JP2008136419A - 複対立遺伝子のハプロタイプ決定方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】2つの対立遺伝子を含む部位を増幅する上で一方の対立遺伝子の多型を一つの増幅プライマーの3'末端もしくはその近傍に配置し変異型ヌクレオチドか野生型ヌクレオチドかどちらか一方のプライマーからしか伸長しないようにする。他方のプライマーは対立遺伝子に影響受けないが、他方の対立遺伝子を増幅物に含むような位置にあって、第1の対立遺伝子について一方のアレルだけの対象ゲノムDNAをPCR増幅する。その増幅物の第2の対立遺伝子についてそのアレルを、両アレル(メジャー/マイナー)を判別する相補の配列のプローブを用いて判定すれば、第1の対立遺伝子と第2の対立遺伝子のハプロタイプを識別できることを利用する。
【選択図】図1
Description
(i)(a−1)以下の順方向プライマーのいずれか1つと、
(a−1−1)前記第1の多型部位に相補的な塩基配列を含み、前記第1の多型部位が変異型である標的核酸を伸長可能であり、且つ前記第1の多型部位が野生型である標的核酸は伸長しない順方向プライマー、および
(a−1−2)前記第1の多型部位に相補的な塩基配列を含み、前記第1の多型部位が野生型である標的核酸を伸長可能であり、且つ前記第1の多型部位が変異型である標的核酸は伸長しない順方向プライマー、
(b−1)該標的核酸の相補鎖の、該第2の多型部位よりも3’側の、該第2の多型部位を含まない所定の塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する逆方向プライマーと、
を用いて該標的核酸のPCR反応を行う工程と、
(ii)前記工程(i)の結果として得られる産物を、該第2の多型部位の野生型ヌクレオチドを含む該標的核酸の所定の塩基配列部分と同じ塩基配列を有する第1のプローブ、及び該第2の多型部位の変異型ヌクレオチドを含む該標的核酸の所定の塩基配列部分と同じ塩基配列を有する第2のプローブとハイブリダイゼーション反応させ、該第1および第2のプローブとのハイブリッド体の形成を示すシグナルを検出する工程とを有することを特徴とするハプロタイプの決定方法である。
3’側に第1の多型部位を有し、5’側に第2の多型部位を有する標的核酸のハプロタイプを決定するためのプライマーセットであって、
前記第1の多型部位に相補的な塩基配列を含み、前記第1の多型部位が変異型である標的核酸を伸長可能であり、且つ前記第1の多型部位が野生型である標的核酸は伸長しない順方向プライマーおよび
前記第1の多型部位に相補的な塩基配列を含み、前記第1の多型部位が野生型である標的核酸を伸長可能であり、且つ前記第1の多型部位が変異型である標的核酸は伸長しない順方向プライマー
の何れかと、
該標的核酸の相補鎖の、該第2の多型部位よりも3’側の、該第2の多型部位を含まない所定の塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する逆方向プライマーと、を含むことを特徴とするプライマーセットである。
ハプロタイプを同時に決定することができる。
を常法により設定可能である。
〔第1の実施態様〕
第1の実施態様を、図1を用いて、以下に説明する。本実施態様は、ゲノムDNA上にある複数の対立遺伝子のアレルタイプを決定する手法に関し、特に2つもしくは2つ以上の対立遺伝子のハプロタイプを決定する手続きを以下に順に追って説明する。
1)第1の対立遺伝子をどちらか一方のアレルを選択し、第2の対立遺伝子を含む増幅産物だけを生成するステップ;
2)第2の対立遺伝子のアレルに特異的な相補的プローブとハイブリダイゼーション反応させ、その結果から第2の対立遺伝子のアレルを決定するステップ。
置関係を示した配置図である。第1のプライマー203、第2のプライマー204と、その増幅産物205をもこれに示される。前記の通り、第1のプライマー203の3’末端部は第1の対立遺伝子201の変異部位にあたり、第2のプライマー204は、第2の対立遺伝子202を含むその下流域に位置する。第1のプライマー203によって、第1の対立遺伝子201の一方のアレルを含む伸長産物の産生量(上図)は他方のアレルを含む伸長産物の産生量(下図)よりも多くなる。すなわち、ポリメラーゼ連鎖反応により、第1の対立遺伝子201の一方のアレルを含んだ一方の対象ゲノムに対してのみその増幅量を増やしていくため、第2の対立遺伝子202もまた、その対象ゲノムに対応するアレルだけを含むことになる。また、配置図上にある第2の対立遺伝子202のアレルを含むプローブを設計する。
第2実施態様を、図5を用いて以下に説明する。各対立遺伝子の多型の位置は×で表示し第N番目、第N+1番目、第N+2番目の多型のみ表示しているが、他は省略しているだけで多型数を限定しているものではない。ここでは、順方向プライマーにCy3標識をしているが、いうまでもなく逆方向プライマーに標識しても、伸長するヌクレオチド自体に標識していても本発明の骨子が変わるものではない。
上記第1の実施態様にかかる実施例を以下に記載する。
I.検体の調製と特定遺伝子部位の抽出
使用したテンプレートDNAは、日本人由来のB細胞株から抽出されたゲノムDNAから代謝酵素遺伝子であるCYP2D6の領域5kbpに限定して増幅し、予め増幅産物を8ng/μLに超純水で稀釈したものである。これは、擬似遺伝子であるCYP2D7、CYP2D8等の重複配列部分を除外し、CYP2D6部位だけに純化する目的で処理されている。詳細には、使用したプライマーは、一般的に広く用いられている表2のものを使用した。
反応プロセスには、変性、アニール、伸長の3ステップサイクルを35回繰り返し、冷却後、精製プロセスにより増幅産物の純化を行った。
プライマーの設計およびPCR増幅産物の純化
表4は、増幅反応に使われる試薬類とその配合比率を示す。PCR用バッファー、DNAポリメラーゼ、各ヌクレオチド、各プライマー、テンプレートDNAの濃度とその投入量もここに記す。ここではCy3で標識化されたプライマーを使用する。
(1)プローブの設計
上記、PCR産物に対して2種のプローブを設計した。設計はプライマーの設計と同様、各プローブが設計した第2の対立遺伝子のアレル塩基配列を特異的に認識できるように充分配慮して設計を行った。このプローブ設計においては、プローブとハイブリダイゼーションし、プローブとハイブリッド体を形成するのは、順方向プライマーFPから伸長したDNA鎖である。各プローブの配列はハイブリッド体の安定性に考慮し、塩基長を調整するなどして充分配慮して設計を行った。設計された2本のプローブの配列は表1に示される通りである。
(2)プローブの合成及びマイクロアレイの作製
プローブの合成およびマイクロアレイの作製は、キヤノン社から開示されているDNAマイクロアレイの作製法(特開平11−187900号公報)に従って行った。すなわち、基板プロセスに関しては、石英ガラスにシランカップリング剤処理及びEMCSを結合し、それにより表面にマレイミド基を導入した。またプローブ合成に関しては、5’末端にチオール基が導入されたプローブを合成しHPLC精製した。DNAマイクロアレイ作製には、インクジェットプリンター(商品名:BJF−850 キヤノン社製)の改造機を使用し、ガラス基板上に、各プローブをスポットして、DNAマイクロアレイを得た。なお、ガラス基板のサイズ(W×L×T)は、25mm×75mm×1mmとした。
IIIで作製したDNAマイクロアレイと、サンプル核酸検体としてIIで作製したPCR増幅産物を用いて、マイクロアレイ上でのハイブリダイゼーションを行った。
(1)DNAマイクロアレイのブロッキング
BSA(牛血清アルブミンFraction V:Sigma社製)を1重量%となるように、100mM NaCl/10mM リン酸バッファーに溶解した。この溶液にIIで作製したDNAマイクロアレイを室温で2時間浸し、ガラス基板面のブロッキングを行った。ブロッキング終了後、0.1重量%SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)を含む2×SSC溶液(NaCl 300mM、Sodium Citrate(trisodium citrate dihydrate,C6H5Na3・2H2O) 30mM、pH7.0)で洗浄を行った。その後、純水でリンスした。更にその後、スピン・ドライ装置でDNAマイクロアレイの水切りを行った。
(2)ハイブリダイゼーション溶液の調製
各PCR産物は互いに等モルとなるよう調製したうえで、PCR増幅産物溶液2マイクロリットルを用いて最終濃度が下記の構成となるよう、ハイブリダイゼーション溶液を調製した。
ハイブリダイゼーション溶液の組成は以下のとおりである。
(6×SSPE: NaCl 900mM、NaH2PO4・H2O 60mM、EDTA 6mM、pH7.4)
(3)ハイブリダイゼーション
水切りしたDNAチップを、ハイブリダイゼーション装置(Genomic Solutions Inc. Hybridization Station)にセットした。そして、上記組成のハイブリダイゼーション溶液を用いて、下記手順および条件でハイブリダイゼーション反応を行った。
(4)蛍光測定
ハイブリダイゼーション反応終了後、スピン・ドライ乾燥したDNAチップについて、DNAマイクロアレイ用蛍光検出装置(Axon社製、Genepix 4000B)を用いで、ハイブリッド体に由来する蛍光測定を行った。各プローブについて測定した結果下記表5の通りになった。
202 :第2の対立遺伝子
203 :第1のプライマー
204 :第2のプライマー
205 :PCR増幅産物
Claims (4)
- 3’側にヘテロ型の第1の多型部位を有し、5’側にヘテロ型の第2の多型部位を有する標的核酸のハプロタイプを決定する方法であって、
(i)(a−1)以下の順方向プライマーのいずれか1つと、
(a−1−1)前記第1の多型部位に相補的な塩基配列を含み、前記第1の多型部位が変異型である標的核酸を伸長可能であり、且つ前記第1の多型部位が野生型である標的核酸は伸長しない順方向プライマー、および
(a−1−2)前記第1の多型部位に相補的な塩基配列を含み、前記第1の多型部位が野生型である標的核酸を伸長可能であり、且つ前記第1の多型部位が変異型である標的核酸は伸長しない順方向プライマー、
(b−1)該標的核酸の相補鎖の、該第2の多型部位よりも3’側の、該第2の多型部位を含まない所定の塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する逆方向プライマーと、
を用いて該標的核酸のPCR反応を行う工程と、
(ii)前記工程(i)の結果として得られる産物を、該第2の多型部位の野生型ヌクレオチドを含む該標的核酸の所定の塩基配列部分と同じ塩基配列を有する第1のプローブ、及び該第2の多型部位の変異型ヌクレオチドを含む該標的核酸の所定の塩基配列部分と同じ塩基配列を有する第2のプローブとハイブリダイゼーション反応させ、該第1および第2のプローブとのハイブリッド体の形成を示すシグナルを検出する工程とを有することを特徴とするハプロタイプの決定方法。 - 前記工程(ii)が、該第1のプローブおよび第2のプローブが固定されたプローブ担体を前記工程(i)の結果として得られる産物とハイブリダイゼーション反応させる工程を含む請求項1に記載のハプロタイプの決定方法。
- 前記(a−1−1)における順方向プライマーが、その3´末端またはその近傍に、変異型ヌクレオチドである前記第1の多型部位に相補的なヌクレオチドを有しており、
前記(a−1−2)における順方向プライマーが、その3´末端またはその近傍に、野生型ヌクレオチドである前記第1の多型部位に相補的なヌクレオチドを有している請求項1または2に記載のハプロタイプの決定方法。 - 3’側に第1の多型部位を有し、5’側に第2の多型部位を有する標的核酸のハプロタイプを決定するためのプライマーセットであって、
前記第1の多型部位に相補的な塩基配列を含み、前記第1の多型部位が変異型である標的核酸を伸長可能であり、且つ前記第1の多型部位が野生型である標的核酸は伸長しない順方向プライマー、および
前記第1の多型部位に相補的な塩基配列を含み、前記第1の多型部位が野生型である標的核酸を伸長可能であり、且つ前記第1の多型部位が変異型である標的核酸は伸長しない順方向プライマー、
の何れかと、
該標的核酸の相補鎖の、該第2の多型部位よりも3’側の、該第2の多型部位を含まない所定の塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する逆方向プライマーと、を含むことを特徴とするプライマーセット。
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