CN110540987A - 一种水稻耐低温基因cold1新功能标记的设计及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于农作物育种技术领域，公开了一种水稻耐低温基因COLD1新功能标记的设计及其检测方法。根据COLD1基因在籼、粳编码区SNP2的等位单核苷酸差别，粳型COLD1Jap为碱基A，籼型COLD1Ind为碱基T或C，设计由5条引物组成的功能标记。5条引物混合在同管里进行PCR；正向外引物COLD1‑O‑F和反向内引物COLD1‑I‑R扩增粳型COLD1Jap的特征条带；反向外引物COLD1‑O‑R与2条内正向内引物即COLD1‑I‑F1和COLD1‑I‑F2扩增籼型COLD1Ind的特征条带。本发明能简便高效地对基因COLD1类型进行鉴别，可用于目的基因的资源鉴定和分子标记辅助育种。

Description

一种水稻耐低温基因COLD1新功能标记的设计及其检测方法
技术领域
本发明属于农作物育种技术领域，尤其涉及一种水稻耐低温基因COLD1新功能标记的设计及其检测方法。
背景技术
在我国，水稻是最主要的农作物之一，分布也较为广阔，全国各省均有种植。依据植物学分类，我国种植的水稻品种属于亚洲栽培稻(Oryza sativa L.)，包括粳稻(Oryzasativa L.ssp.japonica)和籼稻(Oryza sativa L.ssp.Indica)2个亚种，它们在形态、发育与生理等方面都表现出较大的差异。粳稻产量往往不及籼稻，但大都比籼稻具有更强的低温耐受性。尽管全球气候总体变暖，但不可否认，近年来极端气候频繁，如倒春寒和寒露风等低温灾害常有发生，导致水稻产量损失严重，特别是籼稻。利用粳稻耐低温基因导入籼稻，是改良提高籼稻抗寒性能的重要途径和方法，也是籼稻育种工作者的共识。
借助现代分子生物学技术，人们对于粳稻普遍具有的低温耐受性有了一定的认识，但耐低温胁迫的遗传机理较为复杂，研究进展还是相对较为缓慢。据统计，在水稻中，虽然有数百个耐低温QTL被定位，然而，能够进行精细定位和克隆分析的基因少之又少。已进行精细定位的约12个，涉及到萌发期、苗期、孕穗期及成熟期等不同时期的低温耐受性。克隆且开展功能研究的耐低温基因约有8个，涉及Ctb1、GSTZ2、qLTG3-1、LTG1、COLD1、qCTS-9、CTB4a、bZIP73等。其中，COLD1编码一个定位于质膜和内质网上的G蛋白信号调节因子，其与G蛋白α亚基RGA1互作以感知低温，应答低温胁迫机制，激活Ca2+通道，以增强G蛋白GTP酶活性，从而提高水稻的耐寒性能。水稻粳型COLD1Jap较籼型COLD1Ind具有更强的低温耐受性，可将粳型COLD1Jap基因导入籼稻品种，以提高籼稻的耐寒性，具有着重要的育种利用价值。研究已证实，粳型COLD1Jap与籼型COLD1Ind存在的SNP2位点DNA序列差异是导致基因功能不同的根本原因。鉴于COLD1基因在耐冷性品种选育中的重要作用，根据粳型COLD1Jap与籼型COLD1Ind在SNP2位点存在的单核苷酸差异，杨佳等(杨佳等，水稻耐低温基因COLD1功能标记的开发及应用，分子植物育种，网络首发地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/46.1068.s.20190311.0852.002.html，网络首发时间：2019-03-1110:41:37)开发了用于鉴定该基因的衍生型酶切扩增多态性序列(derived cleaved amplified polymorphicsequence,dCAPS)的功能标记；然而，该功能标记还存在以下一些不足：(1)涉及到限制性内切酶的使用，费用昂贵；(2)涉及到限制内切酶的使用，内切酶酶切时间较长，费工费时，操作繁琐；(3)只能鉴定出COLD1基因的籼、粳类型，不能对籼型的两种不同类型进行鉴定；(4)扩增及酶切后的产物片段较小，适用于操作较为复杂且费时的聚丙烯酰胺上电泳，不利于在操作快速、简单的琼脂糖凝胶上进行电泳。等等。
综上所述，COLD1基因具有着重要的育种利用价值，而现有鉴定技术又存在鉴定不彻底，且涉及到限制性内切酶的使用，带来了费用昂贵、操作繁琐及费时费工等弊端。因此，迫切建立一种操作简便、费用低廉及鉴定快速准确的COLD1鉴定方法，以便在育种中更好地推广应用。
发明内容
本发明针对现有技术利用dCAPS标记对COLD1基因的不同类型进行判断，涉及到限制性内切酶的使用，导致鉴定费用昂贵、检测流程复杂等诸多弊端，且现有技术不能对籼型COLD1Ind的两种不同等位差异碱基进行判断，本发明提供了一种水稻耐低温基因COLD1新功能标记的设计及其检测方法，能很好地解决了现在技术的存在的不足。
本发明是这样实现的，一种水稻耐低温基因COLD1新功能标记的设计，所述水稻耐低温基因COLD1新功能标记由5条引物组成，即正、反向外引物各1条，正向内引物2条，反向内引物1条；正向外引物用COLD1-O-F表示，反向外引物用COLD1-O-R表示；检测粳型COLD1Jap的反向内引物为COLD1-I-R；检测籼型COLD1Ind的正向内引物有两条，序列即COLD1-I-F1和COLD1-I-F2。
5条引物序列如下：
进一步，一种水稻耐低温基因COLD1新功能标记的设计，COLD1-O-F序列为SEQ IDNO：1；COLD1-O-R序列为SEQ ID NO：2；COLD1-I-F1序列为SEQ ID NO：3；COLD1-I-F2序列为SEQ ID NO：4；COLD1-I-R序列为SEQ ID NO：5。
进一步，一种水稻耐低温基因COLD1新功能标记的设计方法，所述水稻耐低温基因COLD1新功能标记的设计方法包括：
第一步，从NCBI网站下载水稻COLD1基因的DNA序列；
第二步，根据基因在籼型COLD1Ind为碱基T或C，在粳型COLD1Jap为碱基A，设计内引物，内引物的3'端落在SNP差异位点上，与该位点碱基相同或互补；籼型COLD1Ind的特异性内引物为正向内引物COLD1-I-F1和COLD1-I-F2，分别鉴定等位差异碱基T和C，为增强特异性，在两条内引物的3'端的第3个碱基均引入一个错配碱基，即碱基A变为G；粳型COLD1Jap的特异性内引物为反向内引物COLD1-I-R，鉴定等位差异碱基A，同理，为增强特异性，在该引物的3'端的第3个碱基引入一个错配碱基，即碱基C变为T；
第三步，在内引物的两翼设计外引物，外引物用在线引物设计软件进行设计，正反外引物均位于保守区域CDS编码区，正向外引物用COLD1-O-F表示，反向外引物用COLD1-O-R表示；
进一步，一种水稻耐低温基因COLD1新功能标记对水稻基因COLD1进行检测的方法，包括以下步骤：
第一步，水稻DNA的提取
取水稻的叶片0.3-0.4g，按照CTAB方法进行DNA提取。
第二步，功能标记的PCR扩增
(1)仅检测COLD1基因的粳籼性，即检测COLD1Jap或COLD1Ind，PCR扩增体系为20μL：浓度为10～100ng/L的DNA 2μL，5引物混合液2μL，10×Taq Buffer 2μL，Mg2+Buffer 1.2μL，d NTP Mixture 0.4μL，Taq DNA聚合酶0.4，dd H2O 12μL；
(2)当检测到为籼型COLD1Ind时，进一步鉴定其差异性位点碱基，则将(1)的引物混合液组分构成更改，只用任一条正向内引物与两条外引物和1条反向内引物组成4引物，即正向外引物、反向外引物、任一正向内引物和反向内引物组成4引物混合液；PCR扩增体系为20μL：浓度为10～100ng/L的DNA 2μL，4引物混合液2μL，10×Taq Buffer 2μL，Mg2+Buffer1.2μL，dNTP Mixture 0.4μL，Taq DNA聚合酶0.4，dd H2O 12μL；
第三步，琼脂糖凝胶电泳及观察拍照
将第二步的(1)和(2)反应体系中的扩增产物在1.5-2％的琼脂糖凝胶中于120V电泳35-45min，用核酸染料染色，在紫外凝胶成像仪上观察及拍照。
进一步，一种水稻耐低温基因COLD1新功能标记对水稻基因COLD1进行检测的方法，第二步(1)中的5引物，COLD1-O-F：COLD1-O-R：COLD1-I-F1：COLD1-I-F2：COLD1-O-R浓度比例为1:1:2:2:4；第二步(2)中的4引物，COLD1-O-F：COLD1-O-R：COLD1-I-F1或COLD1-I-F2：COLD1-O-R浓度比例为1:1:2:2。
进一步，一种水稻耐低温基因COLD1新功能标记对水稻基因COLD1进行检测的方法，其特征在于，第二步中的PCR反应程序是：在94℃预变性5min；在94℃变性30s，在60℃退火30s，在72℃延伸1min，循环31次；在72℃下再延伸10min，在10℃保存1min，产物取出备用。
进一步，一种水稻耐低温基因COLD1新功能标记的检测方法，其特征在于，第二步(1)中5条引物在同一管里进行PCR扩增，含纯合粳型COLD1Jap材料能扩增出458bp大小的特征条带，由正向外引物COLD1-O-F和反向内引物COLD1-I-R扩增；含纯合籼型COLD1Ind材料能扩增出大小为562bp或561bp的特征条带，其中562bp为正向内引物COLD1-I-F1和反向外引物COLD1-O-R扩增，而561bp则是正向内引物COLD1-I-F2和反向外引物COLD1-O-R；籼粳杂合子F1扩增出458bp及562bp或561bp两种类型的特征条带。
进一步，水稻耐低温基因COLD1新功能标记，其特征在于，第二步(2)中4引物在同一管里进行PCR扩增，含纯合粳型COLD1Jap材料能扩增出458bp大小的特征条带，由正向外引物COLD1-O-F和反向内引物COLD1-I-R扩增；若加入的任一引物为正向内引物COLD1-I-F1，等位差异碱基为T的纯合籼型COLD1Ind能扩增出562bp大小的特征条带，由正向内引物COLD1-I-F1与COLD1-O-R扩增，等位差异碱基为C的不能扩增出562bp的条带；若加入的任一引物为正向内引物COLD1-I-F2，等位差异碱基为C的纯合籼型COLD1Ind能扩增出561bp大小的特征条带，由正向内引物COLD1-I-F2与COLD1-O-R扩增，等位差异碱基为T的不能扩增出561bp的条带。
进一步，一种水稻耐低温基因COLD1新功能标记在水稻COLD1基因的资源鉴定和分子标记辅助选择育种中的应用。
本发明的优点及积极效果：
本发明提供一种水稻耐低温基因COLD1新功能标记的设计及其检测方法，具有以下优点：
(1)本发明提供的COLD1新功能标记的引物序列均位于基因序列相对稳定的编码区，确保了该标记在鉴定水稻COLD1中具有通用性和适用性。
(2)本发明提供的COLD1新功能标记建立在基因内部，与基因共分离，不存在因遗传交换而导致对基因型的误判。
(3)本发明提供的COLD1新功能标记，其引物混合同管一次PCR扩增，同时对COLD1的籼粳类型及杂合型进行准确鉴别。
(4)与现有的COLD1功能标记相比，本发明的新功能标记不使用限制性内切酶，费用低廉，且不存在酶切费工费时环节，操作简便快速。
(5)与现有的COLD1功能标记相比，本发明的新功能标记不仅能对COLD1的籼型COLD1Ind、粳型COLD1Jap类型进行区分，还弥补了现有功能标记不能对籼型COLD1Ind两种不同等位碱基进行判断的不足。
(6)与先前的COLD1功能标记相比，本发明提供的新功能标记扩增产物的片段相对较大，避免了在操作复杂费时的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，适合在操作简便快速的琼脂糖凝胶上电泳检测，高效快捷。
附图说明
图1是本发明实施例提供的一种水稻耐低温基因COLD1新功能标记的设计及检测方法流程图。
图2是本发明实施例提供的COLD1功能标记设计策略示意图；
图中：序列中字母下划线表示单核苷酸差异位点；省略号表示相同的碱基；箭头表示引物位置和扩增方向；方框内为引入的错配碱基。
图3是本发明实施例提供的功能标记对水稻材料的检测示意图；
图中：M，Ladder H1(100,200,300,400,500,600,700,800,900,1000bp)；1，日本晴；2，9311；3，F1(9311/越光)；4，越光；5，空育131；6，稻花香2号；7，松粳9号；8，特青；9，明恢63；10，珍汕97；11，南京6号。
图4是本发明实施例提供的功能标记对F2群体部分植株的检测示意图；
图中：M，LadderH1(100,200,300,400,500,600,700,800,900,1000bp)；1-16，F2植株。
图5是本发明实施例提供的四引物对籼型COLD1Ind基因差异碱基的鉴定示意图；
图中：(a)和(b)分别为COLD1-I-F2和COLD1-I-F1内引物参与的四引物检测体系；M，LadderH1(100,200,300,400,500,600,700,800,900,1000bp)；1,4：越光；2,5：9311；3,6：F1(9311/越光)。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种水稻耐低温基因COLD1新功能标记的设计及其检测方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
本发明实施例提供的一种水稻耐低温基因COLD1新功能标记的设计及其检测方法，该功能标记由5条引物组成，即正、反向外引物各1条，正向内引物2条，反向内引物1条。正向外引物用COLD1-O-F表示，反向外引物用COLD1-O-R表示；检测粳型COLD1Jap的反向内引物为COLD1-I-R；检测籼型COLD1Ind的正向内引物有两条，序列即COLD1-I-F1和COLD1-I-F2。
COLD1-O-F序列为SEQ ID NO：1，COLD1-O-R序列为SEQ ID NO：2，COLD1-I-F1序列为SEQ ID NO：3，COLD1-I-F2序列为SEQ ID NO：4，COLD1-I-R序列为SEQ ID NO：5。
如图1所示，本发明实施例提供的一种水稻耐低温基因COLD1新功能标记的设计及其检测方法包括以下步骤：
(1)5引物标记设计
根据基因在籼型COLD1Ind为碱基T或C，在粳型COLD1Jap为碱基A，设计内引物，为增强引物的特异性，内引物3'端的第3位引入错配碱基；在内引物的外侧设计外引物；引物表示为：正向外引物COLD1-O-F、反向外引物COLD1-O-R、正向内引物COLD1-I-F1和COLD1-I-F2、反向内引物COLD1-I-R
(2)5引物混合同管PCR扩增检测
将5引物混合同管对水稻DNA进行PCR扩增，电泳检测，呈现458bp的特征条带为粳型COLD1Jap，呈现562bp或561bp的特征条带为籼型COLD1Ind。
(3)籼型COLD1Ind两种不同的等位碱基类型扩增检测
在步骤(2)中检测出为籼型COLD1Ind后，由于籼型存在两种不同的等位碱基类型，采用任一正向内引物COLD1-I-F1或COLD1-I-F2与正向外引物COLD1-O-F、反向外引物COLD1-O-R和反向内引物COLD1-I-R组成4引物同管PCR扩增检测，若加入的任一引物为正向内引物COLD1-I-F1，等位差异碱基为T的纯合籼型COLD1Ind能扩增出562bp大小的特征条带，由正向内引物COLD1-I-F1与COLD1-O-R扩增，等位差异碱基为C的不能扩增出562bp的条带；若加入的任一引物为正向内引物COLD1-I-F2，等位差异碱基为C的纯合籼型COLD1Ind能扩增出561bp大小的特征条带，由正向内引物COLD1-I-F2与COLD1-O-R扩增，等位差异碱基为T的不能扩增出561bp的条带。
下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的描述。
1材料与方法
1.1供试材料
本发明的供试材料均来自毕节市农业科学研究所水稻科研基地的试验田，材料情况如下：
籼稻：9311、特青、明恢63、珍汕97和南京6号。
粳稻：日本晴、越光、空育131、稻花香2号和松粳9号。
籼粳杂合F1：9311/越光
籼粳F2：南京6号/稻花香2号
1.2试验方法
1.2.1功能标记的设计
COLD1基因在籼、粳中存在第四外显子的SNP2多态性，在对低温敏感的籼稻中为碱基T或C，而在耐低温的粳稻中为碱基A。从NCBI中下载相应的DNA序列(AP014960↘BAS90836，国家水稻数据中心：http://www.ricedata.cn/gene/list/2781.htm)，结合扩增受阻突变体系PCR技术原理进行功能标记设计。功能标记由5条引物组成，即正、反向外引物各1条，正向内引物2条，反向内引物1条。利用斯坦福大学的在线引物设计软件(https://www.yeastgenome.org/primer3)进行外引物标记设计，内引物则人工设计确定。引物由生工生物公司合成。
1.2.2 DNA的提取
取水稻的新鲜叶片约0.3-0.4g，按照传统的CTAB方法进行DNA提取。
1.2.3 DNA的PCR扩增及产物检测
(1)仅检测COLD1基因的粳籼性，即耐低温性与不耐低温性，PCR扩增体系为20μL：DNA 2μL(10～100ng/L)，引物Primer混合液2μL(浓度为：正向外引物2μM/L，反向外引物2μM/L，两正向内引物各4μM/L，反向内引物8μM/L)，10×Taq Buffer 2μL，Mg2+Buffer 1.2μL，dNTP Mixture 0.4μL(2.5mM/L)，Taq DNA聚合酶0.4(2.5U/μL)，dd H2O 12μL。COLD1-O-F：COLD1-O-R：COLD1-I-F1：COLD1-I-F2：COLD1-O-R浓度比例为1:1:2:2:4
(2)当检测到为籼型COLD1Ind时，进一步鉴定其差异性位点碱基(T或C)，则将(1)的引物混合液组分构成更改，只用任一条正向内引物与两条外引物和1条反向内引物组成4引物，即正向外引物、反向外引物、任一正向内引物和反向内引物组成4引物混合液；PCR扩增体系为20μL：浓度为10～100ng/L的DNA2μL，4引物混合液2μL(浓度为：正向外引物2μM/L，反向外引物2μM/L，任一正向内引物4μM/L，反向内引物4μM/L)，10×Taq Buffer 2μL，Mg2+Buffer 1.2μL，dNTP Mixture 0.4μL，Taq DNA聚合酶0.4，dd H2O 12μL；COLD1-O-F：COLD1-O-R：COLD1-I-F1或COLD1-I-F2：COLD1-O-R浓度比例为1:1:2:2。
反应程序为：在94℃预变性5min；在94℃变性30s，在60℃退火30s，在72℃延伸1min，循环31次；在72℃下再延伸10min，在10℃保存1min，产物取出备用。。
电泳检测：将扩增产物用1.5-2％的琼脂糖凝胶于120V电压下电泳35-45min左右，越华洋的gillgreen核酸染料染色；用生工的DNA分子量标准Ladder H1(100～1000bp)作对照，电泳结束后将凝胶置于伯乐凝胶成像系统GEL DOC XR下观察并拍照。
2结果与分析
2.1 COLD1基因功能标记的设计
根据基因在籼型COLD1Ind为碱基T或C，在粳型COLD1Jap为碱基A，结合扩增受阻突变体系PCR技术原理，设计内外向引物。外引物用斯坦福大学的在线引物设计软件进行设计，正反引物均位于保守区域CDS编码区，正向外引物用COLD1-O-F表示，反向外引物用COLD1-O-R表示；内引物由人工设计，3'端落在SNP差异位点上，检测粳型COLD1Jap的反向内引物为COLD1-I-R；由于籼型的COLD1Ind在SNP位点上是碱基T或C，因此，检测籼型COLD1Ind的正向内引物有两条，即COLD1-I-F1和COLD1-I-F2；为增强特异性，在3条内引物的3'端的第3个碱基各引入一个错配碱基。上述引物设计策略见图2所示。
根据引物设计策略，5条引物在同一管里进行PCR扩增，理论预计：所有材料均能扩增出965bp大小的条带，由外引物COLD1-O-F和COLD1-O-R扩增，为阳性对照；含纯合粳型COLD1Jap材料能扩增出458bp大小的条带，由正向外引物COLD1-O-F和反向内引物COLD1-I-R扩增；含纯合籼型COLD1Ind材料能扩增出大小为562bp(正向内引物COLD1-I-F1和反向外引物COLD1-O-R)或561bp(正向内引物COLD1-I-F2和反向外引物COLD1-O-R)；而籼粳杂合子可扩增出965bp、562bp(或561bp)及458bp三种类型的条带。引物序列见表1所示。COLD1-O-F为SEQ ID NO：1，COLD1-O-R为SEQ ID NO：2，COLD1-I-F1为SEQ ID NO：3，COLD1-I-F2为SEQ IDNO：4，COLD1-I-R为SEQ ID NO：5。
表1 COLD1基因功能标记的引物序列
2.2 COLD1功能标记的检测
选用对COLD1基因已经测序的9311、特青、明恢63、珍汕97和南京6号、日本晴、越光、空育131、稻花香2号、松粳9号及F1(9311/越光)等11个材料对功能标记进行验证。将所设计的5个引物在同管里对上述水稻材料进行PCR扩增，然后在1.5-2％的琼脂糖凝胶里进行检测。电泳图谱显示，日本晴、越光、空育131、稻花香2号及松粳9号等5个粳稻品种扩增出了约458bp大小的条带，特异性扩增COLD1基因编码区SNP2位点的核苷酸碱基A，为正向外引物COLD1-O-F和反向内引物COLD1-I-R扩增的产物；9311、特青、明恢63、珍汕97及南京6号等5个籼稻品种扩增出了约562bp大小的条带，特异性扩增COLD1基因编码区SNP2位点的核苷酸碱基T，为正向内引物COLD1-I-F1和反向外引物COLD1-O-R所扩增；而籼粳F1则扩增出了以上籼粳的所有特征条带(见图3所示)。供试材料均得到了有效扩增，且所扩增条带的类型与测序的碱基差异相吻合。值得注意的是，COLD1-I-F2引物的作用没有得到体现，那是由于该引物针对检测SNP2位点的差异碱基C，而所检测的水稻材料未存在与之相应的差异碱基的缘故。上述表明所设计的功能标记能对粳型COLD1Jap和籼型COLD1Ind及其杂合子进行鉴定区分。理论上，所有的供试材料还应出现由正向外引物COLD1-O-F和反向外引物COLD1-O-R扩增的大小为965bp的条带，然而，从图3看出，有的材料仅出现了微弱的965bp条带，有点材料甚至没有显示该条带，很可能由于在多引物扩增的反应体系中，存在明显的竞争效应，小片段扩增所需条件相对较低，获得扩增优势，扩增效率高；反之亦然。但是，因为965bp为所有材料共有条带，不属于特征条带，其是否出现，并不影响对COLD1基因籼粳属性的鉴定。
2.3 COLD1功能标记对F2(南京6号/稻花香2号)的检测
利用基因COLD1的五引物功能标记对F2(南京6号/稻花香2号)群体进行检测。从F2代群体中随机选择112株水稻植株，用COLD1功能标记进行鉴定，检测结果表明，在该F2群体被检测材料中，33株出现COLD1Ind基因型特征条带(562bp)、25株出现COLD1Jap基因型特征条带(458bp)及54株出现杂合型特征条带(458bp和562bp),部分植株电泳图谱见图4所示。在这F2群体中，这籼型COLD1Ind、杂合子型COLD1Ind/COLD1Jap、粳型COLD1Jap三种基因型的分离比例符合1:2:1(χ2＝1.286)，进一步证实了笔者所设计的COLD1新功能标记能准确鉴定该基因三种不同的类型，能用于鉴定相关的资源和标记辅助选择育种。
2.4籼型COLD1Ind基因SNP2位点突变碱基的鉴定
研究已证实，COLD1基因的第四外显子区域SNP2的突变位点在粳型COLD1Jap中为碱基A，而在籼型COLD1Ind中为碱基T或C，导致了籼、粳间对低温耐受性的差异。笔者根据这些碱基间的差异，设计了5个引物组成的功能标记对目的基因进行鉴定。在5条引物中，其中3条内引物是针对三种不同差异碱基而设计的，COLD1-I-R是鉴定粳型COLD1Jap碱基A的特异性内引物；而COLD1-I-F1和COLD1-I-F2分别是鉴定籼型COLD1Ind中碱基T和C的特异性引物。一般地，只需将5条引物混合同管PCR扩增对COLD1基因的籼、粳型进行鉴定即可，不管籼型COLD1Ind中的SNP2是碱基T或C，均能获得有效扩增。在5引物混合鉴定确定是籼型COLD1Ind后，若要具体鉴定差异碱基是T或C，则将鉴定该位点的特征内引物COLD1-I-F1和COLD1-I-F2分别与另外三条引物组成四引物同管扩增即可。从图5中可看出，在COLD1-I-F1参与的四引物中，籼型COLD1Ind位点为碱基T的9311扩增出了562bp的特征条带，见图5-b中编号为5的条带；而COLD1-I-F2参与的四引物中，由于9311位点中不是碱基C，因而没有扩增出561bp的条带，见图5-a中编号为2的条带，由于内引物没有得到有效扩增，竞争效应消除，两条外引物组成的大片段(965bp)能进行较好的扩增，同时也验证了提及的竞争效应产生小片段优先获得扩增优势的猜测。
可见，本发明所开发的新功能标记不仅解决了需利用限制性内切酶进行酶切确定COLD1的籼粳性问题，还弥补了先前标记难以对籼型COLD1Ind的SNP2中具体碱基鉴定问题。
近年来，水稻受到低温冷害导致严重减产的事件常有发生，特别是表现在籼稻上，其对低温更为敏感。鉴于此，人们加大了对低温冷害的关注度，如在贵州，耐低温性鉴定成为了该省品种审定的一个重要指标。随着分子生物学的不断进步，凭借分子技术手段，对耐低温基因的研究取得了一定的成绩，特别是近几年，通过不断的探索实践，克隆并功能分析了COLD1、bZIP73、HAN1等一些重要耐低温基因。耐低温基因的克隆及机理的阐明，可为育种利用提供前提和基础条件。传统的育种方法通过表型观察很难对目标基因进行准确的鉴定，存在周期长及效率低等缺点。为提高育种效率，分子标记辅助选择与传统育种相结合是一种重要的手段和方法。分子标记辅助选择是利用目标基因紧密连锁或共分离的分子标记，对植株是否具有目标基因进行研判。与传统观察育种法相比，大大提高了目标基因的选择效率和准确性。功能标记是属于共分离的分子标记，其是依据基因本身的DNA序列差异而设计，因此，能准确地鉴定出目标等位基因，高效率地对目标基因进行鉴定筛选，是分子标记中最为理想的标记类型。
扩增受阻突变体系PCR是在普通PCR基础上针对SNP位点碱基差异性建立起来专用于鉴定单核苷酸突变的衍生技术，数条引物混合同管扩增，一次性鉴定单核苷酸突变的纯合性与杂合性，是一种简单、快速及价格低廉的功能标记。基于扩增受阻突变体系PCR技术原理，结合COLD1基因在籼粳的第4条染色体第四外显子SNP2存在的碱基差异，粳型COLD1Jap为A，而籼型COLD1Ind为T或C，由于SNP2位点差异碱基为3个，因此，针对这一差异性，设计了3个不同的特异性内引物，3'末端落在SNP差异位点上，且与该碱基相同或互补，每条内引物均在3'端第3位碱基引入一个错配以增强引物的特异性，其中，COLD1-I-R为粳型COLD1Jap特异性内引物，其与正向外引物COLD1-O-F引物组成标记，扩增458bp大小的特征条带；COLD1-I-F1、COLD1-I-F2分别为籼型碱基T和C的特异性内引物，与反向外引物COLD1-O-R组成标记，扩增出562bp或561bp大小的特征条带；而籼粳杂合子F1扩增出458bp和562bp(或561bp)的特征条带。所设计引物均选择在基因的外显子区域，保证了引物的适用性和可靠性。经检测验证，以上5条引物同管进行PCR扩增，能准确的区分粳型COLD1Jap、籼型COLD1Ind及其杂合类型，与先前报道的衍生型酶切扩增多态性序列的功能标记相比，省去了内切酶的使用，降低了成本，也省去了酶切时间，也避免了使用聚丙烯酰胺凝胶电泳操作复杂等问题，提高了检测综合效率；同时，利用其中的四引物进行检测，还弥补了先前难以鉴定籼型COLD1Ind具体变异碱基的不足，是一种简便、高效、快捷的基因COLD1鉴定方法，可用于水稻种质资源COLD1基因籼粳属性的鉴定和分子辅助选择育种，有较好的推广应用价值。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 毕节市农业科学研究所
贵州省水稻研究所
<120> 一种水稻耐低温基因COLD1新功能标记的设计及其检测方法
<130> 2019
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
catttcccca tgccttctcc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caactgtccc aacgatacgc 20
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cctggcttac agggaaattg atgagat 27
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctggcttaca gggaaattga tgagac 26
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gagctgcctt tccaatgttt tgatgttct 29

Claims (8)

1.一种水稻耐低温基因COLD1新功能标记的引物，其特征在于，所述水稻耐低温基因COLD1新功能标记由5条引物组成，即正、反向外引物各1条，正向内引物2条，反向内引物1条；正向外引物用COLD1-O-F表示，反向外引物用COLD1-O-R表示；检测粳型COLD1Jap的反向内引物为COLD1-I-R；检测籼型COLD1Ind的正向内引物有两条，即COLD1-I-F1和COLD1-I-F2；
COLD1-O-F序列为CATTTCCCCATGCCTTCTCC；
COLD1-O-R序列为CAACTGTCCCAACGATACGC；
COLD1-I-F1序列为CCTGGCTTACAGGGAAATTGATGAGAT；
COLD1-I-F2序列为CTGGCTTACAGGGAAATTGATGAGAC；
COLD1-I-R序列为GAGCTGCCTTTCCAATGTTTTGATGTTCT。
2.一种如权利要求1所述水稻耐低温基因COLD1新功能标记引物的设计方法，其特征在于，所述水稻耐低温基因COLD1新功能标记的设计方法包括：
第一步，从NCBI网站下载水稻COLD1基因的DNA序列；
第二步，根据基因在籼型COLD1Ind为碱基T或C，在粳型COLD1Jap为碱基A，设计内引物，内引物的3'端落在SNP差异位点上，与该位点碱基相同或互补；籼型COLD1Ind的特异性内引物为正向内引物COLD1-I-F1和COLD1-I-F2，分别鉴定等位差异碱基T和C，为增强特异性，在两条内引物的3'端的第3个碱基均引入一个错配碱基，即碱基A变为G；粳型COLD1Jap的特异性内引物为反向内引物COLD1-I-R，鉴定等位差异碱基A，同理，为增强特异性，在该引物的3'端的第3个碱基引入一个错配碱基，即碱基C变为T；
第三步，在内引物的两翼设计外引物，外引物用在线引物设计软件进行设计，正反外引物均位于保守区域CDS编码区，正向外引物用COLD1-O-F表示，反向外引物用COLD1-O-R表示；
3.一种利用权利要求1所述的水稻耐低温基因COLD1新功能标记引物对水稻基因COLD1进行检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一步，水稻DNA的提取
取水稻的叶片0.3-0.4g，按照CTAB方法进行DNA提取；
第二步，功能标记的PCR扩增
(1)仅检测COLD1基因的粳籼性，即检测COLD1Jap或COLD1Ind，PCR扩增体系为20μL：浓度为10～100ng/L的DNA 2μL，5引物混合液2μL，10×Taq Buffer 2μL，Mg2+Buffer 1.2μL，dNTP Mixture 0.4μL，Taq DNA聚合酶0.4，dd H2O 12μL；
(2)当检测到为籼型COLD1Ind时，进一步鉴定其差异性位点碱基，则将(1)的引物混合液组分构成更改，只用任一条正向内引物与两条外引物和1条反向内引物组成4引物，即正向外引物、反向外引物、任一正向内引物和反向内引物组成4引物混合液；PCR扩增体系为20μL：浓度为10～100ng/L的DNA 2μL，4引物混合液2μL，10×Taq Buffer 2μL，Mg2+Buffer 1.2μL，d NTP Mixture 0.4μL，Taq DNA聚合酶0.4，dd H2O 12μL；
第三步，琼脂糖凝胶电泳及观察拍照
将第二步的(1)和(2)反应体系中的扩增产物在1.5-2％的琼脂糖凝胶中于120V电泳35-45min，用核酸染料染色，在紫外凝胶成像仪上观察及拍照。
4.如权利要求3所述的水稻耐低温基因COLD1新功能标记引物对水稻基因COLD1进行检测的方法，其特征在于，第二步(1)中的5引物，COLD1-O-F：COLD1-O-R：COLD1-I-F1：COLD1-I-F2：COLD1-O-R浓度比例为1:1:2:2:4；第二步(2)中的4引物，COLD1-O-F：COLD1-O-R：COLD1-I-F1或COLD1-I-F2：COLD1-O-R浓度比例为1:1:2:2。
5.如权利要求3所述的水稻耐低温基因COLD1新功能标记引物对水稻基因COLD1进行检测的方法，其特征在于，第二步中的PCR反应程序是：在94℃预变性5min；在94℃变性30s，在60℃退火30s，在72℃延伸1min，循环31次；在72℃下再延伸10min，在10℃保存1min，产物取出备用。
6.如权利要求3所述的水稻耐低温基因COLD1新功能标记引物对水稻基因COLD1进行检测的方法，其特征在于，第二步(1)中5条引物在同一管里进行PCR扩增，含纯合粳型COLD1Jap材料能扩增出458bp大小的特征条带，由正向外引物COLD1-O-F和反向内引物COLD1-I-R扩增；含纯合籼型COLD1Ind材料能扩增出大小为562bp或561bp的特征条带，其中562bp为正向内引物COLD1-I-F1和反向外引物COLD1-O-R扩增，而561bp则是正向内引物COLD1-I-F2和反向外引物COLD1-O-R；籼粳杂合子F1扩增出458bp及562bp或561bp两种类型的特征条带。
7.如权利要求3所述的水稻耐低温基因COLD1新功能标记引物对水稻基因COLD1进行检测的方法，其特征在于，第二步(2)中4引物在同一管里进行PCR扩增，含纯合粳型COLD1Jap材料能扩增出458bp大小的特征条带，由正向外引物COLD1-O-F和反向内引物COLD1-I-R扩增；若加入的任一引物为正向内引物COLD1-I-F1，等位差异碱基为T的纯合籼型COLD1Ind能扩增出562bp大小的特征条带，由正向内引物COLD1-I-F1与COLD1-O-R扩增，等位差异碱基为C的不能扩增出562bp的条带；若加入的任一引物为正向内引物COLD1-I-F2，等位差异碱基为C的纯合籼型COLD1Ind能扩增出561bp大小的特征条带，由正向内引物COLD1-I-F2与COLD1-O-R扩增，等位差异碱基为T的不能扩增出561bp的条带。
8.一种如权利要求1所述水稻耐低温基因COLD1新功能标记引物在水稻COLD1基因的资源鉴定和分子标记辅助选择育种中的应用。
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