CN101619352A - 一种基于等位基因特异性扩增的双探针基因突变检测方法及其专用芯片和试剂盒 - Google Patents
一种基于等位基因特异性扩增的双探针基因突变检测方法及其专用芯片和试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及基因分析领域中一种鉴别基因突变类型的方法及其专用芯片与试剂盒。本发明所提供的基因突变检测方法，是以待检测的来自于人体组织的基因组为模板，用针对特定突变位点设计的引物组和没有3’－5’端外切酶活性的DNA聚合酶进行多重等位基因特异性PCR扩增，然后将得到的PCR产物与基因芯片上的寡核苷酸探针(等位基因特异性探针)进行杂交，根据杂交结果确定各基因位点的突变类型。所述等位基因特异性探针，是指针对待测基因突变位点的特定基因型所设计的探针。本发明可以全面、系统、高通量地检测基因突变，与PCR－RFLP和测序法相比较，本发明环境污染轻，操作简单快捷。
Description
技术领域
本发明涉及基因分析领域中一种鉴别基因突变类型的方法及其专用芯片与试剂盒。
背景技术
随着人类基因组计划的完成和后基因组时代的到来，鉴定并描述的人类致病基因和药物相关基因越来越多，基因突变作为基因发生的可遗传性变异，往往可以导致基因的功能发生改变，因此通过对有显著功能意义的基因突变进行检测，可以推动临床疾病的预防、诊断和治疗，这已成为当今生命科学研究的热点之一，而大规模快速的基因突变检测方法也受到了人们的高度重视。
目前国内外对基因突变进行检测的方法主要有以下几种：
直接测序法：根据突变位点所在基因的序列进行PCR扩增，将产物直接进行测序，对突变位点的基因型进行直接解读，这是目前对基因突变进行检测的金标准，但是这种方法操作复杂，成本较高，需要用到专门的测序仪，因此仅用于科研，不适于在临床检测中广泛应用。
聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性分析，即PCR-RFLP，原理为将待测的DNA片段PCR扩增后用限制性内切酶进行酶切，将酶切后的产物进行电泳，根据酶切片段的大小和数目来判断目的基因是否存在基因突变。这种方法应用较广，但标准化程度差，对混合基因型的检测能力低，检测基因突变时，对于1个碱基以上的突变，需要多个检测系统分别检出，另外还需要进行凝胶的溴乙锭染色，存在着较大的环境污染和对人体健康的损害。
聚合酶链式反应-单链构想多态性分析，即PCR-SSCP法，原理是在非变性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链DNA和RNA分子依据其碱基序列不同而形成不同构象，一个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶上的移动速度改变。由于该法简单快速，因而被广泛用于未知基因突变的检测。用PCR-SSCP法检测小于200bp的PCR产物时，突变检出率可达70％-95％，但当片段大于400bp时，检出率仅为50％左右，而且该法不能测定突变的准确位点，还需通过序列分析来确定。与PCR-RFLP一样，该法由于需要制备聚丙烯酰胺凝胶，也存在较大的环境污染。
等位基因特异性引物PCR，即PCR-SSP，该方法是利用与等位基因序列互补的引物，对待测样本DNA进行特异性PCR扩增，等位基因特异性引物仅与其匹配的特异突变序列结合并特异性地扩增出等位基因特异性片段，用琼脂糖凝胶电泳对特异性PCR扩增产物进行检测，根据特异性PCR扩增产物的出现与否，对待侧样本的基因型别进行判断。这种方法操作简单、耗时短，对设备要求不高，结果判断容易，但缺点是反应条件不易控制，无法实现高通量，而且同样存在环境的污染。
以上的几种方法都仅适用于小样本量和少量基因突变位点的检测，要实现大样本高通量的基因检测，目前最理想的方法是基因芯片检测技术，与其他技术相比较，基因芯片具有体积小、重量轻、成本低，便于携带，防污染，分析过程高通量、高度自动化和速度快，所需样品和试剂少等诸多优点，近年来该种技术得到了人们的极大关注并取得了迅速发展，并有多个基于基因芯片技术进行的基因突变的检测的产品问世。
目前用于突变检测的大多是序列特异性探针杂交法(SSOP)基因芯片技术，该种技术利用寡核苷酸基因芯片的高通量和高度并行性的特点，对发生突变的众多基因设计序列特异性的寡核苷酸探针，将这些探针固定于同一张基片上，将待测的包含突变位点的基因片段进行体外扩增后与芯片杂交，根据杂交的信号判断突变位点的基因型。这种方法的基本原理是与基因特定序列互补的一段序列特异性寡核苷酸探针(SSOP)对基因序列的特异性识别。当探针的序列与基因序列完全匹配时所形成的杂交体热稳定性高于含有错配碱基的杂交体，据此通过控制杂交温度和其他杂交条件可以使完全匹配的杂交体与含有错配碱基的杂交体区分开来，从而达到基因分型的目的。
上述芯片技术尽管从理论上可以利用含有错配碱基的探针和目标基因形成的杂合体稳定性差的现象对基因序列上的碱基变化进行检测，但是往往由于碱基错配形式不同、基因序列不同、基因高级结构的差异等因素造成实际情况比理论情况要复杂得多，为了提高探针对单个碱基变化的检测准确率，一般倾向于把探针设计的较短，但是为了保证探针对基因识别的特异性和维持较高的杂交信号强度又不能使探针过短，而且即使是相同长度的探针也会由于其GC含量不同、所检测的突变碱基在探针上的相对位置不同等原因使得这种基于探针杂交的过程变得十分复杂，短探针与靶序列的杂交特异性问题这时候就变得非常突出，具体的表现就是野生型探针和突变型探针在杂交时都会出现非特异性的杂交信号，无法做到检测信号的“全或无”，必须严格控制杂交条件并反复摸索才能够准确地区分基因型。
目前也有一些方法可以用来提高探针检测基因序列变化，尤其是单个碱基变化的特异性，例如：对核酸上的戊糖进行化学修饰以提高探针Tm值的方法(LNA法)、用肽核酸代替核酸作为探针的方法(PNA法)。另外，还有人用碱基类似物(如3硝基砒硌)对寡核苷酸探针中的某个碱基进行替换从而拉大完全匹配和含单碱基突变探针之间Tm值得差异性。这些方法都因为实际操作难度大、成本高等原因局限在实验室阶段，无法用于大范围推广使用。因此，目前迫切需要建立一种操作方便、价格便宜、实用性强的方法来提高探针杂交的特异性，使寡核苷酸芯片在基因序列分析中发挥更大的作用。
发明内容
本发明的目的在于针对上述基因突变检测中存在的问题，提供一种利用基因芯片技术对基因突变，尤其是药物相关基因突变进行快速、敏感、高通量和特异性检测的方法及其专用芯片和试剂盒。
一种基于等位基因特异性扩增的双探针基因突变检测方法，包括如下步骤：以待检测的来自于人体组织的基因组为模板，用针对突变位点设计的引物组和没有3’-5’端外切酶活性的DNA聚合酶进行多重等位基因特异性PCR扩增，然后将得到的PCR产物与相应的根据该突变位点设计的等位基因特异性探针进行杂交，根据杂交结果确定各基因位点的突变类型；其中
所说的引物组包括以下5条引物：野生型等位基因内引物Inner primer-W、突变型等位基因内引物Inner primer-M、野生型等位基因外引物Outer primer-W、突变型等位基因外引物Outer primer-M、特异性扩增辅助引物GC-primer；
所述等位基因特异性内引物的结构为：靠近其5’端的是一段长度为8-15nt的由G和C组成的与模板DNA不匹配的序列；靠近其3’端的是一段包括17-30nt的序列，且3’端最后一个碱基恰好位于待检测的一个基因突变位点上，与该位点的突变型或野生型碱基匹配，其余碱基与突变位点前的相应片段完全匹配；
所述各个位点共用的特异性扩增辅助引物GC-primer是一段由G和C组成的序列，该序列与所述等位基因特异性内引物的靠近5’端部分完全相同；
每个基因突变位点对应两组寡核苷酸探针，分别对应于野生型等位基因和突变型等位基因，每组探针又包括一条长度为14-25nt的等位基因特异性短探针和一条长度为50-70nt等位基因特异性长探针，所述的每个突变位点的野生型等位基因特异性探针和突变型等位基因特异性探针分别与前面所描述的经等位基因特异性扩增生成的包含该突变位点的野生型碱基和突变型碱基的核苷酸片段匹配；所述等位基因基因特异性短探针与扩增片段上包含该基因突变位点的一段序列匹配，所述等位基因基因特异性长探针与位于扩增片段上该基因突变位点下游但不包含该位点的一段序列匹配。
本发明所提供的基因突变检测方法，是以待检测的来自于人体组织的基因组为模板，用针对特定突变位点设计的引物组和没有3’-5’端外切酶活性的DNA聚合酶进行多重等位基因特异性PCR扩增，然后将得到的PCR产物与基因芯片上的寡核苷酸探针(等位基因特异性探针)进行杂交，根据杂交结果确定各基因位点的突变类型。所述等位基因特异性探针，是指针对待测基因突变位点的特定基因型所设计的探针。
针对每一位点设计的引物组包括一对位于不同DNA链上的等位基因特异性内引物(Inner primer)和对应的两条外引物(Outer primer)，以及各个突变位点共用的一条特异性扩增辅助引物(GC-primer)。所述等位基因特异性引物(包括内引物和外引物)，是指针对待测基因突变位点的特定基因型所设计的引物。具体来说，每个基因突变位点的引物组包括以下5条引物：野生型等位基因内引物Inner primer-W、突变型等位基因内引物Inner primer-M、野生型等位基因外引物Outer primer-W、突变型等位基因外引物Outerprimer-M、特异性扩增辅助引物GC-primer。
所述等位基因特异性内引物的结构为：靠近其5’端的是一段长度为8-15nt的由G和C组成的与模板DNA不匹配的序列；靠近其3’端的是一段包括17-30个碱基的序列，且3’端最后一个碱基恰好位于待检测的一个基因突变位点上，与该位点的突变型或野生型碱基匹配，其余碱基与突变位点前的相应片段完全匹配；优选在3’端倒数第2或第3位处引入一个人工错配的碱基。
所述等位基因特异性外引物可根据相应的等位基因特异性内引物和待扩增的基因片段设计并合成，本领域的一般技术人员均可以掌握，详细操作步骤可参考《分子克隆实验指南》([美]J.萨姆布鲁克著，科学出版社)。
所述各个位点共用的特异性扩增辅助引物(GC-primer)是一段由G和C组成的寡核苷酸序列，用于在反应体系中促进特异性扩增反应的进行，故名。GC-primer的序列与所述等位基因特异性内引物的靠近5’端部分完全相同。GC-primer的5’端标记有荧光分子或可通过化学发光或固体微粒进行标记检测的分子，这些分子包括：地高辛分子(DIG)、生物素分子(Bio)、荧光素及其衍生物分子(FITC等)、其他荧光分子(如Cy3、Cy5等)、碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP)等，这些标记及其标记方法以及各标记物的检测方法都已是本领域众所周知的常规技术，本发明优选对共用特异性扩增辅助引物的5’端进行Cy5标记。
所述位于基因芯片上的等位基因特异性探针对各基因突变位点设计，每个基因突变位点对应两组探针，分别对应于野生型等位基因和突变型等位基因，每组探针又包括一条等位基因特异性短探针(长度为14-25nt)和一条等位基因特异性长探针(长度为50-70nt)。
所述的每个突变位点的野生型等位基因特异性探针(包括野生型短探针SP-W和野生型长探针LP-W)和突变型等位基因特异性探针(包括突变型短探针SP-M和突变型长探针LP-M)分别与前面所描述的经等位基因特异性扩增生成的包含该突变位点的野生型碱基和突变型碱基的核苷酸片段匹配。即SP-W和LP-W与Inner primer-W和Outer primer-W扩增生成的片段P1P2匹配，SP-W对应于P1P2上包含野生型碱基的一段序列，LP-W对应于P1P2上该基因突变位点下游但不包含该位点的一段序列；SP-M和LP-M与Inner primer-M和Outer primer-M扩增生成的片段P3P4匹配，SP-M对应于P3P4上包含野生型碱基的一段序列，LP-M对应于P3P4上该基因突变位点下游但不包含该位点的一段序列。P1P2和P3P4分别来自于双链DNA模板的不同单链。
本发明的技术路线参考图10。
用上述引物组进行的等位基因特异性PCR扩增的原理如下：
1)野生型等位基因内引物和突变型等位基因内引物分别与模板DNA双链的两条单链互补，且3’端正好与SNP位点重合，而引物的3’端是否与模板匹配决定了引物的延伸反应是否可以进行下去；只有当野生型等位基因存在时(即基因型为野生型纯合子或突变杂合子)，野生型等位基因内引物(Inner primer-W)和与之对应的野生型等位基因外引物(Outer primer-W)才可以扩增出包括相应待检测基因突变位点的野生型碱基在内的核苷酸片段；只有当突变型等位基因存在时(即基因型为突变型纯合子或突变杂合子)，突变型等位基因内引物(Inner primer-M)和与之对应的突变型等位基因外引物(Outer primer-M)才可以扩增出包括相应待检测基因突变位点的突变型碱基在内的核苷酸片段。
2)在引物的3’端倒数第2或第3位处引入一个人工错配的碱基，可以提高上述延伸反应的特异性。
3)所述各个位点共用的特异性扩增辅助引物(GC-primer)的序列与内引物的5’端部分完全一致，在PCR反应的最初循环，该引物不起作用，一旦内引物中的任一条或两条同时与模板结合并延伸，与之相对应的外引物向其5’端方向延伸，就形成了一段可以与GC序列完全互补的序列，在以下的循环延伸反应中，将以此片段为模板，在GC-primer和外引物的作用下进行PCR扩增反应，这样可以使特异性延伸产物的量增加。
4)对GC-primer进行5’端标记，可以使生成的等位基因特异性扩增产物的5′端也带有标记，可以被用来方便地对扩增产物进行检测，避免了对每个待检测基因突变位点的每条引物都进行标记的麻烦。
本发明可以用来检测药物相关基因的常见有功能意义的SNP突变，药物相关基因是人体内编码与药物代谢和发挥药理学效应密切相关的药物代谢酶、药物转运体及药物作用靶点的基因，其基因突变可对人体的药物反应性产生显著影响，对其常见基因突变进行检测，并利用检测的结果调整用药方案，是当前药物治疗学领域的一大发展方向。
根据本发明的实施例，所选择的药物相关基因突变位点如下表所示：
表1本发明涉及到的药物相关基因突变位点
上表中相关药物的编号为：①抗高血压药物②抗肿瘤药物③抗糖尿病药物④调脂药物⑤抗心率失常药⑥质子泵抑制剂⑦中枢神经系统药物/镇痛药⑧抗凝药⑨抗心绞痛药
上述各个突变位点的等位基因特异性内引物的序列(靠近3’端的序列)以及各个突变位点共用的特异性扩增辅助引物的序列如下：
表2根据本发明实施例所选取的涉及的药物相关基因突变的等位基因特异性内引物序列
上表中，针对每一药物相关基因的突变位点设计了一条野生型等位基因内引物(innerP-W)序列和一条突变型等位基因内引物(inner P-M)序列，在实际使用中，可选择一个或多个突变位点的两个序列的3’端任意连续17-30个碱基(包括3’端的野生型或突变型碱基在内)作为内引物的序列。另外，为了提高等位基因特异性扩增的效率，可以在靠近内引物的3’端引入一个人工错配的碱基，一般是在3’端的倒数第2或第3位上引入，所述人工错配碱基是天然的A、T、C、G四种碱基或其类似物，所述类似物包括尿嘧啶(U)、肽核酸(PNA)和锁定核酸(LNA)，这属于本领域技术人员熟知的方法。
本发明所述的基因芯片包括固相支持物和有序固定在固相支持物上的若干种寡核苷酸探针(等位基因特异性探针)。
所述的固相支持物可采用基因芯片领域常用的各种材料，如但不限于经活性基团修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片、各种纤维膜、尼龙膜等，用于修饰的活性基团如但不限于醛基、氨基、巯基、羧基等，本发明优选醛基化修饰的玻片。
本发明所涉及的用于检测表1中各突变位点的等位基因特异性短探针序列来自下述表3中17对单链核苷酸片段中的一对或任意多对，由所述17对单链核苷酸片段上的包括基因突变位点(方框内的碱基)在内的任意连续14-25个碱基组成，所述17对单链核苷酸片段的核苷酸序列分别是下表中的序列36至序列69。
表3本发明涉及的药物相关基因突变的等位基因特异性短探针序列
本发明所述基因芯片的等位基因特异性长探针根据每个基因突变位点的序列特点设计并优化，本发明优选的长探针序列为下述17对单链核苷酸片段中的一对或任意多对，所述17对单链核苷酸片段的核苷酸序列分别是序列表中的序列70至序列103。
在上述设计的各探针序列的基础上，为了控制杂交过程中各种因素对杂交信号值的干扰和对杂交过程进行评估，本领域技术人员还可通过本领域熟知的方法设计并合成芯片质控对照、阴性对照、阳性对照、空白对照等质控探针。
在上述设计的各探针序列的基础上，本领域技术人员可通过本领域熟知的方法进行探针合成，并通过对探针3’端或5’端增加间隔臂(如：聚胸腺苷酸、聚四乙二醇等)，来增加杂交容量；以及对其3’端或5’端进行化学集团修饰(比如氨基化修饰)，使探针能通过化学键结合到相应的固相支持物上(如醛基化玻片)；本发明优选对探针的3′端进行氨基修饰，其相较5′端修饰的探针具有更好的杂交效果。
根据本发明的另一方面，提供一种用于检测基因突变的试剂盒，其至少包括本发明的上述引物(包括内引物、外引物和/或特异性扩增辅助引物，不同位点的上述引物可以分开放置，也可以组成引物混合物)和基因芯片(包括固相支持物和寡核苷酸探针，探针可以固定在固相支持物上，也可不固定在固相支持物上)，本发明的试剂盒还可以进一步包含下述试剂中的一种或几种：从待检样本中提取DNA的样本处理试剂；PCR扩增试剂；杂交试剂；显色试剂。
上述样本处理试剂、PCR扩增试剂、杂交试剂以及显色试剂均可以使用本领域技术人员所熟知的在这些操作过程中需使用的各种试剂，这些试剂必要时可以包括在试剂盒中，也可以将其配方列明在试剂盒的说明书中由使用者按照说明书中的指示自行配制。
本发明的试剂盒中还可以包括相应的阴性对照和/或阳性对照样本。
本发明的引物(包括内引物、外引物和/或特异性扩增辅助引物)、芯片(包括固相支持物、短探针、长探针、各种指控探针)及其试剂盒(包括引物、芯片和/或其他试剂)可以针对一个基因突变进行设计，也可以组合用于检测多个基因突变。
常见的组合包括：
1、以SEQ ID NO.1-16所示的序列作为扩增样本所需的内引物序列，以SEQ IDNO.36-51所示的序列作为制备芯片所需的短探针序列，以SEQ ID NO.70-85所示的序列作为制备芯片所需的长探针序列，这样组成的芯片检测系统，可用于检测常见药物代谢酶(CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A5、TPMT、ALDH2)的基因突变rs1057910、rs3758581、rs17878459、rs4986893、rs776746、rs1065852、rs1142345和rs671，确定患者对相关药的代谢活性。
2、以SEQ ID NO.17-24所示的序列作为扩增样本所需的内引物序列，以SEQ IDNO.52-59所示的序列作为制备芯片所需的短探针序列，以SEQ ID NO.86-93所示的序列作为制备芯片所需的长探针序列，这样组成的芯片检测系统，可用于检测常见药物转运体(MDR1、BCRP、SLC22A1、SLC22A6)的基因突变rs1045642、rs2231142、rs2282143和rs4149056，确定患者对相关药的转运和清除能力。
3、以SEQ ID NO.25-34所示的序列作为扩增样本所需的内引物序列，以SEQ IDNO.60-69所示的序列作为制备芯片所需的短探针序列，以SEQ ID NO.94-103所示的序列作为制备芯片所需的长探针序列，这样组成的芯片检测系统，可用于检测常见药物作用靶点(ADRB1、AGTR1、VKORC1)的基因突变rs1801252、rs1801253、rs5186、rs9934438和rs7294，确定患者对相关药的敏感性。
较为优选的实施方案为，以SEQ ID NO.1-34所示的序列作为扩增样本所需的内引物序列，以SEQ ID NO.36-69所示的序列作为制备芯片所需的短探针序列，以SEQ IDNO.70-103所示的序列作为制备芯片所需的长探针序列，这样组成的芯片检测系统，可用于检测上述各药物代谢酶、药物转运体和药物作用靶点的常见基因突变，确定患者对相关药物的体内转运与代谢清除情况以及机体对药物的敏感性。
本发明的基因芯片可以根据点样区域的数目分为1人份、2人份和多人份不等，本发明根据实际应用的需要优选2人份的设计方案，即在基片上设置2个点样区域，分别点上所需的探针，一次可检测2份生物样品。
本发明的优点包括：
1、可以全面、系统、高通量地检测基因突变，与PCR-RFLP和测序法相比较，本发明环境污染轻，操作简单快捷。
2、与常用的SSOP芯片相比较，本发明通过等位基因特异性扩增和设置两对等位基因特异性探针(短探针和长探针)，极大的提高了探针杂交的特异性，可以克服SSOP芯片检测中不可避免的非特异性杂交现象，实现野生型探针与突变型探针检测的“全或无”，极大地提高了芯片检测的准确性和特异性。
3、另外，本发明没有在每个等位基因特异性引物上设置标记，而是将标记统一设置在特异性扩增辅助引物上，一次标记就可以满足各种等位基因特异性扩增的需要，减少了芯片检测的成本。
附图说明
图1为实施例1双探针基因突变检测芯片平面图；
图2为实施例2芯片扫描图；
图3为实施例3常规SSOP芯片扫描图；
图4为实施例3双探针基因检测芯片扫描图；
图5实施例4芯片A扫描图；
图6实施例4芯片B扫描图；
图7：实施例5芯片C扫描图；
图8：实施例5芯片D扫描图；
图9：实施例5芯片E扫描图；
图10：专利技术路线图；
图11：基因突变芯片检测系统的制备流程图。
具体实施方式
下面，结合附图，通过对本发明较佳实施方式的描述，详细说明但不限制本发明。
【实施例1】基于等位基因特异性扩增的双探针基因突变芯片检测系统的制备。
本实施例中的探针和引物的设计与合成、芯片制备等均是本领域一般技术人员熟练掌握的技能，详细操作步骤可参阅《分子克隆试验指南》(([美]J.萨姆布鲁克著，科学出版社)
1、制备流程
见附图11。
2、制备所需的主要原辅材料及仪器设备
表6
| 试剂和仪器设备 | 产地 | 试剂纯度/浓度 |
| 空白超平片 | 上海百傲科技有限公司 | / |
| 氨基硅烷试剂 | Acros(美国) | 99wt.％ |
| 戊二醛 | Acros(美国) | 25wt.％ |
| 95％乙醇 | 上海化工厂 | 分析纯 |
| 冰乙酸 | 上海化工厂 | 分析纯 |
| NaBH4 | 上海化工厂 | 分析纯 |
| Na2HPO4 | 上海化工厂 | 分析纯 |
| KH2PO4 | 上海化工厂 | 分析纯 |
| Na2CO3 | 上海化工厂 | 分析纯 |
| NaHCO3 | 上海化工厂 | 分析纯 |
| 氨基修饰寡核苷酸探针 | 上海Invitrogen公司 | ≥99％ |
| Cy5荧光标记引物 | 上海Invitrogen公司 | ≥99％ |
| 普通引物 | 上海Invitrogen公司 | ≥95％ |
| rTaq DNA多聚酶 | 大连宝生物工程有限公司 | 5u/μl |
| dNTPs | 大连宝生物工程有限公司 | ＞98％2.5mM |
| dUTP | Promega | ＞98％100mM |
| 尿嘧啶糖基化酶(UNG) | Promega | ＞98％1u/μl |
| DNA纯化试剂盒 | Promega | / |
| PCR仪 | 德国Biometra T1 Thermocycle | / |
| DNA合成仪 | ABI公司EXPEDITE8909 | / |
| 点样仪 | 德国GeSIM公司Nano-plotter 1.2 | / |
| 扫描仪 | Axon GenePix4100A | / |
| 台式离心机 | 德国Heraeus Legent Mach 1.6R | / |
| 低温恒温槽 | 上海精宏公司DKB-2015型 | / |
| 纯水仪 | 台湾艾科浦AM L-1-10-S | / |
3、详细制备过程
3.1芯片检测位点的选取
选取表1中的rs1057910、rs3758581、rs17878459、rs4986893、rs776746、rs1065852、rs1142345、rs671、rs1045642、rs2231142、rs2282143、rs4149056、rs1801252、rs1801253、rs5186、rs9934438和rs7294这17种基因突变作为本实施例的目标检测位点。
3.2寡核苷酸探针的设计与合成
根据表3的SEQ ID NO.36-69所示的序列，结合实验条件优化选取包括基因突变位点(方框内的碱基)在内的连续19个碱基(基因突变位点位于中间，前后各9个碱基)组成本实施例的等位基因特异性短探针。如根据SEQ ID NO.39所示的序列AGGAAGAGATTGAACG TGTC
TTGGCAGAAACCGGAGCCCC，取包括基因突变位点(方框内的碱基G)在内的连续19个碱基组成rs3758581的等位基因特异性短探针GAACGTGTC
TTGGCAGAA。
本实施例的等位基因特异性长探针序列如序列SEQ ID NO.70-103所示。
上述等位基因特异性短探针和长探针在确定序列构成后委托上海Invitrogen公司合成。
3.3芯片制备
第一步：处理基片——选用76mm×25mm×1mm超平片，将超平片浸于新配的重铬酸钾洗液中，放置7天后，用去离子水清洗，晾干；配制氨基硅烷的乙醇溶液，浓度分别为2％，将玻片浸入上述溶液中分别作用15分钟，取出用去离子水洗净，晾干；将上述氨基化处理的超平片分别浸入5％的戊二醛PBS(0.2mol/lM，pH8.0)溶液中，分别作用30分钟，PBS溶液清洗晾干。
第二步：设置点样区域——按图(1)所示的基因芯片平面结构图，在一块玻璃介质的基片上划分为两个基因探针点样区域，每个点样区域的面积为10mm*12mm，在每个点样区域内如表4所示呈阵列式分布以下基因探针，其中SP-W、LP-W、SP-M、LP-M分别代表每个基因突变位点的野生型等位基因短探针、野生型等位基因长探针、突变型等位基因短探针、突变型等位基因长探针。
| 行数 | 位点 | 1-5点 | 6-10点 | 11-15点 | 16-20点 |
| 1 | rs1057910 | SP-W | LP-W | SP-M | LP-M |
| 2 | rs3758581 | SP-W | LP-W | SP-M | LP-M |
| 3 | rs17878459 | SP-W | LP-W | SP-M | LP-M |
| 4 | rs4986893 | SP-W | LP-W | SP-M | LP-M |
| 5 | rs776746 | SP-W | LP-W | SP-M | LP-M |
| 6 | rs1065852 | SP-W | LP-W | SP-M | LP-M |
| 7 | rs1142345 | SP-W | LP-W | SP-M | LP-M |
| 8 | rs671 | SP-W | LP-W | SP-M | LP-M |
| 9 | rs1045642 | SP-W | LP-W | SP-M | LP-M |
| 10 | rs2231142 | SP-W | LP-W | SP-M | LP-M |
| 11 | rs4149056 | SP-W | LP-W | SP-M | LP-M |
| 12 | rs2282143 | SP-W | LP-W | SP-M | LP-M |
| 13 | rs1801252 | SP-W | LP-W | SP-M | LP-M |
| 14 | rs1801253 | SP-W | LP-W | SP-M | LP-M |
| 15 | rs5186 | SP-W | LP-W | SP-M | LP-M |
| 16 | rs9934438 | SP-W | LP-W | SP-M | LP-M |
| 17 | rs7294 | SP-W | LP-W | SP-M | LP-M |
第三步：点样与点样后处理——探针溶液各取2μl，用点样仪按上述格式打印到处理过的基片上；室温干燥放置18小时；干燥后立即使用或贮存于4℃备用。
3.4引物的设计与合成
根据表2中SEQ ID NO.1-34所示的序列，结合实验条件优化选取每个位点的innerP-W和inner P-M两个序列的3’端连续17个碱基(包括3’端的野生型或突变型碱基在内)作为该位点野生型等位基因内引物和突变型等位基因内引物的序列，为提高等位基因特异性扩增的特异性，在每个序列的3’端倒数第3个碱基处引入一个人工错配的碱基。如根据SEQID NO.4所示的序列5’-CTGCATGCAGGGGCTC CGGTTTCTGCCAAC-3’，取包括3’突变型碱基C在内的连续17个碱基组成rs3758581的突变型等位基因内引物(inner P-M)5’-CTCCGGTT TCTGCCAAC-3’。
相应的野生型等位基因外引物和突变型等位基因外引物利用本领域技术人员熟知的设计方法确定其序列。
特异性扩增辅助引物的序列如SEQ ID NO：35所示。
上述确定了序列的引物委托上海Invitrogen公司合成，所有等位基因特异性内引物的5’端均连接上了与特异性扩增辅助引物完全相同的一段GC序列，特异性扩增辅助引物的5’端用荧光分子Cy5进行标记。
3.5基于等位基因特异性扩增的双探针基因突变芯片检测系统的构成。
检测系统主要由寡核苷酸芯片、杂交液、洗涤母液、各检测基因位点的PCR反应液(包括引物、dNTP、buffer等)、没有3’-5’端外切酶活性的DNA聚合酶和阳性参照DNA标本等组分构成，寡核苷酸芯片4℃冷藏保存，其他组分于-20℃冷冻保存，其中PCR反应液需避光。
【实施例2】用实施例1的芯片检测系统检测已知基因型的临床样本的相关基因突变。
1、临床样本的处理
采集某已知基因型(用金标准测序法确定)的待检测个体的外周静脉血2ml，使用Promega DNA抽提试剂盒抽提DNA，也可用自配的DNA抽提试剂进行抽提，两种方法均为本领域技术人员所公知。DNA浓度应大200ng/ul，用紫外分光光度计检测A260/A280比值，此比值应介于1.60～1.80之间。
经测序检测，该样本的17个药物相关基因突变的基因型为：rs1057910-WW、rs3758581-WW、rs17878459-WM、rs4986893-WW、rs776746-MM、rs1065852-WW、rs1142345-WW、rs671-WM、rs1045642-WM、rs2231142-WW、rs2282143-WW、rs4149056-WW、rs1801252-MM、rs1801253-WW、rs5186-WM、rs9934438-WW、rs7294-WW(WW代表野生纯合子，WM代表突变杂合子，MM代表突变纯合子)。
2、PCR扩增
针对每个突变位点的PCR反应体系为：模板DNA 50ng；野生型等位基因外引物0.4μmol/L；突变型等位基因外引物0.4μmol/L；野生型等位基因内引物0.7μmol/L；突变型等位基因内引物0.7μmol/L；特异性扩增辅助引物0.7μmol/L；Hotstar Taq DNA聚合酶0.375U，2.5mmol/L的dNTP混合物1.2ul；10倍浓度的PCR Bufer 1.5ul；灭菌蒸馏水(使最终体积为20ul)。PCR反应程序为：95℃预变性6min，热循环40次(95℃，30S；56℃，30s；72℃，40s)，72℃延伸10min，4℃保存。本实施例共扩增对应17个基因检测位点的17管PCR产物。
用PCR方法扩增染色体基因特定片段的方法已经是本领域的公知技术，其中的关键在于引物设计，利用本发明公布的引物序列，本领域的技术人员可根据经验或有关文献确定反应体系和扩增程序，独立完成该操作步骤。
3、芯片杂交
取经43℃预热的杂交液7.5μL，加入15管PCR产物各3μL，混匀，全部吸取混合液转移到芯片的点样区域；将芯片放入杂交舱，密封杂交舱，然后放进43℃水浴保温2小时。
本发明扩增产物与基因芯片之间的杂交按照本领域的经典方法进行，本领域一般技术人员依照经验可以确定有关缓冲液、样品浓度、预杂交温度、杂交温度以及时间等的最适条件。
4、洗片
打开杂交舱，取出芯片，用洗涤液漂洗30秒，再置于去离子水中于室温洗涤30秒，取出，在离心机上瞬时离心30秒，甩去芯片上残留液体。
5、扫描
将干燥后的芯片立即用GenePix4100A扫描仪扫描，PMT设置为600，激光波长为635nm；扫描图像用扫描仪自带的图像分析软件Gene Pix 6.0对扫描结果进行定量分析，并保存分析结果。
通过芯片扫描仪得到的扫描图谱为一矩阵图谱，探针分布如表4所示，当某一位点的野生型短探针和长探针同时出现信号时该位点为野生型，当该位点的突变型短探针和长探针同时出现信号时该位点为突变型，当四个探针同时出现信号时为杂合子。
图像分析软件的定量分析结果如下：
| 行数 | 位点 | 1-5点 | 6-10点 | 11-15点 | 16-20点 |
| 1 | rs1057910 | 有信号 | 有信号 | 无信号 | 无信号 |
| 2 | rs3758581 | 有信号 | 有信号 | 无信号 | 无信号 |
| 3 | rs17878459 | 有信号 | 有信号 | 有信号 | 有信号 |
| 4 | rs4986893 | 有信号 | 有信号 | 无信号 | 无信号 |
| 5 | rs776746 | 无信号 | 无信号 | 有信号 | 有信号 |
| 6 | rs1065852 | 有信号 | 有信号 | 无信号 | 无信号 |
| 7 | rs1142345 | 有信号 | 有信号 | 无信号 | 无信号 |
| 8 | rs671 | 有信号 | 有信号 | 有信号 | 有信号 |
| 9 | rs1045642 | 有信号 | 有信号 | 有信号 | 有信号 |
| 10 | rs2231142 | 有信号 | 有信号 | 无信号 | 无信号 |
| 11 | rs4149056 | 有信号 | 有信号 | 无信号 | 无信号 |
| 12 | rs2282143 | 有信号 | 有信号 | 无信号 | 无信号 |
| 13 | rs1801252 | 无信号 | 无信号 | 有信号 | 有信号 |
| 14 | rs1801253 | 有信号 | 有信号 | 无信号 | 无信号 |
| 15 | rs5186 | 有信号 | 有信号 | 有信号 | 有信号 |
| 16 | rs9934438 | 有信号 | 有信号 | 无信号 | 无信号 |
| 17 | rs7294 | 有信号 | 有信号 | 无信号 | 无信号 |
芯片扫描结果见图(2)
6、分析确定基因型
利用与芯片检测系统配套的结果分析软件进行结果分析与整理，由上述杂交图扫描结果可确定各位点的基因型如下：rs1057910-WW、rs3758581-WW、rs17878459-WM、rs4986893-WW、rs776746-MM、rs1065852-WW、rs1142345-WW、rs671-WM、rs1045642-WM、rs2231142-WW、rs2282143-WW、rs4149056-WW、rs1801252-MM、rs1801253-WW、rs5186-WM、rs9934438-WW、rs7294-WW。
与测序结果相对照，所有位点的检测结果均准确无误。
【实施例3】本发明的基因芯片检测系统与常规SSOP基因芯片检测系统的比较。
按实施例1所述的方法制备用于检测rs1057910(CYP2C9*3)、rs4986893(CYP2C19*3)和rs1065852(CYP2D6*10)的双探针基因芯片检测系统，探针排布阵列为
| 行数 | 位点 | 1-5点 | 6-10点 | 11-15点 | 16-20点 |
| 1 | rs1057910 | SP-W | LP-W | SP-M | LP-M |
| 2 | rs3758581 | SP-W | LP-W | SP-M | LP-M |
| 3 | rs17878459 | SP-W | LP-W | SP-M | LP-M |
按公开号为CN 101054601A的发明专利(一种检测细胞色素P450酶系突变位点的寡核苷酸探针及基因芯片)所披露的方法制备用于检测rs1057910(CYP2C9*3)、rs4986893(CYP2C19*3)和rs1065852(CYP2D6*10)的常规SSOP基因芯片检测系统，芯片的探针排布阵列为：
| 行数 | 位点 | 1-5点 | 6-10点 |
| 1 | rs1057910 | 野生型探针 | 突变型探针 |
| 2 | rs3758581 | 野生型探针 | 突变型探针 |
| 3 | rs17878459 | 野生型探针 | 突变型探针 |
按实施例2和公开号为CN 101054601A的发明专利所述的方法对一个已经确定基因型为rs1057910-WM、rs4986893-WW和rs1065852-MM的临床样本进行检测，其杂交后的芯片扫描图分别如图(3)和图(4)所示。
两图相对照的结果显示，用常规SSOP基因芯片对该临床样本检测时，第二行rs4986893的野生型探针(1-5点)出现明显的信号，但本应没有信号的突变型探针(6-10点)也出现了信号，提示存在较为严重的非特异性杂交，即突变型探针也结合了与其不匹配的PCR扩增产物，当这种情况发生时，该位点本来为WW基因型很容易被误读成WM。第三行rs1065852的野生型探针也出现了这种情况。而本发明的双探针芯片检测系统没有出现这一问题。结果提示本发明的基因芯片检测系统可以很好地克服传统SSOP基因芯片的非特异性杂交问题。
【实施例4】等位基因特异性内引物3’端人工错配碱基的引入对基因芯片检测结果的影响。
选取SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20作为rs2231142(BCRP 421C＞A)的野生型和突变型等位基因内引物的备选序列，按照实例1所述的方法制备用于检测该突变的芯片A和芯片B。
芯片A的野生型等位基因内引物序列(Inner P-W_A)和突变型等位基因内引物序列(Inner P-M_A)分别为：
Inner P-W_A：GACGGTGAGAGAAAACTTAC(无错配碱基)
Inner P-M_A：AAGAGCTGCTGAGAACTT(无错配碱基)
芯片B的野生型等位基因内引物序列(Inner P-W_B)和突变型等位基因内引物序列(Inner P-M_B)分别为：
Inner P-W_B：GACGGTGAGAGAAAACT
AC(倒数第三位引入错配碱基)
Inner P-M_B：AAGAGCTGCTGAGAA
TT(倒数第三位引入错配碱基)
按实施例2所述的方法对两个已经分别确定rs2231142基因型为野生纯合子(WW)和突变纯合子(MM)的临床样本进行检测，其杂交后的芯片扫描图分别如图(5)和图(6)所示。
两图相对照的结果显示，基因型为野生纯合子(WW)和突变纯合子(MM)的临床样本用芯片A进行检测时，由于内引物的3’端没有引入人工错配碱基，因此当内引物与模板DNA在突变位点上不匹配时，延伸反应依旧可以进行下去，导致产生两种等位基因特异性扩增产物均可以生成，经杂交后，原本为WW和MM的样本均被误判为WM。当用在3’端倒数第3位引入了人工错配碱基的等位基因特异性内引物进行扩增时(芯片B)，延伸反应的等位基因特异性得到了保证，不会出现误判。
【实施例5】不同碱基数和序列位置的等位基因短探针的杂交效果比较。
在本发明中，对于等位基因特异性短探针实际使用时可以选择备选序列中的连续14-25个碱基(包括突变碱基)来合成探针，本实施例旨在证明上述碱基数和序列位置的差异并不影响结果的灵敏度和特异性。
选取SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：59作为rs2282143(SLC22A1 1022C＞T)的野生型和突变型等位基因短探针的备选序列，按照实例1所述的方法制备用于检测该突变的芯片C、芯片D和芯片E。
芯片C的野生型等位基因短探针序列(SP-W_C)和突变型等位基因短探针序列(SP-M_C)分别为：
SP-W_C：CCTCAGGCGC
GCGTGCGGAA(SEQ ID NO.58第11～31位碱基序列，共21个碱基)
SP-M_C：TTCCGCACGC
GCGCCTGAGG(SEQ ID NO.59第11～31位碱基序列，共21个碱基)
芯片D的野生型等位基因短探针序列(SP-W_D)和突变型等位基因短探针序列(SP-M_D)分别为：
SP-W_C：CTTCCTCAGGCGC
GCGTGCG(SEQ ID NO.58第8～28位碱基序列，共21个碱基)
SP-M_C：CGCACGCGCGCCTGAGGAAG(SEQ ID NO.59第14～34位碱基序列，共21个碱基)
芯片E的野生型等位基因短探针序列(SP-W_E)和突变型等位基因短探针序列(SP-M_E)分别为：
SP-W_E：CAGGCGCGCGTGCG(SEQ ID NO.58第14～28位碱基序列，共15个碱基)
SP-M_E：CGCACGC
GCGCCTG(SEQ ID NO.59第14～28位碱基序列，共15个碱基)
按实施例2所述的方法对三个已经确定rs2282143基因型为突变杂合子(WM)、野生纯合子(WW)和突变纯合子(MM)的临床样本进行检测，其杂交后的芯片扫描图分别如图(7)-图(9)所示。
三图相对照的结果显示，按照“选择备选序列中的连续14-25个碱基(包括突变碱基)这一标准来合成探针时，不同碱基数目和序列位置的等位基因特异性短探针产生相同的检测结果。
以上对本发明的描述并不限制本发明，本领域的技术人员可以根据本发明做出各种改变和调整，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。
序列表
<110>中南大学
<120>一种基于等位基因特异性扩增的双探针基因突变检测方法及其专用芯片和试剂盒
<160>103
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
atgctgtggt gcacgaggtc cagagataca 30
<210>2
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
atggggcagg ctggtgggga gaaggtcaag 30
<210>3
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
ctaaagtcca ggaagagatt gaacgtgtca 30
<210>4
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
ctgcatgcag gggctccggt ttctgccaac 30
<210>5
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
gtgaaggaag ccctgattga tcttggagag 30
<210>6
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
agtgggaaat ggcctcttcc agaaaactcg 30
<210>7
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
tgaaaacatc aggattgtaa gcaccccctg 30
<210>8
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
gaagcaaaaa acttggcctt acctggatct 30
<210>9
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
atctctttaa agagctcttt tgtctttcaa 30
<210>10
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
ggtaatgtgg tccaaacagg gaagagatac 30
<210>11
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>11
accggcgcca acgctgggct gcacgctacc 30
<210>12
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
cagcccgggc agtggcaggg ggcctggtga 30
<210>13
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>13
gggaattgac tgtctttttg aaaagttata 30
<210>14
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>14
tatgtctcat ttacttttct gtaagtagac 30
<210>15
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>15
tgggcgagta cgggctgcag gcatacactg 30
<210>16
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>16
agcaggtccc acactcacag ttttcacttt 30
<210>17
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>17
aacagccggg tggtgtcaca ggaagagatc 30
<210>18
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>18
tgtatgttgg cctcctttgc tgccctcaca 30
<210>19
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>19
tgggcactct gacggtgaga gaaaacttac 30
<210>20
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>20
tgttgcaagc cgaagagctg ctgagaactt 30
<210>21
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>21
ggaatctggg tcatacatgt ggatatatgt 30
<210>22
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>22
ctattccacg aagcatatta cccatgaacg 30
<210>23
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>23
cccttcattt gcagacctgt tccgcacgcc 30
<210>24
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>24
tcaggatgaa ggtgcgcttc ctcaggcgca 30
<210>25
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>25
ccgcctcgtt gctgcctccc gccagcgaaa 30
<210>26
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>26
tgtccactgc tgagacagcg gctcggggcc 30
<210>27
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>27
gcagccccga cttccgcaag gccttccagg 30
<210>28
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>28
ggcagccctg cgcgcgcagc agagcagtcg 30
<210>29
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>29
cctctgcagc acttcactac caaatgagca 30
<210>30
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>30
tttctccttc aattctgaaa agtagctaag 30
<210>31
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>31
aaggtgcccg gtgccaggag atcatcgacc 30
<210>32
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>32
tgttccccga cctcccatcc tagtccaaga 30
<210>33
<211>30
<212>DNA
<213>人上序列
<400>33
ctagattacc ccctcctcct gccatacccg 30
<210>34
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>34
gtgtggcaca tttggtccat tgtcatgtgt 30
<210>35
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<400>35
gcgcgcgggc ggc 13
<210>36
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>36
gctggtgggg agaaggtcaa tgtatctctg gacctcgtgc a 41
<210>37
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>37
tgcacgaggt ccagagatac cttgaccttc tccccaccag c 41
<210>38
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>38
ggggctccgg tttctgccaa tgacacgttc aatctcttcc t 41
<210>39
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>39
aggaagagat tgaacgtgtc gttggcagaa accggagccc c 41
<210>40
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>40
tggcctcttc cagaaaactc ctctccaaga tcaatcaggg c 41
<210>41
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>41
gccctgattg atcttggaga cgagttttct ggaagaggcc a 41
<210>42
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>42
aacttggcct tacctggatc cagggggtgc ttacaatcct g 41
<210>43
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>43
caggattgta agcaccccct agatccaggt aaggccaagt t 41
<210>44
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>44
gtccaaacag ggaagagata ttgaaagaca aaagagctct t 41
<210>45
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>45
aagagctctt ttgtctttca gtatctcttc cctgtttgga c 41
<210>46
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>46
cagtggcagg gggcctggtg ggtagcgtgc agcccagcgt t 41
<210>47
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>47
aacgctgggc tgcacgctac tcaccaggcc ccctgccact g 41
<210>48
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>48
tttacttttc tgtaagtaga tataactttt caaaaagaca g 41
<210>49
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>49
ctgtcttttt gaaaagttat gtctacttac agaaaagtaa a 41
<210>50
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>50
cacactcaca gttttcactt cagtgtatgc ctgcagcccg t 41
<210>51
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>51
acgggctgca ggcatacact aaagtgaaaa ctgtgagtgt g 41
<210>52
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>52
gcctcctttg ctgccctcac gatctcttcc tgtgacacca c 41
<210>53
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>53
gtggtgtcac aggaagagat tgtgagggca gcaaaggagg c 41
<210>54
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>54
ccgaagagct gctgagaact gtaagttttc tctcaccgtc a 41
<210>55
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>55
tgacggtgag agaaaactta aagttctcag cagctcttcg g 41
<210>56
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>56
gaagcatatt acccatgaac acatatatcc acatgtatga c 41
<210>57
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>57
gtcatacatg tggatatatg cgttcatggg taatatgctt c 41
<210>58
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>58
aggtgcgctt cctcaggcgc ggcgtgcgga acaggtctgc a 41
<210>59
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>59
tgcagacctg ttccgcacgc tgcgcctgag gaagcgcacc t 41
<210>60
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>60
ctgagacagc ggctcggggc tttcgctggc gggaggcagc a 41
<210>61
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>61
tgctgcctcc cgccagcgaa ggccccgagc cgctgtctca g 41
<210>62
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>62
gcgcgcgcag cagagcagtc cctggaaggc cttgcggaag t 41
<210>63
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>63
acttccgcaa ggccttccag cgactgctct gctgcgcgcg c 41
<210>64
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>64
caattctgaa aagtagctaa tgctcatttg gtagtgaagt g 41
<210>65
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>65
cacttcacta ccaaatgagc cttagctact tttcagaatt g 41
<210>66
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>66
acctcccatc ctagtccaag ggtcgatgat ctcctggcac c 41
<210>67
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>67
ggtgccagga gatcatcgac tcttggacta ggatgggagg t 41
<210>68
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>68
atttggtcca ttgtcatgtg cgggtatggc aggaggaggg g 41
<210>69
<211>41
<212>DNA
<213>人上序列
<400>69
cccctcctcc tgccataccc acacatgaca atggaccaaa t 41
<210>70
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>70
ctcacattag gaaacatttc ttgcatagtt ttataaggct ggcataatct taatatcaaa 60
<210>71
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<400>71
tatcagctaa agtccaggaa gagattgaac gtgtgattgg cagaaaccgg 50
<210>72
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<400>72
cagtgtactg ttcacagaaa ttccaatgaa tctagagata aattatgaat agtgattagt 60
<210>73
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<400>73
ttatcatcaa ttgtcatatt ctttgtctct tcttacagtt ttcgtcttga 50
<210>74
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<400>74
agacaatttg acttcctctc atcctatttc aataccattt atttctttct 50
<210>75
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<400>75
gcctgtgtga ctgaataaaa gcatacaaat acaatgaaaa tatgaatcta agt 53
<210>76
<211>53
<212>DNA
<213>人工序列
<400>76
agtaaacaca aaactagtca atgaatcaca aatacgcaag cagtcacata 50
<210>77
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<400>77
gttaattcga gattaatgta aaagtgatgt gttgatttta tgcatgccaa 50
<210>78
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<400>78
caggaaattg actttgatat agtttacaga gcttttcaga tttcaccagt 50
<210>79
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<400>79
caacccttct ttcaaaagca catgttaaat tcagtctaaa tgaaggagtt 50
<210>80
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<400>80
tcaccggcat ggaccatcat ctgggaatgg gatgctaact ggggcctctc 50
<210>81
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<400>81
acagaggacc aggcaggaca ctctcagcac accgagcgcg tgacccttcc cttataaa 58
<210>82
<211>58
<212>DNA
<213>人工序列
<400>82
ctataaaccc ttgtctttta ctcagatcct agcatccctt ttcacatggt 50
<210>83
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<400>83
tcaaccttct caagacaacg tatattgcat attttacctg aaacaagaaa 50
<210>50
<212>DNA
<213>人工序列
<400>84
agatatcaag gcccataacc atatgcatct cctttgattt gcaacttcaa 50
<210>85
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<400>85
tcccaagtag ttaagataac aagtatgtgc cactatgcct ggctaatttt 50
<210>86
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<400>86
cttcctgttt gggttagttg ttacctttac ctgatcacct gaccctcctt 50
<210>87
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<400>87
acaacgccta atacttctga gatgtatcct gacagcctta ttcttaaatc 50
<210>88
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<400>88
aaaactgaaa gcatcatgat cagcataagt aggactttcc ctgtgtggat 50
<210>89
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<400>89
gactgtttag tatacataac ataatccaca aagataacat aactaaggta aagttctagc 60
<210>90
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<400>90
atcaaaagga ggaatatagg gaatacagtg gggttggagg taaggtgatg 50
<210>91
<211>68
<212>DNA
<213>人工序列
<400>91
gcagcataag aatggactaa tacaccatat tgtcaaagtt tgcaaagtga atataaatta 60
cttgtact 68
<210>92
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<400>92
ttgctttatg agctgtgtca ccttgaggaa gttaactaac ctctctgggg 50
<210>93
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<400>93
gtgaaatcta ggaaggggta tctcacatca ctgaatctgg ggctgggttc 50
<210>94
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<400>94
catcgccaag acgccgcggc tgcagacgct caccaacctc ttcatcatgt c 51
<210>95
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<400>95
ctgcaagccc cttctctaat ttggctcctg tagtgtcctc agctcaggcc 50
<210>96
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<400>96
acagatttac cctacatttt cacagccgga ttcaaggtgt tctagactac 50
<210>97
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<400>97
aggtgatggc gaggtagcgg tccagggcaa tgacacacag ggtctcgatg 50
<210>98
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<400>98
ctcgaagaac aatgtcagaa actcgatgaa tgtgttgatt tgagaaattt 50
<210>99
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<400>99
ccaggtatcg atcaatgctg agacacgtga gtagaaacac actagcgtac 50
<210>100
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<400>100
aggtggcttc ttggaaatca cctttctcgg gcagggtcca aggcactggg 50
<210>101
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<400>101
gggcaccttt ggccacgtca ggattccatg tcactgaccc tatcctcccc 50
<210>102
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<400>102
agcaataaag tttcttagat caatcagcca agtctgaacc atgtgtctgc 50
<210>103
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<400>103
ctcttagcct tgccctgggg ttcttggacc ttccggaaac tgagccacat 50
Claims (15)
1、一种基于等位基因特异性扩增的双探针基因突变检测方法，包括如下步骤：以待检测的来自于人体组织的基因组为模板，用针对突变位点设计的引物组和没有3’-5’端外切酶活性的DNA聚合酶进行多重等位基因特异性PCR扩增，然后将得到的PCR产物与相应的根据该突变位点设计的等位基因特异性探针进行杂交，根据杂交结果确定各基因位点的突变类型；其中
所说的引物组包括以下5条引物：野生型等位基因内引物Inner primer-W、突变型等位基因内引物Inner primer-M、野生型等位基因外引物Outer primer-W、突变型等位基因外引物Outer primer-M、特异性扩增辅助引物GC-primer；
所述等位基因特异性内引物的结构为：靠近其5’端的是一段长度为8-15nt的由G和C组成的与模板DNA不匹配的序列；靠近其3’端的是一段包括17-30nt的序列，且3’端最后一个碱基恰好位于待检测的一个基因突变位点上，与该位点的突变型或野生型碱基匹配，其余碱基与突变位点前的相应片段完全匹配；
所述各个位点共用的特异性扩增辅助引物GC-primer是一段由G和C组成的序列，该序列与所述等位基因特异性内引物的靠近5’端部分完全相同；
每个基因突变位点对应两组寡核苷酸探针，分别对应于野生型等位基因和突变型等位基因，每组探针又包括一条长度为14-25nt的等位基因特异性短探针和一条长度为50-70nt等位基因特异性长探针，所述的每个突变位点的野生型等位基因特异性探针和突变型等位基因特异性探针分别与前面所描述的经等位基因特异性扩增生成的包含该突变位点的野生型碱基和突变型碱基的核苷酸片段匹配；所述等位基因基因特异性短探针与扩增片段上包含该基因突变位点的一段序列匹配，所述等位基因基因特异性长探针与位于扩增片段上该基因突变位点下游但不包含该位点的一段序列匹配。
2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的引物组中的内引物序列按照所选定的检测位点选自下列各组序列中的一组或多组：SEQ ID NO.1和2；SEQID NO.3和4；SEQ ID NO.5和6；SEQ ID NO.7和8；SEQ ID NO.9和10；SEQID NO.11和12；SEQ ID NO.13和14；SEQ ID NO.15和16；SEQ ID NO.17和18；SEQ ID NO.19和20；SEQ ID NO.21和22；SEQ ID NO.23和24；SEQID NO.25和26；SEQ ID NO.27和28；SEQ ID NO.29和30；SEQ ID NO.31和32；SEQ ID NO.33和34；
对应的等位基因特异性短探针序列按照所选定的检测位点选自下列各突变位点所对应的短探针序列组中的一组或多组：SEQ ID NO：36和37；SEQ IDNO：38和39；SEQ ID NO：40和41；SEQ ID NO：42和43；SEQ ID NO：44和45；SEQ ID NO：46和47；SEQ ID NO：48和49；SEQ ID NO：50和51；SEQ ID NO：52和53；SEQ ID NO：54和55；SEQ ID NO：56和57；SEQ ID NO：58和59；SEQ IDNO：60和61；SEQ ID NO：62和63；SEQ ID NO：64和65；SEQ ID NO：66和67；SEQ ID NO：68和69；
对应的等位基因特异性长探针序列按照所选定的检测位点选自下列各突变位点所对应的长探针序列组中的一组或多组：SEQ ID NO：70和71；SEQ ID NO：72和73；SEQ ID NO：74和75；SEQ ID NO：76和77；SEQ ID NO：78和79；SEQ IDNO：80和81；SEQ ID NO：82和83；SEQ ID NO：84和85；SEQ ID NO：86和87；SEQ ID NO：88和89；SEQ ID NO：90和91；SEQ ID NO：92和93；SEQ ID NO：94和95；SEQ ID NO：96和97；SEQ ID NO：98和99；SEQ ID NO：100和101；SEQ IDNO：102和103。
特异性扩增辅助引物的序列为SEQ ID NO.35。
3、根据权利要求2所述的方法，其中各引物组与探针的组合是：以SEQ IDNO.1-16所示的序列作为扩增样本所需的内引物序列，以SEQ ID NO.36-51所示的序列作为短探针序列，以SEQ ID NO.70-85所示的序列作为长探针序列。
4、根据权利要求2所述的方法，其中各引物组与探针的组合是：以SEQ IDNO.17-24所示的序列作为扩增样本所需的内引物序列，以SEQ ID NO.52-59所示的序列作为短探针序列，以SEQ ID NO.86-93所示的序列作为长探针序列。
5、根据权利要求2所述的方法，其中各引物组与探针的组合是：以SEQ IDNO.25-34所示的序列作为扩增样本所需的内引物序列，以SEQ ID NO.60-69所示的序列作为短探针序列，以SEQ ID NO.94-103所示的序列作为长探针序列。
6、根据权利要求2所述的方法，其特征在于其中各引物组与探针的组合是：SEQID NO.1-34所示的序列作为扩增样本所需的内引物序列，以SEQ ID NO.36-69所示的序列作为短探针序列，以SEQ ID NO.70-103所示的序列作为长探针序列。
7、根据权利要求1至6之一所述的方法，其特征在于在内引物3’端倒数第2或第3位处引入一个人工错配的碱基。
8、根据权利要求1至6之一所述的方法，其特征在于GC-primer的5’端标记有荧光分子或可通过化学发光或固体微粒进行标记检测的分子。
9、根据权利要求1至6之一所述的方法，其特征在于对探针3’端或5’端增加间隔臂。
10、根据权利要求1至6之一所述的方法，其特征在于对探针的3′端进行氨基修饰。
11、实施权利要求1至10之一的方法所用的基因芯片，包括探针，其特征在于所说的探针为每个基因突变位点对应两组寡核苷酸探针，分别对应于野生型等位基因和突变型等位基因，每组探针又包括一条长度为14-25nt的等位基因特异性短探针和一条长度为50-70nt的等位基因特异性长探针，所述的每个突变位点的野生型等位基因特异性探针和突变型等位基因特异性探针分别与经等位基因特异性扩增生成的包含该突变位点的野生型碱基和突变型碱基的核苷酸片段匹配。
12、根据权利要求11所说的基因芯片，其特征在于等位基因特异性短探针序列选自下列短探针序列组中的一组或多组：SEQ ID NO：36和37；SEQ ID NO：38和39；SEQ ID NO：40和41；SEQ ID NO：42和43；SEQ ID NO：44和45；SEQ IDNO：46和47；SEQ ID NO：48和49；SEQ ID NO：50和51；SEQ ID NO：52和53；SEQ ID NO：54和55；SEQ ID NO：56和57；SEQ ID NO：58和59；SEQ ID NO：60和61；SEQ ID NO：62和63；SEQ ID NO：64和65；SEQ ID NO：66和67；SEQ IDNO：68和69；
对应的等位基因特异性长探针序列选自下列各长探针序列组中的一组或多组：SEQ ID NO：70和71；SEQ ID NO：72和73；SEQ ID NO：74和75；SEQ ID NO：76和77；SEQ ID NO：78和79；SEQ ID NO：80和81；SEQ ID NO：82和83；SEQ IDNO：84和85；SEQ ID NO：86和87；SEQ ID NO：88和89；SEQ ID NO：90和91；SEQ ID NO：92和93；SEQ ID NO：94和95；SEQ ID NO：96和97；SEQ ID NO：98和99；SEQ ID NO：100和101；SEQ ID NO：102和103。
13、根据权利要求11或12所述的基因芯片，其特征在于探针3’端或5’端有间隔臂。
14、根据权利要求11或12所述的基因芯片，其特征在于探针的3′端进行氨基修饰。
15、一种实施权利要求1至10之一的方法所用的试剂盒，包括引物组，基因芯片，其特征在于所说的引物组包括以下5条引物：野生型等位基因内引物Inner primer-W、突变型等位基因内引物Inner primer-M、野生型等位基因外引物Outer primer-W、突变型等位基因外引物Outer primer-M、特异性扩增辅助引物GC-primer；
所述等位基因特异性内引物的结构为：靠近其5’端的是一段长度为8-15nt的由G和C组成的与模板DNA不匹配的序列；靠近其3’端的是一段包括17-30nt的序列，且3’端最后一个碱基恰好位于待检测的一个基因突变位点上，与该位点的突变型或野生型碱基匹配，其余碱基与突变位点前的相应片段完全匹配；
所述各个位点共用的特异性扩增辅助引物(GC-primer)是一段由G和C组成的序列，该序列与所述等位基因特异性内引物的靠近5’端部分完全相同；
所说的基因芯片是权利要求11至14之一所说的基因芯片。
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