CN111471786B - 与花椰菜花青素相关的分子标记及应用 - Google Patents

与花椰菜花青素相关的分子标记及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种与花椰菜花青素相关的分子标记及应用，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其存在于有花青素花椰菜的9号染色体上。开发的用于无花青素花椰菜辅助筛选的PCR引物，具有共显性、特异性强、稳定性好等优点，在55℃不产生非特异扩增，能够十分准确地检测出待测花椰菜材料是否为无花青素。采用本发明的引物NOPur‑F/NOPur‑R进行无花青素花椰菜的辅助筛选，在幼苗期就能够快速筛选出目标株系，提高育种效率。

Description

与花椰菜花青素相关的分子标记及应用
技术领域
本发明属于分子标记技术领域，具体涉及一种与花椰菜花青素相关的分子标记及应用。
背景技术
育种过程中最重要的环节之一就是目标性状的选择，选择目标性状的过程其实就是选择基因型的过程。然而在常规育种过程中，育种家通常都是根据肉眼观察到的表型来进行选择，很难获知后代的基因型，且耗时较长、选择效率低下。随着分子生物学的飞速发展，利用分子标记辅助选择结合常规杂交育种来进行新品种选育已得到广泛应用。分子标记辅助选择具有准确、快速、不受环境干扰的优点，可以快速检测到与目标性状基因紧密连锁的基因或位点，进而选择出目标性状，大大缩短育种进程。花椰菜属于十字花科芸薹属(Brassica)甘蓝类蔬菜，由于其营养丰富、质地柔嫩、味道鲜美深受广大消费者的喜爱，近年来栽培面积和消费量迅速增长，目前花椰菜已成为国内外蔬菜市场的主要蔬菜种类之一。随着生活水平的提高，人们对高营养、高品质蔬菜的需求逐渐提高，对品种类型也要求多样化。
花椰菜生产中经常出现的一个很严重的问题，即在花球采收期前后，一些花球表面出现低温下球面变紫的现象，虽然花球变紫食用时对人体没有伤害，却极其影响花球的美观，从而直接影响花椰菜的生产和销售。正常花球收购价格一般为1.5～2.0元/kg，但是一旦花球变紫将完全失去商品价值，严重影响农民种植效益。如何解决花球变紫问题一直是花椰菜生产上的难题。前人研究报道花青素的累积是花椰菜花球变紫的原因，筛选不含花青素的花椰菜具有十分重要的意义。通过开发与无花青素紧密连锁的分子标记，可实现无花青素花椰菜资源的快速鉴定，可大大缩短育种周期，提高育种效率。
发明内容
本发明的目的在于提供一种与花椰菜花青素相关的分子标记，该标记特异性强、稳定性好，能够快速有效地鉴定有/无花青素的花椰菜材料。
为实现上述目的，本发明采取如下技术方案：
与花椰菜花青素相关的分子标记，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其存在于有花青素花椰菜的9号染色体上，与花青素有/无紧密连锁。
上述分子标记的PCR引物为：
上游引物NOPur-F：5’-GTTACTTTGTCCGTGCCA-3’，
下游引物NOPur-R：5’-AATCCCATATCAATCAGCT-3’。
本发明还公开了上述分子标记在分子标记辅助育种中的应用以及在鉴定花椰菜花青素有无中的应用。
其中鉴定花椰菜蜡质是否缺失的方法，具体为：
(1)取待测花椰菜叶片组织，提取基因组DNA，稀释至约40ng/μL；
(2)以步骤(1)所获得的基因组DNA为模板，利用引物对NOPur-F、NOPur-R进行PCR反应，获得PCR产物；
(3)使用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测获得的PCR产物，使用快速银染法检测产物；
如果能扩增出如SEQ ID NO.2所示的1242bp的特征条带，则所检测材料为纯合的有花青素花椰菜；如果能扩增出如SEQ ID NO.3所示的553bp的特征条带，则所检测材料为纯合的无花青素花椰菜，如果既能扩增出如SEQ ID NO.2所示的1242bp的特征条带又能扩增出如SEQ ID NO.3所示的553bp的特征条带，则所述材料为杂合的有花青素花椰菜。
也即是当两条染色体都包含SEQ ID NO.2序列时，其为有花青素纯合株；当两条染色体都包含SEQ ID NO.3序列时，其为无花青素纯合株；当一条染色体包含SEQ ID NO.2序列，另一条染色体包含SEQ ID NO.3序列时，其为有花青素杂合株。
上述方法中，PCR反应总体积为20gL，其中10μmol/L的上下游引物各1.0μL，北京全式金生物
Figure BDA0002437782250000031
PCR SuperMix(货号AS112-11)10μL，40ng/μL的模板DNA 4μL，ddH2O4μL。
上述检测方法中，所述PCR反应的条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸5min；4℃保存。
上述检测方法中，所述琼脂糖凝胶电泳方法为：称取1.2g琼脂糖凝胶，放入三角锥瓶中；量取100mL 0.5×TBE缓冲液，倒入上述三角锥瓶中；以微波炉加热，使琼脂糖凝胶融化；待冷却至约50℃，加入5gL核酸染料GoldView，将琼脂糖溶液倒入制胶模中，然后在适当位置处插上梳子；大约30分钟后凝固，取出琼脂糖凝胶放入电泳槽中；用微量移液枪将PCR样本加入点样孔；接通电源，电压为120V，时间约30分钟；放入凝胶成像仪中拍照并观察，
上述方法或PCR标记检测应用中，所述花椰菜包括如下品种中的任一种：
PN-322、na-1、HYC-1、HYC-2、HYC-3、HYC-4、HYC-5、HYC-6、HYC-7、HYC-8、HYC-9、HYC-10、HYC-11、HYC-12、津品56、津品66、津品70；
另外，包含所述的分子标记引物对的试剂盒也落入本发明的保护范围之内。
本发明具有如下优点：
本发明开发了用于无花青素花椰菜辅助筛选的PCR引物，具有共显性、特异性强、稳定性好等优点，在55℃不产生非特异扩增，能够十分准确地检测出待测花椰菜材料是否为无花青素。采用本发明的引物NOPur-F/NOPur-R进行无花青素花椰菜的辅助筛选，在幼苗期就能够快速筛选出目标株系。
本发明提供了一种用于无花青素花椰菜辅助筛选的方法，该方法操作简单易行，只需提取待测花椰菜的基因组DNA，采用引物NOPur-F/NOPur-R进行PCR反应，通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物特征条带的长短，即可判断出待测植株中是否为无花青素花椰菜。
利用本发明提供的PCR标记进行花椰菜有无花青素的筛选，操作简单易行，能大大缩短育种周期，提高育种效率。
附图说明
图1表示在不同花椰菜自交系中引物的扩增情况，其中，M：DNA marker；WT：野生型花椰菜PN-322；na-1：无花青素花椰菜突变体，是从PN-322中发现的无花青素突变体；Ca1-Ca15：含花青素(少量)花椰菜自交系或品种，分别为：HYC-1、HYC-2、HYC-3、HYC-4、HYC-5、HYC-6、HYC-7、HYC-8、HYC-9、HYC-10、HYC-11、HYC-12、津品56、津品66、津品70。
具体实施方式
下面将通过具体实施例对本发明进行详细的描述。提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
本发明未特别说明的实验试剂均为本领域常规试剂，或采用本领域常规方法配制而得，可商购获得，规格为实验室纯级即可。
一、本发明所选用的材料如下：
花椰菜材料：PN-322、na-1、HYC-1、HYC-2、HYC-3、HYC-4、HYC-5、HYC-6、HYC-7、HYC-8、HYC-9、HYC-10、HYC-11、HYC-12、津品56、津品66、津品70。
上述材料中：HYC-1、HYC-2、HYC-3、HYC-4、HYC-5、HYC-6、HYC-7、HYC-8、HYC-9、HYC-10、HYC-11、HYC-12记载于文献：张小丽，文正华，柴阿丽等.松花菜种质资源评价及根肿病、黑斑病兼抗材料筛选.植物遗传资源学报，2020,21(2)：338-346.津品56、津品66、津品70为公知公用品种。PN-322为本实验室培育的自交系材料，na-1为在自交系PN-322中发现的无花青素突变体。
以上生物材料在申请人单位的实验室均有保存，可自申请日起二十年内向公众发放用于验证试验或者公众也可以通过购买的方式获取。
二、开发用于花椰菜无花青素材料辅助筛选的标记及其特异性引物：
标记序列来自于对无花青素性状连锁标记的开发。首先选取无花青素花椰菜材料“na-1”和有花青素花椰菜材料“HYC-1”，进行高通量测序，获得重测序数据，具体为：用CTAB(十六烷基三乙基溴化铵，Hexadecyl trimethyl ammonium Bromide)法提取花椰菜高质量基因组DNA，浓度大约为1000ng/μL，委托北京诺禾致源科技股份有限公司建库，并在HiSeq2500平台上测序，各获得了约15Gb的双端reads，将其比对到“HDEM”参考基因组上，所述“HDEM”全基因组序列记载于网址(http：//www.genoscope.cns.fr/projet_BKL/cgi-bin/gbrowse/boleracea/)中。对测序材料进行变异检测，共检测到50多万个InDel变异，并根据这些变异，使用Primer3.0设计了覆盖于9条染色体的100对InDel引物，以“na-1”和“PN-322”及其F2子代BSA混池筛选，初步将无花青素目的基因定位在9号染色体上，进一步对定位区间内的indel变异进行分析，找到一个插入缺失(SEQ ID NO.1)，根据该变异及其上下游序列，使用Primer5.0设计引物NOPur-F/NOPur-R：
上游引物NOPur-F：5’-GTTACTTTGTCCGTGCCA-3’，
下游引物NOPur-R：5’-AATCCCATATCAATCAGCT-3’。
利用该引物对无花青素花椰菜单株扩增，片段长度为553bp；对纯合有花青素花椰菜单株扩增，片段长度为1242bp；对杂合有花青素花椰菜单株扩增，有两条片段，片段长度分别为553b和1242bp。
三、本发明所述PCR引物筛选有无花青素花椰菜的准确性验证
步骤1、提取基因组DNA
用CTAB(十六烷基三乙基溴化铵，Hexadecyl trimethyl ammonium Bromide)法提取花椰菜PN-322、na-1、HYC-1、HYC-2、HYC-3、HYC-4、HYC-5、HYC-6、HYC-7、HYC-8、HYC-9、HYC-10、HYC-11、HYC-12、津品56、津品66、津品70基因组DNA。
DNA提取方法参见Murray MG，Thompson WF(1980)Rapid isolation of highmolecular weight plant DNA.Nucleic Acids Res 8：4321-4325。
步骤2、鉴定引物NOPur-F/NOPur-R在花椰菜材料中的扩增情况
委托华大基因公司人工合成实施例1中设计的引物，直接装入离心管中，或配成110μmol/L工作浓度后装入离心管中。
为鉴定引物在花椰菜中的扩增情况，选取了无花青素材料na-1、有花青素材料PN-322、HYC-1、HYC-2、HYC-3、HYC-4、HYC-5、HYC-6、HYC-7、HYC-8、HYC-9、HYC-10、HYC-11、HYC-12、津品56、津品66、津品70。以步骤1得到的基因组DNA为模板，按照下列反应体系和反应程序进行PCR反应。PCR反应总体积为20μL，其中10μmol/L的上下游引物各1.0μL，北京全式金生物
Figure BDA0002437782250000081
PCR SuperMix(货号AS112-11)10μL，40ng/μL的模板DNA 4μL，ddH2O 4μL。所述PCR反应的条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸5min；4℃保存。
扩增产物在1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，具体步骤为：称取1.2g琼脂糖凝胶，放入三角锥瓶中；量取100mL 0.5×TBE缓冲液，倒入上述三角锥瓶中；以微波炉加热，使琼脂糖凝胶融化；待冷却至约50℃，加入5μL核酸染料GoldView，将琼脂糖溶液倒入制胶模中，然后在适当位置处插上梳子；大约30分钟后凝固，取出琼脂糖凝胶放入电泳槽中；用微量移液枪将PCR样本加入点样孔；接通电源，电压为120V，时间约30分钟；放入凝胶成像仪中拍照并观察，
结果如图1所示：将引物NOPur-F/NOPur-R用于花椰菜材料扩增时，有花青素材料都出现1242bp的特征条带，而无花青素材料出现553bp的特征条带。
上述实验数据表明，本发明提供的引物NOPur-F/NOPur-R能够准确鉴定无花青素/有花青素花椰菜。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 天津科润农业科技股份有限公司
<120> 与花椰菜花青素相关的分子标记及应用
<130> 2020
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 689
<212> DNA
<213> Brassica oleracea L. var. botrytis
<400> 1
aagagtatat gttaatacgt atcactttgt gtgttttaag taacttacga gttttcttgg 60
cctgtaaagg aaatttgaag aaagtgcaac atcttcttga tttgccaaac gcgaagacgc 120
aactcacttt atggaaagcc gatttatctg acgaaggaag ctacgatgac gccataaacg 180
gatgcgacgg cgtttttcac atagctactc ccatggattt tgaatccaag gatcccgagg 240
tgagttatac tatgaacctt tttcttatta cacatcaatc ctacaagatt ttgttaaatg 300
agtttgtttg aatcagaacg aagtgataaa accaacagtg aatggagtgt tggggataat 360
gaaagcatgt gataaggcaa agaccgtacg aagaattgtg tttacttcgt ctgctggaac 420
ggttaatgtt gaggaacacc agaaaaatgt ctatgatgaa aacgattgga gtgatctcga 480
ctttatcatg tccaagaaga tgacaggatg ggtatatata ttaaggatca tatataaaaa 540
attaacccga ggttgatctt cttcaaagta atttatgttt ttgataaatt gttggcagat 600
gtatttcatg tcgaaaacgt tagccgagaa agcagcttgg gattacgcta aggaaaaagg 660
aatagatttc attagtatta tcccgacat 689
<210> 2
<211> 1242
<212> DNA
<213> Brassica oleracea L. var. botrytis
<400> 2
gttactttgt ccgtgccact gttcgcgatc ctggtacgta tcttacaaac tcgttaattt 60
ctcctaagag tatatgttaa tacgtatcac tttgtgtgtt ttaagtaact tacgagtttt 120
cttggcctgt aaaggaaatt tgaagaaagt gcaacatctt cttgatttgc caaacgcgaa 180
gacgcaactc actttatgga aagccgattt atctgacgaa ggaagctacg atgacgccat 240
aaacggatgc gacggcgttt ttcacatagc tactcccatg gattttgaat ccaaggatcc 300
cgaggtgagt tatactatga acctttttct tattacacat caatcctaca agattttgtt 360
aaatgagttt gtttgaatca gaacgaagtg ataaaaccaa cagtgaatgg agtgttgggg 420
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ggaacggtta atgttgagga acaccagaaa aatgtctatg atgaaaacga ttggagtgat 540
ctcgacttta tcatgtccaa gaagatgaca ggatgggtat atatattaag gatcatatat 600
aaaaaattaa cccgaggttg atcttcttca aagtaattta tgtttttgat aaattgttgg 660
cagatgtatt tcatgtcgaa aacgttagcc gagaaagcag cttgggatta cgctaaggaa 720
aaaggaatag atttcattag tattatcccg acattggtga tcggtccatt tataacaaca 780
tctatgccgc ctagccttat taccgcgctc tctcctatca ctcgtgagtg agcctacttt 840
ctaatccctc ttttttaact aagaggttaa tttaaaacgg taaaaatgtt ttaggtaacg 900
aggcacatta ctccatcata agacaaggac agtatgtcca cttggacgac ttatgcaatg 960
ctcatatatt cttgtacgaa caagctgctg ccaagggacg ttatgtttgt tcctctcacg 1020
atgcaacgat tcttactatc tccgagtttc tcaggcaaaa atatccagaa tataacgtgc 1080
cttcaacgta agatttttat cattaccggt ttaagctttt tttgcatatt cagtttaatt 1140
tttttttttc tgaatatgaa ctctttggaa caggtttgaa ggagtggatg agaatctaaa 1200
gagcattatg ttcagttcca agaagctgat tgatatggga tt 1242
<210> 3
<211> 553
<212> DNA
<213> Brassica oleracea L. var. botrytis
<400> 3
gttactttgt ccgtgccact gttcgcgatc ctggtacgta tcttacaaac tcgttaattt 60
ctccttggtg atcggtccat ttataacaac atctatgccg cctagcctta ttaccgcgct 120
ctctcctatc actcgtgagt gagcctactt tctaatccct cttttttaac taagaggtta 180
atttaaaacg gtaaaaatgt tttaggtaac gaggcacatt actccatcat aagacaagga 240
cagtatgtcc acttggacga cttatgcaat gctcatatat tcttgtacga acaagctgct 300
gccaagggac gttatgtttg ttcctctcac gatgcaacga ttcttactat ctccgagttt 360
ctcaggcaaa aatatccaga atataacgtg ccttcaacgt aagattttta tcattaccgg 420
tttaagcttt ttttgcatat tcagtttaat tttttttttt ctgaatatga actctttgga 480
acaggtttga aggagtggat gagaatctaa agagcattat gttcagttcc aagaagctga 540
ttgatatggg att 553

Claims (1)

1.与花椰菜花青素相关的分子标记或分子标记引物在花椰菜分子标记辅助育种或鉴定花椰菜有无花青素中的应用，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其存在于有花青素花椰菜的9号染色体上，所述分子标记引物为：
上游引物NOPur-F：5’-GTTACTTTGTCCGTGCCA-3’，
下游引物NOPur-R：5’-AATCCCATATCAATCAGCT-3’；
利用引物NOPur-F、NOPur-R以被检测花椰菜材料的基因组DNA为模板进行PCR扩增，如果能扩增出如SEQ ID NO.2所示的1242bp的特征条带，则所检测材料为纯合的有花青素花椰菜；如果能扩增出如SEQ ID NO.3所示的553bp的特征条带，则所检测材料为纯合的无花青素花椰菜，如果既能扩增出如SEQ ID NO.2所示的1242bp的特征条带又能扩增出如SEQID NO.3所示的553bp的特征条带，则所述材料为杂合的有花青素花椰菜。
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