CN116978457B - 避免rna检测过程中假基因干扰的引物和探针组合及其设计方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了避免RNA检测过程中假基因干扰的引物和探针组合及其设计方法，属于分子生物学技术领域；设计方法具体包括如下步骤：通过在NCBI数据库中查找目的基因的基因组DNA序列，并在其基因组DNA序列上找出外显子和内含子，在文献中查找已有报道的假基因序列，与mRNA序列进行多序列比对，综合比对结果，避开mRNA序列上与假基因序列相似度高的位点，跨内含子设计引物和探针；假基因是指通过mRNA逆转录并整合到基因组、与mRNA和基因组编码区序列相似度极高的基因。本发明能够有效避免现技术中RNA管家基因出现假阳性的情况，更加准确的监测RNA检测流程。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及避免RNA检测过程中假基因干扰的引物和探针组合及其设计方法。
背景技术
在利用实时荧光PCR（RT-qPCR）对生物样本中含有的微量RNA进行定性或定量分析时，例如对人体中的病原体RNA进行核酸检测或对人体内目的基因的表达量进行测定时，往往会选择人体管家基因的mRNA序列作为内对照来设计引物和探针，确保样本中存在或提取出RNA，以此来监测整个检测流程，也可作为RNA定量检测的参比标准。如β-actin（β-肌动蛋白）基因、GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）基因、β-globin（β-珠蛋白）基因等，均常用于作为人类管家基因。
为了准确监测整个RNA检测流程，保证流程中只存在或只能检测RNA，避免DNA污染，通常会采用两种方法：
（1）在提取时仅提取总RNA；
（2）跨内含子设计管家基因的引物和探针。
对第一种方法而言，需要采用仅提取RNA的试剂盒，或在提取以后用DNA酶进行消化，但均不能完全消除DNA的残留，还可能在处理过程中造成RNA降解、增加操作繁琐度等，也不适用于一些需要DNA和RNA共检的场景。
对第二种方法而言，跨内含子设计理论上的确可以避免对基因组DNA的扩增，也是目前最普遍的方法，利用基因组DNA存在内含子，而成熟mRNA不含内含子导致的序列差异来避免对DNA的扩增。但这种方法无法避免假基因DNA的干扰，从而可能导致RNA管家基因的假阳性，实验结果不可靠。
假基因是泛指与任何另一基因相似且有缺陷的基因组序列，本发明中提到的假基因特指通过mRNA逆转录并整合到基因组的假基因。该类型的假基因与mRNA序列几乎相同，是与mRNA一样不包含内含子的DNA序列，因此跨内含子设计的引物和探针无法避免假基因的干扰。为了避免上述RNA管家基因出现假阳性的情况，更加准确的监测RNA检测流程，本发明提供了避免RNA检测过程中假基因干扰的引物和探针组合设计方法。
发明内容
本发明的目的在于提供避免RNA检测过程中假基因干扰的引物和探针组合及其设计方法，能够有效避免现技术中RNA管家基因出现假阳性的情况，更加准确的监测RNA检测流程。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：
避免RNA检测过程中假基因干扰的引物和探针组合及其设计方法，具体包括如下步骤：通过在NCBI数据库中查找目的基因的基因组DNA序列，并在其基因组DNA序列上找出外显子和内含子，在文献中查找已有报道的假基因序列，与mRNA序列进行多序列比对，综合比对结果，避开mRNA序列上与假基因序列相似度高的位点，跨内含子设计引物和探针。
其中，假基因是指通过mRNA逆转录并整合到基因组，在进化过程中产生变异从而丧失正常基因功能的序列。
进一步优化，目的基因为人类管家基因，针对人类管家基因设计，人类管家基因为β-actin或者GAPDH人类管家基因；
其中，探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团或MGB。
其中，所述荧光报告基团可以为常见商业荧光修饰基团，包括FAM、VIC、HEX、CY3、NED、TXR、ROX、CY5中的任意一种。
进一步限定，所述荧光淬灭基团可以为常见商业淬灭修饰基团，包括TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3和QSY中的任意一种。
本发明还公开了 避免RNA检测过程中假基因干扰的引物和探针组合，上述的避免RNA检测过程中假基因干扰的引物和探针组合设计方法制备的针对人类β-actin基因RNA设计的引物和探针组合，针对人类GADPH基因RNA设计的引物和探针组合中至少一种，具体序列如下表所示：
。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明通过在NCBI数据库中查找目的基因的基因组DNA序列，并在其基因组DNA序列上找出外显子和内含子，在文献中查找已有报道的假基因序列，与mRNA序列进行多序列比对，综合比对结果，避开mRNA序列上与假基因序列相似度高的位点，跨内含子设计引物和探针。能够有效避免现技术中RNA管家基因出现假阳性的情况，更加准确的监测RNA检测流程。
附图说明
图1为实施例1中引物和探针对人咽拭子总DNA/RNA模板的qPCR体系扩增曲线；
图2为实施例1中引物和探针对人咽拭子总DNA/RNA模板的RT-qPCR体系扩增曲线；
图3为实施例1中引物和探针对人咽拭子总DNA/RNA模板的qPCR体系和RT-qPCR体系扩增反应液的琼脂糖凝胶电泳图；
图4为实施例2中引物和探针对人咽拭子总DNA/RNA模板的qPCR体系扩增曲线；
图5为实施例2中引物和探针对人咽拭子总DNA/RNA模板的RT-qPCR体系扩增曲线；
图6为实施例2中引物和探针对人咽拭子总DNA/RNA模板的qPCR体系和RT-qPCR体系扩增反应液的琼脂糖凝胶电泳图；
图7为对比例1中引物和探针对人咽拭子总DNA/RNA模板的qPCR体系扩增曲线；
图8为对比例2中引物和探针对人咽拭子总DNA/RNA模板的RT-qPCR体系扩增曲线；
图9为对比例1中引物和探针对人咽拭子总DNA/RNA模板的qPCR体系和RT-qPCR体系扩增反应液的琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
以下结合具体实施例进行详细说明。实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件或者生产厂家推荐的方法实现。
实施例1
实施例1设计了针对人类β-actin基因RNA设计的引物和探针，首先利用NCBI查询其基因组序列和mRNA序列，并通过DNA和mRNA序列比对在其基因组DNA序列上找出外显子和内含子，在文献中查找已有报道的假基因序列，与mRNA序列进行多序列比对，综合比对结果，避开mRNA序列上与假基因序列相似度90%以上的位点，跨内含子设计引物和探针序列。
具体设计规则如下：
a. 当内含子长度在500bp以下时，引物和探针的其中一条序列的配对区域必须横跨两个外显子；当引物的配对区域横跨两个外显子时，此引物的3’端与其中一个外显子配对的长度不超过10bp。
b. 当内含子长度在500bp以上时，引物和探针的配对区域不需要横跨两个外显子；当引物的配对区域没有横跨两个外显子时，两条引物必须分别与两个外显子互补配对；当引物的配对区域横跨两个外显子时，此引物的3’端与其中一个外显子配对的长度不超过10bp。
（1）其基因组序列如下，详见SEQ ID NO.7：
>NG_007992.1 Homo sapiens actin beta (ACTB), RefSeqGene (LRG_132) onchromosome 7
CGGGAGGCAGAGGTTGCAGTGAGCTGAGATTGTGCCACTGCAGTCCAGCCTGGGCGACAGAGCAAGACTCCATCTCAAAACAACAACAACTAAAAACGAACAACAACAACAACA AAAAACTGAGGCCAGGTGCAGTGGCTCACACCTCTAATCCCAGCAATTTGGGAGGCTGAGGTGAGAGGATCACTTCAGCTCAGCAGTTCGAGACCAGCCCAGGCAACACAGGGAGACAGACCCTGTTATATTGCAGAGAGACCCCATCTCCACAAAATATAAAAATATTAGTCAGATGTGGTGGCATCCCTGCCGTCCCAGCTACTCAGGAGGCTGAGACAGGAGGATCGCTTGAGCCCAGGAGGTCAAGGCTGCAGTGAGCTGTGATCATGCCACTGCACTCCAGCCTGGGCCACAGAGCTAGACCCTGTCTCTAAAATTTTTAGAGACCTTATCTCTAAAAATAAATTAAATAAATAAACCGGGAGCACCTACTTTTTCTTTTTCTTTTACTTTTTTTTTTTTTTTTTGGAGACAGGGTCTCTATCACCCAGGCTGGAGTGCGGTGGCATGATCTTGGTTCACTGCAGCCTCGACCCCTCAGGCTCAGGCAGTTCTCCCACCTTAGCCTCCCCAGTAGCTGGGACTACAGGCACATGCCACCATGCCCGGCTAATTTTGTCTTTTTTTTTTTTTTTGGTAGAGACAGGGTCTCACCATGCTCCTCAAAACTCCTGGACTCGAGAGATCCTCCTGCCTCGGCCTCCCAAAATGCTGGGATTACGGTGTGAGCCGCTGTGCCCGGCTATTTTATTTTTAAATGAATAAAAGCTGGAGCACCCAACTTTTTTGTTGTTGTTTTTCTGAGACAGAGTTTTGCTCGTCACCCAGGCTGGAGTGCAGCGGCGCAATCTCGGCCCACTGCAACCTCTGCCTCCCGGGTTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCTGAGTAGCTGGGATTACAGGCACGCGCCACTATGCCCAGCTAATATTTTGTATTTTTAGTAGAGACAAGGTTTCATCATGTTTGCCAGGCTGATCTTGAATTTTTGACCTCAGGTGATCCACCCGCCTTGACCTCCCAAAGTGCAGGGATTACAGGCGTGAGCCACCACGCCCAGCCTGGAGCACCTAATTTTTAAATTTAATTTTTCTTTTCTTTTTTTTTTTTTTTTGAGACAGGGTCTTCCTCTGTCATCCAAGCTGGAATGCAGTGACTTGATCATAGCTCACTATAACCTTGACCTTCCACGCTGAAGCAATGCTCCTGCCCCAGCCTCCCAATTAGCTGGGAGTACAGGCACGTGCCACAACACCCAGCTGATTTTGTAGAGATAGGATCTCCCGTGTTGCCCAAGCTTGTCTCCAACTCCTGGGCTCGAGCGATCTTCCCTCCTCGGCCTCCCAAAATGCTGGGATTACAGGTACAAGCCATCACACCCCAGTGGGAGAGACCCCACTTGCTGCCACGTGACCATGGGCTGATGGTGTCCTCTCTGGGCCTCAGGTGATAAATTCTGAGGAGGGAGGTAGGGCCCAGGAATTCCGACTTTCAAACAGCCTTTGGACTCAGGCCTTGGGGACATTCCAGGGGACCCTTTACCAGGGAGGGGCAGTGTGAGGCAGGAGGCAGGGCTGCCGCCTCAGGGACCCTGAGGCTAGAGTCCTTCCCACCGCATTTGGGGACTTGAGCACTTCACCAGTCCTGACTCAGTTTCCTAGTCTGTGAATGGGGGTGTGTCTCCTGGAATGTTGCCCCCCCTCATTCATTCATTCTCCTCTCACTGAGCACCTACCGTGTTCAGGGTCCCTGTCCTCCTAGAGCTAACTCAAGTCTTGGAGGGAAGCTCTGTCTCAGTTCCTTCCTCTACAAAATGGAGCTTGAGGACGGGCACGGTGGCTCATGCCTGTAATCCCAGGACTTTGGGAGGCTGAGGTGGGAGGATCGCTTGAGCCCCCCGGAGCTGGAGACCAGCCTGGGCAACATGGTGAGAAGCCATACCTCTACAGATAATTTAAAAATTAGCCAGGCTTGGAAGTGTGTGCCTATAGTCCCAGCTACTCGTGAAGGCTTTGAGCCCAGGAGGTCGAGGCTGCAGTGAGCTGTGATCGCACTCCAGCCTGGGCATCACAGCAAGACCTTGTATCAAAAATAGTAATAATAATAAAAAGGAGGTTGGATTCCCTCCTGGCAGGATAGGGAGGGCGCTGCAGTGCCCAGGGCAAGGTGGCTGGGTGGTTGTTTTGCGGGAGGGCCAAGGAGTGGTCCCTGGGTCTGCGCTGTAAGAGTTGGTTGCCTGGAGGCCTTGCAGGGTGGGGGTGTCACCAAAGCAAAGGCTTGGAGGGGAAAAAACAAAAGTCCCAGCCAGGCAGGTGGAGTCCCCTTGGCTGAGTTCAACCGAGGGTTCTCCGGGGGCTGCGTGCGTGCCCCAGTGACAGCTCCGAAAGCTCCCTTACAGGGCAAAGTTCCCAAGCACAGAAGAGAACCTGTTCACTTCTCCCCTGCTCGGCCCGCCCCCTGGCCAGGCACCTCTACTTCCTCTTTTCCTGCTCCGCTGCTTGCTTTCTCTCTTCAGCTCCTCCCTGCCCCTCACCCCAGGCTGCTCGGCCACCTCCAACCTGCCACCTGAGGACACCCAGGCAGTCACTCATTCAACAGCGAGGAGCCCTGGGGTGGGTGTAGTGGGAAGGAGTGGGGGTGACGGAGACCCTGGGAGGGCTCGCAGCCTGGTGGCTGAGGCCCAGTTCTAAATGCCAGCTGCAAGCCTTGGTCTGAGGTAGGGAGGAAGGCGTGGCTGCAGAGGCTAAAACGCTTCCCCAAAGAGGGGCTTTCTGGGATGGGACTTGAAGGGTGCATAGGAGAGCACTAGGAAGTGGCCGCTGCAGACAGAGGGAACCACAAGCCAGGAGGACAGGCCAGGAATGCTGCAGCCCGGGGCGGGGTGGGGCTGGAGCTCCTGTCTCTTGGCCAGCTGAATGGAGGCCCAGTGGCAACACAGGTCCTGCCTGGGGATCAGGTCTGCTCTGCACCCCACCTTGCTGCCTGGAGCCGCCCACCTGACAACCTCTCATCCCTGCTCTGCAGATCCGGTCCCATCCCCACTGCCCACCCCACCCCCCCAGCACTCCACCCAGTTCAACGTTCCACGAACCCCCAGAACCAGCCCTCATCAACAGGCAGCAAGAAGGGCCCCCCGCCCATCGCCCCACAACGCCAGCCGGGTGAACGTTGGCAGGTCCTGAGGCAGCTGGCAAGACGCCTGCAGCTGAAAGATACAAGGCCAGGGACAGGACAGTCCCATCCCCAGGAGGCAGGGAGTATACAGGCTGGGGAAGTTTGCCCTTGCGTGGGGTGGTGATGGAGGAGGCTCAGCAAGTCTTCTGGACTGTGAACCTGTGTCTGCCACTGTGTGCTGGGTGGTGGTCATCTTTCCCACCAGGCTGTGGCCTCTGCAACCTTCAAGGGAGGAGCAGGTCCCATTGGCTGAGCACAGCCTTGTACCGTGAACTGGAACAAGCAGCCTCCTTCCTGGCCACAGGTTCCATGTCCTTATATGGACTCATCTTTGCCTATTGCGACACACACTCAGTGAACACCTACTACGCGCTGCAAAGAGCCCCGCAGGCCTGAGGTGCCCCCACCTCACCACTCTTCCTATTTTTGTGTAAAAATCCAGCTTCTTGTCACCACCTCCAAGGAGGGGGAGGAGGAGGAAGGCAGGTTCCTCTAGGCTGAGCCGAATGCCCCTCTGTGGTCCCACGCCACTGATCGCTGCATGCCCACCACCTGGGTACACACAGTCTGTGATTCCCGGAGCAGAACGGACCCTGCCCACCCGGTCTTGTGTGCTACTCAGTGGACAGACCCAAGGCAAGAAAGGGTGACAAGGACAGGGTCTTCCCAGGCTGGCTTTGAGTTCCTAGCACCGCCCCGCCCCCAATCCTCTGTGGCACATGGAGTCTTGGTCCCCAGAGTCCCCCAGCGGCCTCCAGATGGTCTGGGAGGGCAGTTCAGCTGTGGCTGCGCATAGCAGACATACAACGGACGGTGGGCCCAGACCCAGGCTGTGTAGACCCAGCCCCCCCGCCCCGCAGTGCCTAGGTCACCCACTAACGCCCCAGGCCTTGTCTTGGCTGGGCGTGACTGTTACCCTCAAAAGCAGGCAGCTCCAGGGTAAAAGGTGCCCTGCCCTGTAGAGCCCACCTTCCTTCCCAGGGCTGCGGCTGGGTAGGTTTGTAGCCTTCATCACGGGCCACCTCCAGCCACTGGACCGCTGGCCCCTGCCCTGTCCTGGGGAGTGTGGTCCTGCGACTTCTAAGTGGCCGCAAGCCACCTGACTCCCCCAACACCACACTCTACCTCTCAAGCCCAGGTCTCTCCCTAGTGACCCACCCAGCACATTTAGCTAGCTGAGCCCCACAGCCAGAGGTCCTCAGGCCCTGCTTTCAGGGCAGTTGCTCTGAAGTCGGCAAGGGGGAGTGACTGCCTGGCCACTCCATGCCCTCCAAGAGCTCCTTCTGCAGGAGCGTACAGAACCCAGGGCCCTGGCACCCGTGCAGACCCTGGCCCACCCCACCTGGGCGCTCAGTGCCCAAGAGATGTCCACACCTAGGATGTCCCGCGGTGGGTGGGGGGCCCGAGAGACGGGCAGGCCGGGGGCAGGCCTGGCCATGCGGGGCCGAACCGGGCACTGCCCAGCGTGGGGCGCGGGGGCCACGGCGCGCGCCCCCAGCCCCCGGGCCCAGCACCCCAAGGCGGCCAACGCCAAAACTCTCCCTCCTCCTCTTCCTCAATCTCGCTCTCGCTCTTTTTTTTTTTCGCAAAAGGAGGGGAGAGGGGGTAAAAAAATGCTGCACTGTGCGGCGAAGCCGGTGAGTGAGCGGCGCGGGGCCAATCAGCGTGCGCCGTTCCGAAAGTTGCCTTTTATGGCTCGAGCGGCCGCGGCGGCGCCCTATAAAACCCAGCGGCGCGACGCGCCACCACCGCCGAGACCGCGTCCGCCCCGCGAGCACAGAGCCTCGCCTTTGCCGATCCGCCGCCCGTCCACACCCGCCGCCAGGTAAGCCCGGCCAGCCGACCGGGGCAGGCGGCTCAC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（2）β-actin基因引物与探针如下：
正向引物（SEQ ID NO.1）：5’-TCTGCCTGACATGAGGGTTAC-3’
反向引物（SEQ ID NO.2）：5’-TCCATGCCTGAGAGGGAAATG-3’
探针（SEQ ID NO.3）：
5’-VIC-CCCTCGGGGCTGTGCTGTGGAAGCT-BHQ1-3’
（3）实施例1中采用的模板为商业试剂盒（诺唯赞VAMNE Magnetic Pathogen DNA/RNA Kit）提取的人咽拭子总DNA/RNA。其中DNA酶消化组，是取10μL人咽拭子总DNA/RNA，加入1μL DNase Ⅰ，37℃孵育10min后， 85℃孵育10min，取1μL反应液为模板；其中RNA酶消化组，是取10μL人咽拭子总DNA/RNA，加入1μL RNase A，37℃孵育10min后，取1μL反应液为模板；其中未消化组，是取10μL人咽拭子总DNA/RNA，加入1μL去离子水后，取1μL反应液为模板。
（4）qPCR反应体系总体积为20μL，其中2×Taq Mix 10μL，10μM正向引物（SEQ IDNO.1）0.4μL，10μM反向引物（SEQ ID NO.2）0.4μL，10μM探针（SEQ ID NO.3）0.2μL，加水补足20μL。qPCR反应条件为94℃ 1min预变性；94℃ 5s变性，60℃ 30s退火，45个循环。60℃采集VIC通道荧光信号。
RT-qPCR反应体系总体积为20μL，其中5×RT Mix 4μL，RT Enzyme Mix 1μL ，10μM正向引物（SEQ ID NO.1）0.4μL，10μM反向引物（SEQ ID NO.2）0.4μL，10μM探针（SEQ IDNO.3）0.2μL，模板1μL，加水补足20μL。RT-qPCR反应条件为55℃ 10min 逆转录，94℃ 2min预变性；94℃ 5s变性，60℃ 30s退火，45个循环。60℃采集VIC通道荧光信号。
扩增曲线由天隆Gentier96R实时荧光PCR仪自带分析软件获得。
实验结果见附图1~2。附图1为实施例1中引物和探针对人咽拭子总DNA/RNA模板的qPCR体系扩增曲线，曲线1是DNA酶消化组，曲线2是RNA酶消化组，曲线3是未消化组。附图2为实施例1中引物和探针对人咽拭子总DNA/RNA模板的RT-qPCR体系扩增曲线，曲线4是DNA酶消化组，曲线5是RNA酶消化组，曲线6是未消化组。
（5）琼脂糖凝胶电泳实验：配置3%浓度的琼脂糖凝胶，取5μL qPCR或RT-qPCR反应液，加入1μL 6×Loading Buffer，另取5μL DNA Marker作为对照，上样后进行电泳分析。
实验结果见附图3。附图3为实施例1中引物和探针对人咽拭子总DNA/RNA模板的qPCR体系和RT-qPCR体系扩增反应液的琼脂糖凝胶电泳图。其中L1~L3为qPCR体系扩增反应液泳道，L1是DNA酶消化组，L2是RNA酶消化组，L3是未消化组；其中L4~L6为RT-qPCR体系扩增反应液泳道，L4是DNA酶消化组，L5是RNA酶消化组，L6是未消化组。
（6）结果分析：
1.根据附图1，DNA酶消化组（曲线1）、RNA酶消化组（曲线2）、未消化组（曲线3）均未出现扩增曲线。由于在qPCR体系中，只有存在与引物和探针匹配的目标DNA才会扩增，而无法扩增RNA模板，说明实施例1中引物和探针由于成功避开假基因，没有对DNA模板产生扩增。
2.根据附图2，DNA酶消化组（曲线4）和未消化组（曲线6）均出现扩增曲线，由于在RT-qPCR体系中，既可以扩增目标DNA模板，又扩增目标RNA模板，说明在存在模板RNA模板的情况下，实施例1中引物和探针能够对β-actin基因RNA产生良好的扩增曲线；RNA酶消化组（曲线5）未出现扩增曲线，说明实施例1中引物和探针由于成功避开假基因，没有对DNA模板产生扩增。
3.根据附图3，泳道L1-L3为qPCR体系扩增反应液泳道，DNA酶消化组（泳道L1）、RNA酶消化组（泳道L 2）、未消化组（泳道L 3）均未出现扩增条带；泳道L4-L6为RT-qPCR体系扩增反应液泳道，DNA酶消化组（泳道L 4）和未消化组（泳道L 6）均出现扩增条带，RNA酶消化组（泳道L5）未出现扩增条带。以上条带均为100bp左右的特异性单一条带，结果与附图1和附图2中一致，进一步证明实验结果可靠性。
实施例2
实施例2设计了针对人类GAPDH基因RNA设计的引物和探针，首先利用NCBI查询其基因组序列，并在其基因组DNA序列上找出外显子和内含子，在文献中查找已有报道的假基因序列，与mRNA序列进行多序列比对，综合比对结果，避开mRNA序列上与假基因序列相似度高的位点，跨内含子设计引物和探针序列。
（1）其基因组序列如下，详见SEQ ID NO.8：
>NG_007073.2/1-10880Homosapiensglyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase(GAPDH),RefSeqGeneonchromosome12TCCTCATCTCCCCTTCCTGCAGACAGCTCCTCTCCTACATCACCAAGGACAAGCAGACAGAGAGCCTGGTGGAAAAGCTGTGTCAGCGGTTCCGCACATCCCGGTATGCTGCCCTCCCTGAGGGTTCTTTGTGCTGAGCGGGGCCCTGCAGGGGAGAAAGGCCCATCCCTCACCCCTTCAATGCCCCCACTGTGGCATCCCTGGGACTGGGGAGGCTGATGGGGAAGGTTGAGCCTTTACTAGCTGGATCTCCCAGTTCCTCACAAAGCCCTTCCTATCTGCAGAACTGAGCGGCAGCAGCGAGACCTGGCCTACTGTGTGTCACAGCTGCCCCTCACAGAGCGAGGCCTCCGTAAGATGCTTGACAATTTTGACTGTTTTGGAGACAAACTGTCAGATGAGTCCATCTTCAGTGCTTTTTTGTCAGTTGTAGGCAAGCTGCGACGTGGGGCCAAGCCTGAGGGCAAGGTGAGCAGCACAGGACACTTCAATGCCTGTTGGGTTCTGGGCTGGCTAAGACATCTGCCGGCCCTGGGCAGCATACGGCTCTTGCAGTCACCTTCCCGTCCTCCTTATCCCCAGCTGGGTTGCAACCAAATTGCCAGAGTGACCTAAGACCAGATCTTTGTCTCCAGTTCTTTTTTTATTACTCCAAAAACACAACCAAAGCAGCATCTCATCCAATTCTTGTTTGTTTGTTTTTAATAGTTTTTATTTTTCAGAGCAGTTTTAGGTTCAAAGCAAAATTGAGCAGAAAGTACAGGGAGTTCCCTTCTACCCCTTGCCCCTACACATCACAGCCTTCCCCACCTTCAACATCCTGCACCAGGGTGGCACATTTGTTACAGCTGAACCTACACTTACACATCATCTCCTAAAGTCATGGTTTACCTTGGAGTTCACTGCACGTAATGACATGTACCCACCATTGCAGTATCATACAGAAGAGTTTCACTGCCTTACAAATCCCCTGCACTCCACCTATTTATCCCTCTCTCCCCACAACCCCTGATCTTTTTACTGTTGCCATCACTTTGTCTTTTCCAGAATGTATCATTGGAATGATCCGGTATGGAGCCTTCTCACCTTGGCTTCTTAGTAATGTGCGTTTAAGGCCTCCATGTCTTCCATGGCCTTGTTTCTTTTTAATCAGAAGTAACTGTTTTCAGGCCTGCTCTGAATCTCCTTTTCTCCCTCCAGGCTATAATAGATGAATTTGAGCAGAAGCTTCGGGCCTGTCATACCAGAGGTTTGGATGGAATCAAGGAGCTTGAGATTGGCCAAGCAGGTAGCCAGAGAGCGCCATCAGCCAAGAAACCATCCACTGGTACGTAAGGCAGCCTGTGCGGGCGAGACCAGACTGGGCCCTCCCCTCCTGCAGTGATTTGTTTCTTCTTCTTTTTTAAATCACGTTTTCCTGCCTTTTCTAGGTTCTAGGTACCAGCCTCTGGCTTCTACAGCCTCAGACAATGACTTTGTCACACCAGAGCCCCGCCGTACTACCCGTCGGCATCCAAACACCCAGCAGCGAGCTTCCAAAAAGAAACCCAAAGTTGTCTTCTCAAGTGATGAGTCCAGTGAGGAAGGTATGATGCTCCCGCCTGTTCCCGGCCGAGAAGGCACACAGCTAGGGTGCAGAGGGCTGGTTTCCATAGGACCTGCTGCGGGGGCCTGAGTGTAGATGCTCTGCCCCACTGCCGCAGAAGGGCCTCTCCTGTACAGCTTGGATTTTATTTCTTCTGTGCGGTGTGGGATTGTCTCACTTGTTCTCTGATATCTATTTTTTCACCATCTTTGTGACTCAGCTTTTTCTTATTCCTTTAATTCTTTGCATAGATCTTTCAGCAGAGATGACAGAAGACGAGACACCCAAGAAAACAACTCCCATTCTCAGAGCATCGGCTCGCAGGCACAGATCCTAGGAAGTCTGTTCCTGTCCTCCCTGTGCAGGGTATCCTGTAGGGTGACCTGGAATTCGAATTCTGTTTCCCTTGTAAAATATTTGTCTGTCTCTTTTTTTTAAAAAAAAAAAAGGCCGGGCACTGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGCGATACCAAGGCGGGTGGATAACCTGAGGTAGGGAGTTCGAGACCAGCCTGACCAACATGGAGAAACCCCATCTCTACTAAAAATAAAAAATTAGCCGGGCGTATTGGCGTGCGCCTGTAATCCCAGCTACTCAAGAGGCTGAGGCAGGAGAATCGCCTGAACCCAGAGGCGGAGGTTGTAGTGAGCCGAAATCACACCATTGCACTCCAGCTTGGGCAACAATAGCGAACCTCCATCTCAAATTAAAAAAAAAATGCCTACACGCTCTTTAAAATGCAAGGCTTTCTCTTAAATTAGCCTAACTGAACTGCGTTGAGCTGCTTCAACTTTGGAATATATGTTTGCCAATCTCCTTGTTTTCTAATGAATAAATGTTTTTATATACTTTTAGACATTTTTTCCTAAGCTTGTCTTTGTTTCATCTTTCACATTAGCCCAGTTTCATGCAGCAGAGAGAGGGTTATCAGTGCAGAGAGAGATGAGTGAGCCCAGAGTCCTAGGGCCTGTCCCGGGATGGCAGATGAGCTTCCTGCCCCGTCACTGCCACCTTTCCCCTCTCAACCTCTGGACCCTGCACAGTGACCAGACAGCCTCTCTGGGGAGAATTATGCAGTGCCTAGGCTCCAGATCAGTGCTTCTGAACCGGGGGCAATTTTGTCTGCCAGAGGACATCTGACAACACCTGGGGCCTGTTTTGTTGTCATAGCCTATAGGGGAAGAATGCTACCAGCATTTGTGGGAAGAGGCCAGGGATGTGGCTCAACATCCTGCAGTGCACAGGATGGCCCCTCAACAAAGAATCACACGGCCCACAATGTCAATAGCGTCACAGTTGAGAAAACCTGCTCTAGACCAAGGGTTGCTTTCTGCCGTGTGCCTCACCCCACCCCCACTCGTGTTCCCTAATCCCATCTCCAAAGGTTGGCAGCAGACCGGCCCAGGCTCGTGGAAGTTCAGATCATGATCCCCTCCAGCTCTGCAGGAGACAAGACCTGTCTCCCAGCATTCCTCATTGTTCCCGGGTCTGCAGAGGGCGTGAGCTATGCTGCAGGCGGGCTGCCCCCTGAAGCCTGCGCACCCCTCTCCAGCTCCTCAAGTCTTCTCTGCTGAGTCACCTTCGAACCGGAGGCTGTGAGCTGGCTGTCGTGACCACACTGGTGCCTCTGCTGTCATGACAACAGCACACTACGTCAGTAGTGCTCCCTGGGCACTGAGCTCCCTCTTTGCGGGGAGAAGACAGTAATGAAAAATGACAAGCATGAGGCAGAGGGGAAGATCACGCTTGGGTGGTGCAGGAGCATGGAGGTGCTCTTAATGCTCTCAATGAGAAAGGGTTAACGGTCCTGGTTGCAGGAATAGCTGAGTCAGAGGTGGGGCTTCCTCCACTCCCCCACCCCACCCCTTTCACCATTAGGGACCTTCTTGCCTTGCTCTTGCTACTCTGCTCTGGGTGGTCATTGTGAAAAGCCCGCACCAACCATGCCAGTGGCAGCCAGACGAGGACACAGCCTGGCTCTGGGTCCCAGCAGGAAAGGCAATCCCAGAAAGGCAGGGTCAGGGACTGGAGTCCTGTGGGTGCTTTTTAAGCAAAGATTATCACCAGGCAGGCTAAACTTAGCAACCGGCTTTTAGCTAGAAGGGCAGGGGGCTGGTGTCAGGTTATGCTGGGCCAGCAAAGAGGCCCGGGATCCCCCTCCCATGCACCTGCTGATGGGCCAAGGCCACCCCACCCCACCCCCTTCCTTACAAGTGTTCAGCACCCTCCCATCCCACACTCACAAACCTGGCCCTCTGCCCTCCTACCAGAAGAATGGATCCCCTGTGGGAGGGGGCAGGGGACCTGTTCCCACCGTGTGCCCAAGACCTCTTTTCCCACTTTTTCCCTCTTCTTGACTCACCCTGCCCTCAATATCCCCCGGCGCAGCCAGTGAAAGGGAGTCCCTGGCTCCTGGCTCGCCTGCACGTCCCAGGGCGGGGAGGGACTTCCGCCCTCACGTCCCGCTCTTCGCCCCAGGCTGGATGGAATGAAAGGCACACTGTCTCTCTCCCTAGGCAGCACAGCCCACAGGTTTCCAGGAGTGCCTTTGTGGGAGGCCTCTGGGCCCCCACCAGCCATCCTGTCCTCCGCCTGGGGCCCCAGCCCGGAGAGAGCCGCTGGTGCACACAGGGCCGGGATTGTCTGCCCTAATTATCAGGTCCAGGCTACAGGGCTGCAGGACATCGTGACCTTCCGTGCAGAAACCTCCCCCTCCCCCTCAAGCCGCCTCCCGAGCCTCCTTCCTCTCCAGGCCCCCAGTGCCCAGTGCCCAGTGCCCAGCCCAGGCCTCGGTCCCAGAGATGCCAGGAGCCAGGAGATGGGGAGGGGGAAGTGGGGGCTGGGAAGGAACCACGGGCCCCCGCCCGAGGCCCATGGGCCCCTCCTAGGCCTTTGCCTGAGCAGTCCGGTGTCACTACCGCAGAGCCTCGAGGAGAAGTTCCCCAACTTTCCCGCCTCTCAGCCTTTGAAAGAAAGAAAGGGGAGGGGGCAGGCCGCGTGCAGCCGCGAGCGGTGCTGGGCTCCGGCTCCAATTCCCCATCTCAGTCGTTCCCAAAGTCCTCCTGTTTCATCCAAGCGTGTAAGGGTCCCCGTCCTTGACTCCCTAGTGTCCTGCTGCCCACAGTCCAGTCCTGGGAACCAGCACCGATCACCTCCCATCGGGCCAATCTCAGTCCCTTCCCCCCTACGTCGGGGCCCACACGCTCGGTGCGTGCCCAGTTGAACCAGGCGGCTGCGGAAAAAAAAAAGCGGGGAGAAAGTAGGGCCCGGCTACTAGCGGTTTTACGGGCGCACGTAGCTCAGGCCTCAAGACCTTGGGCTGGGACTGGCTGAGCCTGGCGGGAGGCGGGGTCCGAGTCACCGCCTGCCGCCGCGCCCCCGGTTTCTATAAATTGAGCCCGCAGCCTCCCGCTTCGCTCTCTGCTCCTCCTGTTCGACAGTCAGCCGCATCTTCTTTTGCGTCGCCAGGTGAAGACGGGCGGAGAGAAACCCGGGAGGCTAGGGACGGCCTGAAGGCGGCAGGGGCGGGCGCAGGCCGGATGTGTTCGCGCCGCTGCGGGGTGGGCCCGGGCGGCCTCCGCATTGCAGGGGCGGGCGGAGGACGTGATGCGGCGCGGGCTGGGCATGGAGGCCTGGTGGGGGAGGGGAGGGGAGGCGTGTGTGTCGGCCGGGGCCACTAGGCGCTCACTGTTCTCTCCCTCCGCGCAGCCGAGCCACATCGCTCAGACACCATGGGGAAGGTGAAGGTCGGAGTCAACGGGTGAGTTCGCGGGTGGCTGGGGGGCCCTGGGCTGCGACCGCCCCCGAACCGCGTCTACGAGCCTTGCGGGCTCCGGGTCTTTGCAGTCGTATGGGGGCAGGGTAGCTGTTCCCCGCAAGGAGAGCTCAAGGTCAGCGCTCGGACCTGGCGGAGCCCCGCACCCAGGCTGTGGCGCCCTGTGCAGCTCCGCCCTTGCGGCGCCATCTGCCCGGAGCCTCCTTCCCCTAGTCCCCAGAAACAGGAGGTCCCTACTCCCGCCCGAGATCCCGACCCGGACCCCTAGGTGGGGGACGCTTTCTTTCCTTTCGCGCTCTGCGGGGTCACGTGTCGCAGAGGAGCCCCTCCCCCACGGCCTCCGGCACCGCAGGCCCCGGGATGCTAGTGCGCAGCGGGTGCATCCCTGTCCGGATGCTGCGCCTGCGGTAGAGCGGCCGCCATGTTGCAACCGGGAAGGAAATGAATGGGCAGCCGTTAGGAAAGCCTGCCGGTGACTAACCCTGCGCTCCTGCCTCGATGGGTGGAGTCGCGTGTGGCGGGGAAGTCAGGTGGAGCGAGGCTAGCTGGCCCGATTTCTCCTCCGGGTGATGCTTTTCCTAGATTATTCTCTGGTAAATCAAAGAAGTGGGTTTATGGAGGTCCTCTTGTGTCCCCTCCCCGCAGAGGTGTGGTGGCTGTGGCATGGTGCCAAGCCGGGAGAAGCTGAGTCATGGGTAGTTGGAAAAGGACATTTCCACCGCAAAATGGCCCCTCTGGTGGTGGCCCCTTCCTGCAGCGCCGGCTCACCTCACGGCCCCGCCCTTCCCCTGCCAGCCTAGCGTTGACCCGACCCCAAAGGCCAGGCTGTAAATGTCACCGGGAGGATTGGGTGTCTGGGCGCCTCGGGGAACCTGCCCTTCTCCCCATTCCGTCTTCCGGAAACCAGATCTCCCACCGCACCCTGGTCTGAGGTTAAATATAGCTGCTGACCTTTCTGTAGCTGGGGGCCTGGGCTGGGGCTCTCTCCCATCCCTTCTCCCCACACACATGCACTTACCTGTGCTCCCACTCCTGATTTCTGGAAAAGAGCTAGGAAGGACAGGCAACTTGGCAAATCAAAGCCCTGGGACTAGGGGGTTAAAATACAGCTTCCCCTCTTCCCACCCGCCCCAGTCTCTGTCCCTTTTGTAGGAGGGACTTAGAGAAGGGGTGGGCTTGCCCTGTCCAGTTAATTTCTGACCTTTACTCCTGCCCTTTGAGTTTGATGATGCTGAGTGTACAAGCGTTTTCTCCCTAAAGGGTGCAGCTGAGCTAGGCAGCAGCAAGCATTCCTGGGGTGGCATAGTGGGGTGGTGAATACCATGTACAAAGCTTGTGCCCAGACTGTGGGTGGCAGTGCCCCACATGGCCGCTTCTCCTGGAAGGGCTTCGTATGACTGGGGGTGTTGGGCAGCCCTGGAGCCTTCAGTTGCAGCCATGCCTTAAGCCAGGCCAGCCTGGCAGGGAAGCTCAAGGGAGATAAAATTCAACCTCTTGGGCCCTCCTGGGGGTAAGGAGATGCTGCATTCGCCCTCTTAATGGGGAGGTGGCCTAGGGCTGCTCACATATTCTGGAGGAGCCTCCCCTCCTCATGCCTTCTTGCCTCTTGTCTCTTAGATTTGGTCGTATTGGGCGCCTGGTCACCAGGGCTGCTTTTAACTCTGGTAAAGTGGATATTGTTGCCATCAATGACCCCTTCATTGACCTCAACTACATGGTGAGTGCTACATGGTGAGCCCCAAAGCTGGTGTGGGAGGAGCCACCTGGCTGATGGGCAGCCCCTTCATACCCTCACGTATTCCCCCAGGTTTACATGTTCCAATATGATTCCACCCATGGCAAATTCCATGGCACCGTCAAGGCTGAGAACGGGAAGCTTGTCATCAATGGAAATCCCATCACCATCTTCCAGGAGTGAGTGGAAGACAGAATGGAAGAAATGTGCTTTGGGGAGGCAACTAGGATGGTGTGGCTCCCTTGGGTATATGGTAACCTTGTGTCCCTCAATATGGTCCTGTCCCCATCTCCCCCCCACCCCCATAGGCGAGATCCCTCCAAAATCAAGTGGGGCGATGCTGGCGCTGAGTACGTCGTGGAGTCCACTGGCGTCTTCACCACCATGGAGAAGGCTGGGGTGAGTGCAGGAGGGCCCGCGGGAGGGGAAGCTGACTCAGCCCTGCAAAGGCAGGACCCGGGTTCATAACTGTCTGCTTCTCTGCTGTAGGCTCATTTGCAGGGGGGAGCCAAAAGGGTCATCATCTCTGCCCCCTCTGCTGATGCCCCCATGTTCGTCATGGGTGTGAACCATGAGAAGTATGACAACAGCCTCAAGATCATCAGGTGAGGAAGGCAGGGCCCGTGGAGAAGCGGCCAGCCTGGCACCCTATGGACACGCTCCCCTGACTTGCGCCCCGCTCCCTCTTTCTTTGCAGCAATGCCTCCTGCACCACCAACTGCTTAGCACCCCTGGCCAAGGTCATCCATGACAACTTTGGTATCGTGGAAGGACTCATGGTATGAGAGCTGGGGAATGGGACTGAGGCTCCCACCTTTCTCATCCAAGACTGGCTCCTCCCTGCCGGGGCTGCGTGCAACCCTGGGGTTGGGGGTTCTGGGGACTGGCTTTCCCATAATTTCCTTTCAAGGTGGGGAGGGAGGTAGAGGGGTGATGTGGGGAGTACGCTGCAGGGCCTCACTCCTTTTGCAGACCACAGTCCATGCCATCACTGCCACCCAGAAGACTGTGGATGGCCCCTCCGGGAAACTGTGGCGTGATGGCCGCGGGGCTCTCCAGAACATCATCCCTGCCTCTACTGGCGCTGCCAAGGCTGTGGGCAAGGTCATCCCTGAGCTGAACGGGAAGCTCACTGGCATGGCCTTCCGTGTCCCCACTGCCAACGTGTCAGTGGTGGACCTGACCTGCCGTCTAGAAAAACCTGCCAAATATGATGACATCAAGAAGGTGGTGAAGCAGGCGTCGGAGGGCCCCCTCAAGGGCATCCTGGGCTACACTGAGCACCAGGTGGTCTCCTCTGACTTCAACAGCGACACCCACTCCTCCACCTTTGACGCTGGGGCTGGCATTGCCCTCAACGACCACTTTGTCAAGCTCATTTCCTGGTATGTGGCTGGGGCCAGAGACTGGCTCTTAAAAAGTGCAGGGTCTGGCGCCCTCTGGTGGCTGGCTCAGAAAAAGGGCCCTGACAACTCTTTTCATCTTCTAGGTATGACAACGAATTTGGCTACAGCAACAGGGTGGTGGACCTCATGGCCCACATGGCCTCCAAGGAGTAAGACCCCTGGACCACCAGCCCCAGCAAGAGCACAAGAGGAAGAGAGAGACCCTCACTGCTGGGGAGTCCCTGCCACACTCAGTCCCCCACCACACTGAATCTCCCCTCCTCACAGTTGCCATGTAGACCCCTTGAAGAGGGGAGGGGCCTAGGGAGCCGCACCTTGTCATGTACCATCAATAAAGTACCCTGTGCTCAACCAGTTACTTGTCCTGTCTTATTCTAGGGTCTGGGGCAGAGGGGAGGGAAGCTGGGCTTGTGTCAAGGTGAGACATTCTTGCTGGGGAGGGACCTGGTATGTTCTCCTCAGACTGAGGGTAGGGCCTCCAAACAGCCTTGCTTGCTTCGAGAACCATTTGCTTCCCGCTCAGACGTCTTGAGTGCTACAGGAAGCTGGCACCACTACTTCAGAGAACAAGGCCTTTTCCTCTCCTCGCTCCAGTCCTAGGCTATCTGCTGTTGGCCAAACATGGAAGAAGCTATTCTGTGGGCAGCCCCAGGGAGGCTGACAGGTGGAGGAAGTCAGGGCTCGCACTGGGCTCTGACGCTGACTGGTTAGTGGAGCTCAGCCTGGAGCTGAGCTGCAGCGGGCAATTCCAGCTTGGCCTCCGCAGCTGTGAGGTCTTGAGCACGTGCTCTATTGCTTTCTGTGCCCTCGTGTCTTATCTGAGGACATCGTGGCCAGCCCCTAAGGTCTTCAAGCAGGATTCATCTAGGTAAACCAAGTACCTAAAACCATGCCCAAGGCGGTAAGGACTATATAATGTTTAAAAATCGGTAAAAATGCCCACCTCGCATAGTTTTGAGGAAGATGAACTGAGATGTGTCAGGGTGACTTATTTCCATCATCGTCCTTAGGGGAACTTGGGTAGGGGCAAGGCGTGTAGCTGGGACCTAGGTCCAGACCCCTGGCTCTGCCACTGAACGGCTCAGTTGCTTTGGGCAGTTACTCCCGGGCCTCACTTTGCACGTGTGCTTACCTAGTGGAGACAAAAGTACATACCTCGGTAGAGCGCGCACGCCTGTAACCCCAGCACTTTGGGAGGCCAAGGTGGGTGTATCACCTGAGGTCAGGAGTTTGAGACCAGCCTGGCCAACATGGTGAAACTCCGTCTCTACTAAAATTACAAAAATCAGCCAGGCTTCATGGCACATGCCTATAGTCCCAGCTACAGGCATGCTGAAGCAGGAGAATCGCTTGCACCCCGGAGGCAGAGGCTGCAGTGAGCTGAGACCACACCACTGCACTCCAGCCTAGGCAACAGAGTATGAGACTCCATCTCAAAAAAAAAAAAAGTACCTACCTCAGAGTTCAAACTAGTGAATATTAGGAAGTGCTTGAGACAGTGACACCAAAGTGCACAATAAATACTCGCCAGTTTCATTATTATTAAAGAATCCATTTGAATGTCAGCTCAACACAGCCTCCTATACCGAGGCATTGTGAACCGCATCTCCCCAGCTTCTCCAGGCTTTTCCAAGAATCAGGGACACTGTAGCCTGTTGGTCTCAGTGTATGACAGACACGGAGGAAGCACATCTTTAGCTGATACTTAAACAGAGACCCTGAGCGCACATACACCCGCGCACACATGCATGGAGCTTCACCTTCTCTGTCATTCTGCAGTGACCAGGAGAGCAAGAGCTCCCACCTCCCTTCAAAACACTGTGCCCATCCCGGGCACTAAGGCCTCTTTAAAGCACGGCACCTCCACGAGGGAGGGCCACAGCCACATACACTCCACCTGGCAGGTGGACAGCGTGAGCACGTGGACCATAGCAGGGACAAGGTGCCCCGGCCAGCCCCAACGCCCTCTGCCGCTGACAGGGACAGAAGCCCTCTCCAGCTGCGTGTGCTGCAGAGGCCATGCGTAGCCTCCAGCTGCATTCTATTCCACTCCAGTGCCTGGGCCAGTTAGCACCAGTGTGGAAGACAGTGAGCTGGCTCCGGACAACAGGGATGGAGGAAAGGTCCCACATTCACATTCCTGATACGTGGACAAGGTGAGGGGCCGCAATCGCTCTGGCAGCATTTTAAAGATGGGGAAGTAGCAGACACCCACGCGTGAAGGCAGGAGAGCCCCAACTGTGGTGGAAATGGCCCCAGAATGGTAGGGCCAAGCCTAGCTCCAGACACCCCAGAGCCCTGGAGAAGCCAAGACTGAGGGAGAAAGCCTGAGGGAGGAGCGCCCCAGTCCCCA
（2）GAPDH基因引物与探针如下：
正向引物（SEQ ID NO.4）：5’-GACAGTCAGCCGCATCTTC-3’
反向引物（SEQ ID NO.5）：5’-CAGAGTTAAAAGCAGCCCTGG-3’
探针（SEQ ID NO.6）：
5’-ROX-TGCGTCGCCAGCCGAGCCACATCGCT-BHQ2-3’
（3）实施例2中采用的模板为商业试剂盒提取的人咽拭子总DNA/RNA。其中DNA酶消化组，是取10μL人咽拭子总DNA/RNA，加入1μL DNase Ⅰ，37℃孵育10min后， 85℃孵育10min，取1μL反应液为模板；其中RNA酶消化组，是取10μL人咽拭子总DNA/RNA，加入1μLRNase A，37℃孵育10min后，取1μL反应液为模板；其中未消化组，是取10μL人咽拭子总DNA/RNA，加入1μL去离子水后，取1μL反应液为模板。
（4）qPCR反应体系总体积为20μL，其中2×Taq Mix 10μL，10μM正向引物（SEQ IDNO.4）0.4μL，10μM反向引物（SEQ ID NO.5）0.4μL，10μM探针（SEQ ID NO.6）0.2μL，加水补足20μL。qPCR反应条件为94℃ 1min预变性；94℃ 5s变性，60℃ 30s退火，45个循环。60℃采集ROX通道荧光信号。
RT-qPCR反应体系总体积为20μL，其中5×RT Mix 4μL，RT Enzyme Mix 1μL ，10μM正向引物（SEQ ID NO.4）0.4μL，10μM反向引物（SEQ ID NO.5）0.4μL，10μM探针（SEQ IDNO.6）0.2μL，模板1μL，加水补足20μL。RT-qPCR反应条件为55℃ 10min 逆转录，94℃ 2min预变性；94℃ 5s变性，60℃ 30s退火，45个循环。60℃采集ROX通道荧光信号。
扩增曲线由天隆Gentier96R实时荧光PCR仪自带分析软件获得。
实验结果见附图4~5。附图4为实施例2中引物和探针对人咽拭子总DNA/RNA模板的qPCR体系扩增曲线，曲线1是DNA酶消化组，曲线2是RNA酶消化组，曲线3是未消化组。附图5为实施例2中引物和探针对人咽拭子总DNA/RNA模板的RT-qPCR体系扩增曲线，曲线4是DNA酶消化组，曲线5是RNA酶消化组，曲线6是未消化组。
（5）琼脂糖凝胶电泳实验：配置3%浓度的琼脂糖凝胶，取5μL qPCR或RT-qPCR反应液，加入1μL 6×Loading Buffer，另取5μL DNA Marker作为对照，上样后进行电泳分析。
实验结果见附图6。附图6为实施例2中引物和探针对人咽拭子总DNA/RNA模板的qPCR体系和RT-qPCR体系扩增反应液的琼脂糖凝胶电泳图。其中L1~L3为qPCR体系扩增反应液泳道，L1是DNA酶消化组，L2是RNA酶消化组，L3是未消化组；其中L4~L6为RT-qPCR体系扩增反应液泳道，L4是DNA酶消化组，L5是RNA酶消化组，L6是未消化组。
（6）结果分析：
1.根据附图4，DNA酶消化组（曲线1）、RNA酶消化组（曲线2）、未消化组（曲线3）均未出现扩增曲线。由于在qPCR体系中，只有存在与引物和探针匹配的目标DNA才会扩增，而无法扩增RNA模板，说明实施例2中引物和探针由于成功避开假基因，没有对DNA模板产生扩增。
2.根据附图5，DNA酶消化组（曲线4）和未消化组（曲线6）均出现扩增曲线，由于在RT-qPCR体系中，既可以扩增目标DNA模板，又扩增目标RNA模板，说明在存在模板RNA模板的情况下，实施例2中引物和探针能够对GAPDH基因RNA产生良好的扩增曲线；RNA酶消化组（曲线5）未出现扩增曲线，说明实施例2中引物和探针由于成功避开假基因，没有对DNA模板产生扩增。
3.根据附图6，泳道L1-L3为qPCR体系扩增反应液泳道，DNA酶消化组（泳道L1）、RNA酶消化组（泳道L 2）、未消化组（泳道L 3）均未出现扩增条带；泳道L4-L6为RT-qPCR体系扩增反应液泳道，DNA酶消化组（泳道L 4）和未消化组（泳道L 6）均出现扩增条带，RNA酶消化组（泳道L5）未出现扩增条带。以上条带均为100bp左右的特异性单一条带，结果与附图4和附图5中一致，进一步证明实验结果可靠性。
对比例1
（1）对比例1采用了某商业试剂盒中针对β-actin基因RNA设计的引物和探针，但引物和探针序列未知。
（2）对比例1中采用的模板为商业试剂盒提取的人咽拭子总DNA/RNA。其中DNA酶消化组，是取10μL人咽拭子总DNA/RNA，加入1μL DNase Ⅰ，37℃孵育10min后， 85℃孵育10min，取1μL反应液为模板；其中RNA酶消化组，是取10μL人咽拭子总DNA/RNA，加入1μLRNase A，37℃孵育10min后，取1μL反应液为模板；其中未消化组，是取10μL人咽拭子总DNA/RNA，加入1μL去离子水后，取1μL反应液为模板。
（3）qPCR反应体系总体积为20μL，其中2×Taq Mix 10μL，引物和探针Mix 1μL，加水补足20μL。qPCR反应条件为94℃ 1min预变性；94℃ 5s变性，60℃ 30s退火，45个循环。60℃采集VIC通道荧光信号。
RT-qPCR反应体系总体积为20μL，其中5×RT Mix 4μL，RT Enzyme Mix 1μL ，引物和探针Mix 1μL，模板1μL，加水补足20μL。RT-qPCR反应条件为55℃ 10min 逆转录，94℃2min预变性；94℃ 5s变性，60℃ 30s退火，45个循环。60℃采集VIC通道荧光信号。
扩增曲线由天隆Gentier96R实时荧光PCR仪自带分析软件获得。
实验结果见附图7~8。附图7为对比例1中引物和探针对人咽拭子总DNA/RNA模板的qPCR体系扩增曲线，曲线1是DNA酶消化组，曲线2是RNA酶消化组，曲线3是未消化组。附图8为对比例2中引物和探针对人咽拭子总DNA/RNA模板的RT-qPCR体系扩增曲线，曲线4是DNA酶消化组，曲线5是RNA酶消化组，曲线6是未消化组。
（4）琼脂糖凝胶电泳实验：配置3%浓度的琼脂糖凝胶，取5μL qPCR或RT-qPCR反应液，加入1μL 6×Loading Buffer，另取5μL DNA Marker作为对照，上样后进行电泳分析。
实验结果见附图9。附图9为对比例1中引物和探针对人咽拭子总DNA/RNA模板的qPCR体系和RT-qPCR体系扩增反应液的琼脂糖凝胶电泳图。其中L1~L3为qPCR体系扩增反应液泳道，L1是DNA酶消化组，L2是RNA酶消化组，L3是未消化组；其中L4~L6为RT-qPCR体系扩增反应液泳道，L4是DNA酶消化组，L5是RNA酶消化组，L6是未消化组。
（5）结果分析：
1.根据附图7，DNA酶消化组（曲线1）未出现扩增曲线，RNA酶消化组（曲线2）和未消化组（曲线3）均出现扩增曲线。由于在qPCR体系中，只有存在与引物和探针匹配的目标DNA才会扩增，而无法扩增RNA模板，说明对比例1中引物和探针由于并未避开假基因，从而对假基因DNA产生扩增。
2.根据附图8，DNA酶消化组（曲线4）和未消化组（曲线6）均出现扩增曲线，由于在RT-qPCR体系中，既可以扩增目标DNA模板，又扩增目标RNA模板，说明在存在模板RNA模板的情况下，对比例1中引物和探针能够对β-actin基因RNA产生扩增曲线；RNA酶消化组（曲线5）也出现扩增曲线，说明对比例1中引物和探针由于没有避开假基因，从而对假基因DNA产生扩增。
3.根据附图9，泳道L1-L3为qPCR体系扩增反应液泳道，DNA酶消化组（泳道L1）未出现扩增曲线，RNA酶消化组（泳道L 2）和未消化组（泳道L 3）均出现扩增条带；泳道L4-L6为RT-qPCR体系扩增反应液泳道，DNA酶消化组（泳道L 4）、RNA酶消化组（泳道L5）和未消化组（泳道L 6）均出现扩增条带。以上条带均为100bp左右的特异性单一条带，结果与附图7和附图8中一致，进一步证明实验结果可靠性。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，应当指出的是，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.避免RNA检测过程中假基因干扰的引物和探针组合设计方法，其特征在于，具体包括如下步骤：通过在NCBI数据库中查找目的基因的基因组DNA序列和mRNA序列，并通过DNA和mRNA序列比对在其基因组DNA序列上找出外显子和内含子，在文献中查找已有报道的假基因序列，与mRNA序列进行多序列比对，综合比对结果，避开mRNA序列上与假基因序列相似度90%以上的位点设计引物探针，设计规则如下：
a. 当内含子长度在500bp以下时，引物和探针的其中一条序列的配对区域必须横跨两个外显子；当引物的配对区域横跨两个外显子时，此引物的3’端与其中一个外显子配对的长度不超过10bp；
b. 当内含子长度在500bp以上时，引物和探针的配对区域不需要横跨两个外显子；当引物的配对区域没有横跨两个外显子时，两条引物必须分别与两个外显子互补配对；当引物的配对区域横跨两个外显子时，此引物的3’端与其中一个外显子配对的长度不超过10bp；
目的基因为人类管家基因；其中，探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团或MGB。
2.根据权利要求1所述的避免RNA检测过程中假基因干扰的引物和探针组合设计方法，其特征在于：假基因是指通过mRNA逆转录并整合到基因组，在进化过程中产生变异从而丧失正常基因功能的序列。
3.根据权利要求1所述的避免RNA检测过程中假基因干扰的引物和探针组合设计方法，其特征在于：所述荧光报告基团为荧光修饰基团，包括FAM、VIC、HEX、CY3、NED、TXR、ROX、CY5中的任意一种。
4.根据权利要求3所述的避免RNA检测过程中假基因干扰的引物和探针组合设计方法，其特征在于：所述荧光淬灭基团为淬灭修饰基团，包括TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3和QSY中的任意一种。
5.避免RNA检测过程中假基因干扰的引物和探针组合，其特征在于：包括权利要求1-4中任意一项所述的避免RNA检测过程中假基因干扰的引物和探针组合设计方法制备的针对人类β-actin基因RNA设计的引物和探针组合，针对人类GADPH基因RNA设计的引物和探针组合中至少一种，具体序列如下所示：
针对人类β-actin基因RNA设计的引物和探针组合序列如下：
SEQ ID NO.1：5’-TCTGCCTGACATGAGGGTTAC-3’；
SEQ ID NO.2：5’-TCCATGCCTGAGAGGGAAATG-3’；
SEQ ID NO.3：5’-VIC-CCCTCGGGGCTGTGCTGTGGAAGCT-BHQ1-3’；
针对人类GADPH基因RNA设计的引物和探针组合序列如下：
SEQ ID NO.4：5’- GACAGTCAGCCGCATCTTC-3’；
SEQ ID NO.5：5’- CAGAGTTAAAAGCAGCCCTGG-3’；
SEQID NO.6：5’-ROX- TGCGTCGCCAGCCGAGCCACATCGCT-BHQ2-3’。
6.根据权利要求5所述的避免RNA检测过程中假基因干扰的引物和探针组合，其特征在于：针对人类β-actin基因RNA设计的引物和探针，基因组序列如SEQ ID NO.7所示；
β-actin基因引物与探针如下：
正向引物（SEQ ID NO.1）：5’-TCTGCCTGACATGAGGGTTAC-3’；
反向引物（SEQ ID NO.2）：5’-TCCATGCCTGAGAGGGAAATG-3’；
探针（SEQ ID NO.3）：5’-VIC-CCCTCGGGGCTGTGCTGTGGAAGCT-BHQ1-3’；
具体方法如下：采用试剂盒提取的人咽拭子总DNA/RNA，
其中，DNA酶消化组，是取10μL人咽拭子总DNA/RNA，加入1μL DNase Ⅰ，37℃孵育10min后， 85℃孵育10min，取1μL反应液为模板；其中RNA酶消化组，是取10μL人咽拭子总DNA/RNA，加入1μL RNase A，37℃孵育10min后，取1μL反应液为模板；其中未消化组，是取10μL人咽拭子总DNA/RNA，加入1μL去离子水后，取1μL反应液为模板；
qPCR反应体系总体积为20μL，其中2×Taq Mix 10μL，10μM正向引物（SEQ ID NO.1）0.4μL，10μM反向引物（SEQ ID NO.2）0.4μL，10μM探针（SEQ ID NO.3）0.2μL，加水补足20μL；
qPCR反应条件为94℃ 1min预变性；94℃ 5s变性，60℃ 30s退火，45个循环，60℃采集VIC通道荧光信号。
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