JP2017225468A - 高度に相同的なゲノム領域での突然変異の検出 - Google Patents

Abstract

【課題】高度に相同的なゲノム領域を識別し、対象の遺伝子座で変異体を検出する方法を提供する。
【解決手段】一実施形態では、本方法は以下を含む：（ａ）対象の遺伝子座を有する核酸のアリコートを提供すること；（ｂ）核酸のアリコートを、限定的プライマー、過剰プライマーおよび核酸の標的鎖上の対象の遺伝子座とハイブリダイズするように設計されたプローブと一緒にインキュベートすること；（ｃ）アリコートを用いて非対称ＰＣＲを実施して、プローブとハイブリダイズする標的鎖に対応する過剰のアンプリコンを生成し、それによってプローブ−アンプリコンエレメントを生成すること；（ｄ）混合液を加熱したときの色素からの蛍光を測定することによって、飽和結合色素との混合液中のプローブ−アンプリコンエレメントの融解曲線を生成すること；ならびに、（ｅ）融解曲線を分析して対象の遺伝子座での変異体の存在または不在を検出すること。
【選択図】図８

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１１年１１月１６日に出願の米国特許仮出願第６１／５６０，７９９号の優先権を主張し、その全開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

本発明は、高度に相同的なゲノム領域を識別し、対象の遺伝子座で変異体を検出するための方法、キット、プライマー、プローブおよび系に関する。より詳しくは、本発明の態様は、他のゲノム領域と高い相同性を共有する対象の遺伝子座に存在する疾患または障害を引き起こす変異体を検出するために、対象の遺伝子座を含有する生体試料の高分解能熱融解分析を実行する際に、非標識のプローブと組み合わせて小アンプリコンアッセイを用いるための方法、キット、プライマー、プローブおよび系に関する。本発明は、患者が患者のゲノムの対象の遺伝子座に疾患または障害を引き起こす変異体を有するかどうかを判定することによって、患者の遺伝子型に基づいて患者の疾患を検出する方法にも関する。

嚢胞性線維症は白色人種集団で最も一般的な致死性常染色体劣性障害であり、本疾患は２，５００人の白色人種新生児中の１人で起こる（Ｒｏｗｎｔｒｅｅ ＲＫ、Ｈａｒｒｉｓ Ａ．Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２００３）６７巻：４７１〜４８５頁）（Ｋｅｒｅｍ ＢＳ、Ｒｏｍｍｅｎｓ ＪＭ、Ｂｕｃｈａｎａｎ ＪＡ、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４５巻：１０７３〜１０８０頁）。現在のところ、米国では３０，０００人を超える子供および若年成人が嚢胞性線維症に罹患した。ＣＦの最初の突然変異、ΔＦ５０８が、遺伝子クローニング技術を用いて１９８８年に発見されてから（Ｒｉｏｒｄａｎ ＪＲ、Ｒｏｍｍｅｎｓ ＪＭ、Ｋｅｒｅｍ Ｂら Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４５巻：１０６６〜７３頁）、ＣＦＴＲ（嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子）遺伝子上の１８００個以上の突然変異がＣＦＴＲ遺伝子データベースに加えられた。それらの間で、エクソン９の上のＡ４５５Ｅは、第７染色体上のＣＦＴＲ遺伝子で２番目に一般的な突然変異であり、ＣＦＴＲ遺伝子のＮＢＦ−１（ヌクレオチド結合フォールド−１（Nucleotide Binding Fold-1））に影響を及ぼす。この突然変異は、保存された膵臓機能および膜を横切る塩素イオンの残留分泌と関連する（Ｇａｎ ＫＨ、Ｖｅｅｚｅ ＨＪ、ｖｅｎ ｄｅｎ Ｏｕｗｅｌａｎｄ ＡＭＷら Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ（１９９５）３３３巻：９５〜９９頁）。Ａ４５５Ｅ突然変異の早期診断は、肺および／または膵臓疾患の進行を予防することおよび少なくすることができるであろう。この目的を満たすために、遺伝子型の正確で信頼できる簡易検出は、明確に強く求められている。

ＣＦＴＲ遺伝子上の突然変異を同定して、特徴づけるために、伝統的な配列決定技術が用いられている（Ｒｉｏｒｄａｎ ＪＲ、Ｒｏｍｍｅｎｓ ＪＭ、Ｋｅｒｅｍ Ｂら Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４５巻：１０６６〜７３頁）（Ｃｈｕ ＣＳ、Ｔｒａｐｎｅｌｌ ＢＣ、Ｍｕｒｔａｇｈ ＪＪ、Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ（１９９１）１０巻（６号）：１３５５〜１３６３頁）。ＣＦＴＲ遺伝子を同定して配列決定をするために、古典的染色体歩行およびジャンピング技術が用いられた（Ｒｏｍｍｅｎｓ ＪＭ、Ｉａｎｎｕｚｚｉ ＭＣ、Ｋｅｒｅｍ Ｂら Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４５巻（４９巻：１０５９〜７３頁）。これらの方法には、隣接マーカーからの染色体ジャンピング、パルスフィールド電気泳動による規定の領域からのＤＮＡセグメントのクローニング、ＣＦＴＲ遺伝子の近くのＤＮＡ断片を単離するように指定される体細胞ハイブリッドおよび分子クローニングの組合せ、ならびに第７染色体上の７ｑ３１領域からの多数のＤＮＡマーカーの飽和クローニングが含まれた。これらの技術は、ＣＦＴＲ遺伝子の明瞭で正確な遺伝子地図を提供した。これらの技術の複雑な手順および時間−手間がかかることは、臨床診断における迅速で、簡単で正確な遺伝子タイピングのためのそれらの使用を制限したが、これらの技術から得られる正確度および信頼できる情報は、ＣＦ突然変異の探究でなお多くの研究者を誘導する。

高分解能融解分析（ＨＲＭＡ）、十分に確立されたＰＣＲ後アンプリコン融解に基づく遺伝子検出方法が、ＣＦ突然変異のスクリーニングおよび遺伝子タイピングで用いられている。ＨＲＭＡは、ＣＦ突然変異を同定して特徴づけることにおける、感度および特異性を強化する（Ｃｈｏｕ ＬＳ、Ｌｙｏｎ Ｅ、Ｗｉｔｔｗｅｒ Ｃ、Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ（２００５）１２４巻：３３０〜３３８頁）。ＨＲＭＡの感度および特異性を増加させるために、小アンプリコン法がＨＲＭＡに適用された（Ｌｉｅｗ Ｍ、Ｐｒｙｏｒ Ｒ、Ｐａｌａｉｓ Ｒら Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ（２００４）５０巻：１１５６〜１１６４頁）。ＨＲＭＡは、ＰＣＲ生成物の迅速なＰＣＲ後融解分析が、ＰＣＲ反応の前の飽和色素によるリアルタイムＰＣＲの直後に来る方法である。突然変異スキャンのためのＨＲＭＡの感度は１００％に到達することができ、遺伝子タイピングの特異性は小アンプリコン融解、非標識プローブまたはスナックバックプライマーで増加させることができる（Ｗｉｔｔｗｅｒ Ｃ．Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔａｔｉｏｎ（２００９）３０巻：８５７〜８５９頁）。この方法は、遺伝子研究および臨床適用で広く適用されている。

小アンプリコン法は、遺伝子研究および診断での突然変異スキャンおよび遺伝子タイピング検出においてＨＲＭＡで確立された。一般的に１００ｐｂ未満の小アンプリコンは、遺伝子スキャンおよび遺伝子タイピングで高い感度および特異性を示すことが証明された（Ｅｒａｌｉ Ｍ、Ｗｉｔｔｗｅｒ ＣＴ、Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０１０）５０巻：２５０〜２６１頁）（Ｗｉｔｔｗｅｒ Ｃ．Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔａｔｉｏｎ（２００９）３０巻：８５７〜８５９頁）。小アンプリコン内のほとんどの単塩基突然変異は、高分解能融解によって容易に遺伝子タイピングすることができる。小アンプリコンの利点は、ＰＣＲが効率的であり、ホモ接合体の融点（Ｔｍ）がしばしばおよそ１℃以上離れていることであることは注目すべきである。しかし、これらの状況でのホモ接合体間のＴｍ差は非常に小さいことがあるので、小アンプリコン法で小さな挿入または欠失を遺伝子タイピングするのは困難である。

米国特許出願公開第２０１２／００５８５７１号 米国特許出願公開第２００２／０１９７６３０号 米国特許第７，４５６，２８１号 米国特許第６，１７４，６７０号 米国特許第８，１４５，４３３号 米国特許第８，１８０，５７２号 米国特許出願公開第２０１０／０２３３６８７号 米国特許出願第１３／２９７，９７０号 米国特許出願公開第２０１０／０１９１４８２号 米国特許出願公開第２００８／０００３５９３号 米国特許第８，３０６，２９４号 米国特許第７，６２９，１２４号 米国特許出願公開第２０１１／００４８５４７号 米国特許出願公開第２００９／０２４８３４９号 米国特許出願公開第２００９／０３１８３０６号 米国特許出願公開第２０１１／００５６９２６号 米国特許第６，４４７，６６１号 米国特許第６，５２４，８３０号 米国特許第７，１０１，４６７号 米国特許第７，３０３，７２７号 米国特許第７，３９０，４５７号 米国特許第７，４０２，２７９号 米国特許第７，６０４，９３８号 米国特許出願公開第２００５／００４２６３９号

Ｒｏｗｎｔｒｅｅ ＲＫ、Ｈａｒｒｉｓ Ａ．Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２００３）６７巻：４７１〜４８５頁 Ｋｅｒｅｍ ＢＳ、Ｒｏｍｍｅｎｓ ＪＭ、Ｂｕｃｈａｎａｎ ＪＡ、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４５巻：１０７３〜１０８０頁 Ｒｉｏｒｄａｎ ＪＲ、Ｒｏｍｍｅｎｓ ＪＭ、Ｋｅｒｅｍ Ｂら Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４５巻：１０６６〜７３頁 Ｇａｎ ＫＨ、Ｖｅｅｚｅ ＨＪ、ｖｅｎ ｄｅｎ Ｏｕｗｅｌａｎｄ ＡＭＷら Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ（１９９５）３３３巻：９５〜９９頁 Ｃｈｕ ＣＳ、Ｔｒａｐｎｅｌｌ ＢＣ、Ｍｕｒｔａｇｈ ＪＪ、Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ（１９９１）１０巻（６号）：１３５５〜１３６３頁 Ｒｏｍｍｅｎｓ ＪＭ、Ｉａｎｎｕｚｚｉ ＭＣ、Ｋｅｒｅｍ Ｂら Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４５巻（４９巻：１０５９〜７３頁 Ｃｈｏｕ ＬＳ、Ｌｙｏｎ Ｅ、Ｗｉｔｔｗｅｒ Ｃ、Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ（２００５）１２４巻：３３０〜３３８頁 Ｌｉｅｗ Ｍ、Ｐｒｙｏｒ Ｒ、Ｐａｌａｉｓ Ｒら Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ（２００４）５０巻：１１５６〜１１６４頁 Ｗｉｔｔｗｅｒ Ｃ．Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔａｔｉｏｎ（２００９）３０巻：８５７〜８５９頁 Ｅｒａｌｉ Ｍ、Ｗｉｔｔｗｅｒ ＣＴ、Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０１０）５０巻：２５０〜２６１頁 ＧｅｎｏｍｅＡｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌシリーズ（Ｉ〜ＩＶ巻）、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ＭａｎｕａｌおよびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（全てＣｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓから） 、Ｓｔｒｙｅｒ、Ｌ．（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第４版）Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｎ．Ｙ． Ｇａｉｔ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、１９８４年、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ ＮｅｌｓｏｎおよびＣｏｘ（２０００）、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ第３版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｕｂ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ． Ｂｅｒｇら（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第５版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｕｂ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ． Ｌｅｅら（Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ３６巻：８６３〜８７０頁、１９９３年） Ｈａｕｇｌａｎｄ（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、第９版、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ、２００２年） Ｅｌ−Ｓｐｅｅｄｙ、Ａ．、Ｄｕｄｏｇｎｏｎ、Ｔ．、Ｂｉｌａｎ、Ｆ．ら、Ｊ Ｍｏｌ Ｄｉａｇ （２００９）１１巻：４８８〜４９３頁 ｇｅｎｅｔ．ｓｉｃｋｋｉｄｓ．ｏｎ．ｃａ Ｇａｎ、Ｋ．Ｈ．ら、Ｔｈｏｒａｘ（１９９５）５０巻：１３０１〜１３０４頁 Ｌｉｕ、Ｙら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ（２００４）５巻：Ｒ６４ Ｉｎｎｉｓら（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５巻：９４３６〜９４４０頁、１９８８年） ＰｉｅｒｃｅおよびＷａｎｇｈ（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ １３２巻：６５〜８５頁、２００７年 ｆｒｏｄｏ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｐｒｉｍｅｒ３／ ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｈｇＰｃｒ？ｗｐ＿ｔａｒｇｅｔ＝＆ｄｂ＝ｈｇ１８＆ｏｒｇ＝Ｈｕｍａｎ＆ｗｐ＿ｆ＝＆ｗｐ＿ｒ＝＆ｗｐ＿ｓｉｚｅ＝４０００＆ｗｐ＿ｐｅｒｆｅｃｔ＝１５＆ｗｐ＿ｇｏｏｄ＝１５＆ｗｐ＿ｓｈｏｗＰａｇｅ＝ｔｒｕｅ＆ｈｇｓｉｄ＝１５１５０１０８２ ｗｗｗ．ｄｎａ．ｕｔａｈ．ｅｄｕ／ｕｍｅｌｔ／ｕｍ．ｐｈｐ ｗｗｗ．ｂｉｏｐｈｙｓ．ｕｎｉ−ｄｕｅｓｓｅｌｄｏｒｆ．ｄｅ／ｌｏｃａｌ／ＰＯＬＡＮＤ／ Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ、Ｊ．Ｗｉｔｔｗｅｒ、Ｃ．ＫｅｎｔＪ．Ｚｈｏｕ、Ｌ．、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ５３巻：１１１８９１〜１８９８頁（２００７）補遺

一態様では、本発明は、高度に相同的なゲノム領域を識別し、対象の遺伝子座で変異体を検出するための方法を提供する。一実施形態では、本方法は以下を含む：（ａ）対象の遺伝子座を有する核酸のアリコートを提供すること；（ｂ）核酸のアリコートを、限定的プライマー、過剰プライマーおよび核酸の標的鎖上の対象の遺伝子座とハイブリダイズするように設計されたプローブと一緒にインキュベートすること；（ｃ）アリコートを用いて非対称ＰＣＲを実施して、プローブとハイブリダイズする標的鎖に対応する過剰のアンプリコンを生成し、それによってプローブ−アンプリコンエレメントを生成すること；（ｄ）混合液を加熱したときの色素からの蛍光を測定することによって、飽和結合色素との混合液中のプローブ−アンプリコンエレメントの融解曲線を生成すること；ならびに、（ｅ）融解曲線を分析して対象の遺伝子座での変異体の存在または不在を検出すること。

別の実施形態では、方法ステップは、（ａ）対象の遺伝子座を有するアンプリコンを提供するステップ；（ｂ）非標識プローブを対象の遺伝子座とハイブリダイズさせてプローブ−アンプリコンエレメントを形成するステップ；（ｃ）プローブ−アンプリコンエレメントの融解曲線を生成するステップ；および、（ｄ）融解曲線を分析して対象の遺伝子座での変異体の存在または不在を検出するステップを含むことができる。一実施形態では、プローブ−アンプリコンエレメントを加熱したときの蛍光を測定することによって、挿入または飽和色素の存在下で融解曲線は生成される。

別の態様では、本発明は、患者の遺伝子型および疾患と関連する疾患または障害を引き起こす変異体遺伝子配列についての先験的な知識に基づいて、患者の疾患もしくは障害、または疾患もしくは障害を起こす傾向を検出する方法を提供する。一実施形態では、本方法は、（ａ）患者から生体試料を得るステップ；（ｂ）生体試料の一部を限定的プライマー、過剰プライマーおよびプローブを含む非対称ＰＣＲにかけて、プローブ−アンプリコンエレメントを生成するステップ；（ｃ）プローブ−アンプリコンエレメントを高分解能熱融解分析にかけることによって融解曲線を生成するステップ；ならびに、（ｄ）患者が疾患または障害を引き起こす変異体を有するかどうか判定するステップを含む。一実施形態では、融解曲線を分析して、患者が疾患または障害を引き起こす変異体を有するかどうか判定する。別の実施形態では、生体試料は、対象の遺伝子座を有する核酸を含む。さらなる実施形態では、プローブと過剰な相補鎖とのハイブリダイゼーションは、限定的プライマーが消耗されると増加する。別の実施形態では、色素で飽和させたプローブおよびアンプリコン二重鎖は、プローブとアンプリコンの両方の融解領域を生成する。

別の実施形態では、本発明は、患者の遺伝子型および疾患と関連する良性のおよび疾患または障害を引き起こす変異体遺伝子配列についての先験的な知識に基づいて、患者の疾患もしくは障害、または疾患もしくは障害を起こす傾向を検出する方法を提供する。一実施形態では、本方法は、（ａ）患者から生体試料を得ること；（ｂ）試料を非対称ＰＣＲにかけて、対象の遺伝子座を有するアンプリコンを生成すること；（ｃ）アンプリコンを非標識プローブアッセイにかけて第１の融解曲線を生成すること；および、（ｄ）患者が疾患または障害を引き起こす変異体を有するかどうか判定することを含む。一実施形態では、融解曲線を分析して、患者が疾患または障害を引き起こす変異体を有するかどうか判定する。

別の態様では、本発明は、対象の遺伝子座を有する核酸の上で、変異体を、（ａ）プライマー対および非標識プローブを用いて非対称ＰＣＲを実施すること；（ｂ）混合液を加熱したときの色素からの蛍光を測定することによって、飽和結合色素との混合液中の非標識プローブを用いる非対称ＰＣＲで生成される生成物の融解曲線を生成すること；ならびに（ｃ）融解曲線を分析して変異体が存在するかどうか検出することによって検出する方法を提供する。

別の態様では、本発明は、対象の遺伝子座を有する標的核酸の上で変異体を検出するための、および／または患者の遺伝子型に基づいて患者の疾患を検出するためのキットを提供する。一実施形態では、キットは非標識プローブを含む。別の実施形態では、キットは、標的核酸の上で対象の遺伝子座を増幅するためのプライマーをさらに含むことができる。一実施形態では、プライマーは、他の高度に相同的なゲノム領域を増幅することなく対象の遺伝子座を増幅するように選択される。別の実施形態では、プライマーは、非対称ＰＣＲ増幅反応のために選択される。さらなる実施形態では、キットは、増幅反応および／または熱分析を実施するための説明書を含むこともできる。キットは、二本鎖と一本鎖の核酸を区別する色素を含むこともできる。適する色素は、挿入色素、飽和色素または二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）結合色素であってよい。

別の態様では、本発明は、対象の遺伝子座を有する標的ＤＮＡの上で変異体を検出するための、および／または患者の遺伝子型に基づいて患者の疾患を検出するための系を提供する。一実施形態では、本発明による系は、（ａ）複数の試料負荷ゾーンを有し、試料負荷ゾーンがそれぞれ対象の遺伝子座を有する核酸を用いる別々の非対称ＰＣＲを収容するように構成されている微流動デバイス；（ｂ）加熱エレメント、蛍光励起光源および蛍光捕集口を含むＨＲＭＡデバイス；ならびに（ｃ）対象の遺伝子座を有する核酸の上の変異体を検出するようにＨＲＭＡデバイスによって生成される融解曲線を分析するように構成されている、蛍光導関数融解曲線分析デバイスを含むことができる。一部の実施形態では、ＨＲＭＡデバイスは、前記試料負荷ゾーンでの非対称ＰＣＲから得られるプローブ−アンプリコンエレメントを熱融解し、前記プローブ−アンプリコンエレメントの蛍光導関数融解曲線を生成するように構成される。

一部の実施形態では、対象の遺伝子座を有するアンプリコンは、対象の遺伝子座を有する標的核酸を第１のプライマーおよび第２のプライマーと混合することであって、プライマーは、対象の遺伝子座を有する標的核酸を増幅し、高度に相同的なゲノム領域から対象の遺伝子座を識別するように設計されること、ならびに対象の遺伝子座を有する標的核酸を増幅して、対象の遺伝子座を有するアンプリコンを生成することによって生成される。他の実施形態では、対象の遺伝子座を有するアンプリコンは、過剰プライマーおよび限定的プライマーを利用する非対称ＰＣＲを用いて生成される。

一実施形態では、過剰プライマーは、他の高度に相同的なゲノム領域と比較して、対象の遺伝子座の独特な非相同領域にハイブリダイズする。別の実施形態では、過剰プライマーはフォワードプライマーである。一実施形態では、アンプリコンサイズを最小にするために、限定的プライマーは対象の遺伝子座の変異体へ可能な限り近くにハイブリダイズする。別の実施形態では、限定的プライマーはリバースプライマーである。一実施形態では、プローブは野生型配列へハイブリダイズする。別の実施形態では、プローブは変異体配列へハイブリダイズする。さらなる実施形態では、プローブは非標識であってよい。さらなる実施形態では、プローブと過剰な相補鎖との結合は、限定的プライマーが消耗されると増加する。さらなる実施形態では、色素で飽和させたプローブおよびアンプリコン二重鎖は、プローブとアンプリコンの両方の融解領域を生成する。

一実施形態では、対象の遺伝子座は１つまたは複数のゲノム領域に高度に相同的であり、本方法は他の高度に相同的なゲノム領域から対象の遺伝子座を識別する。

別の実施形態では、対象の遺伝子座は、嚢胞性線維症などの疾患または障害と関連する遺伝子の上にある。別の実施形態では、対象の遺伝子座は、ＣＦＴＲ遺伝子の第９エクソンである。さらなる実施形態では、変異体は、ＣＦＴＲ遺伝子の第９エクソンのＡ４５５Ｅ変異体である。さらなる実施形態では、変異体は、ＣＦＴＲ遺伝子の第９エクソンの１４６１ｉｎｓ４変異体である。

標的ＤＮＡ配列のための非標識プローブを用いて高分解能熱融解曲線を得ることは、本発明の実施形態の範囲内である。対象の遺伝子座を有する標的核酸を増幅し、高度に相同的なゲノム領域から対象の遺伝子座を識別するのに適するプローブおよびプライマーを設計することも、本発明の実施形態の範囲内である。一実施形態では、プライマーは、対象の標的だけが増幅されるように、標的核酸と高度に相同的なゲノム領域を区別するように設計される。

したがって、別の態様では、本発明は、他のゲノム領域に高度に相同的である標的核酸上に、疾患または障害を引き起こす変異体を含有する対象の遺伝子座の熱融解分析に有用であるプライマーおよびプローブを設計する方法も提供する。この態様によれば、本方法は、（ａ）疾患または障害を引き起こす変異体を有し、他のゲノム領域に高度に相同的である核酸の上にある、疾患または障害の対象の遺伝子座を選択すること、（ｂ）非対称ＰＣＲで使用するためのプライマー対を設計すること、および（ｃ）対象の遺伝子座の１つの鎖にハイブリダイズするためのプローブを設計することを含む。一実施形態では、一方のプライマーは、他の高度に相同的なゲノム領域と比較して、対象の遺伝子座の独特な非相同領域にハイブリダイズするように設計される。別の実施形態では、このプライマーは、過剰プライマーである。さらなる実施形態では、過剰プライマーはフォワードプライマーである。一実施形態では、一方のプライマーは、アンプリコンサイズを最小にするために、対象の遺伝子座の変異体に可能な限り近くにハイブリダイズするように設計される。別の実施形態では、このプライマーは、限定的プライマーである。さらなる実施形態では、限定的プライマーはリバースプライマーである。一実施形態では、プローブは野生型配列にハイブリダイズする。別の実施形態では、プローブは変異体配列にハイブリダイズする。

本発明の上のおよび他の態様および特徴、ならびに本発明の様々な実施形態の構造および適用は、添付図面を参照して下に記載される。

本明細書に組み込まれ、明細書の一部を形成する添付の図面は、本発明の様々な実施形態を例示する。

ＮＣＢＩデータベースからのＤＮＡ配列ＢＬＡＳＴサーチマップを示す図である。全ＤＮＡ配列は、ＣＦＴＲ遺伝子の第８イントロンの３１７ｂｐ、第９エクソンの１８３ｂｐおよび第９イントロンの６４０ｂｐを含む１１４０ｂｐである。 ＵＣＳＣ Ｈｕｍａｎ ＢＬＡＴサーチスコアを示す図である。全ＤＮＡ配列は、ＣＦＴＲ遺伝子の第８イントロンの３１７ｂｐ、第９エクソンの１８３ｂｐおよび第９イントロンの６４０ｂｐを含む１１４０ｂｐである。 ＣＦＴＲ第９エクソン遺伝子地図を示す図である。第９エクソンのヌクレオチド（配列番号１）およびアミノ酸（配列番号２）配列を示す。領域の全ての既知の変異体は、下に図示する。Ａ４５５Ｅ突然変異は丸印で示す。Ａ４５５Ｅ突然変異の近くの他の突然変異も描かれる。 ＣＦＴＲ遺伝子の第９エクソンのＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＴサーチ結果を示す図である。ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴアルゴリズム（上）およびＵＣＳＣゲノムブラウザーＢＬＡＴアルゴリズム（下）を用いて、第９エクソン配列の１８２ｂｐを問い合わせた。両アルゴリズムは、ヒトゲノムのＣＦＴＲ第９エクソン配列と他の領域の間に存在する、多量の配列相同性を示す。 ＣＦＴＲ遺伝子の第９エクソンおよび隣接イントロンのＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＴサーチ結果を示す図である。ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴアルゴリズム（上）およびＵＣＳＣゲノムブラウザーＢＬＡＴアルゴリズム（下）を用いて、合計７２０ｂｐを問い合わせた。これは、第９エクソンの１８３に加えて、第８イントロンからの７７ｂｐおよび第９イントロンからの４６０ｂｐを含む。両アルゴリズムは、第９エクソンとその隣接イントロン配列の間に存在する、ヒトゲノムの他の領域との多量の配列相同性を示す。独特な配列を有する小領域（上画像の左側に示す）が、プライマー設計の標的であった。 ＣＦＴＲ第９エクソンのＡ４５５Ｅ突然変異のためのプライマーおよび非標識プローブの設計を示す図である。独特なゲノム配列を含有する第８イントロンの小領域で、フォワードプライマーを設計した。アンプリコンサイズを最小にするために、Ａ４５５Ｅ突然変異に可能な限り近くでリバースプライマーを設計した。小アンプリコンの遺伝子タイピングで用いるのに３０４ｂｐのアンプリコンサイズは大きすぎるので、Ａ４５５Ｅ突然変異を特異的に標的にするように非標識プローブを設計した。 ＣＦＴＲ第９エクソンＡ４５５Ｅの融解プロファイルの一次導関数を示す図である。６０℃〜７４℃でのプローブ融解を左側に示す。野生型ＤＮＡは単一の特性を提示し、ヘテロ接合のＤＮＡは２つの特性を示す。７５℃〜８４℃での、アンプリコン融解を右側に示す。 ＣＦＴＲ第９エクソンＡ４５５Ｅの融解プロファイルの一次導関数を示す図である。６１℃〜７４℃でのプローブ融解を左側に示す。野生型ＤＮＡは単一の特性を提示し、ヘテロ接合のＤＮＡは２つの特性を示す。ホモ接合構築物ＤＮＡは、ヘテロ接合ＤＮＡの第２の融解特性に対応する単一の融解特性も示す。７５℃〜８４℃での、アンプリコン融解を右側に示す。 合成構築物設計を示す図である。ｐＧＯｖ４プラスミドベクターを、左側に示す。それは、２つの抗生物質耐性遺伝子ならびに複製起点を含有する。ＣＦＴＲ第９エクソン挿入断片（野生型（配列番号３）および１４６１ｉｎｓ４ホモ接合（配列番号４）を、右側に示す。１４６１ｉｎｓ４突然変異は、太字で示す。エクソン配列は太字の大文字によって表され、イントロン配列は小文字によって表される。表１に記載されるプライマーのアニーリング部位には、下線を引く。 先のプライマー設計によるＣＦＴＲ第９エクソンＤＮＡの高分解能融解（ＨＲＭ）を示す図である。融解挙動は、複数のＰＣＲ生成物がゲノムＤＮＡ試料に存在することを示す。破線で表される合成構築物が示すように、真の野生型パターンはゲノムＤＮＡによって示されない。偽遺伝子領域がゲノムＤＮＡで増幅される可能性が非常に高い。 先のプライマー設計による第９エクソンＤＮＡの遺伝子スキャンを示す図である。 先のプライマー設計によるバイオアナライザー結果を示す図である。野生型構築物ＤＮＡからの結果を左側に示し、野生型ゲノムＤＮＡは右側に示す。構築物ＤＮＡは、このアッセイで用いられる２つの内部サイズマーカーに加えてきれいな単一のピークを示し、それは単一のＰＣＲ生成物の指標となる。ゲノムＤＮＡは、主ピークと、主ピークの右側の少数のより小さなピークを示す。これらのピークを積算しても、それらは合計でわずか約３ｎｇ／μｌである。明瞭な第２のピークは見られない。 本発明の一実施形態による、新しいプライマー設計を用いた第９エクソンＤＮＡのＨＲＭを示す図である。ゲノムおよび構築物の野生型ＤＮＡは、新しいプライマー設計で類似した融解パターンを示す。真のＣＦＴＲ第９エクソン領域に加えて、ＰＣＲの間、第９エクソン偽遺伝子領域はもはや増幅されない。 本発明の一実施形態による、新しいプライマー設計を用いたＣＦＴＲ第９エクソンＤＮＡの遺伝子スキャンを示す図である。アッセイの遺伝子スキャン結果を、この図に示す。融解移行の間の蛍光シグナル間の差を、温度関数として示す。同じ配列を有するＤＮＡは、差グラフの上に集合するはずである。ここでは、構築物およびゲノムの野生型ＤＮＡは実際に集合し、構築物ヘテロ接合体およびホモ接合体は野生型ＤＮＡの両方の型から明らかに異なる。 本発明の態様を具体化する微流動デバイスを例示する図である。 本発明の態様を具体化する微流動デバイスを用いるための系の機能ブロック図である。 本発明の態様を具体化する微流動系を例示する図である。

本発明はいくつかの実施形態を有し、当業者に公知である詳細については、特許、特許出願および他の参考文献を利用するものである。したがって、本明細書で特許、特許出願または他の参考文献が引用されるかまたは繰り返される場合は、それが、全ての目的のためにだけでなく列挙される提案のために参照によりその全体が組み込まれることを理解すべきである。

本発明の実施では、特に明記しない限り、従来の技術、ならびに当分野の技術の範囲内である、有機化学、ポリマー技術、分子生物学（組換え技術を含む）、細胞生物学、生化学および免疫学の記載を使用することができる。そのような従来の技術には、ポリマーアレイ合成、ハイブリダイゼーション、ライゲーション、および標識を用いるハイブリダイゼーションの検出が含まれる。適する技術の具体例は、本明細書の下の例を参照して得ることができる。しかし、当然ながら、他の同等の従来の手法を用いることもできる。そのような従来の技術および記載は、標準のラボラトリーマニュアル、例えば、ＧｅｎｏｍｅＡｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌシリーズ（Ｉ〜ＩＶ巻）、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ＭａｎｕａｌおよびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（全てＣｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓから）、Ｓｔｒｙｅｒ、Ｌ．（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第４版）Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｎ．Ｙ．、Ｇａｉｔ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、１９８４年、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、ＮｅｌｓｏｎおよびＣｏｘ（２０００）、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ第３版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｕｂ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．およびＢｅｒｇら（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第５版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｕｂ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．に見出すことができ、その全ては全ての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

本明細書で用いるように、「ホモ接合」は、所与の遺伝子座の２つの同一の対立遺伝子からなる遺伝子型を指す。

本明細書で用いるように、「ヘテロ接合」は、所与の遺伝子座の２つの異なる対立遺伝子からなる遺伝子型を指す。

本明細書で用いるように、「変異体」は、突然変異を含む、遺伝子のＤＮＡ配列の恒久的な変化を指す。遺伝子のＤＮＡ配列の変異体および突然変異は、遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を変更することができる。

本明細書で用いるように、「対象の遺伝子座」は、検出および／または分析される、核酸／アンプリコンの上のヌクレオチド配列を指す。対象の遺伝子座は、変異体／突然変異が疾患を引き起こすかまたは疾患状態の素因になることが知られている部位であってよい。対象の遺伝子座は、遺伝子との関連で標的核酸変異体の部位であってよい。対象の遺伝子座は、変異体部位を含むゲノム配列を包含することができる。

本明細書で用いられるように、「標的核酸」は、複製、増幅、検出および／または分析される、１つまたは複数のＤＮＡまたはＲＮＡ分子（複数可）を指す。「標的核酸」は、デオキシリボ核酸、リボ核酸またはそれらの混合物を指す。さらに、「標的核酸」は、非天然の核酸をさらに含むことができる。標的核酸は、任意の数の手段によって生成することができる。例えば、それは、制限酵素または他のエンドヌクレアーゼもしくはエキソヌクレアーゼによる切断反応から生成されてよい。あるいは、それは、より長い核酸鎖の特異的または非特異的切断の結果として形成することができ、酵素によって、または化学的に生成することができる。本発明の標的核酸は、加齢組織、アポトーシス細胞、または核酸断片を生成することができる他の天然、生物的または化学的反応の結果によって、ｉｎ ｖｉｖｏで天然に生成される断片も企図する。標的核酸はその配列の一部として対象の遺伝子座を含有することができ、または対象の遺伝子座が標的核酸の配列全体を占めてもよい。

本明細書で用いるように、「高度に相同的なゲノム領域」または「実質的に相同的なゲノム領域」は、少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９２％、または少なくとも９５％などの、非常に高い程度の相同性または同一性を有するヒトゲノムなどのゲノムの２つ以上の領域を指す。一部の実施形態では、そのような高い相同性のゲノム領域は、遺伝子および偽遺伝子を含むことができる。

本明細書で用いるように、「偽遺伝子」は、正常な遺伝子に類似するが機能しないゲノムＤＮＡ配列を指す。偽遺伝子は、機能的遺伝子の廃れた関係物と時にはみなされる。

本明細書で用いるように、「プローブ−アンプリコンエレメント」および「プローブ／プライマーアンプリコン」は、プライマーおよびプローブを用いるＰＣＲの間に生成される核酸断片またはアンプリコンを指す。

明細書全体で提供されるように、本明細書に記載される方法の全てのステップは、逐次的または同時に起きてよく、あるいは、ステップのある部分が同時に起こり、他は逐次的に起きてもよい。

対象の遺伝子座を有する標的核酸上の少なくとも２つの変異体を区別するために、本発明の一部の実施形態は熱融解曲線を利用する。温度の傾斜増により二重鎖状態から２本の別々の単鎖へ変性させたときの、ＤＮＡ鎖の融点を判定するために、当技術分野で蛍光の熱融解曲線が用いられている。一般的に、融点すなわちＴｍは、対のＤＮＡ鎖の５０％が単鎖に変性された温度であると規定される。二本鎖ＤＮＡに結合するときに蛍光を発して、変性するときにそれらの蛍光を失う挿入色素は、Ｔｍの測定でしばしば用いられる。一般的に、温度に関して蛍光の負の導関数（−ｄＦ／ｄＴ）が、Ｔｍの測定で用いられている。一般的な系では、ピーク−ｄＦ／ｄＴでの温度が、融点Ｔｍの推定値として用いられる。

融解曲線分析は、ストップフロー形式または連続フロー形式のいずれかで一般的に実行される。ストップフロー形式の一例では、融解曲線分析は、核酸試料が加えられたチャンバーで行われる。代わりのストップフロー形式では、そのチャネル内の温度が所望の融解曲線を生成するのに必要な温度範囲を通して傾斜させられる間、フローは微流動デバイスのマイクロチャネルの中で停止される。連続フロー形式の一例では、融解曲線分析は、微流動デバイスのマイクロチャネルの全長（流れの方向）に沿って温度勾配を加えることによって実施される。融解曲線分析が、分析する分子を第１の温度から第２の温度までの温度範囲にさらすことを必要とする場合は、マイクロチャネルの１つの末端での温度を第１の温度に制御し、全長の他端での温度を第２の温度に制御し、このように、第１および第２の選択された温度の間の温度範囲にわたる連続温度勾配を形成する。融解曲線分析を実施するための機器の例は、米国特許出願公開第２００７／０２３１７９９号および米国特許出願公開第２０１２／００５８５７１号に開示され、それぞれは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

本発明の態様に従って分析される熱融解データは、当技術分野で周知である技術によって得られる。例えば、Ｋｎｉｇｈｔら（米国特許出願公開第２００７／０２３１７９９号）；Ｋｎａｐｐら（米国特許出願公開第２００２／０１９７６３０号）；Ｋｎｉｇｈｔら（米国特許出願公開第２０１２／００５８５７１号）；Ｗｉｔｔｗｅｒら（米国特許第７，４５６，２８１号）；およびＷｉｔｔｗｅｒら（米国特許第６，１７４，６７０号）を参照。本発明は任意の環境で得られる熱融解データの分析に適用できるが、その環境でのより大きな感度の必要性のために、それは微流動環境で得られる熱融解データに特に有用である。

熱融解データは、分子または複数の分子、例えば１つまたは複数の核酸の温度を選択された期間上昇させ、分子または複数の分子から出る検出可能な特性を測定することによって一般的に生成され、そこにおいて、検出可能な特性とは、核酸の変性の程度を示す。この期間は、例えば、約０．０１秒〜約１．０分以上、約０．０１秒〜約１０秒以上、または約０．１秒〜約１．０秒以上であってよく、その間の全ての期間を含む。一実施形態では、加熱は、分子または複数分子の温度を連続的に増加させることによって分子または複数分子の温度を上昇させることを含む。例えば、分子（複数可）の温度は、約０．１℃／秒〜約１℃／秒の範囲内の速度で連続的に増加させることができる。あるいは、分子（複数可）の温度は、より遅い速度で、例えば約０．０１℃／秒〜約０．１℃／秒の範囲内の速度で、またはより速い速度、例えば約１℃／秒〜約１０℃／秒の範囲内の速度で連続的に増加させることができる。当技術分野で公知であるように、加熱は、内部または外部の熱源の加用を通して起こすことができる。

分子の物理的特性の変化（複数可）の実際の検出は、関与する具体的な分子および反応に従い、多数の方法で検出することができる。例えば、分子の変性は、アッセイでの分子からの蛍光または放射光を追跡することによって追跡することができる。蛍光の程度または変化は、分析される分子の立体構造の変化程度に相関するか比例する。したがって、一部の方法では、分子（複数可）の特性の検出は、結合の相対量の関数として変動する分子（複数可）からの蛍光または放射光のレベルを検出することを含む。１つの構成では、蛍光の検出は第１の分子および第２の分子を含み、そこにおいて、第１の分子は蛍光指示色素または蛍光指示分子であり、第２の分子は分析される標的分子である。一実施形態では、蛍光指示色素または蛍光指示分子は、第２の分子上の疎水性または親水性の残基に結合することによって第２の分子に結合または会合する。任意選択で、検出方法は、蛍光指示色素または蛍光指示分子を励起させて、励起した蛍光指示色素または励起した蛍光指示分子を作製すること、および励起した蛍光指示色素または蛍光指示分子の発光またはクエンチング事象を識別し測定することをさらに含む。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、Ｂｏｌｅｓら（米国特許第８，１４５，４３３号）；Ｃａｏら（米国特許第８，１８０，５７２号）；Ｋｎｉｇｈｔら（米国特許出願公開第２００７／０２３１７９９号）を参照。

対象の分子の変性の測定のためにいくつかの技術が存在し、本発明の態様に従って分析するデータを生成することにおいて、これらのいずれかを用いることができる。そのような技術には、蛍光、蛍光偏光法、蛍光共鳴エネルギー転移、円二色性およびＵＶ吸光度が含まれる。簡潔には、蛍光技術は、標的分子を温度変化にさらす間の標的分子の変性／アンフォールディングを追跡するために、蛍光または光の変化を測定するための分光法の使用を含む。例えば蛍光による分光測定は、熱によって誘導される分子の変性／アンフォールディングを検出する有用な方法である。分子の変性を検出するために蛍光が関与する多くの異なる方法が利用でき（例えば、内在性蛍光、多数の蛍光指示色素または分子、蛍光偏光法、蛍光共鳴エネルギー転移など）、それらは本発明の任意選択の実施形態である。これらの方法は、標的分子の内部蛍光特性または外部の蛍光、すなわち分析に関与するさらなる指示分子の蛍光のいずれかを利用することができる。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｃａｏ（米国特許出願公開第２０１０／０２３３６８７号）を参照。

標的分子の変性／アンフォールディングの程度を測定する１つの方法は、標的分子および対象の任意の試験分子と一緒に微流動デバイスに加えられる色素または分子の蛍光の監視による。蛍光色素または分子は、標的分子がアンフォールドもしくは変性したときか、または標的分子が、例えば変性による立体構造変化を経る前のいずれかに標的分子に結合することができ、例えば光もしくは特定の波長によってそれが励起された後に、蛍光エネルギーもしくは光を放出する任意の蛍光分子または化合物（例えば、蛍光団）を指す。

微流動デバイスで一般的に用いられる１つの色素型は、核酸の鎖の中に挿入されるものである。そのような色素の例は、臭化エチジウムである。結合アッセイのための臭化エチジウムの使用例には、例えば、核酸標的分子への試験分子の結合による臭化エチジウムからの蛍光発光の減少を監視すること（臭化エチジウム置換アッセイ）が含まれる。例えば、Ｌｅｅら（Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ３６巻：８６３〜８７０頁、１９９３年）を参照。変性の測定での核酸挿入剤の使用は、当業者に公知である。例えば、Ｈａｕｇｌａｎｄ（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、第９版、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ、２００２年）を参照。

熱融解分析では、挿入以外の機構によって核酸に結合する色素も一般的に使用される。例えば、温度による標的分子の分子アンフォールディング／変性を監視するために、二本鎖ＤＮＡの副溝に結合する色素を用いることができる。適する副溝結合色素の例は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．（Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ、ＵＳＡ）から販売されるＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎファミリーの色素である。例えば、Ｈａｕｇｌａｎｄ（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、第９版、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ、２００２年）を参照。ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ色素は、任意の二本鎖ＤＮＡ分子に結合する。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ色素が二本鎖ＤＮＡに結合するとき、蛍光発光の強度は増加する。温度上昇のためにより多くの二本鎖ＤＮＡが変性するに従って、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ色素シグナルは減少する。他の適する色素は、Ｉｄａｈｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ Ｃｉｔｙ、Ｕｔａｈ、ＵＳＡ）から販売されるＬＣＧｒｅｅｎ（登録商標）Ｐｌｕｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）から販売されるＳＹＴＯ（登録商標）９、およびＢｉｏｔｉｕｍ Ｉｎｃ．（Ｈａｙｗａｒｄ、Ｃａｌｉｆ．）から販売されるＥｖａ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）である。色素のさらなる例には、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｉ（ＢＩＯＲＡＤ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）、Ｐｉｃｏ Ｇｒｅｅｎ、ＴＯＴＯ−１およびＹＯＹＯ−１が含まれる。適する色素を選択することは、当業者の技術の範囲内である。

本発明の態様によれば、高度に相同的なゲノム領域を識別し、対象の遺伝子座で変異体を検出するための方法、キット、プライマー、プローブおよび系が提供される。１つの例示的な実施形態では、本発明の方法は、ＣＦＴＲ遺伝子の第９エクソンにおけるＡ４５５Ｅ変異体の存在または不在を検出するのに有用である。

対象のＤＮＡ配列は長さが約６４０ｂｐであり、それはＣＦＴＲ遺伝子の第９エクソン全体（長さ１８３ｂｐ）を含有し、そのイントロン接合部（第９イントロン接合部に約４００ｂｐ、第８イントロン接合部に約５０ｂｐ）は、ヒトゲノムで、特に第２０染色体上の領域と９６％以上相同的である。このヌクレオチド配列類似性は、特に小アンプリコン法を用いる場合、第９エクソン上の突然変異のための遺伝子タイピング検出をより困難にする。小アンプリコン法の記載については、Ｌｉｅｗら（Ｌｉｅｗ Ｍ、Ｐｒｙｏｒ Ｒ、Ｐａｌａｉｓ Ｒら、Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ（２００４）５０巻：１１５６〜１１６４頁）、Ｅｒａｌｉら（Ｅｒａｌｉ Ｍ、Ｗｉｔｔｗｅｒ ＣＴ、Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０１０）５０巻：２５０〜２６１頁）、Ｗｉｔｔｗｅｒ（Ｗｉｔｔｗｅｒ Ｃ、Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔａｔｉｏｎ（２００９）３０巻：８５７〜８５９頁）、およびＸｕら（米国特許出願第１３／２９７，９７０号、２０１１年１１月１６日に出願された）を参照。ＣＦＴＲ第９エクソンの大きな配列およびそのイントロン接合部が特に第２０染色体の領域で複製され、患者の突然変異同定に影響を及ぼす可能性を、いくつかの研究は示した（Ｅｌ−Ｓｐｅｅｄｙ、Ａ．、Ｄｕｄｏｇｎｏｎ、Ｔ．、Ｂｉｌａｎ、Ｆ．ら、Ｊ Ｍｏｌ Ｄｉａｇ（２００９）１１巻：４８８〜４９３頁）。突然変異Ａ４５５Ｅを遺伝子タイピングすることに関する研究は異なる検出技術を用いて報告されているが、ヒトゲノムの上でこの突然変異と他の相同的配列を区別する方法の詳細な記載は報告されていない。第９エクソンの相同的性質は、偽遺伝子の複製を引き起こすことができる。このＰＣＲの偏りは、遺伝子タイピングでの診断を複雑にし、誤解させることさえある。

ＮＣＢＩ ＢｌａｓｔデータベースおよびＵＣＳＣ Ｈｕｍａｎ ＢＬＡＴサーチゲノムデータベース（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）から得られた配列のｂｌａｓｔサーチ結果は、ＣＦＴＲ第９エクソンおよびそのイントロン接合部が、ヒトゲノム、特に染色体２０の上の他の配列と高度に相同的であることを示す。図１および２を参照。

図１および２に示すように、ＣＦＴＲ第８イントロン、第９エクソンおよび第９イントロンを含む約６４０ｂｐの領域は、他のゲノム領域、主に第２０染色体に高度に相同的である（約９６％）。この領域は、小さなアンプリコン、すなわち一般的に１００ｂｐ未満の一般的なサイズをはるかに超える。

古典的な染色体歩行およびジャンピング技術は遺伝子配列の同定でなお標準であるが、全体の同定方法は、隣接マーカーからの染色体ジャンピング、パルスフィールド電気泳動によるＤＮＡクローニング、ＣＦＴＲ遺伝子の周辺のＤＮＡ断片を単離するための体細胞ハイブリッドおよび分子クローニングの組合せ、ならびに第７染色体上の７ｑ３１領域の多数のＤＮＡマーカーの飽和クローニングを含む、いくつかの異なる工程が関与する。これらの工程はより複雑な実験手順を必要とし、データの取得および分析工程は時間／手間がかかる。ＣＦＴＲ遺伝子タイピングのための速いターンアラウンド臨床ルーチン診断工程にこれらの技術を適用することは非常に困難であり、これらの技術は多くの融解系のプラットホームに適合しない。

ＨＲＭＡによる小アンプリコン法は、特定の標的突然変異を同定する利点を有する。しかし、それが生成するアンプリコンの小さいサイズのために、この方法は、他のゲノム領域とほとんど相同的である領域で見出すことができる突然変異を検出するその能力、および異なる染色体の相同領域から標的突然変異の区別において制限される。この制限の１つの例は、例えば、第２０染色体に存在する大きな相同領域のために、第７染色体上の第９エクソンでのＡ４５５Ｅ変異体で示される。

ＣＦＴＲ遺伝子は、第７染色体の７ｑ３１．２に位置する。遺伝子の第９エクソンは、長さが１８３ｂｐであり、嚢胞性線維症の一般的な原因となる突然変異Ａ４５５Ｅ（図３、ｇｅｎｅｔ．ｓｉｃｋｋｉｄｓ．ｏｎ．ｃａに帰する）を含む、複数の突然変異を含有する。Ａ４５５Ｅ突然変異はＣからＡへの一塩基変化であり、ＣＦＴＲタンパク質のＮＢＦ−１（ヌクレオチド結合ヒダ−１）に影響を及ぼす。ＣＦＴＲタンパク質はＡ４５５Ｅ突然変異で一部の機能性を保持するので、この突然変異は、最も一般的なΔＦ５０８突然変異を有する患者で観察されるものより重症でない表現型と関連している。より少ない患者が膵機能不全症を示し、肺疾患の程度はΔＦ５０８突然変異を有する患者でより軽度である（Ｇａｎ、Ｋ．Ｈ．ら、Ｔｈｏｒａｘ（１９９５）５０巻：１３０１〜１３０４頁）。

ＣＦＴＲ遺伝子の第９エクソン領域のためにＰＣＲベースのアッセイを設計することにおける問題点は、大部分のエクソンおよび隣接するイントロン配列が、ゲノムの他の領域と配列相同性を共有することである。詳細には、偽遺伝子は、第２０染色体に存在することが公知である（Ｌｉｕ、Ｙら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ（２００４）５巻：Ｒ６４）。エクソンそれ自体は他のゲノム領域と１００パーセント相同的であり（図４）、エクソンの隣接イントロン配列の大部分（図５）は、ゲノムの他の領域と配列相同性を共有する。第９エクソンのイントロン接合部（第８イントロンおよび第９イントロン）も、第２０染色体と相同的である。

ＣＦＴＲ第９エクソンを異なる染色体、特に第２０染色体の他の大きな相同領域から区別するために、新しいアプローチが考案された。一実施形態によれば、図６は、第９エクソンのＡ４５５Ｅ突然変異を標的にする新しいプライマーおよびプローブ設計の理論を詳述する。

上で述べたように、ＣＦＴＲの第９エクソンおよび隣接イントロン配列は、ゲノムの他の領域と配列相同性を共有する。エクソンそれ自体は、長さが１８３ｂｐであり、他のゲノム領域と完全に相同的である。配列相同性は、エクソン上流の第８イントロンに５０ｂｐ伸長する。その後、さらなる相同配列に出会う前に、独特な配列を含有する短い（およそ１７０ｂｐ）領域がある。さらに、第９エクソンの直ぐ下流の第９イントロンの最初の４０７ｂｐは、ゲノムの他の領域と配列相同性を共有する。プライマーが相同領域の完全に外部で設計される場合、生じるＰＣＲ生成物は長さ１０００ｂｐ以上になるであろう。それは、ＰＣＲをベースとした遺伝子タイピングアッセイでの実用性には長すぎる。本発明の特定の実施形態に従って、フォワードプライマーは第８イントロンの独特領域の範囲内で設計し、妥協案として、リバースプライマーは、ゲノムの他の部分と配列相同性を共有するエクソンの領域内で設計すると決定された。

このアプローチでは、可能な限り小さなアンプリコンサイズにするために、フォワードプライマーはＣＦＴＲの第８イントロンの非相同領域に置かれ、リバースプライマーは第９イントロン内の第９エクソンＡ４５５Ｅ突然変異の近くに置かれる。Ａ４５５Ｅ突然変異を含むように、非標識プローブが用いられる。この設計の目的は、フォワードプライマーを用いて第２０染色体上の大きな相同領域から第９エクソンを区別すること、および非標識プローブを用いてＡ４５５Ｅ突然変異を特徴づけることである。

この設計から得られるアンプリコンサイズは、約３０４ｂｐである。プローブサイズは、一実施形態では２７ｂｐであり、それはＨＲＭＡの有効で効率的な融解プロファイルを提供する。

本発明の実施形態の方法に従って、対象の遺伝子座を含有するアンプリコンが提供される。アンプリコンは、標的核酸の増幅をもたらす任意の方法によって生成することができる。増幅反応は当技術分野で周知であり、当業者は任意の適する増幅反応を容易に用いることができる。ＰＣＲは、いくつかの異なる増幅技術で、おそらく最も周知である。一実施形態では、アンプリコンを生成するために非対称ＰＣＲが利用される。当技術分野で周知であるように、二本鎖ＤＮＡ鋳型の１つのＤＮＡ鎖を優先的に増幅するために、非対称ＰＣＲは一方のプライマーを限定的濃度で用い、他方のプライマーを過剰濃度で用いる。それは、２本の相補鎖の１本の増幅だけが必要とされる、配列決定およびハイブリダイゼーションプロービングで一般的に用いられる。ＰＣＲは、増幅の対象の鎖のプライマーが過剰である以外、通常通り実行される。限定的プライマーが使い果たされた後の、反応後期の遅い（算術）増幅のため、ＰＣＲの余分のサイクルが必要とされる。Ｉｎｎｉｓら（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５巻：９４３６〜９４４０頁、１９８８年）を参照。限定的プライマー濃度が反応中に減少するので、反応効率を維持するために、Ｌｉｎｅａｒ−Ａｆｔｅｒ−Ｔｈｅ−Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ−ＰＣＲ（ＬＡＴＥ−ＰＣＲ）として知られるこの方法への近年の改変は、過剰プライマーではなく、より高いＴｍの限定的プライマーを用いる。ＰｉｅｒｃｅおよびＷａｎｇｈ（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ １３２巻：６５〜８５頁、２００７年）を参照。好ましい実施形態では、対象の遺伝子座を有するアンプリコンを生成するために、基本的非対称ＰＣＲが利用される。

したがって、本発明による方法の一実施形態では、対象の遺伝子標的上の対象の遺伝子座とゲノムＤＮＡの他の高度に相同的な領域とを区別するために、対象の遺伝子座を有するアンプリコンを生成するために、標的二本鎖ＤＮＡ鋳型の１つのＤＮＡ鎖を優先的に増幅するために、非対称ＰＣＲが用いられる。本発明に従って、非対称ＰＣＲのためのプライマーは、アンプリコンのサイズを最小にして、プローブ：アンプリコンサイズ比を高めるように設計される。さらに本発明に従って、対象の遺伝子座で野生型と変異型ＤＮＡを区別するために、非標識プローブが利用される。プライマーおよびプローブの設計での考慮事項は、本明細書でさらに詳細に記載される。

本発明の一態様によれば、本方法は、非対称ＰＣＲによって生成されるアンプリコンの一部を非標識プローブとハイブリダイズさせることを含む。アンプリコンの一部は非標識のプローブとハイブリダイズして、プローブ−アンプリコンエレメントを生成する。プローブ−アンプリコンエレメントは、指標色素、例えば本明細書に記載され、当業者に周知であるそれらのいずれかの存在下で形成することができる。本明細書に記載される非標識プローブの使用は、独特な融解シグネチャーを生成する。融解シグネチャー曲線は、染色された非標識のプローブ−アンプリコンエレメントを、本明細書に記載される高分解能熱融解分析にかけることによって得ることができる。本発明の実施形態による方法、例えば特別に設計されたプライマーおよびプローブの使用は、対象の遺伝子座をゲノムＤＮＡの他の高度に相同的な領域から区別すること、および対象の遺伝子座での変異体の存在を検出することが可能である。

一実施形態では、対象の遺伝子座を有する標的核酸を含有する生体試料を非対称ＰＣＲにかけて、対象の遺伝子座を有するアンプリコンを生成する。非対称ＰＣＲは、当業者に周知であるサーマルサイクラーおよび微流動デバイスを含む、ＰＣＲを実施するのに適する任意の機器で実施することができる。アンプリコン−プローブハイブリダイゼーション反応が起きてプローブ−アンプリコンエレメントを生成するように、対象の遺伝子座を有する小アンプリコンを含有する反応混合物が、非標識プローブとのハイブリダイゼーションに含まれる。一実施形態では、非標識プローブは、標的核酸の野生型配列に完全に相補的である。

別の態様では、本発明により、標的核酸上の対象の遺伝子座とゲノムＤＮＡの他の高度に相同的な領域を区別して、対象の遺伝子座で変異体を同定するための系が提供され、その系は、（ａ）複数の試料負荷ゾーンを含み、試料負荷ゾーンがそれぞれ対象の遺伝子座を有する核酸を用いる別々の非対称ＰＣＲを収容するように構成されている微流動デバイスであって、限定的プライマー、過剰プライマーおよび非標識プローブを負荷される少なくとも１つの試料負荷ゾーンを含む微流動デバイス；（ｂ）試料負荷ゾーンで非対称ＰＣＲから得られるプローブ−アンプリコンエレメントを熱融解し、プローブ−アンプリコンエレメントの蛍光導関数融解曲線を生成するように構成された、加熱エレメント、蛍光励起光源および蛍光捕集デバイスを含むＨＲＭＡデバイス；ならびに（ｃ）対象の遺伝子座で変異体を同定するように、ＨＲＭＡデバイスによって生成される融解曲線を分析するように構成されている、蛍光導関数融解曲線分析デバイスを含むことができ、それは、プライマーの設計のために、ゲノムＤＮＡの他の高度に相同的な領域と異なり、対象の遺伝子座の増幅を可能にするだけだった。本発明の系により用いることができる微流動デバイスの例は、Ｈａｓｓｏｎら（米国特許出願公開第２０１０／０１９１４８２号）およびＫｎｉｇｈｔら（米国特許出願公開第２００７／０２３１７９９号）、ならびに本明細書に開示される他のものに記載され、それらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。蛍光測定のために構成される可能なＨＲＭＡデバイスの例は、米国特許出願公開第２００８／０００３５９３号およびＫｎｉｇｈｔら（米国特許出願公開第２０１２／００５８５７１号）、および米国特許第８，３０６，２９４号および第７，６２９，１２４号、ならびに本明細書に開示される他のものに例示され、それらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。例示的な一実施形態では、蛍光導関数融解曲線分析デバイスは、本明細書に開示されるＨＲＭＡデバイスによって生成される融解曲線を分析することができる、適切にプログラムされたコンピュータであってよい。標的アンプリコンの各遺伝子型のプローブ融解シグネチャーを認識して比較するために、Ｇｅｎｏｔｙｐｅ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ、Ｍｅｌｔ ＷｉｚａｒｄおよびＭｅｌｔ Ｖｉｅｗｅｒを含む、当業者に周知である従来の高分解能熱融解ソフトウェアを用いることができる。

用いることができる系の例示的な実施形態を、図１５〜１７に例示する。図１５は、本発明の態様を具体化する微流動デバイス１００を例示する。一部の実施形態では、微流動デバイス１００は、反応チップであってよい。例示した実施形態では、微流動デバイス１００は、基材１０１を横切って伸長するいくつかの微流動チャネル１０２を含む。各チャネル１０２は、１つまたは複数の吸入ポート１０３（例示した実施形態は、１チャネル１０２につき２つの吸入ポート１０３を示す）および１つまたは複数の出口ポート１０５（例示した実施形態は１チャネル１０２につき１つの出口ポート１０５を示す）を含む。例示的な実施形態では、各チャネルは、ＰＣＲ熱ゾーン１０４を通って伸長する第１の部分および熱融解ゾーン１０６を通って伸長する第２の部分に細分化することができる。

一実施形態では、微流動デバイス１００は、微流動チャネル１０２と関連している薄膜抵抗ヒーター１１２の形の熱制御エレメントをさらに含む。１つの非限定的実施形態では、薄膜抵抗ヒーター１１２は、それらのそれぞれの温度を制御するためにその抵抗が測定される、白金抵抗ヒーターであってよい。図１５で例示される実施形態では、各ヒーターエレメント１１２は、２つのヒーターセクション：ＰＣＲゾーン１０４内のＰＣＲヒーター１１２ａセクションおよび熱融解ゾーン１０６内の熱融解ヒーターセクション１１２ｂを含む。

一実施形態では、微流動デバイス１００は、様々な薄膜ヒーター１１２ａおよび１１２ｂに接続される複数のヒーター電極１１０を含む。非限定的実施形態では、ヒーター電極１１０は、ＰＣＲセクションリード１１８、１つまたは複数のＰＣＲセクション共通リード１１６ａ、熱融解セクションリード１２０、および１つまたは複数の熱融解セクション共通リード１１６ｂを含むことができる。本発明の一実施形態によれば、別々のＰＣＲセクションリード１１８は薄膜ＰＣＲヒーター１１２ａのそれぞれに接続され、別々の熱融解セクション共通リード１１６ｂは薄膜熱融解ヒーター１１２ｂのそれぞれに接続される。

図１６は、一実施形態に従って、微流動デバイス１００を用いるための系２００の機能ブロック図を例示する。ＤＮＡ試料は、調製段階２０２から微流動チップ１００に入れる。本明細書に記載されるように、調製段階２０２はピペッタ系と互換的に呼ぶこともできる。調製段階２０２は、試料２０４を調製するための、および１つまたは複数の試薬２０６を試料に加えるための、適当なデバイスを含むことができる。試料が、例えば吸入ポート１０３から微流動チップ１００に入れられると、試料はチャネル１０２の中を流れてＰＣＲが起こるＰＣＲゾーン１０４に入る。すなわち、試料がチャネル１０２の中を通ってＰＣＲゾーン１０４まで流れるに従い、試料はＰＣＲ温度サイクルに複数回曝露させられてＰＣＲ増幅が実行される。次に、試料は熱融解ゾーン１０６に流れ込み、そこでは高分解能熱融解工程が起こる。微流動チップ１００への試料の流量は、流量調節器２０８によって制御することができる。流量調節器は、系２００の制御系２５０の一部であってもよい。制御系２５０は、流量調節器２０８、ＰＣＲゾーン温度調節器２１０、ＰＣＲゾーン流量監視器２１８、熱融解ゾーン温度調節器２２４および／または熱融解ゾーン蛍光測定系２３２を含むことができる。一部の実施形態では、制御系２５０は、熱融解ゾーン流量監視器および／またはＰＣＲゾーン蛍光測定系を含むこともできる。したがって、一部の実施形態では、熱融解ゾーンでの流量制御は、融解ゾーン流量監視を通して起こることができる。さらに、流量調節器２０８は、ＰＣＲおよび熱融解ゾーンの両方で流量を同時に、または交互に制御する単一のユニットを含むことができ、または、流量調節器２０８は、ＰＣＲおよび熱融解ゾーンで流量を独立して制御する、ＰＣＲゾーン流量調節器および別の熱融解ゾーン流量調節器を含むことができる。

ＰＣＲゾーン１０４での温度は、ＰＣＲゾーン温度調節器２１０によって制御することができる。プログラムされたコンピュータまたは他のマイクロプロセッサーまたはアナログ温度調節器であってもよいＰＣＲゾーン温度調節器２１０は、温度センサー２１４（例えば、ＲＴＤまたは薄膜サーミスター、または薄膜熱電対温度計）によって判定される温度に基づいてヒーターデバイス２１２（例えば、ＰＣＲヒーター１１２ａ）にシグナルを送る。この方法で、ＰＣＲゾーン１０４の温度は、所望のレベルに維持することができるか、または規定の順序を循環させることができる。本発明の一部の実施形態によれば、ＰＣＲゾーン１０４は冷却装置２１６によって冷却することもでき（例えば、チャネル温度を９５℃から５５℃に速やかに下げるために）、それは、ＰＣＲゾーン温度調節器２１０によって制御することもできる。一実施形態では、冷却装置２１６は、例えば、ペルティエ素子、ヒートシンクまたは強制対流空冷式デバイスであってもよい。

微流動チャネル１０２を通る試料の流量は、ＰＣＲゾーン流量監視系２１８で測定することができる。一実施形態では、流量監視系は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第７，６２９，１２４号に例示される蛍光色素画像化および追跡系であってよい。本発明の一実施形態によれば、ＰＣＲゾーン内のチャネルは励起デバイス２２０によって励起させることができ、試料からの蛍光発光は検出デバイス２２２によって検出することができる。画像化系の一部を形成する１つの可能な励起デバイスおよび検出デバイスの例は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００８／０００３５９３号および米国特許第７，６２９，１２４号に例示される。

熱融解ゾーン１０６の温度を制御するために、熱融解ゾーン温度調節器２２４、例えばプログラムされたコンピュータまたは他のマイクロプロセッサーまたはアナログ温度調節器を用いることができる。ＰＣＲゾーン温度調節器２１０と同様に、熱融解ゾーン温度調節器２２４は、例えばＲＴＤ、薄膜サーミスターまたは薄膜熱電対であってよい温度センサー２２８で測定される温度に基づいて、加熱構成成分２２６（例えば、熱融解ヒーター１１２ｂ）にシグナルを送る。さらに、熱融解ゾーン１０６は、冷却装置２３０によって独立して冷却されてもよい。試料の蛍光シグネチャーは、熱融解ゾーン蛍光測定系２３２で測定することができる。蛍光測定系２３２は、励起デバイス２３４で試料を励起させ、試料の蛍光は検出デバイス２３６によって検出することができる。１つの可能な蛍光測定系の例は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００８／０００３５９３号および米国特許第７，６２９，１２４号に例示される。

本発明の態様によれば、薄膜ヒーター１１２は、ヒーターおよび温度検出器の両方として機能することができる。したがって、本発明の一実施形態では、加熱エレメント２１２および２２６ならびに温度センサー２１４および２２８の機能は、薄膜ヒーター１１２で達成することができる。

一実施形態では、系２００は、ＰＣＲゾーン温度調節器２１０または熱融解ゾーン温度調節器２２４から送られる制御シグナルに基づいて、薄膜ヒーター１１２ａおよび／または１１２ｂに電力を送り、それによってそれらをヒートアップさせる。制御シグナルは、例えば、パルス幅変調（ＰＷＭ）制御シグナルであってよい。ヒーター２１２を制御するためにＰＷＭシグナルを用いる利点は、ＰＷＭ制御シグナルでは、必要とされる様々な温度の全てのために、ヒーター全体で同じ電位を用いることができるということである。別の実施形態では、制御シグナルは、振幅変調または交流を利用することができた。大きな電圧ステップではなく、電圧の連続的な適度の変化がスルーレート制限を避け、セットリング時間を向上させるので、ヒーター２１２を制御するために、振幅変調される制御シグナルを用いることが有利である可能性がある。振幅変調のさらなる論述は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１１／００４８５４７号に見出すことができる。別の実施形態では、制御シグナルは、所望の温度に基づいて定常状態電力を送ることができた。一部の実施形態では、ヒーターのための所望の温度は、制御シグナルの負荷サイクルを変化させることによって到達される。例えば、１つの非限定的実施形態では、ＰＣＲヒーターで９５℃を達成するための制御シグナルの負荷サイクルは約５０％である可能性があり、ＰＣＲヒーターで７２℃を達成するための制御シグナルの負荷サイクルは約２５％である可能性があり、ＰＣＲヒーターで５５℃を達成するための制御シグナルの負荷サイクルは約１０％である可能性がある。

微流動デバイス１００および系２００は、本発明の態様と一緒に用いることができる。例えば、本発明の態様に従って、複数の試薬を得、それらを混合し、微流動デバイス（例えば、界面チップ）にそれらを送り、流量調節器２０８を利用して、流体セグメント間での混合を最小限にして微流動デバイス１００の中を流れる流体セグメントを作製することができる。

図１７は、本発明の一部の実施形態に従って、連続セグメント間の混合を最小限にして微流動チップ中を移動する流体セグメントを提供するための微流動チップ系８００を例示する。図１７の非限定的な例示的実施形態では、微流動チップ系８００は、界面チップ８０２および反応チップ８０４を含む。一部の実施形態では、界面チップ８０２は、異なる反応混合液（すなわち、流体）を、例えば上記の工程６００によって連続的に微流動系に入れるアクセス管（例えば、毛細管または他の管）またはウェル８０３を含有することができる。一部の実施形態では、反応チップ８０４は、反応化学、例えばＰＣＲおよび熱融解を実行するより小さなチップである。一部の実施形態では、反応チップ８０４は、微流動デバイス１００などの微流動デバイスであってよい。

一実施形態では、対象の遺伝子座を有する生体試料の増幅、ならびに増幅によって生成されるアンプリコンのアニーリングおよび伸長は、微流動デバイスで実施される。一実施形態では、微流動デバイスは、１つもしくは複数の生体試料または１つの生体試料の１つもしくは複数の部分の並行した増幅、アニーリングおよび伸長のための、複数のチャネルを有する。一実施形態では、微流動デバイスは、デバイスへ生体試料を送り込むための複数のウェルを有する。別の実施形態では、微流動デバイスは、ＰＣＲ増幅を実施するための第１の部分を、および熱融解分析を実施するための第２の部分を有する。ＰＣＲ増幅、ならびにＰＣＲ増幅および熱融解分析のための熱制御エレメントを含む微流動デバイスの例の記載は、米国特許出願公開第２００９／０２４８３４９号、第２００９／０３１８３０６号、第２０１０／０２３３６８７号および第２０１１／００５６９２６号、ならびに米国特許第８，３０６，２９４号で提供され、その全開示は参照により本明細書に組み込まれる。

本発明の実施形態は様々な機器で用いることができるが、ｉｎ ｖｉｔｒｏ診断を実行するＰＣＲおよび熱融解系で特に有用である。本発明の実施形態は、試料の熱融解用のデバイス（診断用）ならびに全く異なる機能（例えば、試料プレップまたはＰＣＲ）を実行する機器の中の他のヒーターおよびセンサーで用いることができる。本発明の実施形態は、微流動および非微流動デバイスで用いることができる。当技術分野で公知である微流動デバイスの例には、それらに限定されないが、Ｃｈｏｗら（米国特許第６，４４７，６６１号）、Ｋｏｐｆ−Ｓｉｌｌ（米国特許第６，５２４，８３０号）、Ｓｐａｉｄ（米国特許第７，１０１，４６７号）、Ｄｕｂｒｏｗら（米国特許第７，３０３，７２７号）、Ｓｃｈｅｍｂｒｉ（米国特許第７，３９０，４５７号）、Ｓｃｈｅｍｂｒｉ（米国特許第７，４０２，２７９号）、Ｔａｋａｈａｓｈｉら（米国特許第７，６０４，９３８号）、Ｋｎａｐｐら（米国特許出願公開第２００５／００４２６３９号）、Ｈａｓｓｏｎら（米国特許出願公開第２０１０／０１９１４８２号）およびＫｎｉｇｈｔら（米国特許出願公開第２０１２／００５８５７１号）、ならびに本明細書に開示される他のものが含まれる。これらの特許または特許出願公開はそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

本発明の１つまたは複数の実施形態では、増幅、アニーリングおよび伸長の後、プローブ−アンプリコンエレメントは、融解曲線を生成するために、飽和色素および高分解能融解分析にかけられる。標的配列が疾患または障害を引き起こす突然変異／変異体を含有する場合、融解の間、これらの突然変異／変異体の融解シグネチャーは、融解曲線上のプローブ融解領域の上に明確に提示させることができる。したがって、標的核酸上の対象の遺伝子座のために非標識プローブを用いる、生成された融解曲線の分析は、野生型と変異体対立遺伝子の識別を可能にする。１つの可能な蛍光測定系の例は、米国特許出願公開第２００８／０００３５９３号ならびに米国特許第８，３０６，２９４号および第７，６２９，１２４号で例示され、それらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

一部の実施形態では、対象の遺伝子座を有するアンプリコンは、対象の遺伝子座を有する標的核酸を第１のプライマーおよび第２のプライマーと混合することであって、プライマーは、対象の遺伝子座を有する標的核酸を増幅し、高度に相同的なゲノム領域から対象の遺伝子座を識別するように設計されること、ならびに対象の遺伝子座を有する標的核酸を増幅して対象の遺伝子座を有するアンプリコンを生成することによって生成される。他の実施形態では、対象の遺伝子座を有するアンプリコンは、過剰プライマーおよび限定的プライマーを利用する非対称ＰＣＲを用いて生成される。

一実施形態では、過剰プライマーは、他の高度に相同的なゲノム領域と比較して、対象の遺伝子座の独特な非相同領域にハイブリダイズする。別の実施形態では、過剰プライマーはフォワードプライマーである。一実施形態では、アンプリコンサイズを最小にするために、限定的プライマーは対象の遺伝子座の変異体に可能な限り近くにハイブリダイズする。別の実施形態では、限定的プライマーはリバースプライマーである。一実施形態では、プローブは野生型配列にハイブリダイズする。別の実施形態では、プローブは変異体配列にハイブリダイズする。さらなる実施形態では、プローブは非標識であってよい。さらなる実施形態では、限定的プライマーが消耗されると、融解曲線が生成される。

一実施形態では、対象の遺伝子座は１つまたは複数のゲノム領域に高度に相同的であり、本方法は他の高度に相同的なゲノム領域から対象の遺伝子座を識別する。

別の態様では、本発明は、他のゲノム領域に高度に相同的である標的核酸上に、疾患または障害を引き起こす変異体を含有する対象の遺伝子座の熱融解分析に有用であるプライマーおよびプローブを設計する方法も提供する。この態様によれば、本方法は、（ａ）疾患または障害を引き起こす変異体を有し、他のゲノム領域に高度に相同的である核酸の上にある、疾患の対象の遺伝子座を選択すること、（ｂ）非対称ＰＣＲで使用するためのプライマー対を設計すること、および（ｃ）対象の遺伝子座の１つの鎖にハイブリダイズするためのプローブを設計することを含むことができる。一実施形態では、一方のプライマーは、他の高度に相同的なゲノム領域と比較して、対象の遺伝子座の独特な非相同領域にハイブリダイズするように設計される。別の実施形態では、このプライマーは、過剰プライマーである。さらなる実施形態では、過剰プライマーはフォワードプライマーである。一実施形態では、一方のプライマーは、アンプリコンサイズを最小にするために、対象の遺伝子座の変異体に可能な限り近くにハイブリダイズするように設計される。別の実施形態では、このプライマーは、限定的プライマーである。さらなる実施形態では、限定的プライマーはリバースプライマーである。一実施形態では、プローブは野生型配列にハイブリダイズする。別の実施形態では、プローブは変異体配列にハイブリダイズする。例示的な一実施形態では、プライマーおよびプローブは、適切にプログラムされたコンピュータで設計される。

一部の実施形態では、非対称ＰＣＲでフォワードプライマーが過剰プライマーとして設定され、リバースプライマーが限定的プライマーとして設定されるように、プライマー対は設計される。他の実施形態では、非対称ＰＣＲでフォワードプライマーが限定的プライマーとして設定され、リバースプライマーが過剰プライマーとして設定されるように、プライマー対は設計される。過剰プライマーは、高度に相同的なゲノム領域からそれを区別することができるように、対象の遺伝子座の独特な領域とアニールするように設計される。高い遺伝子タイピング感度のためにアンプリコンサイズを最小にすることができるように、各プライマーは設計される。対象の遺伝子座の独特な領域は、従来の技術、例えばＢＬＡＳＴ分析およびＵＳＣＳ Ｈｕｍａｎ ＢＬＡＴサーチゲノム分析を用いて判定することができる。

独特な領域が特定されると、従来の技術を用いて、１つのプライマーはこの領域とアニールするように設計され、第２のプライマーは相同領域（すなわち、対象の遺伝子座と他の高度に相同的なゲノム領域の間で相同的である領域）でアニールするように設計される。例えば、プライマー設計は、次に例えば、適切にプログラムされたコンピュータで実施することができる。プライマー設計ソフトウェアの例には、それらに限定されないが、Ｐｒｉｍｅｒ３ソフトウェア（ｆｒｏｄｏ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｐｒｉｍｅｒ３／）またはプライマー配列を生成するＳＮＰ Ｗｉｚａｒｄソフトウェア（Ｃａｒｌ Ｗｉｔｔｗｅｒ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｕｔａｈの好意による）が含まれる。配列アラインメントを得るために、ＢＬＡＳＴおよびＨｕｍａｎ ＢＬＡＳＴなどのツールを用いて、ソフトウェアによって出力されるプライマーと同じゲノム内の他の配列との配列類似性が比較される。プライマー配列が、複数の位置、例えば異なる染色体の上、または同じ染色体の上の同じゲノムの中の他の配列と同じである場合は、このプライマーは拒絶される。プライマー配列が、好ましい実施形態では任意の他の配列と１００％異なる独特な配列である場合は、このプライマーおよび／またはプローブは受け入れられる。プライマー対が前記のように設計され、受け入れられると、プライマー対は、適切にプログラムされたコンピュータを用いて、例えばＰＣＲ条件および生成物のＰＣＲ予測のためのＩｎ−Ｓｉｌｉｃｏ ＰＣＲツールで検査される。Ｉｎ−Ｓｉｌｉｃｏ ＰＣＲツールの例には、それに限定されないが、（ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｈｇＰｃｒ？ｗｐ＿ｔａｒｇｅｔ＝＆ｄｂ＝ｈｇ１８＆ｏｒｇ＝Ｈｕｍａｎ＆ｗｐ＿ｆ＝＆ｗｐ＿ｒ＝＆ｗｐ＿ｓｉｚｅ＝４０００＆ｗｐ＿ｐｅｒｆｅｃｔ＝１５＆ｗｐ＿ｇｏｏｄ＝１５＆ｗｐ＿ｓｈｏｗＰａｇｅ＝ｔｒｕｅ＆ｈｇｓｉｄ＝１５１５０１０８２）が含まれる。

受け入れられた配列は、適切にプログラムされたコンピュータを用いて、理論的融解予測について検討することができる。融解予測ソフトウェアの例には、それらに限定されないが、ＵＭｅｌｔソフトウェア（Ｃａｒｌ Ｗｉｔｔｗｅｒの好意による、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｕｔａｈ、ｗｗｗ．ｄｎａ．ｕｔａｈ．ｅｄｕ／ｕｍｅｌｔ／ｕｍ．ｐｈｐ）およびＰｏｌａｎｄ Ｍｅｌｔ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎソフトウェア（ｗｗｗ．ｂｉｏｐｈｙｓ．ｕｎｉ−ｄｕｅｓｓｅｌｄｏｒｆ．ｄｅ／ｌｏｃａｌ／ＰＯＬＡＮＤ／）が含まれる。一部の実施形態では、標的突然変異の野生型配列およびミスマッチ配列は、２つ以上のプログラムで検査されてもよい。予測された結果を比較し、記録し、および実験データと比較するために後に参照として用いることができる。プライマー配列が上記の基準および検査に合格したならば、それらはアッセイの感度、特異性および再現性を含むアッセイの実現可能性について試験することができる。

特定の実施形態では、野生型配列に相補的である配列を有する非標識プローブが設計される。一実施形態では、プローブは、同一のＰＣＲ条件のためのプライマーと同じ基準で設計される。遺伝子の上で突然変異および対象の遺伝子座を同定した後に、プローブを対象の遺伝子座領域の中に置くことによってプローブの設計を実施することができる。前に指摘したＢＬＡＳＴまたはＨｕｍａｎＢｌａｓｔツールを用いて、配列を整列させることができる。これらのツールを用いて、無関係な配列の他の領域に相同的である任意のプローブ配列を排除するべきである。一部の実施形態では、プローブは、そのＴｍを約７０℃未満にするように設計される。特定の実施形態では、プローブは、そのＴｍをプライマーのＴｍ未満にするように設計される。一部の実施形態では、プローブは、標的核酸変異体がプローブの全長の中央付近に位置するように設計される。他の実施形態では、プローブは、変異体がプローブの５’末端により近いように設計される。さらなる実施形態では、プローブは、変異体がプローブの３’末端により近いように設計される。

一部の実施形態では、非標識プローブは、標的核酸のフォワード鎖上の野生型配列に完全に相補的である。他の実施形態では、非標識プローブは、標的核酸のリバース鎖上の野生型配列に完全に相補的である。したがって、対象の遺伝子座で突然変異／変異体を有する個体では、非標識プローブは、対応する遺伝子座に１つまたは複数の単一の塩基対ミスマッチ（複数可）を有する。この設計は、標的核酸上の対象の遺伝子座での突然変異／変異体のアッセイの感度および特異性を増加させるために用いられる。したがって、一実施形態では、非標識プローブの長さは、対象の遺伝子座の中で突然変異／変異体への十分な感度および特異性を有するように設計される。非標識プローブの長さは、標的アンプリコンの融解特性に従い変更することができる。

プローブ：アンプリコン比を最大にするために、プローブサイズを最大にする。一部の実施形態では、プローブは２０〜５０ヌクレオチド、例えば２５〜４０ヌクレオチド、例えば２５〜３０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、プローブの伸長を阻止するために、プローブは３’末端でブロックされる。３’末端は、任意の適するブロッカー、例えば、３’Ｃ６−アミノブロッカー、３’リン酸化ブロッカーまたは他の任意の適する３’ブロッカーでブロックされてもよい。プローブ設計の間、プローブの最適なＴｍの範囲は、プライマーＴｍより約２〜１０℃低い。一実施形態では、プローブＴｍは、プライマーＴｍより約４〜８℃未満低い。別の実施形態では、プローブＴｍは、最も低いプライマーＴｍより約４℃低い。

上記の実施形態の１つまたは複数により、本発明は、本明細書に記載されるプライマー設計の結果として、ゲノムＤＮＡの他の高度に相同的な領域から区別される対象の遺伝子座での患者の遺伝子型に基づいて、患者の疾患を検出する方法を提供する。一実施形態では、診断医は、標的の疾患または障害と関連する疾患または障害を引き起こす変異体遺伝子配列についての先験的な知識を利用することができる。別の実施形態では、非標識プローブを用いて得られる標的配列および融解シグネチャー曲線の分析に基づいて、特定の疾患または障害と関連する疾患または障害を引き起こす変異体を同定し、遺伝子タイピングするツールとして、本発明を用いることが可能である。一実施形態では、患者からの生体試料の一部を非対称ＰＣＲにかけて、対象の遺伝子座を有するアンプリコンを生成することができ、それは、非標識プローブとハイブリダイズして融解曲線を生成する。

別の実施形態では、患者からの生体試料を非対称ＰＣＲにかけて、対象の遺伝子座を有するアンプリコンを生成することができる。対象の遺伝子座を有するアンプリコンの一部を非標識プローブアッセイにかけて、融解曲線を生成する。

本発明は、他の高度に相同的なゲノム領域から、変異体を有する可能性がある対象の遺伝子座を識別する方法を提供する。この識別は本明細書に記載されるプライマーの選択に基づいて行われ、その結果、非対称ＰＣＲ増幅は対象の遺伝子座のアンプリコンの生成をもたらし、他の高度に相同的なゲノム領域の増幅はもたらさない。

本明細書の一実施形態に記載されているように、非標識プローブアッセイは、非標識プローブをアンプリコン上の対象の遺伝子座とハイブリダイズさせてプローブ−アンプリコンエレメントを形成するステップと、飽和色素をプローブ−アンプリコンエレメントに加えて混合液を形成するステップと、混合液を加熱したときの色素からの蛍光を測定することによって、プローブ−アンプリコンエレメントの融解曲線を生成するステップとを含む。

高分解能熱融解分析での非標識プローブアッセイの上記実施形態は簡単、迅速であり、微流動および非微流動デバイスの両方に容易に応用することができる。標的アンプリコンのための各遺伝子型のプローブ融解シグネチャーを認識することができる。一実施形態では、適切にプログラムされたコンピュータを用いて認識することができる。例示的な実施形態では、Ｇｅｎｏｔｙｐｅ ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｏｒおよびＭｅｌｔ Ｖｉｅｗｅｒを含む、当業者に周知である従来の高分解能熱融解ソフトウェアを用いることができる。プローブで生成される各突然変異ごとの各遺伝子型の確定的プローブ融解形状を、臨床分子診断報告で用いることができる。プローブで生成される各突然変異ごとの各遺伝子型の確定的プローブ融解形状は、臨床医および医師が受け入れ、容易かつ明瞭に解釈することができる。本発明によって設計されるプローブ／プライマーセットは、例えば嚢胞性線維症を含む様々な疾患を研究するために用いることができる。

別の態様では、本発明は、ゲノムＤＮＡの対象の遺伝子座と他の高度に相同的な領域を区別して、患者の遺伝子型に基づいて患者の疾患または障害を検出するためのキットを提供する。本発明によって設計される非標識プローブは、本発明によって設計されるプライマー対とともに、プローブおよびプライマーがそのために設計された特定の疾患または障害を検出するための診断検査を実施するためのキットに含まれてもよい。キットは、様々な核酸配列で生化学研究を実行するために用いることもできる。キットは、診断検査を実施するための説明書を含むことができる。非限定的な例では、キットは、プライマー対、非標識プローブ、ならびに対象の遺伝子座を有する標的核酸を用いて変異体／突然変異を検出するための診断検査を実施するための説明書を含有することができる。キットは、ポリメラーゼ、リガーゼ、ＮＡＤＰ、ｄＮＴＰ、緩衝剤、塩などの、ＰＣＲのために必要な一般的な試薬を含有することもできる。そのような試薬は、当業者に公知である。一実施形態では、キットは、配列番号５に示すヌクレオチド配列を有するプライマー、配列番号６に示すヌクレオチド配列を有するプライマー、および配列番号７に示すヌクレオチド配列を有するプローブを含むことができる。別の実施形態では、説明書は、本明細書に記載される方法および系を用いて診断検査を実施するための説明書を含むことができる。

本発明により設計される非標識プローブおよびプライマー対は、標的の疾患または障害に関する臨床分子診断のための任意の高分解能熱融解分析機器で用いることができる。本発明により設計される非標識プローブおよびプライマー対は、疾患または障害、例えば嚢胞性線維症の臨床分子診断のためにクリニック検査室によって用いられてもよい。本発明により設計される非標識プローブおよびプライマー対は、標的疾患の臨床分子診断のためのクリニック検査室による遺伝子のＨＲＭＡスキャンの後に、再帰遺伝子タイピング試験として用いられてもよい。

本発明の設計概念は、対象の他の遺伝子上の状況、ならびに高度に相同的なゲノム領域を有する他の遺伝子についての突然変異の発見に適用されてもよい。

本明細書に例示されるように、本発明の一実施形態に記載されるプライマーは、第２０染色体上の高度に相同的な領域の同時増幅なしで、ＣＦＴＲ遺伝子の第９エクソン領域の増幅を可能にする。本発明の一実施形態に記載される非標識プローブは、非標識プローブ融解領域のＨＲＭＡを用いてＡ４５５Ｅ突然変異についてＤＮＡを遺伝子タイピングするのに用いることができる。本発明の一実施形態で本明細書に記載した第９エクソンのＡ４５５Ｅ突然変異を遺伝子タイピングするためのこの非標識プローブアプローチは、正確かつ簡単である。本アッセイは、ターンアラウンド時間の速い有用な診断アッセイである。Ａ４５５Ｅ変異体に加えて、本発明の一実施形態に記載されるプライマーセットは、第９エクソンの１４６１ｉｎｓ４変異体についてスキャンするのに用いることもできる。ＣＦのためのＡＣＯＧ推奨のスクリーニングパネルは、Ａ４５５Ｅ突然変異を含む。本発明の一実施形態に記載されるプライマー／プローブ設計は、Ａ４５５Ｅ突然変異を正しく遺伝子タイピングすることができる。

（実施例）
本発明は、例示として提供され、本発明を限定するものでは決してない以下の実施例を参照することによって説明される。当技術分野で周知である標準技術、または下で具体的に記載される技術を利用した。

ヒトゲノム上の他の相同配列からＣＦＴＲ遺伝子の第９エクソンを識別するために、本発明はプライマーの設計を考慮する。第９エクソンのＡ４５５Ｅの突然変異を検出するために非標識プローブ法を用いる利点は、必須でありえる。本発明の実施形態による方法は、第８イントロン接合部領域上の非相同領域でフォワードプライマーの位置を決め、非標識プローブを用いてＡ４５５Ｅの突然変異を同定することによって、ヒトゲノム上の他の相同領域からＣＦＴＲ遺伝子の第９エクソンを識別する。本発明のこの実施形態は、Ａ４５５Ｅ検出、ならびに偽遺伝子過誤を避けることに関して、納得のいく結果を提供する。

本発明は、第９エクソン上のＡ４５５Ｅ、および相同領域から第９エクソンを識別するその接合部第８イントロン領域を含む配列を含む、突然変異同定のための独特で納得のいく方法を提供し、それは、ＨＲＭＡでＡ４５５Ｅ突然変異を特徴づけるために非標識プローブアプローチを用いて実施される。本発明は、上に記載される、およびさもなければ当技術分野で公知であるＨＲＭＡ系に適用することができる。

第９エクソン上のＡ４５５Ｅを遺伝子タイピングするための非標識プローブアプローチは、正確で簡単な方法であり、当分野で認識されている速いターンアラウンド試験に対する必要性に適合する。

本発明の実施形態によるプライマーおよびプローブ設計は、ＣＦＴＲ遺伝子のＡ４５５Ｅ変異体の臨床診断のために、信頼できる結果を提供する。

具体的には、このアプローチでは、フォワードプライマーは図６に示される第８イントロンの独特領域でアニールする。アンプリコンサイズを最小にするために、リバースプライマーはＡ４５５Ｅ突然変異の直ぐ下流にアニールする。非標識プローブも、Ａ４５５Ｅ突然変異を特に標的にするように設計された。この設計の目的は、他の染色体上の偽遺伝子領域も増幅することなく、ＣＦＴＲの第９エクソンだけを特異的に増幅することであった。通常、望ましくない二次生成物の形成を防止するために、両方のＰＣＲプライマーは独特なゲノム配列へアニールするように設計されている。他の染色体の上での偽遺伝子領域の存在のためだけでなく、アンプリコンサイズを最小にする必要性のために、通常のプライマー設計戦略は不可能であった。表１は、最終的なオリゴヌクレオチド設計を要約する。

したがって、本発明の実施形態に従って、以下の原理によってオリゴヌクレオチドおよびアッセイの設計が導かれた：

１）他の相同的ゲノム領域から第９エクソン領域を識別するために、フォワードプライマー、第９エクソンのＡ４５５Ｅ Ｆ１は、第８イントロンの独特な領域で設計した。

２）アンプリコンサイズを最小にするために、リバースプライマー、第９エクソンＡ４５５Ｅ Ｒ１は、Ａ４５５Ｅ突然変異に可能な限り近くで設計した。

３）非標識プローブ、ｅ９ Ａ４５５Ｅ ＵＰ１ｒは、野生型配列に相補的になるように設計した。Ａ４５５Ｅ突然変異をもつ個体では、プローブはＡ４５５Ｅ遺伝子座に一塩基対ミスマッチを有する。理想的には、ミスマッチはプローブの中央に設計される。プローブはアンプリコンの末端近くでアニールするので、この場合これは不可能であった。したがって、中央でのミスマッチが可能でなく、ミスマッチ塩基対がプローブの５’末端のより近くにくるときに非標識プローブ遺伝子タイピングがより良好である、より理想的でない例において以前の研究が示唆しているように、プローブミスマッチはプローブの５’末端のより近くにくるように設計した（Ｕｎｌａｂｅｌｅｄ Ｐｒｏｂｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ、Ｒｏｂ Ｐｒｙｏｒ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｕｔａｈ）。

４）プローブ：アンプリコンサイズ比を最大にするために、プローブサイズを最大にした。高分解能融解分析の間、比がより小さいほど、プローブシグナルはより高くなる。

５）ＰＣＲの間のＤＮＡポリメラーゼによる伸長を阻止するために、３’末端でプローブをアミノ−Ｃ６改変でブロックした。この３’末端改変は、下で概説するデータを生成するために用いた。他の適する３’改変、例えば３’リン酸化改変を利用することもできる。

６）リバースプライマーは、非対称ＰＣＲ反応で限定的プライマーであった。リバースプライマーは第９エクソンの非独特配列にアニールするので、このプライマーの伸長から生成される生成物は制限されるはずである。

７）プライマー配列は、合成構築物ＤＮＡで用いることもできた（さらに下に記載される）。プライマーアニーリング部位は、ゲノムＤＮＡの第９エクソン標的だけでなく合成構築物ＤＮＡの第９エクソン標的のＰＣＲ増幅も可能にする、６００ｂｐのプラスミドベクター挿入断片の中にある。

新しいプライマーおよびプローブ設計を利用することによって得られた予備データは、ＣＦＴＲ第９エクソンのＡ４５５Ｅ標的が、本発明に従って設計された非標識プローブによって首尾よく遺伝子タイピングされることを示した。図７は、２つの異なるゲノムＤＮＡによる遺伝子タイピング結果を示す。野生型ＤＮＡはプローブ融解領域で予想される単一のピークを示し、ヘテロ接合ＤＮＡはプローブ融解領域で予想される二重ピークを示した。

さらに、その精度のさらなる検査として、合成ＤＮＡ（さらに下に記載される）をこのアッセイで用いた。６００ｂｐの合成ＤＮＡは第９エクソン領域を含有し、その設計に含まれた唯一の塩基対変化は、ＣからＡへのホモ接合変化であった。このＤＮＡは、より低い温度のヘテロ接合ＤＮＡピークに対応する単一のプローブ融解ピークを生成すると予想される。実験データ（図８）は、全てのＤＮＡが予想通りに遺伝子タイピングされることを示した。観察された各プローブピークは、予想されたプローブピークに対応する。

新しいプライマーセット設計が、第９エクソンの１４６１ｉｎｓ４突然変異についてスキャンするためにさらに試験された。ゲノム野生型ＤＮＡおよび突然変異を有する合成構築物ＤＮＡの両方を試験した。簡潔には、構築物は、ｐＧＯｖ４プラスミドベクターに挿入されたおよそ６００ｂｐの配列からなる（図９）。プラスミドは大腸菌宿主細胞によって複製され、宿主細胞は必要に応じて容易に増殖させた。プラスミドは、宿主から精製された。プラスミド挿入断片は、野生型配列またはホモ接合の突然変異を含有する配列のいずれかを有するように設計された（図９）。プラスミドを宿主から抽出し、精製した後、野生型プラスミドおよびホモ接合プラスミドを１：１の比で混合して、ヘテロ接合構築物ＤＮＡミックスを生成した。

異なるプライマー設計（本発明の一実施形態による上記のもの以外の）を、最初に用いた。用いたプライマーは、配列ＴＧＧＧＧＡＡＴＴＡＴＴＴＧＡＧＡＡＡＧ（配列番号８）およびＣＴＴＣＣＡＧＣＡＣＴＡＣＡＡＡＣＴＡＧＡＡＡ（配列番号９）を有し、これらのプライマーの使用は、第９エクソンの２５８ｂｐのアンプリコンをもたらした（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ、Ｊ．Ｗｉｔｔｗｅｒ、Ｃ．Ｋｅｎｔ Ｊ．Ｚｈｏｕ、Ｌ．、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ ５３巻：１１ １８９１〜１８９８頁（２００７）補遺）。図１０から明らかであるように、このプライマーセットは、第９エクソン偽遺伝子領域を誤って増幅した。スキャン結果（図１１）は、構築物野生型とゲノム野生型ＤＮＡの間の融解不一致の存在をさらに裏づけた。構築物ＤＮＡはゲノム全体を含まず、したがって、特定のＰＣＲ生成物がどのように見えるべきかを表す。対照的に、ゲノム野生型ＤＮＡは、ＣＦＴＲ第９エクソン偽遺伝子を有する第２０染色体領域を実際に含む。図１０のゲノムＤＮＡで観察された２つの融解ドメインは、ゲノム上の２つの領域、すなわち、第７染色体（真の遺伝子）からのものおよび第２０染色体（偽遺伝子）からのもの、を増幅する元のプライマーセットによって説明することができる。これらの２つの領域は配列が相同的であるので、両方のＰＣＲ生成物は同じサイズであり、このようにバイオアナライザー分析で区別できなかった（図１２）。

本発明による上記のプライマーセットを利用したとき、ゲノムＤＮＡに関して図１０で観察された第２の融解特性は、もはや明白でなかった（図１３）。スキャン結果は、このプライマーセットが特異的生成物を生成したことの付加証拠を提供した（図１４）。さらに、構築物ヘテロ接合体ミックスおよび構築物ホモ接合体ＤＮＡはそれぞれ、野生型ＤＮＡの両方と比較して特徴的な融解パターンを生成した。この実験は、遺伝子スキャン実験ならびにＣＦＴＲ合成構築物プロジェクトで用いられるその能力のために、本発明の一実施形態によるプライマーセットの有用性を示した。

本発明は、ＰＣＲの間の、ヒトゲノム上の他の相同的な配列から差別した、ＣＦＴＲ第９エクソンの増幅を可能にする。第９エクソンのＡ４５５Ｅ突然変異を検出する非標識プローブ法を用いる利点は、それが配列決定より速く、安いことである。特異的なプローブを利用しない小アンプリコンアプローチは、不可能であった。小アンプリコン遺伝子タイピングは、その名の通り、小さな（一般的に１００ｂｐ以下）ＰＣＲ生成物の生成を必要とする。Ａ４５５Ｅ突然変異の周囲でのそれだけ多くの相同配列の存在は、小さな生成物を生成することができる特異的プライマーの設計を阻止した。したがって、より大きな、およそ３００ｂｐのＰＣＲ生成物からＡ４５５Ｅ突然変異を選び出すために、非標識プローブが必要であった。フォワードプライマーの特異性は、ヒトゲノム上の他の相同領域から第９エクソンを識別する。この設計は、正確なＡ４５５Ｅ遺伝子タイピングを可能にし、ＰＣＲの間の偽遺伝子配列の増幅を回避する。

本発明は、他の高度に相同的なゲノム領域から標的核酸上の対象の遺伝子座を識別するため、および対象の遺伝子座に存在する可能性がある突然変異を同定するために用いることができるプライマーおよびプローブを設計する方法を提供する。

１．非標識プローブおよびプライマー対の設計は、簡単および単純である；

２．一実施形態では、標的遺伝子座の独特領域が突然変異の５’側にある場合は、フォワードプライマーはこの独特領域にアニールするように設計される。本明細書に記載の一実施形態では、所望のＣＦＴＲ第９エクソン領域を増幅するために、フォワードプライマーはＣＦＴＲ遺伝子の第８イントロンの独特領域にアニールするように設計した。別の実施形態では、標的遺伝子座の独特領域が突然変異の３’側にある場合は、リバースプライマーはこの独特領域にアニールするように設計される。

３．一実施形態では、フォワードプライマーが独特領域にアニールする場合は、アンプリコンサイズを最小にするために、リバースプライマーは突然変異の可能な限り近くにアニールするように設計される。本明細書に記載の一実施形態では、アンプリコンサイズを最小にするために、リバースプライマーは、ＣＦＴＲ遺伝子の第９エクソンのＡ４５５Ｅ突然変異の近くにアニールするように設計した。別の実施形態では、リバースプライマーが独特領域に結合する場合は、アンプリコンサイズを最小にするために、フォワードプライマーは突然変異の可能な限り近くにアニールするように設計される。

４．非標識プローブは、野生型ＤＮＡ配列に完全に相補的であるように設計される。本明細書に記載の一実施形態では、Ａ４５５Ｅ突然変異を有する個体は、プローブへの単一ｂｐのミスマッチを有し、それは、ＨＲＭ分析の間に異なるパターンを提供する。

５．一実施形態では、フォワードプライマーが独特領域に結合する場合は、リバースプライマーは、偽遺伝子のＰＣＲ増幅が起こる確率を低減する限定的プライマーである。本明細書に記載の一実施形態では、リバースプライマーはＣＦＴＲ遺伝子の第９エクソンの非独特配列にアニールし、したがって、このプライマーの伸長から生成される生成物は制限されるはずである。別の実施形態では、リバースプライマーが独特領域に結合する場合は、フォワードプライマーは、偽遺伝子のＰＣＲ増幅が起こる確率を低減する限定的プライマーである。

６．一実施形態では、フォワードプライマーが独特領域に結合する場合は、ＨＲＭＡのためにプローブがアニールするのに望まれる特異的生成物の最大量を生成するために、フォワードプライマーは過剰にＰＣＲに加えられる。本明細書に記載の一実施形態では、ＨＲＭＡのためにプローブがアニールするための特異的なＣＦＴＲ第９エクソンＰＣＲ生成物の最大量を生成するために、フォワードプライマーを過剰にＰＣＲに加えた。別の実施形態では、リバースプライマーが独特領域に結合する場合は、ＨＲＭＡのためにプローブがアニールするのに望まれる特異的生成物の最大量を生成するために、リバースプライマーは過剰にＰＣＲに加えられる。

７．設計されたオリゴヌクレオチドは、任意のプラットホームで用いるのに十分に一般的である。

８．ＨＲＭの間にプローブによって生成されるパターンは、ＣＵＬＳによって開発されたＧＤＭＶ、Ｒｏｃｈｅ Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ４８０ソフトウェア、およびＷｉｔｔｗｅｒ Ｌａｂ’ｓ Ｍｅｌｔ Ｗｉｚａｒｄを含むＨＲＭＡソフトウェアによって容易に認識される。

９．本明細書に示されるように、本発明に従って設計されるプライマーは、ゲノムＤＮＡに加えて合成構築物ＤＮＡを遺伝子タイピングするために用いることもできる。

本明細書で特記されない限り、または文脈によって明確に否定されない限り、本発明の記載との関連で（特に以下の請求項との関連で）、用語「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」および類似の指示語の使用は、単数形および複数形の両方をカバーすると解釈するものとする。用語「含む」、「有する」、「含む」および「含有する」は、特に指摘されない限り、限定しない用語（すなわち、「含むが、これに限定されない」ことを意味する）と解釈されるべきである。本明細書で特に明記しない限り、本明細書での値の範囲の列挙は、単にその範囲に入る各別個の値に個々に言及する手短な方法の役割をするものであり、各別個の値は、それが本明細書に個々に挙げられているかのように明細書に組み込まれる。例えば、１０〜１５の範囲が開示される場合ならば、１１、１２、１３および１４も開示される。さらに、特に明記しない限り、本明細書での値の範囲の列挙は、単にその範囲に入る全ての別個の範囲に言及する手短な方法の役割をするものであり、各別個の範囲は、それが本明細書に個々に挙げられているかのように明細書に組み込まれる。例えば、１０〜１５の範囲が開示されるならば、１０〜１４、１０〜１３、１０〜１２、１０〜１１、１１〜１５、１１〜１４、１１〜１３、１１〜１２、１２〜１５、１２〜１４、１２〜１３、１３〜１５、１３〜１４および１４〜１５の範囲も開示される。本明細書に記載される全ての方法は、本明細書で特に明記しない限り、さもなければ文脈によって明らかに否定されない限り、任意の適する順序で実施することができる。特に主張されない限り、本明細書で提供される任意および全ての実施例、または例示を示す言語（例えば、「など」）の使用は、本発明を単により良好に示すことが目的であり、本発明の範囲を限定するものではない。明細書中のいかなる言語も、請求外のいかなる要素も本発明の実施に必須であることを示すと解釈されるべきでない。

本発明の方法および組成物を、様々な実施形態の形で組み込むことができるが、その少数だけが本明細書に開示されることが理解されよう。それらの実施形態の変形は、前述の記載を読むことによって当業者に明白になるであろう。発明者らは、当業者がそのような変形を適宜使用すると予想し、発明者らは、本明細書で具体的に記載されるのと別の方法で本発明が実施されることを意図する。したがって、本発明は、適用法によって許可される、それに添付される請求項で列挙される対象発明の全ての改変形および同等物を含む。さらに、本明細書で特に明記しない限り、さもなければ文脈によって明らかに否定されない限り、その全ての可能な変形形態の上記の要素の任意の組合せが、本発明に包含される。

Claims (14)

1. 第２のゲノム領域に実質的に相同的である対象の遺伝子座を有するＣＦＴＲ遺伝子の第９エクソン中のＡ４５５Ｅまたは１４６１ｉｎｓ４変異体を同定する方法であって、
   （ａ）対象の遺伝子座を有する核酸分子のアリコートを、限定的プライマー、過剰プライマー、およびＣＦＴＲ遺伝子の第９エクソンの標的鎖上の対象の前記遺伝子座とハイブリダイズするように設計されるプローブと一緒にインキュベートすることであって、ここで過剰プライマーはＣＦＴＲ遺伝子の独特配列とアニールし、限定的プライマーは第２のゲノム領域に相同的であるＣＦＴＲ遺伝子の非独特配列とアニールすることと、
   （ｂ）前記アリコートを用いて非対称ＰＣＲを実施して、プローブとハイブリダイズする標的鎖に対応する過剰のアンプリコンを生成し、それによってプローブ−アンプリコンエレメントを生成することと、
   （ｃ）混合液を加熱したときの色素からの蛍光を測定することによって、飽和結合色素との混合液中のプローブ−アンプリコンエレメントの融解曲線を生成することと、
   （ｄ）融解曲線を分析して変異体が存在するかどうか判定することと
   を含み、ここで、
   前記プローブが５’−ａａｃｃｇｃｃａａｃａａｃｔｇｔｃｃｔｃｔｔｔｃｔａｔ−３’（配列番号７）のヌクレオチド配列を有する、方法。
2. 過剰プライマーが５’−ｇｇｇｃｃａｔｇｔｇｃｔｔｔｔｃａａａｃｔ−３’（配列番号５）のヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載の方法。
3. 限定的プライマーが５’−ｇａａｃｔａｃｃｔｔｇｃｃｔｇｃｔｃｃａ−３’（配列番号６）のヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載の方法。
4. 対象の遺伝子座を有する核酸分子の標的鎖が増幅され、第２のゲノム領域は増幅されない、請求項１に記載の方法。
5. プローブが非標識である、請求項１に記載の方法。
6. プローブがその３’末端でブロックされる、請求項１に記載の方法。
7. 過剰プライマーが、対象の遺伝子座を有する核酸分子の標的鎖上で独特である配列にアニールし、限定的プライマーが、第２のゲノム領域に実質的に相同的である配列にアニールし、高い遺伝子タイピング感度のためにアンプリコンサイズを最小にするために変異体の近くに設定される、請求項１乃至６のいずれか１項に記載の方法。
8. ＣＦＴＲ遺伝子の第９エクソンの遺伝子型、および疾患または障害と関連する疾患または障害を引き起こす変異体遺伝子配列についての先験的な知識に基づいて、前記疾患または障害を引き起こす変異体を検出する方法であって、変異体遺伝子配列は、第２のゲノム領域に実質的に相同的である対象の遺伝子座を有するＣＦＴＲ遺伝子の第９エクソンの標的鎖の上にあり、
   （ａ）対象の遺伝子座を有する核酸分子および対象の遺伝子座に実質的に相同的である第２のゲノム領域を含有する生体試料の一部について非対称ＰＣＲを実施してアンプリコンを生成することであって、ここで過剰プライマーはＣＦＴＲ遺伝子の独特配列とアニールし、限定的プライマーは第２のゲノム領域に相同的であるＣＦＴＲ遺伝子の非独特配列とアニールすることと、
   （ｂ）前記一部を非標識プローブアッセイにかけて融解曲線を生成することと、
   （ｃ）融解曲線を分析して疾患または障害を引き起こす変異体が標的鎖中に有るかどうか判定することと
   を含み、ここで、
   前記プローブが５’−ａａｃｃｇｃｃａａｃａａｃｔｇｔｃｃｔｃｔｔｔｃｔａｔ−３’（配列番号７）のヌクレオチド配列を有する、方法。
9. 非標識プローブアッセイが、非標識プローブをアンプリコン上の対象の遺伝子座とハイブリダイズさせてプローブ−アンプリコンエレメントを形成することと、飽和色素をプローブ−アンプリコンエレメントに加えて混合液を形成することと、混合液を加熱したときの前記色素からの蛍光を測定することによって、プローブ−アンプリコンエレメントの融解曲線を生成することとを含む、請求項８に記載の方法。
10. プローブがその３’末端でブロックされる、請求項８に記載の方法。
11. 過剰プライマーが、対象の遺伝子座を有する核酸分子の標的鎖上で独特である配列にアニールし、限定的プライマーが、第２のゲノム領域に実質的に相同的である配列にアニールする、請求項８に記載の方法。
12. 変異体がＣＦＴＲ遺伝子のＡ４５５Ｅまたは１４６１ｉｎｓ４である、請求項８に記載の方法。
13. 過剰プライマーが５’−ｇｇｇｃｃａｔｇｔｇｃｔｔｔｔｃａａａｃｔ−３’（配列番号５）のヌクレオチド配列を有する、請求項１２に記載の方法。
14. 限定的プライマーが５’−ｇａａｃｔａｃｃｔｔｇｃｃｔｇｃｔｃｃａ−３’（配列番号６）のヌクレオチド配列を有する、請求項１２に記載の方法。

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