CN101548010A - 测定多等位基因单倍型的方法 - Google Patents

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Abstract

扩增含两种等位基因的区域时，所述等位基因之一的多态型位于或接近扩增引物的3’末端，从而所述链仅可从两个引物之一延伸，一个匹配突变型核苷酸，一个匹配于野生型核苷酸。其他引物不受等位基因的影响，但定位于在扩增子中包括其他等位基因。PCR仅扩增具有一种第一等位基因的特异等位基因的靶基因组DNA。所述技术探索出，如果可鉴定扩增子中的第二等位基因的等位基因，则可测定第一和第二等位基因的单倍型。设计具有互补于用于鉴定第二等位基因的两种等位基因(主要和次要)的序列的探针，并将所述探针组固定于固体支持物上，并将其与扩增子杂交，以鉴定形成杂交体的探针是本发明的特征。

Description

测定多等位基因单倍型的方法
技术领域
本发明涉及测定具有至少两种杂合多态型的靶核酸的单倍型的方法及用于所述测定的引物组。
背景技术
单倍型是位于单染色体上的两种或多种多态型的顺式排列。单倍型信息被认为非常有用，因为单倍型与特定疾病或异常及特异性药物敏感性相关。单倍型分析至今需要对有关覆盖多个家族世代的多态型的遗传信息的追终研究及基于计算机的评估算法。另外，聚合酶链式反应(PCR)技术的发展使直接的，分子水平的DNA分析成为可能，且有提议使用所述分析结果来测定单倍型。但为用PCR测定单倍型，需使用多种组合的特异于等位基因的引物，并进行大量次PCR。如果我们仅考虑2种等位基因，需通过在多态性位点定位2对引物，并检查是否发生任何扩增来测定多态型。已有推荐将此方法用于使用单试管测定法测定单倍型(见日本专利申请人-特开No.2002-272482)。更具体而言，用根据5’末端等位型产生不同信号的标记物修饰含第一多态型的正向引物。而对于含第二多态型的反向引物，将不存在于靶序列中的游离序列(flap sequence)连接于所述5’末端，从而将所述引物设计为产生长度取决于所述等位基因的扩增子。可使用这些引物双向进行等位基因特异性PCR测定。可通过检测PCR扩增子的荧光标记，并从所述扩增子的长度来知晓哪个引物对导致扩增，从而可测定单倍型。
但上述已知方法的关键在于使所述引物含具有多态型序列的位点。这限制了选择所述引物碱基序列的自由度。其中，为进行等位基因特异性PCR，所述用于PCR的引物的Tm必需近似。但由于上述选择引物碱基序列的限制，使某些情况下难以使引物的Tm近似。换言之，日本专利申请人-特开No.2002-272482的方法可能仅限在多态型位于可使用Tm近似的引物的位置时实现高精度单倍型检测。此外，此检测方法难以侧移正向和反向引物序列的位置。因此，一旦正向和反向引物形成二聚体，就不可能检测单倍型。
发明内容
本发明提供更精确的无关多态型位置的单倍型测定方法。本发明更具体提供测定具有至少两种杂合多态型的靶核酸序列的单倍型的方法及用于所述目的的引物组。
本发明的方法测定在3’侧具有第一杂合多态性位点，且在5’侧具有第二杂合多态性位点的靶核酸的单倍型，且所述方法的特征在于包括：
(i)用下列正向引物(a-1)之一对靶核酸进行PCR：
(a-1-1)含互补于所述第一多态性位点的碱基序列，且当所述第一多态型是突变型时可延伸所述靶核酸，而当所述第一多态型是野生型时不延伸所述靶核酸的正向引物，和
(a-1-2)含互补于所述第一多态性位点的碱基序列，且当所述第一多态型是野生型时可延伸所述靶核酸，而当所述第一多态型是突变型时不延伸所述靶核酸的正向引物，和
(b-1)含互补于不含所述第二多态型的特定碱基序列的碱基序列，且位于在所述靶核酸的互补链上的所述第二多态型的3’侧的反向引物；和
(ii)将通过(i)得到的产物与碱基序列等于所述含所述第二多态型的野生型核苷酸的靶核酸的碱基序列的特定片段的第一探针杂交，且与碱基序列等于所述含所述第二多态型的突变型核苷酸的靶核酸的碱基序列的特定片段的第二探针杂交，及检测与所述第一和第二探针形成杂交体的信号。
本发明的用于测定单倍型的引物组是用于测定在3’侧具有第一多态性位点，且在5’侧具有第二多态性位点的靶核酸的单倍型的引物组，且所述引物组的特征在于包含下列正向引物之一：
含互补于所述第一多态性位点的碱基序列，且当所述第一多态型是突变型时可延伸所述靶核酸，而当所述第一多态型是野生型时不延伸所述靶核酸的正向引物，和
含互补于所述第一多态性位点的碱基序列，且当所述第一多态型是野生型时可延伸所述靶核酸，而当所述第一多态型是突变型时不延伸所述靶核酸的正向引物，和
含互补于不含所述第二多态型的特定碱基序列的碱基序列，且位于在所述靶核酸的互补链上的所述第二多态型的3’侧的反向引物。
如上所述，当存在多个杂合多态型时，本发明可同时并穷尽测定所述单倍型。
附图简述
图1：本发明的第一实施方案的测定两种等位基因的单倍型的流程图；
图2：本发明的第一实施方案的两种等位基因排列的示意图；
图3：本发明的第一实施方案的用于提取基因组的特异性片段的PCR扩增所使用的方案的示意图；
图4：本发明的第一实施方案的PCR扩增所使用的方案的示意图；及
图5：本发明的第二实施方案的两种或多种多等位基因的排列的示意图。
最佳实施方式
本发明中，将等位基因特异性PCR扩增方案用于待用微阵列测定单倍型的基因组DNA中的目标多态型。首先，产生特异于第一等位基因的等位基因中的一种，且还含第二等位基因的扩增子。然后将此扩增子与各特异于所述第二等位基因的等位基因中的一种的寡核苷酸探针杂交，以鉴定所述第二等位基因的等位基因。当所述第一和第二等位基因形成单倍型时，此技术可以是在分子水平进行检测的非常有力的方法。制备当所述第二等位基因是主要等位基因时形成DNA杂交体的互补链探针和当所述第二等位基因是次要等位基因时形成DNA杂交体的的另一互补链探针，并固定于固体支持物，如微阵列。可通过用标记物确认由此发生杂交的探针来测定所述单倍型。当有多对候选等位基因时，可通过将N种单倍型与N×2种装载于固体支持物上的探针杂交来对其进行穷尽分析。如果所述第一等位基因是预选的杂合等位基因，可制备专用的固体支持物以用于鉴定所述单倍型。可将扩增引物之一设计为特异于一种等位基因的等位基因之一，且必需将另一种扩增引物设计为将其他等位基因包括于扩增子内。所述标记物可为带于所述载体的例如荧光团，且采用当等位基因特异性扩增成功发生时仅可检测到与其他等位基因杂交的探针的荧光的结构。
将下述正向引物之一用于本发明，以得到具有特异于所述第一等位基因的等位基因之一的区域的扩增子。
(a-1-1)含互补于上述第一多态性位点的碱基序列，且当所述第一多态型是突变型时可延伸所述靶核酸，而当所述第一多态型是野生型时不延伸所述靶核酸的正向引物。
(a-1-2)含互补于上述第一多态性位点的碱基序列，且当所述第一多态型是野生型时可延伸所述靶核酸，而当所述第一多态型是突变型时不延伸所述靶核酸的正向引物
在这些正向引物中，可通过基于含所述已知第一多态型的片段的序列的标准方法，基于所述靶核酸的分型，以可从所述PCR扩增子得到所述片段的方式，设置所述引物的碱基序列(和/或所述序列的长度)。
可选择突变型或野生型多态型。
将用于从扩增子得到含所述第二多态型的反向引物设计为具有互补于不含所述第二多态型的特定碱基序列的碱基序列的反向引物，所述靶序列位于在所述靶核酸的互补链上的所述第二多态型的3’侧。可通过基于含所述已知第二多态型的片段的序列的标准方法，基于所述靶序列的分型，且以可从所述PCR扩增子得到所述片段的方式，设置所述反向引物的碱基序列(序列长度)。
对于也用于检测含所述第二多态型的片段，可选择特异于此片段的序列，且可通过标准方法设置所述可检测所选序列的探针的碱基序列(和/或序列长度)，因为含所述第二多态型的片段通过对靶核酸的分型已知。
以下描述本发明的实施方案。
第一实施方案
以下参考图1描述本发明的第一实施方案。本实施方案涉及测定基因组DNA中多等位基因的等位基因型的技术。以下更具体顺序描述了测定两种或两种以上等位基因的单倍型的过程。
本实施方案测定了基因组DNA中两种杂合等位基因的单倍型。两种等位基因间的距离可从几个碱基对至几十个碱基对到几百至几千个碱基对。因此有必要制备具有两个等位基因的扩增子。在这里，将两种等位基因从5’末端算起定义为第一等位基因和第二等位基因。第一等位基因的主要等位基因是G，次要等位基因是C；而第二等位基因的主要等位基因是G，次要等位基因是T。
为在本实施方案中测定单倍型，将引物的3’末端与所述等位基因作为匹配，以选择性扩增所述第一等位基因的主要或次要等位基因。例如，当第一等位基因是次要等位基因时，将第一引物(所述正向引物)设计为在其3’末端与所述第一等位基因的次要等位基因互补，从而会发生延伸，而当所述第一等位基因是主要等位基因时，则不发生延伸。反之，将相反链的第二引物(反向引物)设计为使用第一引物的结合位置作为参考点插入所述第二等位基因。所述第二引物不依赖于所述等位基因型。用此排列，如果所述第一等位基因是次要等位基因，则产生大量扩增子，其将证实所述第一等位基因是次要等位基因，且已优选产生含所述第二等位基因的扩增子。因此，通过测定所述扩增子中第二等位基因的等位基因型，我们可测定所述第一和第二等位基因的单倍型。
本发明的测定单倍型的方法包括如下步骤(1)和(2)：
(1)选择所述第一等位基因的等位基因之一，且产生仅含所述第二等位基因的扩增子；
(2)使探针与特异于所述第二等位基因的等位基因的互补探针杂交，从而鉴定所述第二等位基因的等位基因。
图1是上述步骤的流程图。S-1是证实所述第一和第二等位基因是杂合子的步骤。对用于各等位基因的分型方法无限制。如果所述第一和第二等位基因中的至少一种是杂合子，所述两种等位基因的单倍型组合便已知，且无需应用本发明。
本实施方案仅专注于基因分型后已证实杂合性的组合。S-2是通过联合使用特异于所述第一等位基因的次要等位基因的第一引物和用于包括所述第二等位基因的相反链的第二引物从所述靶基因组得到扩增子的步骤。特异于所述第一等位基因的次要等位基因的所述第一引物是突变位点位于其3’末端的引物，从而其是互补的，且如果所述靶基因组序列具有次要等位基因，则所述引物不进行延伸。在这里，因为所述第一等位基因是杂合的，仅当所述次要等基因的基因组与所述第一引物退火时，延伸反应才进行下去。换言之，形成的扩增子将限于具有所述第一等位基因的次要等位基因的扩增子。所述第二引物不受靶基因组影响，且会产生其构型匹配于靶基因组的含所述第二等位基因的扩增子。这种情况下，所述第一等位基因是次要等位基因，形成含所述第二等位基因的匹配等位基因的扩增子。所述第二等位基因是否为主要或次要等位基因无任何影响，但可通过将所述扩增子与特异于所述第二等位基因的等位基因的探针杂交来测定具有所述第一等位基因的单倍型。不同于上述情况，当甚至将所述第一引物设计为特异于所述主要等位基因，本发明的本质仍相同。
还需使用标记物测定所述第二等位基因。可标记所述第一或第二引物中的任一个。或在延伸反应过程中将经标记的的核苷酸掺入所述扩增子。所述标记物可为荧光团、化学发光物质或放射性同位素。本实施方案中使用了Cy3荧光染料标记物。S-3是使所述扩增子与已固定有特异于所述第二等位基因的探针的固体支持物杂交的步骤。制备各特异于所述主要或次要等位基因的探针。可将这些探针固定于固体支持物上，或用于可在液相反应中导致FRET的排列。在本实施方案中使用所述固体支持物测定所述第二等位基因。换言之，如果仅可在置有特异于第二等位基因的次要等位基因的探针的固体支持物上的特定位置见到荧光，则表示所述第一和第二等位基因形成次要/次要单倍型。同时这也证实存在主要/主要单倍型。而如果仅可在置有特异于第二等位基因的主要等位基因的探针的固体支持物上的特定位置见到荧光，则表示所述第一和第二等位基因形成次要/主要单倍型，其同时证实存在主要/次要单倍型。而且，如果可在置有两个探针(一个特异于所述第二等位基因的主要等位基因，而另一个特异于所述第二等位基因的次要等位基因)的固体支持物上的两个位点见到荧光，则可解释为所述第一和第二等位基因具有弱单倍型联合。从而S-4是测定所述第二等位基因的等位基因和所述第一和第二等位基因的单倍型的步骤。
图2是描绘上述第一等位基因201和第二等位基因202在靶基因组上的潜在关系的示意图。液在所述示意图中显示了第一引物203和第二引物204及它们的扩增子205。如上所述，所述第一引物203的3’末端对应于所述第一等位基因201的突变位点，而所述第二引物204位于含所述第二等位基因202的区域的下游。由于第一引物203，所述含所述第一等位基因201中的一种等位基因的延伸产物的产生(图上部)多于含其他等位基因的延伸产物的产生(图下部)。换言之，PCR仅扩增含第一等位基因201的两种等位基因之一的靶基因组侧。因此，所述第二等位基因202也会仅具有匹配所述靶基因组侧的等位基因。此外，如图所示，将所述探针设计为含所述第二等位基因202的等位基因。
表1显示本实施方案中的扩增引物对的碱基序列、它们的扩增子和针对第二等位基因的探针。从5’侧开始，粗体字依次对应于第一等位基因的等位基因座位(突变核苷酸C)和第二等位基因的等位基因座位(突变核苷酸T)。将突变核苷酸C选作正向引物(FP)。
表1
 
正向引物(FP) 5′-AGGGCGGCAGAGGTC-3′
反向引物(RP) 5′-CTACTCTTCCTTGGCCTTT-3′
扩增子 5′-AGGGCGGCAGAGGTCCTGAGGCTCCCCTACCAGAAGCAAACATGGATGGTGGGTGAAACCACAGGCTGGACCAGAAGCCAGGCTGAGAAGGGGAAGCAGGTTTGGGGGACTTCCTGGAGAAGGGCATTTATACATGGCATGAAGGACTGGATTTTCCAAAGGCCAAGGAAGAGTAG-3′
针对第二等位基因的主要等位基因G的探针 5′-TCTCCAGGACGTCCCCCAAACC-3′
针对第二等位基因的次要等位基因T的探针 5′-TCTCCAGGAAGTCCCCCAAACC-3′
第二实施方案
以下参考图5描述第二实施方案。各等位基因的多态性座位用“×”表示。本文仅描绘了在座位N、N+1和N+2的多态型。其他省略，其不对多态型数量构成限制。本情况下，正向引物就Cy3标记，但本发明的基本特征当然未变，即便当反向引物或延伸核苷酸链自身被标记。
对于此实施方案，我们应该描述用于测定多等位基因单倍型的通用技术。在此检测了N号杂合的多态型。如图5所示定义了FP(N)(第N多态型的正向引物)和RP(N)(相反方向的反向引物)。对于N+1向前，我们也可类似定义正向引物FP(N+1)、FP(N+2)、......和反向引物RP(N+1)、RP(N+2)、......将正向引物FP(N)和反向引物RP(N+1)设计为产生含第N多态型和第N+1多态型的PCR扩增子。用两种所选等位基因之一将FP(N)设计为在其3’末端具有第N多态型。将RP(N+1)以PCR扩增子含第N+1多态型的的方式设计在第N多态型的相反侧。当第N多态型仅匹配两种等位基因之一时，FP(N)和RP(N+1)的引物对是会产生含第N多态型和第N+1多态型的的PCR扩增子的引物对。然后从m号PCR扩增(N＝1、2、3、......、m)得到反应产物，并与可测定第N+1等位基因的探针杂交，为通过FP(N)选择的第N等位基因。这种情况下将设计为匹配2×m等位基因的探针固定于微阵列的期望位置。
根据以下实施例1中描述的方案将从m PCR扩增中得到的扩增子与微阵列上的探针混合并杂交。这样，便可通过用单标记穷尽测定多等位基因的单倍型组合。而且，本发明的技术(即通过找出两个探针中的哪个具有对应于一种等位基因的两个等位基因的序列来鉴定等位基因，进行杂交)提高分析单倍型的精确性。
在此，我们将讨论局限于杂合等位基因。可制备两组各自特异于第一等位基因的两种等位基因的引物，并各自进行杂交，用于测定。
实施例
实施例1
以下描述根据第一实施方案的实施例。
I.样品制备并提取基因组的特定区域。
通过仅扩增提取自源于日本个体的B细胞系的基因组DNA上的5kbp的代谢酶基因CYP2D6，并用超纯水将所述扩增子稀释至8ng/μL而制备了所用模板DNA。进行所述过程，以消除重复的序列区域(如CYP2D7和CYP2D8(它们是假基因))，并以得到纯CYP2D6区域。更具体而言，使用了表2所列的通用的广泛使用的引物。
表2
 
2D6-DPKup GTTATCCCAGAAGGCTTTGCAGGCTTC
2D6-DPKlow GCCGACTGAGCCCTGGGAGGTAGGTA
如表3所示制备的PCR溶液，如图3所示进行了PCR循环，结果得到CYP2D6基因区域的扩增子(5079bp)。
在反应过程中，将变性、退火和延伸的3步循环重复35次，并在冷却后通过纯化过程纯化所述扩增子。
在纯化柱(Qiagen QIAquick PCR纯化试剂盒)上纯化所述PCR扩增子，将所述PCR扩增子溶液的体积调至50μL。将由此得到一部分纯化的PCR扩增子溶液取样并通过标准方法进行电泳，并从产物大小证实已合成期望的PCR产物。用纯水将所述产物进一步稀释至8ng/μL。
表3
 
扩大长酶混合物(Roche) 0.375μL
2D6-DPKup(1μM) 4μL
2D6-DPKlow(1μM) 4μL
缓冲液1 2.5μL
dNTP(10mM each) 0.875μL
H2O 12.25μL
基因组DNA 1μL
总共 25μL
II.PCR扩增
设计引物并纯化PCR扩增子
表4列出了用于扩增反应的制剂及它们的混合比例。也列出了PCR缓冲液、DNA聚合酶、核苷酸、引物和模板DNA的浓度和用量。使用了Cy3标记的引物。
表4
 
项目 浓度 量[μl]
H2O 17.3
正向引物(FP) 10μM 1.0
反向引物(RP) 10μM 1.0
10×缓冲液dNTP(dATP，dGTP，dCTP，dTTP)Ampl iTaq Gold(TAKARA)模板DNA 4μM2mM每种8ng/μl 2.52.50.2
总共 -- 25.0
图4显示用于扩增反应的方案。在反应过程中，将变性、退火和延伸的3步循环重复35次，然后在冷却后通过纯化过程纯化所述扩增子。
在纯化柱(Qiagen QIAquick PCR纯化试剂盒)上纯化所述PCR扩增子。纯化后将所述PCR扩增子溶液的体积调至50μL。将由此得到一部分纯化的PCR扩增子溶液取样并通过标准方法进行电泳，并从产物大小证实已合成期望的PCR产物。所用引物序列和扩增子显示于之前的表1。
III.制备微阵列
(1)设计探针
针对上述PCR产物设计两个探针。在设计引物时，经过仔细考虑设计所述探针，从而使各探针可特异性识别所述第二等位基因的等位基因的碱基序列。在此探针设计中，所示从正向引物FP延伸的DNA链是与探针形成杂交体的链。通过调整碱基对长度、考虑形成的杂交体的稳定性来仔细设计各探针的碱基序列。两个设计的探针序列显示于表1。
(2)探针合成及微阵列制备
使用Canon公司公开的制备DNA微阵列的方法(日本专利申请，特开No.11-187900)进行探针合成和微阵列制备。简言之，对于基板处理，用硅烷偶联剂处理石英玻璃，且EMCS结合于此，从而将马来酰亚胺基团导于表面。对于探针合成，合成5’末端导入巯基的探针，并通过HPLC纯化。为制备DNA微阵列，用改良版的喷墨打印机(专有名BJF-850，Canon公司生产)将各探针点于所述玻璃基板上。玻璃基板的尺寸为25mm×75mm×1mm(宽×长×厚)。
IV.杂交
使用III中制备的DNA微阵列和II中制备的PCR扩增子作为核酸样品在微阵列上进行杂交。
(1)封闭DNA微阵列
将BSA(牛血清白蛋白，Sigma公司生产)溶于100mM NaCl/10mM磷酸缓冲液中至浓度1wt％。将III中制备的DNA微阵列浸入此溶液中于室温下2小时，以封闭玻璃基板表面。封闭后，用含0.1wt.％ SDS(十二烷基硫酸钠)的2×SSC溶液(NaCl 300mM和柠檬酸钠(柠檬酸三钠二水合物，即C6H5Na3·2H2O)30mM，pH 7.0)洗涤。再用纯水润洗。然后在旋转干燥机中干燥DNA微阵列。
(2)制备杂交溶液
用2μL PCR扩增子溶液制备杂交溶液，以达到如下终浓度。所述杂交溶液具有下列组成。
6×SSPE/10％甲酰胺/PCR扩增子溶液
(6×SSPE：NaCl 900mM、NaH2PO4·H2O 60mM和EDTA 6mM，pH 7.4)
(3)杂交
将干燥的DNA微阵列安装于杂交仪器(杂交台，Genomic Solution公司)中，并根据下述方法和条件用具有上述组成的杂交溶液进行杂交反应。
所用杂交条件和方法如下：
将杂交溶液加热至65℃，于该温度维持3小时，并加热至92℃维持2分钟，然后在50℃维持4小时。然后于40℃用含0.1％ SDS的2×SSC洗涤。如需要，根据常规手册进一步于25℃用2×SSC洗涤，并用纯水润洗，并最终在旋转干燥机中干燥。
(4)荧光测量
杂交反应完成后，使用DNA微阵列荧光扫描仪(Genepix 4000B，Axon公司生产)对旋转干燥的DNA阵列测量发自杂交体的荧光。对各探针测量得到的结果显示于表5。
表5
 
探针类型 荧光亮度(相对于在535nm的值)
主要探针 530
次要探针 1800
计算亮度时，将部分无探针DNA点的DNA微阵列的荧光强度作为背景值，并将各点显示出的荧光强度减去背景值作为测量到的荧光强度。测量进行两次，并给出平均值。
从所述结果，将第一等位基因和第二等位基因的单倍型测定为C/T(次要/次要)。因为两个等位基因还是杂合的，将二倍型测定为G/G(主要/主要)。在这里，我们将我们自己限定于杂合等位基因。制备各特异于第一等位基因的两种等位基因两组引物，并各自进行杂交。
本发明并不局限于上述实施方案，可在本发明的精神和范围内进行各种改变和修饰。因此为公开本发明的范围，给出如下权利要求书。
本申请要求提交于2006年12月1日的日本专利申请No.2006-325951的权利，其通过引用全文并入本文。
序列表
<110>CANON KABUSHIKI KAISHA，et al.
<120>测定多等位基因单倍型的方法
<130>10048407WO01
<150>JP 2006-325951
<151>2006-12-01
<160>7
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>15
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>1
Figure A200780044428D00171
<210>2
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>2
<210>3
<211>176
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>3
Figure A200780044428D00181
<210>4
<211>22
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>探针
<400>4
<210>5
<211>22
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>探针
<400>5
Figure A200780044428D00183
<210>6
<211>27
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>6
Figure A200780044428D00184
<210>7
<211>26
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>7
Figure A200780044428D00191

Claims (4)

1.测定在3’侧具有第一杂合多态性位点、且在5’侧具有第二杂合多态性位点的靶核酸的单倍型的方法，其特征在于包括：
(i)用下列正向引物(a-1)之一和正向引物对靶核酸进行PCR：
(a-1-1)正向引物，其含互补于所述第一多态性位点的碱基序列，且当所述第一多态型是突变型时可延伸所述靶核酸，而当所述第一多态型是野生型时不延伸所述靶核酸，和
(a-1-2)正向引物，其含互补于所述第一多态性位点的碱基序列，且当所述第一多态型是野生型时可延伸所述靶核酸，而当所述第一多态型是突变型时不延伸所述靶核酸，和
(b-1)反向引物，其含互补于不含所述第二多态型的特定碱基序列的碱基序列，且位于在所述靶核酸的互补链上的所述第二多态型的3’侧；及
(ii)将通过(i)得到的产物与碱基序列等于含所述第二多态型的野生型核苷酸的所述靶核酸的碱基序列的特定片段的第一探针杂交，且与碱基序列等于含所述第二多态型的突变型核苷酸的所述靶核酸的碱基序列的特定片段第二探针杂交，及检测与所述第一和第二探针形成杂交体的信号。
2.权利要求1的测定单倍型的方法，其中所述杂交(ii)还包括将固定有所述第一探针和所述第二探针的探针载体与通过(i)的结果得到的产物杂交。
3.权利要求1或2的测定单倍型的方法，其中所述正向引物(a-1-1)在或接近其3’末端具有互补于具有突变型核苷酸的第一多态型的核苷酸，且所述正向引物(a-1-2)在或接近其3’末端具有互补于具有野生型核苷酸的第一多态型的核苷酸。
4.用于测定在3’侧具有第一多态性位点、且在5’侧具有第二多态性位点的靶核酸的单倍型的引物组，其中所述引物组的特征在于包含下列正向引物之一和反向引物：
正向引物，其含互补于所述第一多态性位点的碱基序列，且当所述第一多态型是突变型时可延伸所述靶核酸，而当所述第一多态型是野生型时不延伸所述靶核酸，和
正向引物，其含互补于所述第一多态性位点的碱基序列，且当所述第一多态型是野生型时可延伸所述靶核酸，而当所述第一多态型是突变型时不延伸所述靶核酸，和
反向引物，其含互补于不含所述第二多态型的特定碱基序列的碱基序列，且位于在所述靶核酸的互补链上的所述第二多态型的3’侧。
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