TWI527905B

TWI527905B - 透過利用基因檢測技術與微珠微流道結合進行單核苷酸多態性檢測之方法

Info

Publication number: TWI527905B
Application number: TW102140240A
Authority: TW
Inventors: 李侃謙; 丁詩同; 林恩仲; 盧彥文
Original assignee: 國立台灣大學
Priority date: 2013-11-06
Filing date: 2013-11-06
Publication date: 2016-04-01
Also published as: US9080202B2; US20150125855A1; TW201518510A

Description

透過利用基因檢測技術與微珠微流道結合進行單核苷酸多態性檢測之方法

本發明係關於一種藉由利用基因檢測技術進行單核苷酸多態性(SNP)檢測之方法。更特別的，本發明係關於一種藉由利用基因檢測技術與具有控制良好的溫度梯度區域之微珠微流道結合進行SNP檢測之方法，而該溫度梯度區域係分布於微通道內。

單核苷酸多態性(SNPs)為大多數常見的基因變異類型之一，估計在人類基因體中每1000個鹼基會出現1個，其意義為遍及人類基因體中出現超過1千萬個SNPs的位點。SNPs為將序列變異與外表型改變連接的重要標記；此研究係期望促進人類生理機能的理解以及闡明以分子為基礎(molecular bases)的疾病。時至今日，大量的實驗研究皆專心致力於準確的、快速的及符合成本效益的SNP基因分型技術。基因分型的程序一般涉及用於重要SNP的等位基因特異性產品放大，接著基因型檢測技術，例如：酵素接合、酵素分解、引子延伸、分裂DNA酵素G-四聯體(G-quadruplex)、定序、焦磷酸定序及質譜分析。所有的技術皆利用酵素、分子信號標燈(molecular beacon)或螢光標記以標定DNA探針，導致高試劑耗費或複雜程序的需求。

另一方面，動態等位基因特異性雜交(DASH)技術吸引了SNP基因型的高度注意，這是因為其不需在酵素或螢光分子上的複雜及昂貴的修飾程序。習知的DASH程序如後所述。標的序列係由PCR放大，其中一引子係被生物素化(biotinylated)。生物素化所產生的股係鍵結於以卵白素塗佈的(streptavidin-coated)微滴定孔盤(microtiter plate well)，而未生物素化的股以鹼潤洗掉。等位基因特異性的寡核苷酸探針係在低溫與標的雜交。此形成雙鏈體DNA區域，其與雙股特異的插入性螢光標記反應。於激發態時，螢光標記發出的螢光正比於雙股DNA(探針-標的物(probe-target)雙鏈體)存在的量。樣品接著逐漸加熱，同時持續監測螢光，螢光的快速下降指的是探針-標的物DNA雙鏈體分離(或”熔解”)溫度。當在適當的緩衝物及螢光標記的情況下進行時，介於探針及標的物之間的單一鹼基失配(mismatch)導致熔解溫度(T_m)急遽降低，以致於可易於測量該熔解溫度。

再者，微型化裝置，例如：微流道或實驗室晶片(lab on a chip)裝置，帶來了與大規模裝置類似的許多優點，其包含：可攜性、降低樣品消耗、快速反應時間及高通量。微珠可做為一媒介以固定標的分子，運載生物分子以進行一連串的反應。微珠微流道裝置因此可顯著地將冗長的傳統DNA/RNA純化與雙股DNA分離製程的勞動密集洗滌程序單純化。

近年來，微流道的發展更促進前述微型化裝置的熔解分析，該裝置不僅可減少試劑成本，亦可提供重點照護(point-of-care)分子診斷的可能性。微流道裝置的DNA熔解分析通常訴諸於固相或液相樣品的製備，其中必須將DNA固定於通道表面或是僅允許單獨分析。然而，某些相關先前技術，例如Russom等人所提出的”Rapid melting curve analysis on monolayered beads for high-throughput 分析法以用於SNP基因型分析。該熔解曲線分析係以動態等位基因特異性雜交(DASH)為基礎。DNA雙鏈體係共軛於珠子上，其係固定於具有整合加熱器與溫度感測器之微加熱晶片之表面上，並獲得熔解曲線。然而，該些相關技術未能教示增強測量靈敏度及準確度的溫度梯度區域。有鑑於此，具有溫度梯度配置的微流珠熔解分析是需要的。

本發明之主要目的係提供藉由利用基因檢測技術與微珠微流道結合進行SNP檢測之方法。本發明之設計是利用特殊的微珠作為移動式的支撐體以固定標的DNA分子，其流過微通道內控制良好的溫度梯度控制區域以作為熔解分析。

為了達到上述目的，本發明提供一種藉由利用基因檢測技術與微珠微流道結合進行單核苷酸多態性(SNP)檢測之方法，其包含下列步驟：(a)製備具有雙鏈體DNA之微珠；(b)將螢光標記插入雙鏈體DNA；(c)將微珠送入具有溫度梯度區域的微通道；(d)將溫度梯度區域加熱以使雙鏈體DNA變性；(e)於(d)步驟過程中監測雙鏈體DNA之螢光強度以獲得熔解曲線；及；(f)透過熔解曲線分析法決定單核苷酸多態性；其中，雙鏈體DNA係透過標的單股DNA與等位基因特異性探針合成。

較佳地，於(a)步驟之前，標的單股DNA可透過PCR放大。

較佳地，於該標的單股DNA可由PCR放大之後，可將標的單股DNA生物素化(biotinlayted)並可將微珠塗佈卵白素(streptavidin)。此外，標的單股DNA可透過生物素-卵白素反應固定於該微珠上。

較佳地，將標的單股DNA可透過一生物素-卵白素反應固定於微珠上之後，等位基因特異性探針可與標的單股DNA雜交。

於本發明較佳之實施例中，裝配溫度計之圖案化玻璃及加熱器可結合於微通道上；其中，溫度梯度之溫度係透過加熱器而控制，且溫度梯度區域之溫度係透過溫度計所測得。

較佳地，螢光強度可透過CCD相機所監控。

較佳地，螢光標記可為插入性螢光標記。

較佳地，插入性螢光標記可包含SYBR Green I、EtBr或EVE Green。

於本發明較佳實施例中，溫度梯度區域之溫度範圍可自50℃至95℃，較佳為自65℃至85℃。

此發明說明並非本發明的延伸性概論，且其無法辨識本發明的重要性/關鍵性元素或界定本發明之範圍。其目的僅以單純的格式來呈現本文中所揭露之概念作為呈現於後文更詳細敘述的序論。

本發明的許多特徵及優點將參照後文與附圖相關之詳細說明而變得更容易理解。

201‧‧‧微通道

202‧‧‧溫度計

203‧‧‧ITO玻璃

204‧‧‧加熱器

205‧‧‧入口

206‧‧‧出口

207‧‧‧溫度梯度區域

無

本發明將參照附圖由後文的詳細敘述使得本發明更加容易理解，其中：第一圖為用於SNP基因型之微珠微流道裝置熔解分析之概要流程圖；第二圖為具有ITO圖案化玻璃之SNP檢測晶片之三度空間示意圖；第三圖係繪示於微通道內之800μm長之區域內自50℃至 85℃溫度梯度之紅外線影像；第四圖顯示從兩種藍瑞斯種豬的放大的DNA的ATM-A基因區域與負控制組相較之下進行的的洋菜凝膠電泳照片：(M)DNA標記；(N)負控制組；(1)野生型(CC基因型)的非對稱性PCR產物；(2)突變型(TT基因型)的非對稱PCR產物；第五圖繪示透過本發明SNP偵測系統測量的三種基因型熔解曲線圖；第六圖繪示透過本發明SNP偵測系統測量的三種基因型熔解溫度圖；以及第七圖繪示由Rotor-Gene Q儀器測量的三種基因型熔解曲線圖。

後文所提供與附圖相關之詳細說明係意欲為本發明實施例之敘述，且並非意欲代表本發明實施例可被建構或利用的唯一型式。實施例所提到的功能及步驟之順序係用以建構及操作實施例。然而，相同或均等的功能或順序可由不同之實施例所達成。

為了方便，於說明書、實施例及後附之申請專利範圍所採用之實施例係在此集中。除非另外定義，所有於本文中所使用的技術及科學的專有名詞對於所屬領域具備通常知識者而言具有一般所能理解的相同意義。

以下將配合圖式詳細敘述例示實施例。然而，這些實施例可以包含於不同的形式中，且不應被解釋為用以限制本發明之申請專利範圍。這些實施例之提供使得本發明之揭露完整與明暸，熟知此技術之人將能經由該些實施例了解本發明之範疇。因此，已知的製程、元件及技術於某些實施例中係不再贅述。

除非本文另外清楚地指出，單數形式”一”、”及”與”該”用於本文中係包含複數個指涉物。

於本發明中，一種基因型系統係透過將動態等位基因特異性雜交(DASH)技術與微珠微流道裝置結合而建立。

本發明不僅自DASH技術保留彈性及準確的SNP檢測流程，亦保有具備試劑最小量的優點。微珠流進微流道裝置，進而將標的DNA固定於經設計而具有連續式流動的微流道，接著進行熔解曲線分析。基因體DNA的基因型於SNP-微血管擴張失調突變(ataxia-telangiectasia mutated)(ATM)基因-係經由熔解曲線分析而辨別。近來發現藍瑞斯種豬的ATM基因於小豬繁殖的總數、存活仔豬頭數(number born alive)及平均出生重量扮演了重要的角色，這是由於其介於桑葚胚(morula)與囊胚(blastocyst)階段之間的不同表現之故，本發明展現此具備良好潛力的微珠SNP檢測系統，其具備於豬隻中選擇有用的生物標記及改善繁殖性狀(reproductive trait)的有效方法。

於是，為達到所欲之效果，本發明提供一種藉由利用基因檢測技術與微珠微流道結合進行單核苷酸多態性(SNP)檢測之方法，其包含下列步驟：(a)製備具有雙鏈體DNA之微珠；(b)將螢光標記插入雙鏈體DNA；(c)將微珠送入具有溫度梯度區域的微通道；(d)將溫度梯度區域加熱以使雙鏈體DNA變性；(e)於(d)步驟過程中監測雙鏈體DNA之螢光強度以獲得熔解曲線；及；(f)透過熔解曲線分析法決定單核苷酸多態性；其中，雙鏈體DNA係透過標的單股DNA與等位基因特異性探針合成。

於(a)步驟之前，標的單股DNA可透過PCR放大。再者，於該標的單股DNA可由PCR放大之後，可將標的單股DNA生物素化(biotinlayted)並可將微珠以卵白素(streptavidin)塗佈。此外，標的單股DNA可透過生物素-卵白素反應固定於該微珠上。

其中，將標的單股DNA可透過一生物素-卵白素反應固定於微珠上之後，等位基因特異性探針可與標的單股DNA雜交。

於本發明較佳之實施例中，具有溫度計及加熱器之圖案化之玻璃可結合於微通道上；其中，溫度梯度之溫度係透過加熱器而控制，且溫度梯度區域之溫度係透過溫度計所測得。

於本發明較佳之實施例中，螢光強度可透過CCD相機所監測。

於本發明較佳之實施例中，螢光標記可為插入性螢光標記。

較佳地，插入性螢光標記可包含SYBR Green I、EtBr或EVE Green。

後述的實例係提供以闡述本發明的某些態樣且輔助所屬領域通常知識者實踐本發明。這些實例並非被視為限制本發明之範圍的手段。

設計及工作原理 動態等位基因特異性雜交法

於本發明的動態等位基因特異性雜交(DASH)法中，等位基因特異性的寡核苷酸探針係與標的物雜交。此形成與雙股DNA(dsDNA)特異插入性螢光標記反應的雙鏈體DNA區域。於激發態時，螢光標記發出螢光係正比於dsDNA的量。因此，當樣品逐漸加熱時，dsDNA開始變性，且dsDNA的量降低，導致螢光強度減少。當溫度接近探針-標的物雙鏈體的熔解溫度(T_m)時，螢光強度快速地下降。等位基因特異性探針，其可與野生型單股DNA(ssDNA)及與包含SNP的一個鹼基對失配的ssDNA形成完美的dsDNA，該等位基因特異性探針係設計在熔解曲線分析期間以分隔熔解溫度。本發明改編此方法且更進一步將DNA序列耦合於微珠上以降低試劑的使用。

用於SNP檢測的微珠微流道裝置

第一圖繪示連續流動式微珠微流道以作為SNP基因型分析之熔解曲線，且步驟如下列所述：(a)將固定於一微珠的雙鏈體檢測樣品係裝載於一微通道內的溫度梯度區域，且係即時偵測螢光強度；(b)進行與獲得完美匹配樣品及失配樣品的熔解曲線分析。當具有DNA雙鏈體之微珠逐漸地通過溫度梯度(65℃至85℃)時，DNA雙鏈體變性且釋放出插入性螢光標記，誘導螢光訊號衰退。

特別地，直徑20μm的二氧化矽微珠係以卵白素塗佈，且用來與具有生物素化之單股DNA鍵結。依序加入DNA探針與插入性螢光標記以形成插入螢光標記的探針-標的物之構型。在與標的物-探針雙鏈體共軛反應後，微珠係傳送至微通道。接著當溫度增加時，利用DASH技術於DNA變性期間進行熔解曲線分析即時監測樣品。由於核甘酸突變，標的物-探針雙鏈體之間的一個鹼基失配會導致低於完美匹配鹼基的T_m，因此SNP係可偵測。

微珠微流道的溫度梯度區域

由ITO玻璃構成的微流道裝置係結合至聚二甲基矽氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)。於結合前，將ITO玻璃圖案化以定義加熱器及溫度感應器(即溫度計)，如第二圖所示。溫度感應器係利用microIR相機及熱電偶來校準。請參閱第二圖，當微珠流進微通道201時，具備DNA 雙鏈體之微珠會流經位於圖案化之ITO玻璃203之上的溫度梯度區域207。其中，加熱器204係建立於ITO玻璃203之右側，且自加熱器204產生的熱係自較高溫度區域(ITO玻璃203之右側)擴散到較低溫度區域(ITO玻璃203之左側)。接著，形成溫度梯度區域207，且溫度計202係負責偵測溫度梯度區域207之溫度。透過利用市售的有限元素分析軟體，COMSOL多重物理4.0a版(COMSOL,Inc.,Burlington,MA,USA)進行流速場模擬。模型係基於穩態的Nervier-Stokes’以作為不可壓縮的流道。用於模擬的參數如下：密度為1000kg/m³、動力黏滯係數為1mPa‧s。0.01m s^-1的等速度(uniform velocity)係施加於入口205及零壓力邊界條件係施加於出口206。通道孔洞設定無滑動邊界條件。模擬結果支持本發明之假設，流速會於流道的出口增加且導致低壓以吸引微珠。

本發明於ITO玻璃上定義溫度計或加熱器之方法，包含，但不限於蝕刻、光罩等方式。任何所屬領域通常知識者所認知的改變及修飾，皆落入本發明之範圍，如後附之申請專利範圍所定義。

材料與方法

本發明所揭露的一種藉由利用DASH技術與微珠微流道結合的SNP檢測方法將參照後述的許多態樣及實例做更詳細的敘述，其並非意欲限制本發明之範圍。

微珠及功能化

平坦的(plain)20μm聚苯乙烯微珠(Cat.18329-5,Polysciences Inc.,Warrington,PA,USA)於700珠子μL^-1不僅用於提供相對較高的表面對體積之比例(surface to volume ratio)，更增強較佳靈敏度及較大的突變鑑別之反應動力學。以卵白素塗佈的直徑20μm的二氧化矽微珠 (silica microbead)(Cat.141048-05,Corpuscular Inc.,Coldspring,NY,USA)於250珠子μL^-1，係用以形成介於標的序列與微珠(生物素-卵白素)之間的生物連接劑，以作為SNP檢測。特別來說，運用於本發明之微珠具有每單位體積所暴露的30000份表面積。意思是說，每單位體積中30000份表面積係暴露於環境中，且微珠具有熱傳之卓越能力以使得加熱期間微珠與環境之間即時地熱交換，以確保微珠上DNA雙鏈體的反應溫度係與環境溫度相同。

SNPs檢測晶片及微通道設計

晶片的示意圖係如第二圖所示。該晶片由具有微通道201的頂部PDMS層以及具有加熱器204及溫度計202的底部ITO玻璃層203。依螢光偵測系統的視野，兩個溫度計202之間的距離謹慎地設計為1250μm。為了精確地測量及控制溫度，將溫度計202設計且嵌於晶片中並鄰近於通道。利用透明的ITO材料作為溫度計202及加熱器204。依據微通道形態，ITO圖案的形狀係設計以感測溫度並提供能量至微通道以製成基因型熔解曲線。

依據微珠微流道SNPs偵測流程，微珠應以緩慢且穩定的速度流動。隨著液體於微通道的快速流動、溫度場偏移，流動快速的微珠難以透過具有一般曝光時間的CCD相機清楚地拍攝成像。

第二圖中的微通道輪廓係以如前所述之設計為基礎。當微通道充滿液體時，2公分長的微通道係設計以提供高內壓及更穩定的流場。微通道的寬度為300μm以使微注射器及高精密度注射泵浦控制流速於10μm/秒以下(泵浦速度=1μL/hr)。微通道之高度為30μm以確保一次僅流過一顆微珠。為了能在有限空間容納微通道，微通道係依據蛇形幾何學(serpentine geometry)設計。此外，由於用於本發明中以卵白素塗佈的(streptavidin-coated)二氧化矽微珠直徑為20μm，微通道之高度與寬度係分別設計為30μm及300μm。

加熱器與溫度計之設計

為了產生遍及偵測區域所欲之溫度梯度，係透過ITO加熱器以產生溫度場。透過控制電流穿越加熱器，可調整溫度場。電流、電壓及電阻之間的關係為：

其中P(焦耳/秒)為功率，I(安培)為電流，V(伏特)為電壓，以及R(歐姆)為電阻。

由於材料的電阻因不同溫度而異，電阻(R)與溫度(T)的關係為：

其中T₀為初溫，且α為溫度係數。ITO的溫度係數係透過重新整合(2)式而得：

溫度測量

為了檢測溫度遍及整個晶片的均勻度，係使用紅外線相機(TVS-500EX,NEC,Inc.)捕捉熱影像。交流電壓係施加於加熱器。約5分鐘便使得系統變得穩定，故熱傳輸可穩定地達成。熱傳輸的方向，大多數為熱傳導的型式，係垂直於加熱器，其係由第二圖之插圖所示。該插圖即為SNP檢測晶片之上視圖，並顯示用於熔解曲線分析之加熱器溫度計區域之近視圖。加熱器附近的溫度為最高，且朝著晶片的兩側降低。溫度梯度係於平行微通道之方向而產生。

當溫度梯度變得穩定時，則比較由紅外線相機及數位溫度計(DE-303,DER EE Electrical Instrument,Inc.)所量測之溫度。由於ITO玻璃表面之溫度可透過利用數位溫度計來測量，微通道之溫度可衍生自傅立葉傳導方程式：

其中Q為熱傳導，△X為ITO玻璃表面至微通道之距離，K為PDMS的熱導係數(K_PDMS標準值為0.15W/m)，T _s為自數位溫度計量得ITO玻璃的溫度。

DNA萃取、放大及發現SNP

視蛋白基因(Basic Local Alignment Sequence Tool：AY587061.1)而定的SNP區別點ATM-A係選為證明SNP檢測系統的有效性與潛力，該區別點ATM-A被證明為一與藍瑞斯種豬繁殖效率有關的可能性生物標記。以SNP發現的ATM基因中，台灣總共有三種藍瑞斯種豬係利用自血液樣品分離的基因體DNA，該血液樣品係基於製造商的推薦(Genra System,Inc.,MN,USA)利用Puregene^TM DNA Purification Kit從上腔靜脈(superior vena cava)所獲得。用於ATM基因的引子對透過利用豬的核苷酸資料庫(GenBank：AY587061)而設計。ATM基因的轉譯起始位點係出現於外顯子(exon)3³⁰內。為了透過PCR放大ATM基因的5’-兩側區域(上游促進子及外顯子1至內含子(intron)2區域)序列，係使用如表一所示之引子來放大1,581鹼基對片段。純化的PCR產物係利用這些引子對並藉由自動定序儀(ABI PRISM 3730 DNA Analyzer，Applied 50 Biosystems,Foster City,CA,USA)直接定序。核苷酸序列係利用Lasergene程式(DNAstar,Madison,WI,USA)排列用以檢測SNP。關於調控的SNPs，於DNA片段的轉錄因子的結合模序(binding motif)係利用Matlnspector軟體(Genomatrix,Munich,Germany)估算。

PCR製備

執行包含對稱PCR或非對稱PCR的二個步驟PCR程序以允許具有適當修飾的標的ssDNA鍵結至微珠上。於對稱的PCR流程中，基因體DNA係放大以供給含有標的SNP點(ATM-A)的dsDNA。於非對稱的PCR流程中，以第一PCR的產物作為模板，且將生物素化的正向引子(forward primer)應用於放大標的ssDNA。再者，為了經由洋菜凝膠電泳分離dsDNA模板及ssDNA標的物，於每個步驟設計引子以產生不同長度的DNA序列，該些序列長度分別為91bp及73mer。同時，於兩者PCR步驟中對於不同濃度的正向引子及反向引子(reverse primer)及黏合溫度進行一連串的測試之後，PCR的條件係最佳化以確保產生充足且正確的ssDNA。最佳化PCR的條件為：5ng μL^-1的基因體DNA、200μM的dNTP混合物、0.5μM的甜菜鹼、1%的DMSO、2.5U Tag於全部的反應體積50μL中，以用於對稱的PCR。此外，0.2μM的正向及反向引子係用於對稱的PCR以放大標的基因體區域，且0.5μM的生物素化的正向引子係用於非對稱的PCR以放大含有ATM-A SNP點的單股DNA。對稱的PCR條件為：94℃ 5分鐘，接著94℃ 20秒30循環、55℃ 20秒、72℃ 20秒。非對稱的PCR條件為：94℃ 5分鐘，接著94℃ 20秒30循環、52℃ 20秒、72℃ 20秒。如表一所示，所有的寡核苷酸係購自Protect Technology Enterprise(台北，台灣)且並未更進一步純化即使用。ssDNA探針係完美地與CC基因型序列匹配以及與TT基因型序列一個鹼基對失配。此二步驟PCR經由移除殘基試劑(residual reagent)及非特異性DNA序列，將冗長的清洗步驟簡化以促進標的ssDNA鍵結於微珠上。藉此允許DASH技術在之後的程序進行。

確認樣品的基因型

為了證實用於本發明的樣品的基因型，該等樣品之前已利用市售的即時PCR儀器(MyiQ，Bio-Rad)鑑定基因型。簡單來說，10μL的2X SYBR Green I(Applied Biosystems,Beverly,MA,USA)及0.5μL的探針(10μM)係添加至非對稱PCR的10μL產物中。當ssDNA樣品準備好時，樣品係加熱至95℃ 60分鐘以分離非專一性的結合。熔解曲線分析係透過將溫度冷卻至55℃且維持該溫度60秒而進行。接著溫度係以0.1℃/s加熱速率逐漸地增加至95℃，而螢光強度係以每0.5℃的間隔測量。

將合成DNA與PCR DNA耦合至微珠

為了固定合成DNA，試劑包含混合0.4μL的10μM 5’-生物素化的合成DNA、0.4μL的10μM探針、10μL的2X SYBR Green I、1μL以卵白素塗佈的微珠懸浮物(200珠子uL^-1)，以及8.8μL的雙蒸水(ddH₂O)。混合物接著於加熱塊(heat block)(DB130-1,Firstek Ltd.)以60℃培養30分鐘以加強卵白素鍵結的珠子與生物素化的標的物-探針雙鏈體的鍵結效率。同時，為了固定來自動物樣品的DNA序列，將10μL的非對稱PCR產物(ssDNA)、10μL的2X SYBR Green I、1μL的10μM探針以及1μL卵白素塗佈的微珠懸浮物(200珠子uL^-1)混合且於加熱塊中以60℃培養30分鐘。

螢光影像的資料獲取

微流道裝置係放置於反向的螢光顯微鏡(Axio Observer.Al,Carl Zeiss MicroImaging GmbH,Göttingen,Germany)之下。根據SYBR Green I的光譜，用於激發及發射的過濾器為425-475nm及600-660nm。來自檢測混合物的螢光訊號係透過利用CMOS相機(ORCA-Flash 4.0,Hamamatsu,Japan)所獲得。每個影像係利用曝光時間50ms以獲得。實驗期間，拍攝沒有珠子的液體流動區域的背景影像，之後的影像係自動去掉該背景影像。微通道的螢光強度係取為背景。在一檢測混合物(例如：10μL樣品)經由檢測區域檢測並移除後，捕捉一連串的螢光影像。微珠的位子係被安排在通道區域之內的溫度分佈並分析。若檢測完成，在下一個檢測混合物被引進前，去離子水(DI water)接著流入微通道用以清潔。不同基因型(即CC、TT及CT類)的檢測混合物接著可連續地在單一晶片中測試。

將螢光訊號定量分析

每個直徑20μm微珠上的標的物-探針雙鏈體的相對螢光強度，係透過利用影像處理軟體ImageJ(NIH,Bethsda,MA,USA)基於調整螢光影像而定量。顯示較高的初始螢光強度且無聚集的微珠係選為用於DASH技術之候選者，這是由於它們具有較多鍵結於微珠表面的標的DNA。螢光強度接著透過利用下列方程式的正規化功能為代表：

其中X_i為微珠的相對螢光強度，X_final為微珠的最終螢光強度，且X_initial為微珠的初始螢光強度。熔解曲線輪廓係由100%起始且終端於0%而正規化。此外，以試驗結果做統計顯著性測試(statistical significance testing)，對應於二同質基因型ATM-A(CC及TT)的p值係經由未配對學生氏t檢定(Student’s t test)來計算。p差異小於0.05係視為統計上的顯著性。

結果與討論 微珠微流道裝置

於本發明中，在微珠微流道系統中，連續流動式微流道裝置中的具有DNA雙鏈體的微珠之後會被偵測到。為了使得具有DNA雙鏈體的微珠流動平穩，係研究各種幾何因子的組合(例如：微通道的寬度與高度)以改善微流道之效率。本發明之裝置中係採用下列組合：微通道之高度及寬度分別為40μm及300μm。微珠微流道裝置係透過注入普通的聚苯乙烯微珠20μm來測試。再者，本發明之重要的技術特徵是透過將圖案化之ITO玻璃黏合至微通道上以發展出溫度-梯度區域以使得檢測SNP更有效率。加熱器係嵌在ITO玻璃的右側，以致於自加熱器產生的熱可自高溫區擴散至低溫區，進而形成溫度梯度區域。此外，採用PID控制模式以創造於微通道內穩定的溫度梯度(如第三圖所示)以即時監控加熱期間的溫度變化。

經由微珠微流道裝置的SNP檢測

為了確認經放大的DNA序列，非對稱PCR的PCR產物係經由溴化乙錠(ethidium bromide)染色的2%洋菜凝膠電泳來顯現，且與DNA標記(25/100bp經DNA階梯狀條帶混合，Bioneer)比較。如第四圖所示，如所預期的，結果說明了91bp的DNA片段係作為DNA模板且73mer的DNA片段係作為生物素化的標的ssDNA序列。當其顯示dsDNA中鹼基對的量時，溴化乙錠的插入性染劑可僅展現ssDNA的自我摺疊區域，導致相對弱的條帶(band)。含有ATM-A SNP點的73mer生物素標記的標的ssDNA序列亦透過DNA序列儀(Applied Biosystems 3730 DNA分析儀)確認。

選擇具有SNP區別點ATM-A之DNA序列，且檢測兩種基因型(野生型與突變型)。使用本發明之原型(prototype)裝置，及商業上可獲得的儀器(Rotor-Gene Q real time PCR)作為SNP檢測。當溫度的範圍自50℃至85℃時，每個樣品的SNP基因型分析係利用微珠微流道裝置並藉由偵測標的物-探針雙鏈體的螢光強度來執行。接著螢光強度資料係定量且繪製成圖。

熔解曲線分析

三種基因型DNA樣品(包含CC、CT及TT)的熔解曲線係如第五圖所示。至少挑選三個微珠作為每個基因型的分析。基因型透過觀察每個曲線的下降趨勢來做區別。由於探針與標的DNA之間較大的鍵結力之故，完美匹配樣品(23-CC)的線形輪廓一開始具有較少的降低速率(介於60至67℃之間)。最大的斜率改變值或曲線中第一負導函數的最小值則決定為熔解溫度。CC基因型樣品(23)具有最高熔解溫度75.1℃且TT基因型樣品(17)具有最低熔解溫度67.1℃。雜合的(heterozygous)基因型樣品(76)顯示了兩熔解溫度：67.2℃及75.3℃。比較同型結合的(homozygous)、雜合的及非均質的(heterogeneous)樣品，CC與TT基因型之熔解溫度(△T_m)差為8℃。雖然CT基因型(67.2℃與75.3℃)的熔解溫度與CC(75.1℃)以及TT(67.1℃)基因型有著些微差異，這些誤差係低於0.2℃，且不影響基因型的判斷結果。

三種基因型的熔解溫度係摘要於第六圖。所有的熔解溫度係透過發現他們的第一導函數的負最大值而決定。兩波峰的p值為7.9×10^-6證明三種基因型在統計學上可區分。

透過Rotor-Gene Q系統進行熔解曲線分析

熔解分析的其他方式是透過利用Rotor-Gene Q系統來進行，其結果係如第七圖所示。此熔解分析的操作參數亦列於表二。

CC基因型樣品(23)具有熔解溫度78.8℃且TT基因型(17)具有熔解溫度75.3℃。雜合的基因型樣品(76)顯示二種熔解溫度：75.5℃及78.6℃。相較於同型結合的及雜合的樣品的T_m，△T_m為3.5℃。三種基因組種類係經由市面上販售的儀器(Rotor-Gene Q系統)成功地進行基因型檢測。

微珠型式的SNP檢測與Rotor-Gene Q系統的比較

透過本發明的SNP檢測系統所測量的熔解曲線的空間分辨度(spatial resolution)係由sCMOS檢測陣列、光學偵測路徑及溫度梯度分布而決定。於這些實驗中，sCMOS偵測器的畫素解析度為1638畫素/mm，該解析度係於溫度為0.00000122℃/畫素下產生。另一方面，20μm微珠表面的最大溫度差異為約0.4℃。

透過本發明系統(微珠微流道、空間分辨度)判定基因型的結果與Rotor-Gene Q系統(套管型式的(tube-based)、短暫熔解分析)是一致的。本發明微珠微流道裝置的△T_m值為8℃，其係大於Rotor-Gene Q系統△T_m值為3.5℃約2.5倍。較大的△T_m值可有利於區分完美匹配的雙鏈體及失配的雙鏈體。此優點是由於優越的加熱速率之故。

表三比較了本發明微珠型式的SNP偵測系統與套管型式的Rotor-Gene Q系統。在微珠型式的裝置中，嵌入微通道的溫度控制單元不僅提供精準的溫度控制，更在小距離之內提供了大的溫度差異。由於在比例上縮放至微尺寸而有較佳的熱傳輸，導致了於微珠上有快速的熱傳速率。本發明之SNP偵測系統之加熱速率係由微珠流動速率及微通道中的溫度而決定，相較於套管型式系統的平均加熱速率0.1℃/秒，本系統估計具有約0.62℃/秒的平均加熱速率。此外，因為在混合物導入偵測區之前，於微通道中已產生溫度場，加熱速率係受到混合物流動速率的影響。較建議的是能在一個SNP位置測試中有相同的流動速率，以確保微珠及微通道有相似的流體動力學及熱傳導。

再者，雖然兩種方式中偵測混合物的體積類似，但微珠型式之系統可利用僅少許三個微珠(或甚至一個微珠)來進行熔解曲線分析。換句話說，本發明中微珠型式的方式估計僅需要少許ssDNA的10⁵串做偵測，遠少於套管型式系統所需的10¹²串ssDNA。此外，相較於Rotor-Gene Q系統偵測時間用了45分鐘，當使用微珠型式系統的裝置時，每個基因型的偵測時間僅用了少於30分鐘。其中，總偵測時間30分鐘之中，混合物注入程序需花15分鐘。

同樣地，為了改善偵測效率及降低偵測時間，混合物注入程序可利用自動填料系統來協助，該系統係由開關閥、再兩個注射泵、注射器及電腦以所構成，以執行混合物注入程序。

綜上所述，本發明的新穎SNP係透過微珠微流道裝置中的微珠上執行DASH技術而發展。DNA雙鏈體係共軛至二氧化矽微珠上，且在溫度梯度區域進行熔解曲線分析。同樣地，於微珠上的SNP偵測係於非常短的時間達成。ATM-A突變的基因型結果與市面上販售的基因型儀器的結果比較，驗證了所發展系統的可行性。最終，本發明可更進一步地與PCR結合以將DNA的放大與分離程序單純化。本發明之裝置體積降低與快速分析可在基因型之應用中提供省成本與高通量SNP偵測法的潛力。

依據本發明之利用基因檢測技術與微珠微流道結合進行單核苷酸多態性檢測之方法，具備下述優點：1.本發明設計了溫度梯度區域，當具有DNA雙鏈體的微珠流經此區域，流速會提升且微珠及DNA雙鏈體之溫度會立即上升，以致於增進測量準確度；2.相較於傳統的DASH技術，本發明之樣品可由微珠聚集(固體支撐)，以致於不僅可降低干擾背景，且更可增加靈敏度及偵測極限；3.微珠不僅提供相對較高的比表面積(surface to volume ratio)作為生物分子固定，更亦具有加強反應動力動力學與降低背景干擾之優點。微珠具有良好的熱傳能力以使得微珠與環境之間在加熱時有著立即地溫度改變，以致於可確保DNA雙鏈體於微珠上之反應溫度與環境相等且改善測量的穩定性。

其它實施態樣

所有揭露於本發明書之特徵係可使用任何方式結合。本說明書所揭露之特徵可使用相同、相等或相似目的的特徵取代。因此，除了特別陳述強調處之外，本說明書所揭露之特徵係為一系列相等或相似特徵中的一個實施例。

此外，依據本說明書揭露之內容，熟悉本技術領域者係可輕易依據本發明之基本特徵，在不脫離本發明之精神與範圍內，針對不同使用方法與情況作適當改變與修飾，因此，其它實施態樣亦包含於申請專利範圍中。

<110> 台灣大學

<120> 透過利用基因檢測技術與微珠微流道結合進行單核苷酸多態性檢測之方法

<130>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Primer

<400> 1

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 2

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 3

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 4

<210> 5

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 5

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 6

Claims

一種藉由利用基因檢測技術與微珠微流道結合進行單核苷酸多態性(SNP)檢測之方法，包含：(a)製備具有一雙鏈體DNA之一微珠；(b)將一螢光標記插入該雙鏈體DNA；(c)將該微珠送入一具有一溫度梯度區域的微通道；(d)將該溫度梯度區域加熱以使該雙鏈體DNA變性，其加熱速率係由微珠流動速率及微通道中的溫度而決定；(e)於該(d)步驟過程中監測該雙鏈體DNA之一螢光強度以獲得一熔解曲線；及(f)透過一熔解曲線分析法決定該單核苷酸多態性；其中，該雙鏈體DNA係透過一標的單股DNA與一等位基因特異性探針合成。
根據申請專利範圍第1項之方法，其中該標的單股DNA係透過PCR放大。
根據申請專利範圍第2項之方法，其中於該標的單股DNA由PCR放大之後，將該標的單股DNA生物素化(biotinlayted)並將該微珠塗佈卵白素(streptavidin)。
根據申請專利範圍第3項之方法，其中該標的單股DNA係透過一生物素-卵白素反應固定於該微珠上。
根據申請專利範圍第4項之方法，其中將該標的單股DNA係透過一生物素-卵白素反應固定於該微珠上之後，該等位基因特異性探針係與該標的單股DNA雜交。
根據申請專利範圍第1項之方法，其中一裝配一溫度計之圖案化玻璃及一加熱器係結合於該微通道上。
根據申請專利範圍第6項之方法，其中該溫度梯度之溫度係透過該加熱器而控制。
根據申請專利範圍第6項之方法，其中該溫度梯度區域之溫度係透過該溫度計所測得。
根據申請專利範圍第1項之方法，其中該螢光強度係透過CCD相機所監控。
根據申請專利範圍第1項之方法，其中該螢光標記為一插入性螢光標記。
根據申請專利範圍第10項之方法，其中該插入性螢光標記包含SYBR Green I、EtBr或EVE Green。
根據申請專利範圍第1項之方法，其中該溫度梯度區域之溫度範圍係自50℃至95℃。