.：2～3所示。利用本发明引物对甘蓝材料叶片的蜡粉情况进行鉴别，其分辨准确率高达99.8％，对甘蓝杂交育种以及品种改良等具有重要的意义，对甘蓝生产具有较高的指导价值。

Description

一种用于鉴定甘蓝叶片蜡粉性状的分子标记、引物对及其 应用

技术领域

本发明属于分子辅助育种技术领域，具体涉及一种用于鉴定甘蓝叶片蜡粉性状的分子标记、引物对及其应用。

背景技术

结球甘蓝是一种重要的叶菜类蔬菜，叶球的品质代表了其商品价值。甘蓝叶球品质的评价指标包括球型、营养成分，蜡粉含量等。普通甘蓝叶表具有蜡粉覆盖，一定程度上可以减轻逆境和病虫伤害，也决定了叶片的色泽。甘蓝蜡粉缺失突变体则叶色亮绿，叶片薄，口感好。因此，蜡粉性状的研究对于甘蓝品质改良具有重要意义。利用分子辅助育种培育符合目标性状的甘蓝新品种则是一种重要技术手段。

芸薹属蜡粉缺失性状遗传规律方面的研究发现蜡粉性状遗传方式不尽相同，蜡粉缺失性状的基因定位虽已有相关报道，但多基于图位克隆的方法，其需要研究群体较大，花费时间较长。目前关于甘蓝蜡粉性状基因定位与连锁的分子标记虽有报道，但鉴于甘蓝蜡粉分子标记研究和基因定位所使用群体不同，得到的结果也有很大差异。

发明内容

发明目的：本发明要解决的技术问题是提供一种用于鉴定甘蓝叶片蜡粉性状的分子标记。

本发明还要解决的技术问题是提供一种用于鉴定甘蓝叶片蜡粉性状的引物对。

本发明最后要解决的技术问题是提供上述引物对在鉴定甘蓝叶片蜡粉性状中的应用。

本发明在前期研究中，发明人在常规甘蓝品种410W中，发现了稳定遗传的亮叶突变体410M。410W和410M除蜡粉性状差异外，其他性状无差异。遗传分析表明，突变体410M的亮叶性状受隐性单基因控制。因此，410M是甘蓝亮叶育种的优异种质资源。本发明在获得亮叶突变体410M的基础上，将亮叶性状控制位点定位在C05染色体的8K区间内，并获得了与蜡粉性状紧密连锁的分子标记，在甘蓝蜡粉性状调控育种中具有重要的应用前景。

一种用于鉴定甘蓝叶片蜡粉性状的分子标记，该分子标记为甘蓝亮叶材料特异片段BolLY，其核苷酸序列如SEQ ID NO.：1所示。

通过有蜡粉材料410W(P1)与其田间自然突变的亮叶材料410M(P2)进行杂交配置F2群体，然后构建两个亲本混池与有蜡粉子代池和亮叶子代池，对其亲本进行重测序与BSA分析，通过对序列进行比较分析，发现亮叶材料基因组中有一个8K片段的缺失，而蜡粉材料中则均含有该片段。

从8K缺失区间最终设计得到本发明引物对，包括上游引物和下游引物，并经过验证具有较高的可靠性。核苷酸序列为：

上游引物：Bol-Del2-F1(SEQ ID NO.：2)：5’-CCTCGAAACAAACAGCCACG-3’；

下游引物：Bol-Del2-R1(SEQ ID NO.：3)：5’-CTCTTCGGGTTGGCATTCCT-3’。

或者，与SEQ ID NO.：2或SEQ ID NO.：3中任一的序列同一性大于90％的引物序列。

本发明是以8K缺失区间(SEQ ID NO.：1)的核苷酸序列为检测目标，若以该缺失基因及其上游或下游基因序列为检测目标也能够实现本发明的目的。

进一步地，利用发明SEQ ID NO.：1所示的序列及其上游基因序列为引物设计模板，设计得到的引物可以用于鉴定甘蓝叶片蜡粉性状。

进一步地，利用发明SEQ ID NO.：1所示的序列及其下游基因序列为引物设计模板，设计得到的引物可以用于鉴定甘蓝叶片蜡粉性状。

使用本发明引物对甘蓝基因组DNA进行PCR扩增，理论上本组合中亮叶甘蓝材料均不能够扩增得到84bp的特异性条带，而蜡粉材料则可以成功扩增出84bp的条带。

当然，由于植株个体之间的差异，个别甘蓝F2群体植株可能存在基因突变或者染色体方面的变异，造成个别亮叶单株也会有特异性条带，但整体来讲，使用本发明引物对886份本F2群体甘蓝植株进行蜡粉性状鉴定，鉴定无蜡粉植株的准确率高达99.8％左右，具有足够的经济效益。

上述引物对在制备甘蓝叶片蜡粉性状检测试剂中的应用在本发明的保护范围之内。

上述引物对在鉴定甘蓝叶片蜡粉性状中的应用在本发明的保护范围之内。

一种鉴定甘蓝叶片蜡粉性状的方法，包括以下步骤：

(1)提取待检测甘蓝植株的基因组DNA；

(2)以步骤(1)得到的基因组DNA为模板，利用SEQ ID NO.：2～3所示的引物对进行PCR扩增；

(3)对PCR扩增产物进行电泳检测；

若电泳检测结果在84bp处没有特异性条带，则为亮叶甘蓝材料；

若电泳检测结果在84bp处有特异性条带，则待检测甘蓝植株为正常蜡粉材料。

其中，所述的PCR扩增，其PCR扩增体系为20μl，在微量PCR管中依次加入其中含基因组DNA 1μl、上下游引物各1μl、2xEasyTaq PCR SuperMix 10μl，余量用水补齐。

所述的PCR扩增，其PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性50S，56℃50S，72℃延伸60S，35个循环；72℃延伸10min，然后于4℃保存；

(4)对(3)中的PCR产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，得到阳性条带，目的条带大小预计约为84bp。

(5)为进一步确定该84bp的片段是否为目的片段，继续如下实验；将(4)中阳性PCR产物样品进行切胶回收，回收产物直接与PMD18-T载体进行连接，转化到DH-5α菌株中进行培养，挑取阳性单菌落进行菌液复苏，经菌液PCR鉴定为阳性的样品进行进一步测序，依据测序结果进行比对以确定目的片段。

本发明可以用于鉴定甘蓝品种410W和410M，但不限于甘蓝品种410W和410M，若甘蓝品种的突变位点与本发明相同，则可以利用本发明中的分子标记和引物对进行鉴定。

有益效果：

本发明通过对田间自然突变获得的亮叶突变体与其野生型有蜡粉材料配置杂交组合，对其进行遗传规律分析，发现该亮叶性状为隐性单基因控制的性状。后对有蜡粉和亮叶甘蓝亲本进行基因组重测序以及F2群体构建混池进行BSA分析，发现了在亮叶亲本中存在8K片段的缺失，最终设计得到本发明引物对。后利用该引物对对现有F2群体，约886个单株进行蜡粉性状鉴定，其预测准确率高达99.8％，利用本发明引物对进行PCR鉴定甘蓝亮叶性状，对甘蓝材料的幼苗鉴定，杂交育种以及甘蓝蜡粉性状的品质改良具有重要意义，对甘蓝的实践生产具有较高的指导价值。

附图说明

图1为甘蓝亮叶突变体的表型；410W为野生型，有蜡粉材料；410M为亮叶突变体，无蜡粉；

图2为引物组合Bol-Del2-F1和Bol-Del2-R1与蜡粉和亮叶材料缺失段序列的位置关系。

图3为引物组合Bol-Del2-F1和Bol-Del2-R1在部分F2群体单株中琼脂糖凝胶电泳PCR检测结果；该引物组合能够快速准确的区分F2群体中的有蜡粉和无蜡粉单株。P1为有蜡粉亲本，P2为亮叶亲本，1-6为F2群体中有蜡粉单株，7-15为F2群体中亮叶单株，M为DNAmarker。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，实施例中的各种试剂均可通过商业渠道购买，所用引物由武汉擎科生物科技有限公司合成，测序由武汉擎科生物科技有限公司完成，BSA测序由北京诺禾致源科技股份有限公司完成，实验中所用的甘蓝材料为江苏省农业科学院蔬菜研究所提供。

实施例1：甘蓝亮叶突变体410M的获得。

供试甘蓝野生型材料410W，为江苏省农业科学院蔬菜所高代自交系，其蜡粉缺失突变体410M，为410W田间自然突变而来，并连续自交，性状稳定，410W植株体表有蜡粉，牛心型，叶球内充实，冬性较强，早熟；410M性状表现为植株体表无蜡粉覆盖，叶色亮绿，牛心型。

实施例2：基因组DNA的提取。

用改良的CTAB法提取甘蓝叶片基因组DNA，方法如下：

取甘蓝幼嫩叶片0.1g，经液氮研磨，加入500μl CTAB裂解液，转入1.5ml离心管中，65℃水浴0.5～1h后取出冷却，加入等体积的氯仿/异戊醇混合物后轻轻摇晃，12000r/min，离心8～10min，上清液用氯仿/异戊醇混合物抽提1～2次，加入预冷异丙醇，在4℃条件下静置3小时以上，收集絮状DNA用体积分数为70％的乙醇洗涤，干燥后将絮状DNA晾干并溶于200μL的TE缓冲液中保存，加入2μLRNA酶(10mg/mL)以去除RNA；DNA检测采用紫外分光光度计(Beckman coulter,USA)，确定其浓度和质量，同时取1μL用TE缓冲液稀释5倍后在1.0％的琼脂糖凝胶上检测，DNA原液保存于-20℃，工作液稀释为30ng/μL备用。

其中，所述的CTAB裂解液的组成如下：体积分数为2％CTAB，2mol/L NaCl₂,，20mmol/L EDTA，100mmol/L Tris-HCl，PH＝8.0，体积分数为0.2％β-巯基乙醇；所述的氯仿/异戊醇混合物中氯仿与异戊醇的体积比为24：1。

实施例3：PCR扩增。

PCR扩增体系如下：

使用实施例2得到的基因组DNA进行PCR扩增，其PCR反应体系为20μl，在微量PCR管中依次加入其中含基因组DNA 1μl，上下游引物各1μl，2xEasyTaq PCR SuperMix 10μl，余量用水补齐。

所述的PCR扩增的反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性50S，56℃50S，72℃延伸60S，35个循环；72℃延伸10min，然后于4℃保存；

产物在1.2％琼脂糖凝胶上电泳检测，紫外灯下观察并照相记录结果。:

实施例4：蜡粉缺失性状控制位点的定位。

将410M与410W杂交并自交，获得P1、P2、F1、F2、B1和B2六个基本世代，于3-4叶期调查各群体单株蜡粉有无情况，获得的F2群体经卡平方测验符合3:1的分离比例，回交群体符合1:1分离比，验证了410M的蜡粉缺失性状由隐性单基因控制。

410M与410W的F2群体共有886个单株，从中选择亮叶和蜡粉单株各30株，提取DNA进行等量混合，构建两个DNA子代混合池，与两个亲本一起进行基因组重测序，通过亲本重测序结合BSA分析结果，发现亮叶亲本在基因组C05染色体上存在7944bp的缺失，在这段缺失区域设计引物Bol-Del2-F1和Bol-Del2-R1，按照实施例2中的方法提取甘蓝F2群体(650个有蜡粉单株，236株亮叶单株)的DNA做为模板，使用Bol-Del2-F1和Bol-Del2-R1引物利用实施例3中的PCR扩增方法进行扩增检测，部分植株的电泳结果图如图3所示，结果显示：有蜡粉的亲本和F2单株在84bp处有单一特异条带，而亮叶材料的单株在84bp处无该条带，虽亮叶F2群体中有2份材料在84bp处出现特异性片段，但是利用该标记引物预测F2群体单株蜡粉有无的准确率高达99.8％。

序列表

<110> 江苏省农业科学院

<120> 一种用于鉴定甘蓝叶片蜡粉性状的分子标记、引物对及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 7944

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggtcagagtg gatccggaac ctttgcacat ggtagctgag cgtgaccctt tcgggagtgc 60

tacggcgagc atcctatgtc tgtattgggc gacgtggtcg tccggatcag tggttccgtt 120

atactccttt atgcttggga aagagaactt cctggccatc ttgatcaagg tgatctcgtc 180

cgtgaaggga gtatcggcgt aggaatctag gttgctcttc cgtatggggg gagctacccc 240

tgggagtctc tccaccatgg attgcatggc gtcgagccta tcggagaaca tctggtgaag 300

gtgagcgatc ataggagact ccgctctggc tgctccatct gatgcttctt tatcaggctc 360

aggctccgag tcgctgtcct cctggtcata ggtctgaggg tcgttggcct tttctcgcat 420

agaagcttct cctcctggtg ccgcagtcgg gagactcgcg cctgtcccgg agttaggtgt 480

ttccagaggc ggcatagggc gaatcgatgc ttcttgttgc tcgctgtgtt aagagcttgg 540

ttctcgtctc ggagggtaag attctccgat tcaagctggc tgagcttctt ggagctctgg 600

tccagttgct tggagtgttt gttgagtttt tcctttagga tctgatactc cgaggacaac 660

tcgggattgg tctcttcccg agctctatgt aacccggtta cttgaccttg caggtcatcg 720

atttatcttt ggagttcagc ctctctctgg gtagcttcag gtagctcgtc gtgctcgtcc 780

accggcatta tcacgtagtt tagattactc ccctccttct agcaccaaac tgttagggga 840

tttttgtgta ggatctttgt gagtaccacg gaacgatgga caagactggt gtttgtattg 900

attttgagag atgtagtaga aataaagact tgaagagacg ttttattgag tagacaaact 960

aggattacaa tgatttgagt aagaaccata attgtagccg tctagcccta gtctccaagt 1020

cttgaagtgt cgatcccttg cttttgggtt tgggttcccc ttatatagtc ttcctaaggc 1080

gggccttagt cggttagggt aggttaaact cttccatatt tgaaaatatg gaaggttctc 1140

cttatcggaa gttttccatt tccatttccc ggaggaaggg gggcgatcct gcgaccggac 1200

ccggaaatct ccacagcggg gaaccggggt tccttctagc ggggatcctg gaaaccgggg 1260

ttccttccag cagggatcca gaggccagtg tcctgcatgt ggtctggagg aattcaatac 1320

ctgagaattt ttccccaaca tcgtcgatgt agacctccat ggttcgcccg atctggtccg 1380

tgaacatcat gtttaccagc cgttgatagg ttgatcatgc gttctttagg ccgaagggca 1440

taaccttgta gcagtagatc cctctgggcg tcatgaagta tgttttctcc tggtcttcag 1500

gatgtataag tatttgatta tagcctgaga acgcgtccat gaagctcatc aactgatgcc 1560

ccgcggtggc gtccaccagc ttgtcgatat gaggcaactg gaaggggtcc tttggacagg 1620

acttgttgag gtccgtgaag tcgatacaga ctctccactt cccgttctat ttcttgacca 1680

cgacgacatt ggctagccat tccggatatt gcacctcacg aatgaaccct gcgccgagca 1740

ggctctggac ttcatcgttg atgattgcgt ctcttttggg agcgaacttc cttctctttt 1800

gtctgatggg ttgatgtagg ggatccacct tcagcttgtg catgatgatc tccgggtcga 1860

tcccaggcat atctgcgtgg gaccaagcga agcaatcgga gttagaccag aggaagtcta 1920

ctagtcttct cctcaatcct tcggtcagct tggagccgat cttgagatgt tgggtctgat 1980

ctccttcggt taatggttct tcggtgtgat gatccagagg cttactttgt aattgctata 2040

agaccttggt ctttcccttc aaagtagtct ggtagcagga gtgggaatac tcctgatcgc 2100

ctttatgccc cagggtgtac ggaattgcac catttggtga agagttgaag ggacggctcc 2160

catgccgtga atctagggcc gtcaatccag ggccgttgga ggatcatgtt gtaagacgag 2220

tcacagtcaa caacgaggaa cttggttgac atgttgactc cttcagcgta tacggggagg 2280

gttacttccc cggcggtttg tttgacttcc ccgctgaacc ctataagggg ggttatcctc 2340

cgagttagag cgctttcctc cagccccagg tccttgtatg cggcctggaa gatgatgttg 2400

tcggagcttc cattatctaa cagtatcctt tttaccaggc agttcgctac agtgagcgat 2460

atgactagag agtcgtgatg cggggtgaga actttctcct gctccttggc cgtgaacctt 2520

atttcgtccg ttcctaggag caggcgtttt ggcttggctt cttctaggtc gtgcttggca 2580

ttccaggtgc ttttctttgt ggctgcatgg cttttgattt ccgaaccgcc cgatatgaca 2640

tggatcactt ggtcctgttg cggtggcgag acgggagcag cttcagtggg cttacccgct 2700

gtctccttgc ttagatggct cttggccttc tcggaaagga actccctgag gtgttctttc 2760

ttaagcagct cgttgacctc gatcttttgt gcgatgcagt cctccgtttt gtgaccgtgg 2820

tctcagtgga agtcccacca gaaaccaggg ttccggaaag aatcggatgc tttcatcttc 2880

tgaggccact tgacctgttg gcccatctgc ctcagaacat tgatcagctc cggcgttgag 2940

accaagaggt gagagatgtc tggccacgtg gacactgcca tcccttctac cttctcgatc 3000

ggccgattct ggtatctgcc ccggtttcga tttccggagt ccctagttgg tctttgagag 3060

ggtttctcgt cttgctcggt ttggtctggt ctgatcgtct tgggatcttg cttctgttgc 3120

accttggcgc ggctggcgac atcttcctcc cattttacct gcgcccaggc tcgagatagg 3180

acgtcttcca tggttttgca ctggtatttg tttagctcct tatagaggtc cccgtcgggg 3240

agcatgcctc tcttgaaggc agagatagca gtggggatac tgcattcgga gatagccacc 3300

ttctcttgat tgaagcgggc tatgtagcct cgcaggggtt ctgctcggtg ctggaggatt 3360

tcgtagaggc tgtcggaggt cttttccagg tccctgctgc tggcgaattg ctccacgaat 3420

ttgtcgctga gaaccgcgaa ggaagctatg gacctagagg gtaggttgat ataccattgc 3480

agagcgggtc cggtcagggt ggagccgaac cctttgcaca tggtagcttc gcgcgacccc 3540

tttgggacgt ggtcgtccgg atcagtggtg ccatcatacg cctttatgct ggggaaggag 3600

aacttcctgg gcatctcgat caaggtaacc tcatccgtta agagagtgtc ggcgtaggag 3660

tcggggttgc tcttccagat ggggggagct accctcggga gcctctctac catggactgc 3720

atggtgtcga gcctctcgga gaatatctgg tgaaggtgag cgatcatagg agactccgct 3780

cttgctgctc cgtcaggtgc ttctttatcg ggtttgggct ccaattcgct gtcctccacg 3840

tcgtagttct gagcgtcctt agccttttcg cgcgttgatg cgtctcctcc cagcgccgcg 3900

gttgggagat tcgcgccgac ccggagttgg gtgtctcaag aatcggcatc gggctgagtc 3960

cggaatcgat gcttcttgtt actcgccgtg ttgggggttt gattttcgtc tcggagggta 4020

agattctccg attcgagctg gctgagtttc tcggctctct gctccagttg ctgggagtgt 4080

ttgttgagtt tgtccttcaa tctttagaac tccgaggaga gctcaagata ggtctcctcc 4140

cgagtttttt gtaactcagt tacttggttc tagcgccaaa ctgttaaggg gtttttgtgt 4200

tggatctttg tgagtaccac agaatgatgg acaaggctaa tgtttgtgtt gatttacaag 4260

tacgaaagta gaaagagacg tttttattag atcaaagagc tggaactaca atgattggtg 4320

tataaactct aattctagtc gcatagccct aaactctaag tctcgaagtg tcgatctcca 4380

gctttagggt ttaggttccc cttatatagt cttcttaagg caggccttag tcggttggag 4440

taggttaaac tcttccatat tcggaaatat ggaaggttct ccttattaga agttttcatt 4500

ttcctagggg aaagggggcg gtctcgggga ccggacccgg agaactccat agcggggacc 4560

cggggttcct cttagtgggg accaagaggt cggtgtcctg ccaggggtcc ggcagaattc 4620

agtacctgag tatttttccc caacagcagg tgtttgagaa aaatactcag gtattgaatt 4680

cctccagacc ccatgcagga gaccggcctc tgggtccccg ctaggagacg ccccgggtcc 4740

ccgctaggaa gtaatccggg tccggtccaa gggacccccc cccctcctct ggaaaaaaga 4800

aaactttcga taaggagaac cttccatatt tctaaatatg gaggacagcg aatctgagcc 4860

ggaacccgat aaggaagcac ctgagggagc agcaaaaacg gagtctcccc tgattgctta 4920

cttggagcag atgttctcga agaggctcga agccatgcag tccatggtag agaggctccc 4980

aggagtagct cccccccatc tgaaagagca atcccaaccc ttacgccgac actcctatca 5040

cggatgaaat caccttaatc gagatgccca ggaagttctt cttccccagc ataaaggcgt 5100

atgacggcac tagcgatccg gactgttgga gaaaaatatt ccatgaagag attactccag 5160

ctttcgggtt cctggctcca ggttccgggt tcctgccccc gggtctgggt cccttccccc 5220

cttatagggt tcaccgggga agtcaaataa accgccgggg aagtaaccct ccctgtatac 5280

gctgaaggag tcaacaagtc aaccaagttc ctcgttgttg actgcgactc gtctttcaac 5340

atgatcctta gacggccctg gattgacggc ccaggattca cggcatggga gccgtccttc 5400

aactcttcac caaatggtga aattccctac gccctggggc ataagagcga tcaggggtga 5460

tcaggaccct acgccctggg gcataagagc gatcaggggg gatcaggagt attcccgctc 5520

ctgcgaccag actactctga agggatagac caaagtctta tagcaattac agagcaaacc 5580

cccggctcat cacactgagg agccagaggt cgaagaaatg gacgacgtgc cattaatcga 5640

aggggaccac acccgaaatc tcatggtcgg ctccaaactg accgaaggat taaggaggag 5700

actaatagac ttcttcaggt ccaactccga ctgcgtcgct tggtctcatg cagacatgcc 5760

tgggatcgac ccggagatta tcatgcacaa gctgcaggtc gaccccctac atcaacccgt 5820

caggcaaaag aggaggaagt tcgcccttga aagggacgca atcatcaacg acgaggtgaa 5880

aaacctgctc ggctcgggtt tcattcgcga ggtacactac ccaaaatgtc ttgccaacgt 5940

ggttgtagtc aaaaagaaga acggtaagtg gagagactgc atagacttca caggcctcaa 6000

taagtcctgc ccaaaggacc cctttcctct acctcacatc gacaaactgg tcgatgccac 6060

agcggggcac cagctgatga atttcatgga tgcgttctcc ggctacaacc agatactcat 6120

gcatccggaa gcccaggaga agacgtcctt catgacatcc agagggatct attgctacaa 6180

agtcatgcct ttcggtttaa aaaacgcagg atcaacctac caaaggctgc tgaatatgat 6240

gttggccgat cagatagggc gaaccatgga ggtctacatc gatgacatgt tggtcaagtc 6300

tctagaagct gaggaccaca tatctcacct gcaacaagcc ttctccactc tccggaagta 6360

caacatgaag cttaacccag ctaaatgttc attcggggtc agtttcggta agttcctcgg 6420

gtacattgta acccaccggg gcattgaagc caacccggag caaatcaggg acatccattc 6480

gatcccttca acgaagaatg tcaaggaagt ccaaaagcta gcaggaagaa tggcggcctt 6540

gagaagattc atctcaagac tctccgacat atctcatgcc ttctttggaa cccacaaaaa 6600

cccaaaggac tttcagtgga cagaagagtg cgaatccgct ctccatgagc taaaggcgta 6660

tctcaccact cctcctctcc tatccaagcc actactcggt gagttcctgc tgctatatct 6720

agcagtctcg gagcacaccg taagcatcgt cctaataccc gaggagggaa gcaaacagct 6780

accaatctac tacgtaagta aggctttcct ggatgcagaa acccagtaca gcaatctaga 6840

gaatttggcc ttagccctga tagtggccgc ccgcaaattg cggccctact tttaggctca 6900

cccaatcgtg gtcatcacct ccttccccat aaagctggtc ctcgacaagc ctgaagtctc 6960

cggacgccta gccaaatggg ccgtggaact tggggaatac aatgtgattt ttcgaccagc 7020

cacatctata aagtgacagg tcctagcgga ctttgtggcc gaattctccc ctaccttgct 7080

cccagctttg gagaaagaag tgcgcctccg aagcgtaaca aagggagaag gagaatgggt 7140

cctgcatgtc gacggatcca gcaacattag aggagcgggt taggaatagt gcttacctcg 7200

ccgacaggga acacatcctc aagggccgtg aggtgcaact taaaagcaac caacagcgaa 7260

agcgagtacg aggccttaat cgcagggcta acactcgccc atcaaatggg ggcagaaaac 7320

atcaaggtct tcagtgactc ccagctgata atcaatcaag tgcatggaga gtaccaagca 7380

aagaatgaca acatgatcca gtatatggcg gtcgcccagt gactattcaa gaaattcaag 7440

agtagcaagc tcactcaaat cccagggagc aaaactcgca agccgatccc ctggctaatc 7500

tagggtccgc cctcgaaaca aacagccacg ctgaagcata cccttgctcg tgcttcagcg 7560

gccagccacc ctggaggaat gccaacccga agaggtctcc gctgtcgaaa agtgtgaaac 7620

ttggatgacc cccctagtcc ggtacctaga gaactatatt ctcccggaag attacaacga 7680

ggcaagaaaa atcaagaaac aagctgcaag gtattgtatc tcccaggaga agctataccg 7740

gagatccttc tcaggcccat acctaagatg tgtcacaccc tgagaagccg ctagaatcct 7800

tgtagaacta cataaaggag attgtggatc ccactctatc ggcagaagcc tggtgctcaa 7860

ggccagaagg gccgcagacg ccaaccgaca agccaaacac tgaaaccagt gtcaaaggca 7920

cgctccagtt tctaaactcc ctcc 7944

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cctcgaaaca aacagccacg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctcttcgggt tggcattcct 20

Claims (4)

1.用于鉴定甘蓝叶片蜡粉性状的引物对在制备甘蓝叶片蜡粉性状检测试剂中的应用，其特征在于，所述用于鉴定甘蓝叶片蜡粉性状的引物对的核苷酸序列如下：

上游引物Bol-Del2-F1：5’- CCTCGAAACAAACAGCCACG -3’；

下游引物Bol- Del2-R1：5’- CTCTTCGGGTTGGCATTCCT -3’。

2.一种鉴定甘蓝叶片蜡粉性状的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）提取待检测甘蓝植株的基因组DNA；

（2）以步骤（1）得到的基因组DNA为模板，利用SEQ ID NO.：2~3所示的引物对进行PCR扩增；

（3）对PCR扩增产物进行电泳检测；

若电泳检测结果在84bp处有特异性条带，则待检测甘蓝植株为有蜡粉单株；

若电泳检测结果在84bp处无特异性条带，则待检测甘蓝植株为亮叶单株。

3. 根据权利要求2所述的鉴定甘蓝叶片蜡粉性状的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述PCR扩增，其PCR扩增体系为20 µl体系，包括：基因组DNA 1 µl、上下游引物各1 µl、2xEasyTaq PCR SuperMix 10µl、余量用水补齐。

4.根据权利要求2所述的鉴定甘蓝叶片蜡粉性状的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述PCR扩增，其PCR扩增的条件如下：

94℃预变性3min；94℃ 变性50 S，60℃ 50 S，72℃延伸100 S，35个循环；72℃ 延伸10min。