JP2010035532A - アレル特異的pcr法 - Google Patents
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Abstract
【課題】アレル特異的PCRを高精度に行うことを目的とし、プライマー中のSNP部位を3’末端以外の部位に設定したプライマーを提供する。
【解決手段】SNP部位を含む標的核酸101をアレル特異的に増幅するために次の3種のプライマーを用いる。(i)3’末端から数えて2塩基目及び3塩基目の一方のみにSNP部位として野生型ヌクレオチドを有する以外は、標的核酸内のSNP部位を含む部分領域と同一の塩基配列を有する第1の順方向プライマー105。(ii)3’末端から数えて2塩基目及び3塩基目の一方のみにSNP部位として変異型ヌクレオチドを有する以外は、標的核酸内のSNP部位を含む部分領域と同一の塩基配列を有する第2の順方向プライマー107。(iii)標的核酸の相補鎖103の、前記SNP部位よりも5’末端側で、前記SNP部位に対応する部位を含まない部分領域と同一の塩基配列を有する逆方向プライマー109。
【選択図】図1
【解決手段】SNP部位を含む標的核酸101をアレル特異的に増幅するために次の3種のプライマーを用いる。(i)3’末端から数えて2塩基目及び3塩基目の一方のみにSNP部位として野生型ヌクレオチドを有する以外は、標的核酸内のSNP部位を含む部分領域と同一の塩基配列を有する第1の順方向プライマー105。(ii)3’末端から数えて2塩基目及び3塩基目の一方のみにSNP部位として変異型ヌクレオチドを有する以外は、標的核酸内のSNP部位を含む部分領域と同一の塩基配列を有する第2の順方向プライマー107。(iii)標的核酸の相補鎖103の、前記SNP部位よりも5’末端側で、前記SNP部位に対応する部位を含まない部分領域と同一の塩基配列を有する逆方向プライマー109。
【選択図】図1
Description
本発明は、アレル特異的PCRを高精度に行う方法に関する。
アレル特異的ポリメラーゼチェインリアクション(PCR)は、多型を検出する際に用いられる手法である。特に、一塩基多型(SNP)の検出の際に用いられる手法である。具体的には、標的とするSNP部位を含むプライマーを用いて、標的核酸の増幅の有無を検出する方法が挙げられる。本手法で用いられるプライマーは、その3’末端にSNP部位を有する。標的核酸中のSNPとプライマーの3’末端の塩基が相補的である場合(完全一致プライマー)、DNAポリメラーゼによる鎖伸長反応が進行し、増幅シグナルが観測される。一方、標的核酸中のSNPとプライマーの3’末端の塩基が相補的でない場合(不完全一致プライマー)にDNAポリメラーゼによる鎖伸長反応が進行しないと増幅シグナルは観測されない。このように、アレル特異的PCRは、3’末端に野生型もしくは変異型ヌクレオチドを配したプライマーを用いることで、その増幅結果からSNPを判定する手法である。
上記手法を用いた応用例として、ハプロタイプ検出が挙げられる。ハプロタイプとは、単一染色体上に存在する2つまたはそれ以上の多型の組み合わせを指す。近年の研究において、ハプロタイプが疾患の発症や薬剤応答性(薬効・副作用)と関係があることが明らかになりつつある。
上記ハプロタイプを実験的に直接決定する方法として、アレル特異的PCRと電気泳動による解析を組み合わせたものがある(特許文献1参照)。この方法は、2つのSNPのハプロタイプを決定するもので、2箇所のSNP部位に対してアレル特異的プライマーを2種類ずつ、計4種類用意する。上記プライマーは、2箇所のSNP部位が含まれるように設計した順方向および逆方向プライマーである。4種類の上記プライマーを用いて、アレル特異的PCRを行う。得られた増幅産物が、いずれの順方向および逆方向プライマー対で増幅されたかを、電気泳動にて解析することで、ハプロタイプを決定する。
本手法で用いられるプライマーについて具体的に記述する。第一のSNPを含む順方向プライマーは5’末端にアレルによって異なるシグナルを与える標識が修飾されており、3’末端にSNP部位を有する。また、第二のSNP部位を含む逆方向プライマーは、5’末端に標的配列には存在しないフラップ配列が付加されており、3’末端にSNP部位を有する。これらのプライマーを用いてアレル特異的PCRを行うことで、第一のSNPを蛍光波長で、第二のSNPを増幅産物長で判定することが可能となる。
特開2002-272482
上記方法では、3’末端にSNP部位を設けたプライマーが用いられている。しかしながら、3’末端にSNP部位が設けられている場合、多くの条件でアレル特異的PCRが成功しない。これは、酵素の特異性の低さに由来する。即ち、DNA伸長酵素は、3’末端で標的核酸とプライマーとの間でミスマッチが存在しても、多くの場合、伸長してしまうのである。したがって、アレル特異的PCRを達成するためには、反応条件の最適化が必須となる。しかしながら、反応条件の最適化は容易ではなく、例え最適化が行えたとしても、同時に完全一致プライマーによる増幅効率も著しく低下するため、判定能が低下する問題点がある。
そこで、本発明では、アレル特異的PCRを高精度に行うことを目的とし、プライマー中のSNP部位を3’末端以外の部位に設定したプライマーを提供する。
本発明のSNP部位を含む標的核酸をアレル特異的に増幅する方法は、
(i)3’末端から数えて2塩基目及び3塩基目の一方のみに前記SNP部位として野生型ヌクレオチドを有する以外は、前記標的核酸内のSNP部位を含む部分領域と同一の塩基配列を有する第1の順方向プライマーと、
(ii)3’末端から数えて2塩基目及び3塩基目の一方のみに前記SNP部位として変異型ヌクレオチドを有する以外は、前記標的核酸内のSNP部位を含む部分領域と同一の塩基配列を有する第2の順方向プライマーと、
(iii)前記標的核酸の相補鎖の、前記SNP部位よりも5’末端側で、前記SNP部位に対応する部位を含まない部分領域と同一の塩基配列を有する逆方向プライマーと、
を用いて前記標的核酸のPCR反応を行うことを特徴とする。
(i)3’末端から数えて2塩基目及び3塩基目の一方のみに前記SNP部位として野生型ヌクレオチドを有する以外は、前記標的核酸内のSNP部位を含む部分領域と同一の塩基配列を有する第1の順方向プライマーと、
(ii)3’末端から数えて2塩基目及び3塩基目の一方のみに前記SNP部位として変異型ヌクレオチドを有する以外は、前記標的核酸内のSNP部位を含む部分領域と同一の塩基配列を有する第2の順方向プライマーと、
(iii)前記標的核酸の相補鎖の、前記SNP部位よりも5’末端側で、前記SNP部位に対応する部位を含まない部分領域と同一の塩基配列を有する逆方向プライマーと、
を用いて前記標的核酸のPCR反応を行うことを特徴とする。
本発明のプライマーセットは、上記の標的核酸をアレル特異的に増幅する方法に用いるプライマーのセットであって、
(A)3’末端から数えて2塩基目及び3塩基目の一方のみに前記SNP部位として野生型ヌクレオチドを有する以外は、前記標的核酸内のSNP部位を含む部分領域と同一の塩基配列を有する第1の順方向プライマーと、
(B)3’末端から数えて2塩基目及び3塩基目の一方のみに前記SNP部位として変異型ヌクレオチドを有する以外は、前記標的核酸のSNP部位を含む部分領域と同一の塩基配列を有する第2の順方向プライマーと、
(C)前記標的核酸の相補鎖の、前記SNP部位よりも5’末端側で、前記SNP部位に対応する部位を含まない部分領域と同一の塩基配列を有する逆方向プライマーと、
を含むことを特徴とする。
(A)3’末端から数えて2塩基目及び3塩基目の一方のみに前記SNP部位として野生型ヌクレオチドを有する以外は、前記標的核酸内のSNP部位を含む部分領域と同一の塩基配列を有する第1の順方向プライマーと、
(B)3’末端から数えて2塩基目及び3塩基目の一方のみに前記SNP部位として変異型ヌクレオチドを有する以外は、前記標的核酸のSNP部位を含む部分領域と同一の塩基配列を有する第2の順方向プライマーと、
(C)前記標的核酸の相補鎖の、前記SNP部位よりも5’末端側で、前記SNP部位に対応する部位を含まない部分領域と同一の塩基配列を有する逆方向プライマーと、
を含むことを特徴とする。
本発明の5’側に第1のSNP部位を有し、3’側に第2のSNP部位を有する標的核酸のハプロタイプの決定方法であって、
(1)(i)3’末端から数えて2塩基目及び3塩基目の一方のみに前記第1のSNP部位として野生型ヌクレオチドを有する以外は、前記標的核酸内のSNP部位を含む部分領域と同一の塩基配列を有する第1の順方向プライマーと、
(ii)3’末端から数えて2塩基目及び3塩基目の一方のみに前記第1のSNP部位として変異型ヌクレオチドを有する以外は、前記標的核酸内のSNP部位を含む部分領域と同一の塩基配列を有する第2の順方向プライマーと、
(iii)前記標的核酸の相補鎖の、前記第2のSNP部位よりも5’末端側で、前記第2のSNP部位に対応する部位を含まない部分領域と同一の塩基配列を有する逆方向プライマーと、
を用いて前記標的核酸のPCR反応を行う工程と、
(2)前記工程(1)の結果として得られる産物を、
(I)該第2のSNP部位が野生型ヌクレオチドである該標的核酸内の該第2のSNP部位を含む検出対象領域の塩基配列と相補的な塩基配列を有する第1のプローブ及び
(II)該第2のSNP部位が変異ヌクレオチドである該標的核酸内の該第2のSNP部位を含む検出対象領域の塩基配列と相補的な塩基配列を有する第2のプローブ、
の両方と反応させて、これらの第1及び第2のプローブとのハイブリッド体の形成を示すシグナルを検出する工程と、
を含むことを特徴とする。
(1)(i)3’末端から数えて2塩基目及び3塩基目の一方のみに前記第1のSNP部位として野生型ヌクレオチドを有する以外は、前記標的核酸内のSNP部位を含む部分領域と同一の塩基配列を有する第1の順方向プライマーと、
(ii)3’末端から数えて2塩基目及び3塩基目の一方のみに前記第1のSNP部位として変異型ヌクレオチドを有する以外は、前記標的核酸内のSNP部位を含む部分領域と同一の塩基配列を有する第2の順方向プライマーと、
(iii)前記標的核酸の相補鎖の、前記第2のSNP部位よりも5’末端側で、前記第2のSNP部位に対応する部位を含まない部分領域と同一の塩基配列を有する逆方向プライマーと、
を用いて前記標的核酸のPCR反応を行う工程と、
(2)前記工程(1)の結果として得られる産物を、
(I)該第2のSNP部位が野生型ヌクレオチドである該標的核酸内の該第2のSNP部位を含む検出対象領域の塩基配列と相補的な塩基配列を有する第1のプローブ及び
(II)該第2のSNP部位が変異ヌクレオチドである該標的核酸内の該第2のSNP部位を含む検出対象領域の塩基配列と相補的な塩基配列を有する第2のプローブ、
の両方と反応させて、これらの第1及び第2のプローブとのハイブリッド体の形成を示すシグナルを検出する工程と、
を含むことを特徴とする。
本発明に係るアレル特異的プライマーを用いることで、高精度なアレル特異的PCRを行うことが可能となる。
本発明のSNP部位を含む標的核酸をアレル特異的に増幅する核酸増幅方法では以下の3種のプライマーが用いられる。
(i)3’末端から数えて2塩基目及び3塩基目の一方のみに前記SNP部位として野生型ヌクレオチドを有する以外は、前記標的核酸内のSNP部位を含む部分領域と同一の塩基配列を有する第1の順方向プライマー。
(ii)3’末端から数えて2塩基目及び3塩基目の一方のみに前記SNP部位として変異型ヌクレオチドを有する以外は、前記標的核酸内のSNP部位を含む部分領域と同一の塩基配列を有する第2の順方向プライマー。
(iii)前記標的核酸の相補鎖の、前記SNP部位よりも5’末端側で、前記SNP部位に対応する部位を含まない部分領域と同一の塩基配列を有する逆方向プライマー。
(i)3’末端から数えて2塩基目及び3塩基目の一方のみに前記SNP部位として野生型ヌクレオチドを有する以外は、前記標的核酸内のSNP部位を含む部分領域と同一の塩基配列を有する第1の順方向プライマー。
(ii)3’末端から数えて2塩基目及び3塩基目の一方のみに前記SNP部位として変異型ヌクレオチドを有する以外は、前記標的核酸内のSNP部位を含む部分領域と同一の塩基配列を有する第2の順方向プライマー。
(iii)前記標的核酸の相補鎖の、前記SNP部位よりも5’末端側で、前記SNP部位に対応する部位を含まない部分領域と同一の塩基配列を有する逆方向プライマー。
第1のプライマー及び第2のプライマーは、標的核酸のSNP部位を含む部分領域、すなわち標的核酸内のSNP部位を含む一部の領域に対応し、SNP部位を除いた部分については、標的核酸と同一の塩基配列からなる。これらのプライマーのSNP部位としては、第1のプライマーにおけるSNP部位として野生型であり、第2のプライマーにおけるSNP部位として変異型を設定する。また、このSNP部位は、各プライマーの3’末端から2番目または3番目に設定され、ともに3番目であることが好ましい。
上記の第1〜第3のプライマーを用いて、SNP部位を含む標的核酸のアレル特異的増幅方法用のプライマーセットを構成することができる。また、後述する第1及び第2のSNPを有する標的核酸におけるハプロタイプの決定方法におけるプローブと組み合わせて、ハプロタイプの決定方法に用いるプライマー及びプローブセットを構成することもできる。
第1及び第2のプライマーとで検出用の標識を異ならせておくことで、増幅した核酸断片が、どのプライマーから増幅されたものであるかを効率良く検出可能となる。
上記のSNP部位を含む標的核酸のアレル特異的増幅方法は、2つのSNP(第1のSNP部位及び第2のSNP部位)を有する標的核酸のハプロタイプの決定に好適に用いることができる。このハプロタイプの決定方法は以下の工程により行うことができる。
(1)先に挙げた(i)〜(iii)の全てのプライマーを用いて標的核酸のPCR反応を行う工程。
(2)前記工程(1)の結果として得られる産物を、以下のプローブの両方と反応させて、これらの第1及び第2のプローブとのハイブリッド体の形成を示すシグナルを検出する工程。
(I)該第2のSNP部位が野生型ヌクレオチドである該標的核酸内の該第2のSNP部位を含む検出対象領域の塩基配列と相補的な塩基配列を有する第1のプローブ。
(II)該第2のSNP部位が変異ヌクレオチドである該標的核酸内の該第2のSNP部位を含む検出対象領域の塩基配列と相補的な塩基配列を有する第2のプローブ。
(1)先に挙げた(i)〜(iii)の全てのプライマーを用いて標的核酸のPCR反応を行う工程。
(2)前記工程(1)の結果として得られる産物を、以下のプローブの両方と反応させて、これらの第1及び第2のプローブとのハイブリッド体の形成を示すシグナルを検出する工程。
(I)該第2のSNP部位が野生型ヌクレオチドである該標的核酸内の該第2のSNP部位を含む検出対象領域の塩基配列と相補的な塩基配列を有する第1のプローブ。
(II)該第2のSNP部位が変異ヌクレオチドである該標的核酸内の該第2のSNP部位を含む検出対象領域の塩基配列と相補的な塩基配列を有する第2のプローブ。
なお、2種のプローブとの反応は、同一反応領域内で行ってもよいし、個々のプローブと個別に反応させてもよい。また、SNPの変異型が複数ある場合は、第2のプライマーおよび第2のプローブを、検出目的に応じて複数用意しても良い。
以下、本発明の一例について図面を参照して説明する。
図1は、1つのSNP部位を含む標的核酸のアレル特異的増幅における第1〜第3のプローブ、SNP部位を一箇所有する標的核酸及びその相補鎖の塩基配列上の位置関係を示す図である。図1において、標的核酸101は、その相補鎖103と二本鎖核酸を構成している。標的核酸101は、検出対象としてのSNP部位を有する。従って、相補鎖103は、核酸101の検出対象としてのSNP部位に対応する位置にその相補核酸からなる相補SNP部位を有していることとなる。ここで、標的核酸101側のSNP部位における野生型ヌクレオチドは「C」、変異型ヌクレオチドは「T」とする。従って、相補鎖103側のSNP部位における野性型ヌクレオチドは「G」、変異型ヌクレオチドは「A」となる。
次いで、標的核酸101側のSNPに対してアレル特異的な2種類の順方向プライマー105、107を用意する。第1の順方向プライマー105は、5’末端に第1の標識106を有し、3’末端付近にヌクレオチド「C」を有する。第2の順方向プライマー107は、5’末端に第2の標識108を有し、3’末端付近にヌクレオチド「T」を有する。ここで、第1の標識106と第2の標識108とは、互いに区別し得るシグナルを生じるものであることが好ましい。例えば、異なる波長の蛍光を発する2種の標識の組み合わせが挙げられる。具体的には、下記1)と2)との組み合わせが挙げられる。
1)1−(ε−カルボキシペンチル)−1’−エチル−3,3,3’,3’−テトラメチルインドカルボシアニン−5,5’−ジサルフォネート(商品名:Cy3;GEヘルスケアバイオサイエンス社製)
2)1−(ε−カルボキシペンチル)−1’−エチル−3,3,3’,3’−テトラメチルインドジカルボシアニン−5,5’−ジサルフォネート(商品名:Cy5;GEヘルスケアバイオサイエンス社製)
一方、逆方向プライマー109も用意する。逆方向プライマー109は、相補鎖103側のSNP部位よりも5’側の、このSNP部位を含まない部分領域の塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するものとする。
1)1−(ε−カルボキシペンチル)−1’−エチル−3,3,3’,3’−テトラメチルインドカルボシアニン−5,5’−ジサルフォネート(商品名:Cy3;GEヘルスケアバイオサイエンス社製)
2)1−(ε−カルボキシペンチル)−1’−エチル−3,3,3’,3’−テトラメチルインドジカルボシアニン−5,5’−ジサルフォネート(商品名:Cy5;GEヘルスケアバイオサイエンス社製)
一方、逆方向プライマー109も用意する。逆方向プライマー109は、相補鎖103側のSNP部位よりも5’側の、このSNP部位を含まない部分領域の塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するものとする。
なお、プライマーの長さ(塩基数)は、目的とする増幅ができるように、標的核酸においてSNPを含む部分領域として設定される領域の塩基配列に応じて選択することができ、例えば15〜19塩基の範囲から選択することが好ましい。
そして第1、第2の順方向プライマー105、107と、逆方向プライマー109とを用いて該標的核酸101のPCRを行う。
図1に示すSNPの場合、第1の順方向プライマー105は、相補鎖103側のSNP部位にヌクレオチド「G」を有するため、伸長される。一方、第2の順方向プライマー107は、相補鎖103の第2のSNP部位に相補的なヌクレオチドを有さないため伸長しない。即ち、PCR産物中には、図2に示した第1の順方向プライマー由来の増幅産物110が存在することとなる。増幅産物110は、5’末端に第1の標識106を有し、第1のSNPに対応する部位にヌクレオチド「C」を有する。一方、第2の順方向プライマー由来の増幅産物は存在しない。
次に、標的核酸101側のSNPが「T」であった場合について説明する。上述の原理に基づいてPCR産物中には、第2の順方向プライマー107由来の、5’末端に第2の標識108を有し、第1のSNPに対応する部位にヌクレオチド「T」を有する増幅産物が含まれることとなる。
図6に、上記の1つのSNP部位を含む標的核酸のアレル特異的増幅を利用したハプロタイプの決定方法の一例における標的核酸、プライマー及びプローブの関係を示す。図6において、標的核酸101は、第1のSNP(SNP1)と第2のSNP(SNP2)を有する。図6の例では、これらのSNPの組合によりハプロタイプが決まる。このハプロタイプの決定には、プライマー105及び109を用いる。これらのプライマーは図1で説明した場合と同様の機能を有する。なお、第3のプライマー109は、標的核酸101の第2のSNPよりも3’側、すなわち標的核酸の相補鎖103の第2のSNP部位よりも5’側の部分領域から選択される。これらのプライマーを用いてPCRを行うことで、標的核酸が図6に示す101である場合は、図6(b)に示す核酸断片が増幅される。この増幅過程は先に図1で説明したとおりである。こうして得られた増幅産物の第2のSNPを検討するために、この部分を検出可能なプローブを用意してハイブリダイゼーション法により第2のSNPを決定する。こうして、標的核酸における第1及び第2のSNPを決定することでそのハプロタイプを決定することができる。ハイブリダイゼーション法による第2のSNPの決定は定法により行うことができ、プローブの長さやその反応条件も検出すべき領域の塩基配列などに応じて適宜選択できる。また、SNPとして複数の変異型がある場合は、これらの変異型のそれぞれに対応するプライマー及びプローブを用意してPCR及びハイブリダイゼーションを行えばよい。
(ターゲットの準備)
検体由来の核酸の増幅反応(PCR)の例を以下に説明する。
検体由来の核酸の増幅反応(PCR)の例を以下に説明する。
先ず、増幅反応液を用意する。増幅反応液の組成の例を以下に示す。
--PCR溶液組成--
Expand Long Enzyme Mix (Roche):0.3μl
Template Genome DNA:〜5ng
Forward/Reverse Primer:各々0.12μM each
dNTP:0.7μl
buffer 1:2 μl
H2O:11.4μl
合計:20μl
上記組成の反応液を、図7に示す温度サイクルのプロトコルに従って、サーマルサイクラーを用い増幅反応を行う。反応終了後、精製用カラム(QUIAGEN QIAquick PCR Purification Kit: QUIGEN社製)を用いてPrimerを除去した後、電気泳動(BioAnalyzer: Agilent社製)により、増幅産物の定量を行う。
--PCR溶液組成--
Expand Long Enzyme Mix (Roche):0.3μl
Template Genome DNA:〜5ng
Forward/Reverse Primer:各々0.12μM each
dNTP:0.7μl
buffer 1:2 μl
H2O:11.4μl
合計:20μl
上記組成の反応液を、図7に示す温度サイクルのプロトコルに従って、サーマルサイクラーを用い増幅反応を行う。反応終了後、精製用カラム(QUIAGEN QIAquick PCR Purification Kit: QUIGEN社製)を用いてPrimerを除去した後、電気泳動(BioAnalyzer: Agilent社製)により、増幅産物の定量を行う。
(アレル特異的PCR)
前述の増幅したPCR産物を用い、アレル特異的PCRを行う。増幅ではCy3標識およびCy5標識された順方向プライマーを用いる。このときのプロトコルの例を以下に示す。
--PCR溶液組成--
AmpliTaq Gold (Applied Biosystems):0.2μl
Template Genome DNA:4 ng
Forward/Reverse Primer:0.4μM each
dNTP mix:各々0.1 mM
10xbuffer:2.5 μl
H2O:9.3μl
合計:25 μl
上記組成の反応液を図8に示す温度サイクルのプロトコルに従って、サーマルサイクラーを用い増幅反応を行う。反応終了後、精製用カラム(QUIAGEN QIAquick PCR Purification Kit: QUIGEN社製)を用いてPrimerを除去した後、電気泳動(BioAnalyzer: Agilent社製)により、増幅産物の定量を行う。
前述の増幅したPCR産物を用い、アレル特異的PCRを行う。増幅ではCy3標識およびCy5標識された順方向プライマーを用いる。このときのプロトコルの例を以下に示す。
--PCR溶液組成--
AmpliTaq Gold (Applied Biosystems):0.2μl
Template Genome DNA:4 ng
Forward/Reverse Primer:0.4μM each
dNTP mix:各々0.1 mM
10xbuffer:2.5 μl
H2O:9.3μl
合計:25 μl
上記組成の反応液を図8に示す温度サイクルのプロトコルに従って、サーマルサイクラーを用い増幅反応を行う。反応終了後、精製用カラム(QUIAGEN QIAquick PCR Purification Kit: QUIGEN社製)を用いてPrimerを除去した後、電気泳動(BioAnalyzer: Agilent社製)により、増幅産物の定量を行う。
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。
(実施例1)
1つのSNPとして「C」を有する標的核酸に関し、先に記載した方法に従ってアレル特異的PCRを行った。標的核酸調製は上述した方法に従った。ただし、アレル特異的PCRの際のアニーリング温度は、62℃とした。また、完全一致順方向プライマーとして、以下の配列1)〜9)から、不完全一致順方向プライマーとして、以下の配列10)〜18)から、それぞれ選択し、逆方向プライマーとして、配列19)を用いた。以下に各配列を示す。
配列1) 5’ Cy3-GGGCTGCACGCTACC 3’(配列番号:1)
配列2) 5’ Cy3-GGCTGCACGCTACCC 3’(配列番号:2)
配列3) 5’ Cy3-GCTGCACGCTACCCA 3’(配列番号:3)
配列4) 5’ Cy3-GCTGCACGCTACCCAC 3’(配列番号:4)
配列5) 5’ Cy3-CTGCACGCTACCCACC 3’(配列番号:5)
配列6) 5’ Cy3-GCACGCTACCCACCAG 3’(配列番号:6)
配列7) 5’ Cy3-CACGCTACCCACCAGG 3’(配列番号:7)
配列8) 5’ Cy3-GCTACCCACCAGGCC 3’(配列番号:8)
配列9) 5’ Cy3-TACCCACCAGGCCCC 3’(配列番号:9)
配列10) 5’ Cy5- GGGCTGCACGCTACT 3’(配列番号:10)
配列11) 5’ Cy5- GGCTGCACGCTACTC 3’(配列番号:11)
配列12) 5’ Cy5- GCTGCACGCTACTCA 3’(配列番号:12)
配列13) 5’ Cy5- GCTGCACGCTACTCAC 3’(配列番号:13)
配列14) 5’ Cy5- CTGCACGCTACTCACC 3’(配列番号:14)
配列15) 5’ Cy5- GCACGCTACTCACCAG 3’(配列番号:15)
配列16) 5’ Cy5- CACGCTACTCACCAGG 3’(配列番号:16)
配列17) 5’ Cy5- GCTACTCACCAGGCC 3’(配列番号:17)
配列18) 5’ Cy5- TACTCACCAGGCCCC 3’(配列番号:18)
配列19) 5’ GCATCCCATTCCCAGATGA 3’(配列番号:19)
ここで完全一致順方向プライマー1)は5’末端に「Cy3」標識、3’末端にSNPである「C」を有する。また、プライマー2)は5’末端に「Cy3」標識、3’末端から2番目にSNPである「C」を有する。以下同様に、完全一致順方向プライマー3)〜9)は5’末端に「Cy3」標識、3’末端からn番目にSNPである「C」を有する。
1つのSNPとして「C」を有する標的核酸に関し、先に記載した方法に従ってアレル特異的PCRを行った。標的核酸調製は上述した方法に従った。ただし、アレル特異的PCRの際のアニーリング温度は、62℃とした。また、完全一致順方向プライマーとして、以下の配列1)〜9)から、不完全一致順方向プライマーとして、以下の配列10)〜18)から、それぞれ選択し、逆方向プライマーとして、配列19)を用いた。以下に各配列を示す。
配列1) 5’ Cy3-GGGCTGCACGCTACC 3’(配列番号:1)
配列2) 5’ Cy3-GGCTGCACGCTACCC 3’(配列番号:2)
配列3) 5’ Cy3-GCTGCACGCTACCCA 3’(配列番号:3)
配列4) 5’ Cy3-GCTGCACGCTACCCAC 3’(配列番号:4)
配列5) 5’ Cy3-CTGCACGCTACCCACC 3’(配列番号:5)
配列6) 5’ Cy3-GCACGCTACCCACCAG 3’(配列番号:6)
配列7) 5’ Cy3-CACGCTACCCACCAGG 3’(配列番号:7)
配列8) 5’ Cy3-GCTACCCACCAGGCC 3’(配列番号:8)
配列9) 5’ Cy3-TACCCACCAGGCCCC 3’(配列番号:9)
配列10) 5’ Cy5- GGGCTGCACGCTACT 3’(配列番号:10)
配列11) 5’ Cy5- GGCTGCACGCTACTC 3’(配列番号:11)
配列12) 5’ Cy5- GCTGCACGCTACTCA 3’(配列番号:12)
配列13) 5’ Cy5- GCTGCACGCTACTCAC 3’(配列番号:13)
配列14) 5’ Cy5- CTGCACGCTACTCACC 3’(配列番号:14)
配列15) 5’ Cy5- GCACGCTACTCACCAG 3’(配列番号:15)
配列16) 5’ Cy5- CACGCTACTCACCAGG 3’(配列番号:16)
配列17) 5’ Cy5- GCTACTCACCAGGCC 3’(配列番号:17)
配列18) 5’ Cy5- TACTCACCAGGCCCC 3’(配列番号:18)
配列19) 5’ GCATCCCATTCCCAGATGA 3’(配列番号:19)
ここで完全一致順方向プライマー1)は5’末端に「Cy3」標識、3’末端にSNPである「C」を有する。また、プライマー2)は5’末端に「Cy3」標識、3’末端から2番目にSNPである「C」を有する。以下同様に、完全一致順方向プライマー3)〜9)は5’末端に「Cy3」標識、3’末端からn番目にSNPである「C」を有する。
また、不完全一致順方向プライマー10)は5’末端に「Cy5」標識、3’末端にSNPである「T」を有する。また、不完全一致プライマー11)は5’末端に「Cy5」標識、3’末端から2番目にSNPである「T」を有する。以下同様に、不完全一致順方向プライマー12)〜18)は5’末端に「Cy5」標識、3’末端からn番目にSNPである「T」を有する。さらに、逆方向プライマーはPCR産物が標的核酸に対する相補鎖側のSNPを含まないよう設計した。
アレル特異的PCRは、完全一致順方向プライマー1種、不完全プライマー1種、逆方向プライマーを用いて行った。各実験で用いたプライマーの組み合わせは、表1のとおりである。
標的核酸および上記プライマーセットを用いてアレル特異的PCRを行った。その後、精製を行い、電気泳動にて定量を行った。アレル特異的PCRおよび精製、電気泳動の各工程は、先に記載した方法に従った。
得られた解析結果を図示し、アレル特異的PCRにおけるプライマー中のSNP位置の評価を行う。図3は、SNPとして「C」を有する標的核酸を用いて、アレル特異的PCRを行った結果である。縦軸は生成した産物量、横軸はプライマーセットを示す。図中の四角は完全一致順方向プライマー、丸は不完全一致順方向プライマーを用いた場合の結果である。図3に示したとおり、不完全一致プライマーによる増幅産物量は、配列12)の時、最少になる。一方、完全一致プライマーによる増幅産物量は、全ての配列でほぼ同じである。このことから、3’末端から3番目にSNP部位を有するプライマーセットを用いた時、不完全一致プライマーによる増幅産物量が最少になり、完全一致プライマーによる増幅産物量が変化しないといえる。したがって、アレル特異的PCRを高精度で行うためには、3’末端から3番目にSNP部位を有するプライマーセットを用いることが好ましい。
(実施例2)
SNPとして「C」を有する標的核酸に関し、アレル特異的PCRを行った。標的核酸調製は先に記載した方法に従った。ただし、アレル特異的PCRの際のアニーリング温度は、56℃とした。また、完全一致順方向プライマーとして、配列20)〜27)から、不完全一致順方向プライマーとして、配列28)〜35)からそれぞれ選択し、逆方向プライマーとして、配列36)を用いた。以下に各配列を示す。
配列20) 5’ Cy3-AATGCCCTTCTCCAGGAC 3’(配列番号:20)
配列21) 5’ Cy3-GCCCTTCTCCAGGACG 3’(配列番号:21)
配列22) 5’ Cy3-CCCTTCTCCAGGACGT 3’(配列番号:22)
配列23) 5’ Cy3-CCCTTCTCCAGGACGTC 3’(配列番号:23)
配列24) 5’ Cy3-CCTTCTCCAGGACGTCC 3’(配列番号:24)
配列25) 5’ Cy3-CTTCTCCAGGACGTCCC 3’(配列番号:25)
配列26) 5’ Cy3-TCCAGGACGTCCCCC 3’(配列番号:26)
配列27) 5’ Cy3-ACGTCCCCCAAACCTG 3’(配列番号:27)
配列28) 5’ Cy5-AATGCCCTTCTCCAGGAA 3’(配列番号:28)
配列29) 5’ Cy5-GCCCTTCTCCAGGAAG 3’(配列番号:29)
配列30) 5’ Cy5-CCCTTCTCCAGGAAGT 3’(配列番号:30)
配列31) 5’ Cy5-CCCTTCTCCAGGAAGTC 3’(配列番号:31)
配列32) 5’ Cy5-CCTTCTCCAGGAAGTCC 3’(配列番号:32)
配列33) 5’ Cy5-CTTCTCCAGGAAGTCCC 3’(配列番号:33)
配列34) 5’ Cy5-TCCAGGAAGTCCCCC 3’(配列番号:34)
配列35) 5’ Cy5-AAGTCCCCCAAACCTG 3’(配列番号:35)
配列36) 5’ GCTTTGCAGGCTTCAGG 3’(配列番号:36)
ここで完全一致順方向プライマー20)は5’末端に「Cy3」標識、3’末端にSNPである「C」を有する。また、プライマー21)は5’末端に「Cy3」標識、3’末端から2番目にSNPである「C」を有する。以下同様に、完全一致順方向プライマー22)〜27)は5’末端に「Cy3」標識、3’末端からn番目にSNPである「C」を有する。また、不完全一致順方向プライマー28)は5’末端に「Cy5」標識、3’末端にSNPである「A」を有する。また、不完全一致プライマー29)は5’末端に「Cy5」標識、3’末端から2番目にSNPである「A」を有する。以下同様に、不完全一致順方向プライマー30)〜35)は5’末端に「Cy5」標識、3’末端からn番目にSNPである「A」を有する。さらに、逆方向プライマーはPCR産物が標的核酸に対する相補側のSNPを含まないよう設計した。
SNPとして「C」を有する標的核酸に関し、アレル特異的PCRを行った。標的核酸調製は先に記載した方法に従った。ただし、アレル特異的PCRの際のアニーリング温度は、56℃とした。また、完全一致順方向プライマーとして、配列20)〜27)から、不完全一致順方向プライマーとして、配列28)〜35)からそれぞれ選択し、逆方向プライマーとして、配列36)を用いた。以下に各配列を示す。
配列20) 5’ Cy3-AATGCCCTTCTCCAGGAC 3’(配列番号:20)
配列21) 5’ Cy3-GCCCTTCTCCAGGACG 3’(配列番号:21)
配列22) 5’ Cy3-CCCTTCTCCAGGACGT 3’(配列番号:22)
配列23) 5’ Cy3-CCCTTCTCCAGGACGTC 3’(配列番号:23)
配列24) 5’ Cy3-CCTTCTCCAGGACGTCC 3’(配列番号:24)
配列25) 5’ Cy3-CTTCTCCAGGACGTCCC 3’(配列番号:25)
配列26) 5’ Cy3-TCCAGGACGTCCCCC 3’(配列番号:26)
配列27) 5’ Cy3-ACGTCCCCCAAACCTG 3’(配列番号:27)
配列28) 5’ Cy5-AATGCCCTTCTCCAGGAA 3’(配列番号:28)
配列29) 5’ Cy5-GCCCTTCTCCAGGAAG 3’(配列番号:29)
配列30) 5’ Cy5-CCCTTCTCCAGGAAGT 3’(配列番号:30)
配列31) 5’ Cy5-CCCTTCTCCAGGAAGTC 3’(配列番号:31)
配列32) 5’ Cy5-CCTTCTCCAGGAAGTCC 3’(配列番号:32)
配列33) 5’ Cy5-CTTCTCCAGGAAGTCCC 3’(配列番号:33)
配列34) 5’ Cy5-TCCAGGAAGTCCCCC 3’(配列番号:34)
配列35) 5’ Cy5-AAGTCCCCCAAACCTG 3’(配列番号:35)
配列36) 5’ GCTTTGCAGGCTTCAGG 3’(配列番号:36)
ここで完全一致順方向プライマー20)は5’末端に「Cy3」標識、3’末端にSNPである「C」を有する。また、プライマー21)は5’末端に「Cy3」標識、3’末端から2番目にSNPである「C」を有する。以下同様に、完全一致順方向プライマー22)〜27)は5’末端に「Cy3」標識、3’末端からn番目にSNPである「C」を有する。また、不完全一致順方向プライマー28)は5’末端に「Cy5」標識、3’末端にSNPである「A」を有する。また、不完全一致プライマー29)は5’末端に「Cy5」標識、3’末端から2番目にSNPである「A」を有する。以下同様に、不完全一致順方向プライマー30)〜35)は5’末端に「Cy5」標識、3’末端からn番目にSNPである「A」を有する。さらに、逆方向プライマーはPCR産物が標的核酸に対する相補側のSNPを含まないよう設計した。
アレル特異的PCRは、完全一致順方向プライマー1種、不完全プライマー1種、逆方向プライマーを用いて行った。各実験で用いたプライマーの組み合わせは、表2のとおりである。
標的核酸および上記プライマーセットを用いてアレル特異的PCRを行った。その後、精製を行い、電気泳動にて定量を行った。アレル特異的PCRおよび精製、電気泳動の各工程は先に記載した方法に従った。
得られた解析結果を図示し、アレル特異的PCRにおけるプライマー中のSNP位置の評価を行う。図4は、SNPとして「C」を有する標的核酸を用いて、アレル特異的PCRを行った結果である。縦軸は生成した産物量、横軸はプライマーセットを示す。図中の四角は完全一致順方向プライマー、丸は不完全一致順方向プライマーを用いた場合の結果である。図に示したとおり、不完全一致プライマーによる増幅産物量は、配列30)の時、最少になる。一方、完全一致プライマーによる増幅産物量は、全ての配列でほぼ同じである。このことから、3’末端から3番目にSNP部位を有するプライマーセットを用いた時、不完全一致プライマーによる増幅産物量が最少になり、完全一致プライマーによる増幅産物量が変化しないといえる。したがって、アレル特異的PCRを高精度で行うためには、3’末端から3番目にSNP部位を有するプライマーセットを用いることが好ましい。
(実施例3)
第1のSNPとして「T」を有する標的核酸に関し、アレル特異的PCRを行った。標的核酸調製は実施様態例に従った。ただし、アレル特異的PCRの際のアニーリング温度は、60℃とした。また、完全一致順方向プライマーとして、配列37)〜42)から、不完全一致順方向プライマーとして、配列43)〜48)からそれぞれ選択し、逆方向プライマーとして、配列49)を用いた。以下に各配列を示す。
配列37) 5’ Cy3-GACCTGTAGTCTGGGGT 3’(配列番号:37)
配列38) 5’ Cy3-ACCTGTAGTCTGGGGTG 3’(配列番号:38)
配列39) 5’ Cy3-CCTGTAGTCTGGGGTGA 3’(配列番号:39)
配列40) 5’ Cy3-CCTGTAGTCTGGGGTGAT 3’(配列番号:40)
配列41) 5’ Cy3-AGTCTGGGGTGATCCTG 3’(配列番号:41)
配列42) 5’ Cy3-GGTGATCCTGGCTTGAC 3’(配列番号:42)
配列43) 5’ Cy5-GACCTGTAGTCTGGGGG 3’(配列番号:43)
配列44) 5’ Cy5-ACCTGTAGTCTGGGGGG 3’(配列番号:44)
配列45) 5’ Cy5-CCTGTAGTCTGGGGGGA 3’(配列番号:45)
配列46) 5’ Cy5-CCTGTAGTCTGGGGGGAT 3’(配列番号:46)
配列47) 5’ Cy5-AGTCTGGGGGGATCCTG 3’(配列番号:47)
配列48) 5’ Cy5-GGGGATCCTGGCTTGAC 3’(配列番号:48)
配列49) 5’ GGCCTGTTTCATGTCCA 3’(配列番号:49)
ここで完全一致順方向プライマー37)は5’末端に「Cy3」標識、3’末端に第1のSNPである「T」を有する。また、プライマー38)は5’末端に「Cy3」標識、3’末端から2番目にSNPである「T」を有する。以下同様に、完全一致順方向プライマー39)〜42)は5’末端に「Cy3」標識、3’末端からn番目にSNPである「T」を有する。また、不完全一致順方向プライマー43)は5’末端に「Cy5」標識、3’末端にSNPである「G」を有する。また、不完全一致プライマー44)は5’末端に「Cy5」標識、3’末端から2番目にSNPである「G」を有する。以下同様に、不完全一致順方向プライマー45)〜48)は5’末端に「Cy5」標識、3’末端からn番目にSNPである「G」を有する。さらに、逆方向プライマーはPCR産物が第2のSNPを含まないよう設計した。
第1のSNPとして「T」を有する標的核酸に関し、アレル特異的PCRを行った。標的核酸調製は実施様態例に従った。ただし、アレル特異的PCRの際のアニーリング温度は、60℃とした。また、完全一致順方向プライマーとして、配列37)〜42)から、不完全一致順方向プライマーとして、配列43)〜48)からそれぞれ選択し、逆方向プライマーとして、配列49)を用いた。以下に各配列を示す。
配列37) 5’ Cy3-GACCTGTAGTCTGGGGT 3’(配列番号:37)
配列38) 5’ Cy3-ACCTGTAGTCTGGGGTG 3’(配列番号:38)
配列39) 5’ Cy3-CCTGTAGTCTGGGGTGA 3’(配列番号:39)
配列40) 5’ Cy3-CCTGTAGTCTGGGGTGAT 3’(配列番号:40)
配列41) 5’ Cy3-AGTCTGGGGTGATCCTG 3’(配列番号:41)
配列42) 5’ Cy3-GGTGATCCTGGCTTGAC 3’(配列番号:42)
配列43) 5’ Cy5-GACCTGTAGTCTGGGGG 3’(配列番号:43)
配列44) 5’ Cy5-ACCTGTAGTCTGGGGGG 3’(配列番号:44)
配列45) 5’ Cy5-CCTGTAGTCTGGGGGGA 3’(配列番号:45)
配列46) 5’ Cy5-CCTGTAGTCTGGGGGGAT 3’(配列番号:46)
配列47) 5’ Cy5-AGTCTGGGGGGATCCTG 3’(配列番号:47)
配列48) 5’ Cy5-GGGGATCCTGGCTTGAC 3’(配列番号:48)
配列49) 5’ GGCCTGTTTCATGTCCA 3’(配列番号:49)
ここで完全一致順方向プライマー37)は5’末端に「Cy3」標識、3’末端に第1のSNPである「T」を有する。また、プライマー38)は5’末端に「Cy3」標識、3’末端から2番目にSNPである「T」を有する。以下同様に、完全一致順方向プライマー39)〜42)は5’末端に「Cy3」標識、3’末端からn番目にSNPである「T」を有する。また、不完全一致順方向プライマー43)は5’末端に「Cy5」標識、3’末端にSNPである「G」を有する。また、不完全一致プライマー44)は5’末端に「Cy5」標識、3’末端から2番目にSNPである「G」を有する。以下同様に、不完全一致順方向プライマー45)〜48)は5’末端に「Cy5」標識、3’末端からn番目にSNPである「G」を有する。さらに、逆方向プライマーはPCR産物が第2のSNPを含まないよう設計した。
アレル特異的PCRは、完全一致順方向プライマー1種、不完全プライマー1種、逆方向プライマーを用いて行った。各実験で用いたプライマーの組み合わせは、表3のとおりである。
標的核酸および上記プライマーセットを用いてアレル特異的PCRを行った。その後、精製を行い、電気泳動にて定量を行った。アレル特異的PCRおよび精製、電気泳動の各工程は、先に記載した方法に従った。
得られた解析結果を図示し、アレル特異的PCRにおけるプライマー中のSNP位置の評価を行う。図5は、SNPとして「T」を有する標的核酸を用いて、アレル特異的PCRを行った結果である。縦軸は生成した産物量、横軸はプライマーセットを示す。図中の四角は完全一致順方向プライマー、丸は不完全一致順方向プライマーを用いた場合の結果である。図に示したとおり、不完全一致プライマーによる増幅産物量は、配列45)の時、最少になる。一方、完全一致プライマーによる増幅産物量は、全ての配列でほぼ同じである。このことから、3’末端から3番目にSNP部位を有するプライマーセットを用いた時、不完全一致プライマーによる増幅産物量が最少になり、完全一致プライマーによる増幅産物量が変化しないといえる。したがって、アレル特異的PCRを高精度で行うためには、3’末端から3番目にSNP部位を有するプライマーセットを用いることが好ましい。
上記実施例で示したとおり、本発明に基づき設計した不完全一致順方向プライマーを用いることで、非特異的な増幅反応が低減されることが明らかとなった。したがって、本発明で示されるプライマーは、高精度なアレル特異的PCRに有効であるといえる。
101:標的核酸
103:標的核酸の相補鎖
105:第1の順方向プライマー
106:第1の標識
107:第2の順方向プライマー
108:第2の標識
109:逆方向プライマー
110:増幅産物
103:標的核酸の相補鎖
105:第1の順方向プライマー
106:第1の標識
107:第2の順方向プライマー
108:第2の標識
109:逆方向プライマー
110:増幅産物
Claims (9)
- SNP部位を含む標的核酸をアレル特異的に増幅する方法であって、
(i)3’末端から数えて2塩基目及び3塩基目の一方のみに前記SNP部位として野生型ヌクレオチドを有する以外は、前記標的核酸内のSNP部位を含む部分領域と同一の塩基配列を有する第1の順方向プライマーと、
(ii)3’末端から数えて2塩基目及び3塩基目の一方のみに前記SNP部位として変異型ヌクレオチドを有する以外は、前記標的核酸内のSNP部位を含む部分領域と同一の塩基配列を有する第2の順方向プライマーと、
(iii)前記標的核酸の相補鎖の、前記SNP部位よりも5’末端側で、前記SNP部位に対応する部位を含まない部分領域と同一の塩基配列を有する逆方向プライマーと、
を用いて前記標的核酸のPCR反応を行うことを特徴とする核酸増幅方法。 - 前記第1の順方向プライマーが、前記SNP部位を3’末端から数えて3番目に有する請求項1に記載の核酸増幅方法。
- 前記第2の順方向プライマーが、前記SNP部位を3’末端から数えて3番目に有する請求項1または2に記載の核酸増幅方法。
- 前記第1のプライマーと前記第2のプライマーとが異なる標識を有する請求項1〜3のいずれかに記載の核酸増幅方法。
- 請求項1に記載の核酸増幅方法に用いるプライマーのセットであって、
(A)3’末端から数えて2塩基目及び3塩基目の一方のみに前記SNP部位として野生型ヌクレオチドを有する以外は、前記標的核酸内のSNP部位を含む部分領域と同一の塩基配列を有する第1の順方向プライマーと、
(B)3’末端から数えて2塩基目及び3塩基目の一方のみに前記SNP部位として変異型ヌクレオチドを有する以外は、前記標的核酸のSNP部位を含む部分領域と同一の塩基配列を有する第2の順方向プライマーと、
(C)前記標的核酸の相補鎖の、前記SNP部位よりも5’末端側で、前記SNP部位に対応する部位を含まない部分領域と同一の塩基配列を有する逆方向プライマーと、
を含むことを特徴とするプライマーセット。 - 前記第1の順方向プライマーが、前記SNPを3’末端から数えて3番目に有する請求項5に記載のプライマーセット。
- 前記第2の順方向プライマーが、前記SNPを3’末端から数えて3番目に有する請求項5または6に記載のプライマーセット。
- 前記第1のプライマーと前記第2のプライマーとが異なる標識を有する請求項1〜3のいずれかに記載のプライマーセット。
- 5’側に第1のSNP部位を有し、3’側に第2のSNP部位を有する標的核酸のハプロタイプの決定方法であって、
(1)(i)3’末端から数えて2塩基目及び3塩基目の一方のみに前記第1のSNP部位として野生型ヌクレオチドを有する以外は、前記標的核酸内のSNP部位を含む部分領域と同一の塩基配列を有する第1の順方向プライマーと、
(ii)3’末端から数えて2塩基目及び3塩基目の一方のみに前記第1のSNP部位として変異型ヌクレオチドを有する以外は、前記標的核酸内のSNP部位を含む部分領域と同一の塩基配列を有する第2の順方向プライマーと、
(iii)前記標的核酸の相補鎖の、前記第2のSNP部位よりも5’末端側で、前記第2のSNP部位に対応する部位を含まない部分領域と同一の塩基配列を有する逆方向プライマーと、
を用いて前記標的核酸のPCR反応を行う工程と、
(2)前記工程(1)の結果として得られる産物を、
(I)該第2のSNP部位が野生型ヌクレオチドである該標的核酸内の該第2のSNP部位を含む検出対象領域の塩基配列と相補的な塩基配列を有する第1のプローブ及び
(II)該第2のSNP部位が変異ヌクレオチドである該標的核酸内の該第2のSNP部位を含む検出対象領域の塩基配列と相補的な塩基配列を有する第2のプローブ、
の両方と反応させて、これらの第1及び第2のプローブとのハイブリッド体の形成を示すシグナルを検出する工程と、
を含むことを特徴とするハプロタイプの決定方法。
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