JP2009125020A - ハプロタイプの決定方法 - Google Patents

Abstract

【課題】多型マーカーの位置に因らず、ハプロタイプをより正確に決定することができるハプロタイプの決定方法を提供する。
【解決手段】５’側に第１のＳＮＰ部位を有し、３’側に第２のＳＮＰ部位を有する標的核酸のハプロタイプの決定するためのプライマーとして、第１のＳＮＰ部位が野生型である標的核酸を増幅するための第１の標識を有する第１の順方向プライマーと、第１の標識と異なる信号を発する第２の標識を有し、第１のＳＮＰ部位が変異型である標的核酸を増幅するための第２の順方向プライマーと、これらのプライマーに共通する逆方向プライマーとを用いてハプロタイプが未知の標的核酸のＰＣＲ増幅を行い、増幅産物が第１及び第２の順方向プライマーのどちらに基づくものかを判定するとともに、得られた増幅産物に対して更にプローブを用いて第２のSNPのタイプを決定する。
【選択図】図３

Description

本発明は統計的な推定を用いず、実験的にハプロタイプを決定する方法に関する。

ハプロタイプとは、単一の染色体上に位置する２つまたはそれ以上の多型マーカーの組み合わせのことである。例えば、図１において、個体Aのゲノムの遺伝子座１と遺伝子座２とがある場合、一方のゲノム上ではA-Tというハプロタイプを持ち、もう一方のゲノム上ではA-Gというハプロタイプを持つと言う。

近年の研究で、ハプロタイプが疾患の発症や薬剤応答性（薬効・副作用）と関係があることが明らかになりつつある。例えば、薬物代謝酵素のN−アセチル化転移酵素２（NAT2）が挙げられる。このNAT２酵素をコードする遺伝子には３ヶ所のSNPが存在するが、２本の染色体のうち少なくとも一本の染色体において、3ヶ所のSNPが全て野生型でないと副作用のリスクが高まる。したがって、ハプロタイプを正確に検出することは大変重要である。

現在ハプロタイプの解析に用いられるものとして、統計学的にハプロタイプを推定する手法が注目されている。家系データが与えられたときのハプロタイプを決定する手法としては、Linkage Package（例えば、非特許文献１参照）やGENEHUNTER（例えば、非特許文献２参照）のようなソフトウェアがある。一方、家系データが存在しない場合に対応する方法としては、アルゴリズムを用いた最尤推定する手法（非特許文献３）がある。このアルゴリズムには、Clarkのアルゴリズムやハーディ・ワインバーグ平衡（Hardy-Weinberg equilibrium: HWE）を仮定して遺伝子を数えることによるＥＭアルゴリズムが利用される。しかし、これらの方法はあくまでも推定であり、パラメーターの設定によっては結果が異なってくるので、精度が高いと言い切ることはできない。つまり、統計学を利用している限り正確度が100%にはなりえない。

そこで、統計的な推定を用いず、実験的な方法でハプロタイプを検出することが望まれている。

現状、多型を解析する装置として代表的なものにシーケンサーとリアルタイムPCRが存在する。ただ、これらの装置では2本の染色体情報が１本の染色体情報としてまとめられて検出されるため、１本の染色体情報であるハプロタイプを正確に検出することは困難である。図２に示すように個体Aの遺伝子座1がA/A、遺伝子座２がT/Gという遺伝子型であることが解析された場合、一方のゲノム上のハプロタイプはA-Tであり、もう一方のゲノム上のハプロタイプはA-Gであることが分かる。しかし、個体Bの遺伝子座１にはA/C、遺伝子座2にはT/Gという遺伝子型が解析結果として得られた場合は、この解析結果から個体Bのハプロタイプを判定することは不可能である。つまり、個体Bのハプロタイプが、一方のゲノム上でA-T、他方のゲノム上でC-Gである場合と、一方のゲノムがA-G、他方のゲノムがC-Tである場合とがあり、これらのいずれかであるかは判定できない。

ハプロタイプを実験的に直接解析する方法として、アレル特異的PCRと電気泳動の解析を組み合わせたものがある（特許文献１参照）。この方法では２つの多型マーカーのハプロタイプを決定するもので、各多型マーカーに対してアレル特異的なプライマーを２種類ずつ用意し、２つの多型マーカーが含まれるように順方向と逆方向プライマーの両方でアレル特異的なPCRを行う。そして得られた増幅産物が、どの順方向および逆方向プライマー対の組み合わせで増幅されたかを、電気泳動にて解析することで、ハプロタイプを決定する。さらに具体的に示すと、第一の多型マーカーを含む順方向プライマーは５’末端に、アレルによって異なるシグナルを与える標識が修飾されている。また第二の多型マーカーを含む逆方向プライマーにおいては、５’末端にターゲット配列には含まれないフラップ配列をつけて、アレルによって異なる長さになるように設計されている。これらのプライマーを用いて両方向でアレル特異的にPCRを行い、増幅産物中の蛍光標識と増幅産物長を検出することによって、どのプライマー対により増幅されたかが分かり、ハプロタイプを決定することが可能となる。
G. M. Lathrop et al., "Multilocus linkage analysis in humans: detection of linkage and estimation of recombination," Am. J. Hum. Genet., vol.37, pp.482-498, 1985 L. Kruglyak, M. J. Daly, M. P. Reeve-Daly and E. S. Lander, "Parametric and nonparametric linkage analysis: a unified multipoint approach," Am. J. Hum. Genet., vol.58, pp.1347-1363, 1996 M. N. Chiano and D. G. Clayton, "Fine genetic mapping using haplotype analysis and the missing problem," Ann. Hum. Genet., vol.62, pp.55-60, 1998 特開2002-272482

しかし、上記方法においては、プライマーに多型配列部位が含まれることが必須である。そのため、プライマーの塩基配列の選択の自由度が制限を受ける。ここで、アレル特異的なPCRを行なう為には、PCRに用いるプライマー間でTmを揃えることが必要となる。しかしながら、上記した通り、プライマーの塩基配列の選定に制約があると、プライマー間でTmを揃えることが困難となる場合が想定される。言い換えると、上記特許文献１の方法によって精度よくハプロタイプを検出できるのはTｍが揃ったプライマーを設定可能な位置に多型マーカーが存在している場合に限定されてしまう可能性がある。また、上記検出法では、両方向のプライマーの配列位置をずらすことが困難なため、順方向のプライマーと逆方向のプライマー間でプライマーダイマーを形成した場合には、ハプロタイプを検出できなくなる。

そこで、本発明の目的は、多型マーカーの位置に因らず、ハプロタイプをより正確に検出することができるハプロタイプの決定方法を提供することにある。

本発明のハプロタイプの決定方法は、５’側に第１のＳＮＰ部位を有し、３’側に第２のＳＮＰ部位を有する標的核酸のハプロタイプの決定方法であって、
（i）前記第１のＳＮＰ部位が野生型ヌクレオチドである場合に対応する第１の順方向プラマーとして、該第１のＳＮＰ部位を含む部分の塩基配列に対して同一な塩基配列を有し、前記第１のＳＮＰ部位にある野生型ヌクレオチドと同一のヌクレオチドを３’末端部に有し、且つ５’末端に、第１の標識を有するプライマーを用意する工程と、
（ii）前記第１のＳＮＰ部位が変異型ヌクレオチドである場合に対応する第２の順方向プラマーとして、該第１のＳＮＰ部位を含む部分の塩基配列に対して同一な塩基配列を有し、前記第１のＳＮＰ部位にある変異型ヌクレオチドと同一のヌクレオチドを３’末端部に有し、且つ５’末端に、前記第１の標識とは異なるシグナルを与える第２の標識を有するプライマーを用意する工程と、
（iii）前記標的核酸の相補鎖の、前記第２のＳＮＰ部位よりも５’末端側の、該第２のＳＮＰ部位に対応する部位を含まない部分の塩基配列に対して同一な塩基配列を有する逆方向プライマーを用意する工程と、
（iv）前記第１の順方向プライマー、前記第２の順方向プライマー及び逆方向プライマーを用いて、前記第１のＳＮＰ部位が野生型か変異型かが未知である標的核酸のＰＣＲ反応を行う工程と、
（v）前記工程（iv）の結果として得られる増幅産物を、該第２のＳＮＰ部位が野生型ヌクレオチドである標的核酸の該第２のＳＮＰ部位を含む部分を検出するための塩基配列を有する第１のプローブと、該第２のＳＮＰ部位が変異型ヌクレオチドである標的核酸の該第２のＳＮＰ部位を含む部分を検出するための塩基配列を有する第２のプローブと、ハイブリダイゼーション反応させ、該第１または第２のプローブとのハイブリッド体の形成を示すシグナルを検出する工程、
を含むことを特徴とするハプロタイプの決定方法である。

本発明に係るハプロタイプの決定方法によれば、逆方向プライマーはPCR産物が第2のSNP部位を含むよう設計すればよく、アレル特異的配列にする必要がない。したがって、逆方向プライマーのTmを順方向プライマーに合わせやすく、アレル特異的PCRを容易に達成可能である。その結果、前記アレル特異的PCRとマイクロアレイでの検出を組み合わせて、ハプロタイプの検出を正確に行うことができる。本発明によれば、考えられうる全てのハプロタイプの組み合わせをマイクロアレイ上の輝度プロファイルから一意に決定することが可能である。

本発明のハプロタイプの決定方法は、５’側に第１のＳＮＰ部位を有し、３’側に第２のＳＮＰ部位を有する標的核酸のハプロタイプの決定方法であり、以下の工程を有する。
（i）前記第１のＳＮＰ部位が野生型ヌクレオチドである場合に対応する第１の順方向プライマーとして、以下の構成のプライマーを用意する工程。
・該第１のＳＮＰ部位を含む部分の塩基配列に対して同一な塩基配列を有し、前記第１のＳＮＰ部位にある野生型ヌクレオチドと同一のヌクレオチドを３’末端部に有し、且つ５’末端に第１の標識を有するプライマー。
（ii）前記第１のＳＮＰ部位が変異型ヌクレオチドである場合に対応する第２の順方向プラマーとして、以下のプライマーを用意する工程。
・該第１のＳＮＰ部位を含む部分の塩基配列に対して同一な塩基配列を有し、前記第１のＳＮＰ部位にある変異型ヌクレオチドと同一のヌクレオチドを３’末端部に有し、且つ５’末端に、前記第１の標識とは異なるシグナルを与える第２の標識を有するプライマー。
（iii）前記標的核酸の相補鎖の、前記第２のＳＮＰ部位よりも５’末端側の、該第２のＳＮＰ部位に対応する部位を含まない部分の塩基配列に対して同一な塩基配列を有する逆方向プライマーを用意する工程。
（iv）前記第１の順方向プライマー、前記第２の順方向プライマー及び逆方向プライマーを用いて、前記第１のＳＮＰ部位が野生型か変異型かが未知である標的核酸のＰＣＲ反応を行う工程。
（v）前記工程（iv）の結果として得られる増幅産物を、以下の第１のプローブと第２のプローブとハイブリダイゼーション反応させ、該第１または第２のプローブとのハイブリッド体の形成を示すシグナルを検出する工程。
第１のプローブ：該第２のＳＮＰ部位が野生型ヌクレオチドである標的核酸の該第２のＳＮＰ部位を含む部分を検出するための塩基配列を有する第１のプローブ・
第２のプローブ：該第２のＳＮＰ部位が変異型ヌクレオチドである標的核酸の該第２のＳＮＰ部位を含む部分を検出するための塩基配列を有する第２のプローブ。

本発明に係る基本的な原理について図３を用いて説明する。図３において、標的核酸３０１は、その相補鎖３０３と二本鎖核酸を構成している。そして、標的核酸３０１は、５’側に第１のＳＮＰ、３´側に第２のＳＮＰを有している。従って、相補鎖３０３は、３’側に核酸３０１の第１のＳＮＰに対応する第３のＳＮＰ、５´側に、核酸３０１の第２のＳＮＰに対応する第４のＳＮＰを有していることとなる。ここで、標的核酸３０１の第１のSNP部位における野生型ヌクレオチドは「C」、変異型ヌクレオチドは「T」とする。また標的核酸３０１の第２のＳＮＰ部位における野性型ヌクレオチドは「Ｇ」、変異型ヌクレオチドは「Ｔ」とする。従って相補鎖３０３の第３のＳＮＰ部位における野性型ヌクレオチドは「Ｇ」、変異型ヌクレオチドは「Ａ」、第４のＳＮＰ部位における野性型ヌクレオチドは「Ｃ」、変異型ヌクレオチドは「Ａ」となる。

次いで、標的核酸３０１の５’側に位置している第一のSNPに対してアレル特異的な２種類の順方向プライマー３０５、３０７を用意する。第１の順方向プライマー３０５は、５’末端に第１の標識３０６を結合より有し、３’末端に、第１のＳＮＰ部位が野生型である場合のヌクレオチドと同じであるヌクレオチド「C」を有している。

第２の順方向プライマー３０７は、５’末端に第２の標識３０８を結合により有し、３’末端に、第１のＳＮＰ部位が変異型である場合のヌクレオチドと同じであるヌクレオチド「T」を有する。ここで、第１の標識３０６と第２の標識３０８とは、互いに区別し得るシグナルを生じるものである。例えば、異なる波長の蛍光を発する2種の標識の組み合わせが挙げられる。具体的には、下記（１）と（２）との組み合わせが挙げられる。
（１）１−（ε−カルボキシペンチル）−１’−エチル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニン−５，５’−ジサルフォネート（商品名：Ｃｙ３；アマシャムバイオサイエンス社製）；
（２）１−（ε−カルボキシペンチル）−１’−エチル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドジカルボシアニン−５，５’−ジサルフォネート（商品名：Ｃｙ５；アマシャムバイオサイエンス社製）。また、ここで第１の順方向プライマー３０５と第２の順方向プライマー３０７のプライマーは、PCRがアレル特異的にかかる塩基長が好ましく、１５から３０塩基であることが望ましい。

一方、逆方向プライマー３０９も用意する。逆方向プライマー３０９は、相補鎖３０３の、第４のＳＮＰ部位よりも５´側の、該第４のＳＮＰを含まない所定の長さの塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するものとする。

そして上記第１、第２の順方向プライマー３０５、３０７と、上記逆方向プライマー３０９とを用いてハプロタイプが未知である標的核酸のＰＣＲ反応による増幅を行う。

ハプロタイプが未知である標的核酸の第１及び第２のSNPが野生型である場合には、相補鎖３０３は、第３のSNP部位にヌクレオチド「Ｇ」を有するため、第１の順方向プライマー３０５が伸長される。一方、第2の順方向プライマー３０７は、標的核酸３０１の第１のＳＮＰ部位、及び相補鎖３０３の第３のＳＮＰ部位において相補的なヌクレオチドを有しないため伸長しない。即ち、ＰＣＲ増幅産物中には、図４に示した第１の順方向プライマー由来の増幅産物３１０が存在することとなる。増幅産物３１０は、５’末端に第１の標識３０６を有し、第１のSNPに対応する部位にヌクレオチド「C」を、第２のSNPに対応する部位にヌクレオチド「G」を有する。一方、第２の順方向プライマー由来の増幅産物は存在しない。

次に、核酸３０１の、第２のＳＮＰについて野生型及び変異型の各々のヌクレオチド「G」、「T」を含む所定の長さ塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する２つのプローブ３１１、３１３の各々を固相表面の異なる位置に固定したマイクロアレイ３１５を用意する。ここで、プローブ３１１と３１３はアレル特異的にハイブリ反応が行われる塩基長が好ましく、
１５から３０塩基であることが望ましい。そして、マイクロアレイ３１５と上記ＰＣＲによる増幅産物とをハイブリダイゼーション反応させる。すると図５（ａ）に示したように、増幅産物３１０がマイクロアレイ上の第１のプローブ３１１とハイブリッド体を形成する。一方、第２のプローブ３１３とハイブリッド体を形成する増幅産物は当該増幅産物中には存在しない。その結果、マイクロアレイ３１５のプローブ３１１の固定位置において、ハイブリッド体の形成を示すシグナルが観察される。且つそのシグナルは、第１の標識３０６由来のシグナルである。つまり、マイクロアレイ上の２本鎖核酸の形成を示すシグナルの位置から、標的核酸３０１の第２のＳＮＰ部位のヌクレオチドが「Ｇ」であることが決定される。また当該シグナルが第１の標識由来のシグナルであることにより、標的核酸３０１の第１のＳＮＰのヌクレオチドが「Ｃ」であることが決定される。

次に、ハプロタイプが未知の標的核酸が、標的核酸３０１における第１のSNPが「T」、第２のSNPが「Ｔ」であった場合について説明する。上述の原理に基づいてPCR増幅産物中には、第２の順方向プライマー３０７由来の増幅産物が含まれることとなる。この増幅産物は、５´末端に第２の標識３０８を有し、第１のSNPに対応する部位にヌクレオチド「T」を、第２のSNPに対応する部位にヌクレオチド「Ｔ」を有する。従って当該増幅産物をマイクロアレイ３１５とハイブリダイゼーション反応させると、図５（ｂ）に示したように、マイクロアレイ３１５のプローブ３１３の固定位置において第２の標識由来のシグナルが観察される。これにより、標的核酸３０１の第１のSNPが「Ｔ」、第２のSNPが「T」であることが決定される。

更に、ハプロタイプが未知の標的核酸が、標的核酸３０１における第１のSNPが「C」、第２のSNPが「T」であった場合は以下の通りとなる。PCR増幅産物中には、第１の順方向プライマー３０５由来の増幅産物が含まれる。この増幅産物は、５´末端に第１の標識３０６を有し、第１のSNPに対応する部位にヌクレオチド「C」、第２のSNPに対応する部位にヌクレオチド「T」を有する。従って、マイクロアレイ３１５と当該PCR増幅産物とをハイブリダイゼーション反応させると、図５（ｃ）に示したように、マイクロアレイ上のプローブ３１３の固定位置において第１の標識由来のシグナルが観察される。これにより、核酸３０１の第１のＳＮＰが「Ｃ」、第２のＳＮＰが「Ｔ」であることが決定される。

また、ハプロタイプが未知の標的核酸が、標的核酸３０１における第１のＳＮＰが「Ｔ」、第２のＳＮＰが「Ｇ」であった場合には以下の通りである。ＰＣＲ増幅産物中には、第１の順方向プライマー３０７由来の増幅産物が含まれる。この増幅産物は、５´末端に第２の標識３０8を有し、第１のＳＮＰに対応する部位にヌクレオチド「Ｔ」、第２のＳＮＰに対応する部位にヌクレオチド「Ｇ」を有する。従って、マイクロアレイ３１５と当該ＰＣＲ増幅産物とをハイブリダイゼーション反応させると、図５（ｄ）に示したように、マイクロアレイ上のプローブ３１１の固定位置において第２の標識３０８由来のシグナルが観察される。これにより、核酸３０１の第１のＳＮＰが「Ｔ」、第２のＳＮＰが「G」であることが決定される。

（染色体２本の場合）
ヒトは染色体を２本ずつ持っているため、ハプロタイプが２種存在し得る。即ち、図６において、５０１は第１の染色体を構成する核酸であり、５０３は第２の染色体を構成する核酸である。図６では、標的核酸５０１の相補鎖、及び標的核酸５０３の相補鎖は簡略のために不図示とした。そして標的核酸５０１及び標的核酸５０３の各々には、第１のＳＮＰと第２のＳＮＰが存在している。ここで、第１のＳＮＰにおける野生型のヌクレオチドが「Ｃ」、変異型のヌクレオチドが「Ｔ」、第２のＳＮＰにおける野生型のヌクレオチドが「Ｇ」、変異型のヌクレオチドが「Ｔ」であったとする。この場合、ハプロタイプには、下記表１に示した様に１０通りの組み合わせがあり得る。

下記表１中、標的核酸５０１と標的核酸５０３とで、ハプロタイプが一致している場合をホモ検体、不一致の場合をヘテロ検体とよぶ。

そして前記した本発明に係るハプロタイプの検出方法は、上記表に掲げた１０通りの組み合わせの全てについて、マイクロアレイ上の蛍光の位置並びに第１及び第２の標識由来のシグナルの識別により一意に決定することが可能である。

以下具体的に説明する。

先ず、ホモ検体の場合、即ち、ハプロタイプの組み合わせが（Ｃ−Ｇ、Ｃ−Ｇ）、（Ｔ−Ｔ、Ｔ−Ｔ）、（Ｃ−Ｔ、Ｃ−Ｔ）及び（Ｔ−Ｇ、Ｔ−Ｇ）である場合について説明する。この場合、プライマー３０５、３０７及び３０９を用いて得られるＰＣＲ増幅産物とマイクロアレイ３１５とをハイブリダイゼーション反応させた結果として、マイクロアレイ上で観察されるシグナルの位置及び種類は、図５（ａ）〜（ｄ）と同様となる。

一方、ヘテロ検体の場合、例えばハプロタイプの組み合わせが（Ｃ−Ｔ、Ｃ−Ｇ）の場合、ＰＣＲ増幅産物中には、下記２種の第１の順方向プライマー由来の増幅産物が存在する。

１）５´末端に第１の標識を有し、第１のＳＮＰに相当する部位にヌクレオチド「Ｃ」、第２のＳＮＰに相当する部位にヌクレオチド「Ｔ」を有する増幅産物；及び
２）５´末端に第１の標識を有し、第１のＳＮＰに相当する部位にヌクレオチド「Ｃ」、第２のＳＮＰに相当する部位にヌクレオチド「Ｇ」を有する増幅産物。

従って、当該ＰＣＲ増幅産物をマイクロアレイ３１５とハイブリダイゼーション反応させると、図７（ｅ）に示すように、マイクロアレイ３１５上のプローブ３１１及び３１３の固定位置の双方で、第１の標識由来のシグナルが観察される。

ハプロタイプの組み合わせが（Ｔ−Ｇ、Ｃ−Ｔ）の場合、ＰＣＲ増幅産物中には、下記２種の増幅産物が存在する。

３）５´末端に第２の標識を有し、第１のＳＮＰに相当する部位にヌクレオチド「Ｔ」、第２のＳＮＰに相当する部位にヌクレオチド「Ｇ」を有する増幅産物；及び
４）５´末端に第１の標識を有し、第１のＳＮＰに相当する部位にヌクレオチド「Ｃ」、第２のＳＮＰに相当する部位にヌクレオチド「Ｔ」を有する増幅産物。

従って、当該ＰＣＲ増幅産物をマイクロアレイ３１５とハイブリダイゼーション反応させると、図７（ｂ）に示した結果が得られることとなる。つまり、マイクロアレイ３１５上のプローブ３１１の固定位置において第２の標識由来のシグナルが観察され、プローブ３１３の固定位置において第１の標識由来のシグナルが観察される。

ハプロタイプの組み合わせが（Ｃ−Ｇ、Ｔ−Ｔ）の場合、ＰＣＲ増幅産物中には、下記２種の増幅産物が存在する。

５）５´末端に第１の標識を有し、第１のＳＮＰに相当する部位にヌクレオチド「Ｃ」、第２のＳＮＰに相当する部位にヌクレオチド「Ｇ」を有する増幅産物；及び
６）５´末端に第２の標識を有し、第１のＳＮＰに相当する部位にヌクレオチド「Ｔ」、第２のＳＮＰに相当する部位にヌクレオチド「Ｔ」を有する増幅産物。

従って、当該ＰＣＲ増幅産物をマイクロアレイ３１５とハイブリダイゼーション反応させると、図７（ａ）に示した結果が得られる。即ち、マイクロアレイ３１５上のプローブ３１１の固定位置において第１の標識由来のシグナルが観察され、プローブ３１３の固定位置において第２の標識由来のシグナルが観察される。

ハプロタイプの組み合わせが（Ｃ−Ｇ、Ｔ−Ｇ）の場合、ＰＣＲ増幅産物中には、下記２種の増幅産物が存在する。

７）５´末端に第１の標識を有し、第１のＳＮＰに相当する部位にヌクレオチド「Ｃ」、第２のＳＮＰに相当する部位にヌクレオチド「Ｇ」を有する増幅産物；及び
８）５´末端に第２の標識を有し、第１のＳＮＰに相当する部位にヌクレオチド「Ｔ」、第２のＳＮＰに相当する部位にヌクレオチド「Ｇ」を有する増幅産物。

従って、当該ＰＣＲ増幅産物をマイクロアレイ３１５とハイブリダイゼーション反応させると、図７（ｃ）に示した結果が得られる。即ち、マイクロアレイ３１５上のプローブ３１１の固定位置において第１の標識由来のシグナル及び第２の標識由来のシグナルが混合したシグナルが観察され、プローブ３１３の固定位置においては２本鎖の形成を示すシグナルは観察されない。

ハプロタイプの組み合わせが（Ｔ−Ｔ、Ｃ−Ｔ）の場合、ＰＣＲ増幅産物中には、下記２種の増幅産物が存在する。

9）５´末端に第２の標識を有し、第１のＳＮＰに相当する部位にヌクレオチド「Ｔ」、第２のＳＮＰに相当する部位にヌクレオチド「Ｔ」を有する増幅産物；及び
１０）５´末端に第１の標識を有し、第１のＳＮＰに相当する部位にヌクレオチド「Ｃ」、第２のＳＮＰに相当する部位にヌクレオチド「Ｔ」を有する増幅産物。

従って、当該ＰＣＲ増幅産物をマイクロアレイ３１５とハイブリダイゼーション反応させると、図７（ｄ）に示した結果が得られる。即ち、マイクロアレイ３１５上のプローブ３１３の固定位置において第１の標識由来のシグナル及び第２の標識由来のシグナルが混合したシグナルが観察され、プローブ３１１の固定位置においては２本鎖の形成を示すシグナルは観察されない。

ハプロタイプの組み合わせが（Ｔ−Ｔ、Ｔ−Ｇ）の場合、ＰＣＲ増幅産物中には、下記２種の増幅産物が存在する。

１１）５´末端に第２の標識を有し、第１のＳＮＰに相当する部位にヌクレオチド「Ｔ」、第２のＳＮＰに相当する部位にヌクレオチド「Ｔ」を有する増幅産物；及び
１２）５´末端に第２の標識を有し、第１のＳＮＰに相当する部位にヌクレオチド「Ｔ」、第２のＳＮＰに相当する部位にヌクレオチド「Ｇ」を有する増幅産物。

従って、当該ＰＣＲ増幅産物をマイクロアレイ３１５とハイブリダイゼーション反応させると、図７（ｆ）に示すように、マイクロアレイ３１５上のプローブ３１１及び３１３の固定位置において第２の標識由来のシグナルが観察される。

以上のとおり、本発明によれば、マイクロアレイ３１５上の２本鎖核酸の形成を示すシグナルの位置、及びシグナルの種類から、ヘテロ検体のハプロタイプの種類が決定される。

(マイクロアレイの構成)
図８にマイクロアレイ上にプローブが固定されている様子を示す。プローブの固定は特開平１１−１８７９００に詳細が示されているように、表面処理を行った基板にインクジェットにより３’末端をチオール化されたオリゴDNAを吐出する方法を用いる。ここでプローブとなるDNAは例えば２５塩基程度の長さをもつものが適当に用い得る。

(ブロッキング)
ハイブリダイゼーション反応を行う前に、マイクロアレイのプローブ以外の部分に核酸分子が吸着することを防ぐ目的でブロッキングを行うことが好ましい。一般的にハイブリダイゼーションの直前に行うことが好ましい。具体的な方法としては、例えば、BSA（牛血清アルブミンFraction V : Sigma社製）を１wt％となるように100mM NaCl/10mMりん酸緩衝液に溶解し、この溶液にDNAマイクロアレイを室温で２時間浸す。ブロッキング終了後、0.1wt%SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)を含む0.1×SSC溶液（クエン酸三ナトリウムとNaCl）と、SDSを含まないSSC溶液で洗浄し、超純水でリンス後、スピンドライで水切りを行う。

(ターゲットの準備)
検体由来の核酸の増幅反応(PCR)の例を以下に説明する。先ず、増幅反応液を用意する。増幅反応液の組成の例を以下に示す。
---PCR溶液組成---
Expand Long Enzyme Mix (Roche)：0.3μl
Template Genome DNA ：〜5ng
Forward/Reverse Primer：0.12μM each
dNTP ：0.7μl
buffer 1(Expand Long Template Buffer1;10×conc. With 17.5mM MgCl₂)：2μl
H₂O：11.4μl
Total：20μl
上記組成の反応液を、図１５に例を示す温度サイクルのプロトコルに従って、サーマルサイクラーを用い増幅反応を行う。

反応終了後、精製用カラム（QUIAGEN QIAquick PCR Purification Kit: QUIGEN社製）を用いてPrimerを除去した後、電気泳動（BioAnalyzer: Agilent社製）により、増幅産物の定量を行う。

（アレル特異的PCR）
前述の増幅したPCR産物を用い、アレル特異的PCRを行う。増幅ではCy3標識およびCy5標識されたForward Primerを用いてPCRを行う。このときのプロトコルの例を以下に示す。

--PCR溶液組成--
AmpliTaq Gold (Applied Biosystems)：0.2μl
Template Genome DNA ：4 ng
Forward/Reverse Primer：0.06μM each
dNTP mix：0.2 mM each
10xbuffer(GeneAmp 10×PCR Buffer;100mM Tris-HCl, pH8.3, 500mM KCl, 15mM MgCl₂, 0.01%(w/v)geltatin)：2.5μl
H₂O：9.3μl
Total：25μl
上記組成の反応液を図１６の温度サイクルのプロトコルに従って、サーマルサイクラーを用い増幅反応を行う。

（ハイブリダイゼーション）
水切りしたＤＮＡマイクロアレイをハイブリダイゼーション装置（Genomic Solutions Inc. Hybridization Station）にセットし、以下に示すハイブリダイゼーション溶液、条件でハイブリダイゼーション反応を行う。ハイブリダイゼーション装置を用いずに、スライドガラスとハイブリダイゼーション用のチャンバーを用いてマニュアルで反応を行ってもよい。

（ハイブリダイゼーション溶液）
以下にハイブリダイゼーション溶液の組成の一例を示す。
６×ＳＳＰＥ ／ １０％ Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ ／ ターゲット（未知検体由来の核酸）（ＰＣＲ産物 １００ｎｇ） ／ ０．０５％ ＳＤＳ
前述の増幅した未知検体由来の核酸１００ｎｇ相当をバッファー（ＳＳＰＥ）に溶かし、最終濃度が１０％になるように Ｆｏｒｍａｍｉｄｅを加える。この溶液に最終濃度が０．０５％になるようにＳＤＳ溶液を加え、ハイブリダイゼーション溶液とする。なお、バッファー（ＳＳＰＥ）の濃度は、最終溶液の状態で６×ＳＳＰＥとなるよう、予め計算しておく。

上記ハイブリダイゼーション溶液を、９２℃に加温し２分間保持したあと、さらに５０℃で４時間保持する。その後、２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを用いて、４０℃で洗浄をした。さらに２×ＳＳＣを用いて２０℃で洗浄を行い、必要に応じて通常のマニュアルに従い純水でリンス、スピンドライ装置で水切りを行う。

（蛍光測定）
前述のＤＮＡマイクロアレイを、ＤＮＡマイクロアレイ用蛍光検出装置（Ａｘｏｎ社製、ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ）を用いて、例えば以下の条件で標識由来のシグナルの検出を行なう。前記したように、標識として「Ｃｙ３」及び「Ｃｙ５」を用いる場合には、具体的には、これらの標識が発する蛍光の測定を行う。蛍光測定波長を「Ｃｙ３」および「Ｃｙ５」測定波長とし、蛍光測定値が３００００以下となるように励起光の強さを調整して測定する。

（スポット解析）
蛍光測定結果の画像を、マイクロアレイ用のデータ解析ソフトＡｒｒａｙＰｒｏ（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ社製）で解析を行い、各スポットに対する輝度値のデータを得る。

以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。
（実施例１）
第1の多型C100Tおよび第2の多型G310Tのハプロタイプを決定するため、表２に示した検体に関してハプロタイプ決定を行った。

マイクロアレイ上のプローブ配列をターゲットDNAの調製は実施様態例に従った。ただし、検出用プライマーとして順方向プライマーには配列a)および配列b)を、逆方向プライマーには配列c)を用いた。以下に各配列を示す。
配列a) 5' Cy3-GGGCTGCACGCTACC 3'
配列b) 5' Cy5-GGGCTGCACGCTACT 3'
配列c) 5' GCATCCCATTCCCAGATGA 3'
ここで順方向プライマーa)は5'末端に「Cy3」標識、3'末端に多型C100T野生型ヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを有する。また、プライマーb)は5'末端に「Cy5」標識、3'末端に多型C100T変異型ヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを有する。さらに、逆方向プライマーはPCR産物が多型G310Tを含むように設計した。各検体に関して上記プライマーを用いてPCR後、精製および電気泳動による定量を行い、ターゲットDNAとした。精製および電気泳動の各工程は実施様態例に従った。

上記工程で得られたターゲットDNAをハイブリダイゼーション反応に供した。ハイブリダイゼーション反応は核酸マイクロアレイを用いて行った。核酸マイクロアレイは、1つのブロックが9x16のスポットで構成され、その同一ブロックが3x3の9ブロック配置されている。各ヌクレオチドはプローブとしてマイクロアレイ上に2スポットずつ固定されている。以下にプローブ配列を示す。
配列d) 5' TCTCCAGGACGTCCCCCAAACC 3'
配列e) 5' TCTCCAGGAAGTCCCCCAAACC 3'
ここでプローブ配列d)はG310T野生型に対応し、プローブ配列e)はG310T変異型に対応する。このマイクロアレイに対して上記工程で調製したターゲットDNAをハイブリダイゼーション反応させた。ハイブリダイゼーション反応の各工程は実施様態例に従った。

ハイブリダイゼーション後のマイクロアレイの蛍光輝度は、蛍光検出装置を用いて測定した。測定は「Cy3」励起に波長532nmを、「Cy5」励起に波長635nmを選択した。得られた蛍光輝度画像および解析結果からC100TおよびG310Tの遺伝子型を決定し、ハプロタイプの判定を行った。蛍光輝度測定に関する工程およびスポット解析は実施様態例に従った。以下、各検体に関して得られた解析結果を図示し、ハプロタイプの決定を行う。

（アレル1/1）
図９は、鋳型DNAとしてC100TおよびG310Tの両多型に関して全て野生型を有する検体を用いた場合の解析結果である。図９に示したとおり、G310T野生型に対応するプローブにおいてCy3に由来する蛍光が観測された。

Cy3標識は、C100T野生型ヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを有するプライマーに付加されていることから、本検体の第1の多型C100Tは共にCであることがわかる。また、蛍光輝度がG310Tの野生型プローブのみで観測されたことから、第2の多型G310Tは共にGであることがわかる。以上のことから、本検体のハプロタイプはC-G、C-Gと決定できる。この結果は、使用した検体のアレルと一致する。

（アレル10/10）
図１０は、鋳型DNAとしてC100TおよびG310Tの両多型に関して全て変異型を有する検体を用いた場合の解析結果である。図１０に示したとおり、G310T変異型に対応するプローブでCy5に由来する蛍光が観測された。

Cy5標識は、C100T変異型ヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを有するプライマーに付加されていることから、本検体の第1の多型C100Tは共にTであることがわかる。また、蛍光輝度がG310Tの変異型プローブのみで観測されたことから、第2の多型G310Tは共にTであることがわかる。以上のことから、本検体のハプロタイプはT-T、T-Tであると決定できる。この結果は、使用した検体のアレルと一致する。

（アレル10/1）
図１１は、鋳型DNAとして、多型C100Tに関してCおよびT、G310Tに関してGおよびTを有する検体を用いた場合の解析結果である。図１１に示したとおり、Cy3に由来する蛍光がG310T野生型に対応するプローブで、Cy5に由来する蛍光がG310T変異型に対応するプローブで観測された。

Cy3標識は、C100T野生型ヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを有するプライマーに付加されており、この色素由来の蛍光がG310T野生型に対応するプローブで観測された。このことから、本検体のハプロタイプの一つはC-Gであると決定できる。またCy5標識は、C100T変異型ヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを有するプライマーに付加されている。この色素由来の蛍光がG310T変異型に対応するプローブで観測されたことから、本検体のもう一つのハプロタイプはT-Tであると決定できる。この結果は、使用した検体のアレルと一致する。

（アレル10/2）
図１２は、鋳型DNAとしてC100Tに関してCおよびT、G310Tに関してTを有する検体を用いた場合の結果である。図１２に示したとおり、G310T変異型に対応するプローブでCy3に由来する蛍光およびCy5に由来する蛍光が観測された。

Cy3標識は、C100T野生型ヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを有するプライマーに付加されており、Cy5標識はC100T変異型ヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを有するプライマーに付加されている。Cy3およびCy5に由来する蛍光がG310T変異型に対応するプローブで観測されたことから、本検体のハプロタイプはC-T、T-Tであると決定できる。この結果は、使用した検体のアレルと一致する。

（アレル2/1）
図１３は、鋳型DNAとしてC100Tに関してC、G310Tに関してGおよびTを有する検体を用いた場合の結果である。図１３に示したとおり、DNAマイクロアレイ上のG310T野生型および変異型に対応するプローブでCy3に由来する蛍光が観測された。

Cy3標識は、C100T野生型ヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを有するプライマーに付加されている。このことから、本検体のハプロタイプはC-G、C-Tであると決定できる。この結果は、使用した検体のアレルと一致する。

上記実施例で示したとおり、本発明の手法で得られる輝度パターンはアレルから予想されるパターンと一致する。従って、本発明を用いることで同一染色体上に存在するSNPの組み合わせを一意に決定することができる。

（実施例２）10/1 G1661C Cy3/Cy5
第1の多型G1661Cおよび第2の多型A2097Gのハプロタイプを決定するため、以下の実験を行った。ターゲットDNAの調製は、実施様態例に従った。ただし、鋳型DNAはG1661Cに関してGおよびC、A2097Gに関してAおよびGを有する既知の検体を用いた。また、検出用プライマーとして、順方向プライマーには配列f)および配列g)を、逆方向プライマーには配列h)を用いた。以下に各配列を示す。
配列f) 5' Cy3-GAGGCGCTTCTCCGTG 3'
配列g) 5' Cy5-GAGGCGCTTCTCCGTC 3'
配列h) 5' GAAAGCCTTTTGGAAGCGT 3'
ここで、順方向プライマーf)は5'末端に「Cy3」標識、3'末端に多型G1661Cの野生型ヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを有する。順芳香プライマーg)は5'末端に「Cy5」標識、3'末端に多型G1661Cの変異型ヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを有する。また、逆方向プライマーh)はPCR産物が多型A2097Gを含むように設計した。上記鋳型DNAおよびプライマーを用いてPCR後、精製および電気泳動による定量を行い、ターゲットDNAとした。精製および電気泳動の各工程は、実施様態例に従った。

上記工程で得られたターゲットDNAをハイブリダイゼーション反応に供した。ハイブリダイゼーション反応はマイクロアレイを用いて行った。マイクロアレイは、１つのブロックが9x16のスポットで構成され、その同一ブロックが３x３の9ブロック配置されている。各ヌクレオチドはプローブとしてマイクロアレイ上に2スポットずつ固定されている。以下にプローブ配列を示す。
配列i) 5' CCAAACCCATCTATGCAAATCCTGC 3'
配列j) 5' CCAAACCCATCTACGCAAATCCTGC 3'
ここで、プローブ配列i)はA2097G野生型に対応し、プローブ配列j)はA2097G変異型に対応する。このマイクロアレイに対して上記工程で調製したターゲットDNAをハイブリダイゼーション反応させた。ハイブリダイゼーション反応の各工程は実施様態例に従った。

ハイブリダイゼーション後のマイクロアレイの蛍光輝度は、蛍光検出装置を用いて測定した。測定は「Cy3」励起に波長532nmを、「Cy5」励起に波長635nmを選択した。得られた蛍光輝度画像および解析結果からG1661CおよびA2097Gの遺伝子型を決定し、ハプロタイプの判定を行った。蛍光輝度測定に関する工程およびスポット解析は実施様態例に従った。

図１４は、スポット解析結果である。図１４に示したとおり、「Cy3」に由来する輝度がA2097G野生型に対応するプローブで、「Cy5」に由来する輝度がA2097G変異型に対応するプローブで観測された。

「Cy3」標識は、G1661C野生型ヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを有するプライマーに付加されている。この色素由来の蛍光がA2097G野生型に対応するプローブで観測されたことから、本検体のハプロタイプの一つはG-Aであると決定できる。また、「Cy5」標識は、G1661C変異型ヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを有するプライマーに付加されている。この色素由来の蛍光がA2097G変異型に対応するプライマーで観測されたことから、本検体のハプロタイプの一つはC-Gであると決定できる。以上のことから、本検体のハプロタイプはG-A、C-Gであることがわかる。この結果は、使用した検体のアレルと一致する。

上記実施例で示したとおり、本発明の手法で得られる輝度パターンはアレルから予想されるパターンと一致する。従って、任意の多型位置においても本発明を用いることで同一染色体上に存在するSNPの組み合わせを一意に決定することができる。

ハプロタイプの説明図である。 ハプロタイプの説明図である。 本発明に係るハプロタイプの検出原理の説明図である。 図３に係るＰＣＲ増幅により得られる増幅産物の説明図である。 本発明に係るハプロタイプの検出原理の説明図である。 染色体２本の場合のハプロタイプの説明図である。 本発明に係るヘテロ型のハプロタイプの検出原理の説明図である。 核酸マイクロアレイの概略平面図である。 アレル1/1検体の解析結果（C100TとG310Tのハプロタイプ）を示す図である。 アレル10/10検体の解析結果（C100TとG310Tのハプロタイプ）を示す図である。 アレル10/1検体の解析結果（C100TとG310Tのハプロタイプ）を示す図である。 アレル10/2検体の解析結果（C100TとG310Tのハプロタイプ）を示す図である。 アレル2/1検体の解析結果（C100TとG310Tのハプロタイプ）を示す図である。 アレル10/1検体の解析結果（G1661CとA2097Gのハプロタイプ）を示す図である。 ＰＣＲのサイクル条件の一例を示す図である。 ＰＣＲのサイクル条件の一例を示す図である。

符号の説明

３０１：標的核酸
３０３：標的核酸の相補鎖
３０５：第１の順方向プライマー
３０６：第１の標識
３０７：第２の順方向プライマー
３０８：第２の標識
３０９：逆方向プライマー
３１０：増幅産物
３１１：第１のプローブ
３１３：第２のプローブ
３１５：マイクロアレイ
５０１：第１の染色体を構成する核酸
５０３：第２の染色体を構成する核酸

Claims (2)

1. ５’側に第１のＳＮＰ部位を有し、３’側に第２のＳＮＰ部位を有する標的核酸のハプロタイプの決定方法であって、
   （i）前記第１のＳＮＰ部位が野生型ヌクレオチドである場合に対応する第１の順方向プライマーとして、該第１のＳＮＰ部位を含む部分の塩基配列に対して同一な塩基配列を有し、前記第１のＳＮＰ部位にある野生型ヌクレオチドと同一のヌクレオチドを３’末端部に有し、且つ５’末端に第１の標識を有するプライマーを用意する工程と、
   （ii）前記第１のＳＮＰ部位が変異型ヌクレオチドである場合に対応する第２の順方向プラマーとして、該第１のＳＮＰ部位を含む部分の塩基配列に対して同一な塩基配列を有し、前記第１のＳＮＰ部位にある変異型ヌクレオチドと同一のヌクレオチドを３’末端部に有し、且つ５’末端に、前記第１の標識とは異なるシグナルを与える第２の標識を有するプライマーを用意する工程と、
   （iii）前記標的核酸の相補鎖の、前記第２のＳＮＰ部位よりも５’末端側の、該第２のＳＮＰ部位に対応する部位を含まない部分の塩基配列に対して同一な塩基配列を有する逆方向プライマーを用意する工程と、
   （iv）前記第１の順方向プライマー、前記第２の順方向プライマー及び逆方向プライマーを用いて、前記第１のＳＮＰ部位が野生型か変異型かが未知である標的核酸のＰＣＲ反応を行う工程と、
   （v）前記工程（iv）の結果として得られる増幅産物を、該第２のＳＮＰ部位が野生型ヌクレオチドである標的核酸の該第２のＳＮＰ部位を含む部分を検出するための塩基配列を有する第１のプローブと、該第２のＳＮＰ部位が変異型ヌクレオチドである標的核酸の該第２のＳＮＰ部位を含む部分を検出するための塩基配列を有する第２のプローブと、ハイブリダイゼーション反応させ、該第１または第２のプローブとのハイブリッド体の形成を示すシグナルを検出する工程、
   を含むことを特徴とするハプロタイプの決定方法。
2. 前記第１の標識及び該第２の標識が蛍光標識である請求項１記載のハプロタイプの決定方法。

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