CN104164478A

CN104164478A - 一种基因单碱基变异的cras-pcr检测方法

Info

Publication number: CN104164478A
Application number: CN201410107860.5A
Authority: CN
Inventors: 黄庆; 府伟灵; 张阳; 杨昭; 黄君富; 夏涵
Original assignee: First Affiliated Hospital of TMMU
Current assignee: Third Military Medical University TMMU; First Affiliated Hospital of TMMU
Priority date: 2014-03-21
Filing date: 2014-03-21
Publication date: 2014-11-26

Abstract

本发明提供了一种基因单碱基变异的CRAS-PCR检测方法。在该检测方法中，同时使用了能够特异性识别单碱基变异野生型和突变型核酸序列的单链型或双链型等位基因特异性蝎形引物，以及等位基因特异性蝎形引物的共用引用。通过分析PCR扩增过程中各个竞争性等位基因特异性蝎形引物所产生的荧光信号种类与强度，可在单个PCR反应管内定性和定量检测单碱基变异的不同基因型，检测结果准确可靠，并且具有良好的线性范围和灵敏度，无非特异性扩增所导致的假阳性结果，也能完全避免假阴性结果。

Description

一种基因单碱基变异的CRAS-PCR检测方法

技术领域

本发明属生命科学和生物技术领域，是一种基因单碱基变异(即：基因型)的检测方法，可以对基因的单核苷酸多态性和单碱基突变等基因型进行准确检测。

背景技术

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNP)是指基因组DNA序列中某个特定碱基发生了转换、颠换、缺失和插入等变化而引起的序列多态性，而且，任何一种等位基因的群体频率不小于1%。SNP在人类基因组中分布广泛，并且，某些SNP可直接影响蛋白质功能和遗传稳定性等。对基因组SNP的分析是研究个体、系谱和人种特征、疾病风险预测和预防、多种疾病个体化治疗的重要线索。据估计，大约有10⁵个SNP分子标记被用于基因功能及疾病相关性的关联研究。2001个，SNP协会(The SNP Consortium)构建了1.42x10⁶个SNP、密度达到1个SNP/1.9kb的人类遗传图谱，这对开展致病基因的定位和人类起源与进化研究非常重要。基因点突变(genetic point mutations)是指基因组DNA序列中某个特定碱基突然发生的、可遗传的变异现象。从分子水平上看，基因点突变同样包括某个特定碱基的转换、颠换、缺失和插入等变化。基因虽然稳定，能在细胞分裂时精确地复制自己，但这种稳定性是相对的，在一定条件下的基因也可从原来存在的形式突变改变成另一种新的存在形式，就是在一个位点上，突然出现了一个新基因，代替了原有基因，这种基因叫做突变基因，于是后代的表现中也就突然地出现在祖先从未有的新性状。SNP与基因点突变的区别在于：多态性是一个群体性概念，多态性在群体中的频率不小于1%，否则就叫突变(小于1%)；SNP是多态性中的一种，只是进一步限定了差异是单碱基；一般来说，SNP是全部体细胞一样的基因型，而基因突变则往往只是部分体细胞或少量体细胞的变化；如果突变发生在生殖细胞，则可以遗传，但是，只要这个突变群没有达到总群体的1%，它就只是一个突变株/系，达到1%就是多态性了。可见，SNP和基因点突变均是基因组DNA特定碱基发生了转换、颠换、缺失和插入等变化，二者在基因组DNA序列的变化上具有共性，只是二者在群体中具有不同的发生频率，前者不小于1%，后者则小于1%。正是由于SNP和基因点突变在序列变化上的相似性，因此，SNP和基因点突变统称为基因变异(genetic variations)或基因单碱基变异(genetic single-base variations)。但是，在文献报道中，SNP也往往被部分研究者称之为基因突变。SNP及基因点突变等基因单碱基变异与人类多种疾病的发生、发展和预后相关，目前，上述基因单碱基变异的检测已经广泛应用于疾病预防和预测、个体化治疗、预后判断等生命科学的多个领域，在上述应用领域中，基因单碱基变异检测技术的方法学特征，如准确度、特异性、灵敏度和线性范围等方法学参数直接决定其临床实际应用价值。

目前，基因单碱基变异检测的基本方法已多达20余种，根据其基本检测原理，可分为DNA链构象分析、限制性内切酶片段分析、等位基因特异性PCR(allele-specific PCR，AS-PCR)、核酸测序、生物芯片与生物传感器等技术。上述各种检测原理均演变出多种方法，每种方法均具有各自的优缺点。例如，基于DNA链构象变化的单链构象多态性(PCR-SSCP)和变性高效能液相层析(Denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC)等方法的优点在于检测成本低，适用于大样本筛选。但是，上述方法操作烦琐，需要PCR扩增和凝胶电泳等多个步骤，易导致样本交叉污染；DNA片段长度增加，检测灵敏度急剧下降；易出现假阴性和假阳性结果；无法获得碱基变异的具体位置和碱基变异类型，必须通过后续技术手段确认上述变异信息(如：核酸测序)。核酸测序、生物芯片和生物传感器等技术则需要事先对待分析物进行PCR扩增，同时，存在检测成本高或通量低等问题。限制片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)为代表的限制性内切酶片段分析方法则受到限制性内切酶位点存在与否的限制，同时需要凝胶电泳方式判断结果。在上述多种检测方法中，AS-PCR方法是最常用的方法之一。

AS-PCR方法检测基因型的基本技术原理主要有两类，分别是等位基因特异性引物(allele-specific primers)和等位基因特异性探针(allele-specific probes)。

依赖于等位基因特异性引物的AS-PCR通过等位基因特异性引物扩增产物的有无来判断是否存在相应的基因型，该方法最初被称之为扩增阻滞突变系统(amplification refractory mutation system, ARMS)或序列特异性引物PCR(PCR with sequence specific primers, PCR-SSP)(Newton CR, et al. Analysis of any point mutation in DNA. The amplification refractory mutation system (ARMS). Nucleic Acids Res. 1989; 17(7): 2503-16; Wu DY, et al. Allele-specific enzymatic amplification of beta-globin genomic DNA for diagnosis of sickle cell anemia. Proc Natl Acad Sci USA. 1989; 86(8):2757-60; Sommer SS, et al. A novel method for detecting point mutations or polymorphisms and its application to population screening for carriers of phenylketonuria. Mayo Clin Proc. 1989; 64(11): 1361-72)。等位基因特异性引物的设计是ARMS技术特异性识别基因型的关键所在，其特征是通过等位基因特异性引物3'-末端碱基识别基因型。理论上，当等位基因特异性引物与特定基因型完全匹配时才能产生扩增产物，而对于其它基因型，则由于3'-末端碱基的错配而无法形成扩增产生。但是，由于不同基因型之间仅存在一个碱基的差异，等位基因特异性引物往往会产生非特异性扩增，即其它基因型也会产生扩增产物，从而产生假阳性结果。同时，由于不同基因型的扩增产物片段大小基本一致，因此，不同的基因型往往都需要一个独立的PCR反应管。尽管采用高保真耐热DNA聚合酶、在等位基因特异性引物3'-末端倒数第2位或第3位碱基进一步引入错配碱基、提高退退火温度等技术能够在一定程度上缓解等位基因特异性引物3'-末端碱基错配所导致的非特异性扩增，但是，非特异性扩增往往都难以避免。同时，由于PCR扩增体系中的耐热DNA聚合酶的热动力学特征，即总是努力试图扩增出产物，因此，当反应体系中存在与等位基因特异性引物不相匹配的靶分子时，等位基因特异性引物极易产生非特异性扩增。可以说，耐热DNA聚合酶的上述热动力学特征是ARMS技术产生非特异性扩增的根本原因之一。

依赖于等位基因特异性探针的AS-PCR技术通常应用了实时荧光PCR技术。该PCR扩增体系中的引物不具备等位基因特异性，因此能够扩增所有基因型，基因型的识别依赖于等位基因特异性探针(Livak KJ. Allelic discrimination using fluorogenic probes and the 5' nuclease assay. Genet Anal. 1999 Feb;14(5-6):143-9.)。例如，等位基因特异性探针通常在其5'-和3'-末端分别标记荧光报告基团(reporter)和淬灭基团(quencher；即：TaqMan探针，也叫水解探针(hydrolysis probes)；Livak KJ, et al. Oligonucleotides with fluorescent dyes at opposite ends provide a quenched probe system useful for detecting PCR product and nucleic acid hybridization. PCR Methods Appl. 1995; 4: 357-62. Bustin SA, et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 2009; 55: 611-622)。当检测体系中存在相应的基因型时，等位基因特异性探针与特定基因型扩增产物形成分子间杂交，随后被Taq DNA聚合酶5'->3'外切酶活性水解而产生荧光信号，反之则不产生。由于不同基因型之间仅有一个碱基的差异，等位基因特异性探针极易与其它基因型产生非特异性杂交而产生荧光信号，最终导致其它基因型的假阳性结果。但是，该技术的非特异性荧光信号，或者说假阳性率仍然较高，往往需要对探针进行特定的修饰(如引入锁核酸(locked nucleic acids, LNA)、DNA小沟结合物(minor groove binder, MGB)和特定的分析软件才能够较为准确地分析基因型。

蝎形引物(scorpion primer)是在发夹式引物(sunrise primer; Nazarenko IA, et al. A closed tube format for amplification and detection of DNA based on energy transfer. Nucleic Acids Res. 1997; 25:2516-21)和分子信标(molecular beacon; Tyagi S, et al. Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization. Nat Biotechnol. 1996; 14:303-8)基础上演变出来的一种实时荧光定量PCR技术(Mackay J, et al. Real-time PCR fluorescent chemistries. Methods Mol Biol. 2007;353:237-61.)。蝎形引物由两部分构成，分别是3'-端的引物序列区和5'-端具有分子信标结构与特性的探针序列区，引物序列区与探针序列区之间用PCR阻断剂(PCR blocker)连接(如：聚六乙二醇(hexaethylene glycol, HEG)、C3(三个碳原子的碳链，其长度相当于一个碱基))，以阻止PCR产物沿探针序列延伸。探针序列区呈亚稳定状态的茎环结构。在游离状态时，探针序列区茎部结构的5'-末端和3'-末端分别标记的荧光报告基因和淬灭基团在荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)作用下不产生荧光信号。在引物延伸阶段，探针序列区的环状序列与引物的3'-末端延伸产物形成分子内杂交双链，从而使原有的茎部结构被破坏而释放荧光信号。可见，蝎形具有引物和探针双重功能：引物延伸产生扩增产物，探针环部与引物延伸片段以分子内杂交的形式结合在扩增产物内部，并导致其茎环结构解体而释放荧光信号。由于每个PCR扩增产物均带有一个荧光探针，因此，一个延伸产物只能对应于一个荧光基团，从而解决了待检测模板的定量问题。但是，该技术依然会产生非特异性扩增现象，假阳性率仍然较高。

综上所述，耐热DNA聚合酶的热动力学特征是导致AS-PCR产物非特异性扩增的根本原因之一，在无法完全抑制非特异性扩增的前提下，存在假阳性检测结果，最终导致现有的基因型检测缺乏可靠性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种能够完全抑制AS-PCR非特异性扩增，在单个反应管内特异性平行检测单碱基变异的所有基因型，从而确保检测结果准确性的单管竞争性等位基因特异性蝎形引物实时荧光AS-PCR检测方法。同时将这种方法称之为竞争性实时荧光等位基因特异性PCR(competitive real-time fluorescent AS-PCR, CRAS-PCR)。

为解决上述技术问题，本发明提供以下技术方案：

一种基因单碱基变异的CRAS-PCR检测方法，其检测体系中包括野生型和突变型等位基因特异性蝎形引物、上述等位基因特异性蝎形引物的共用引物，其特征在于：

野生型和突变型基因的等位基因特异性蝎形引物具有相同的3'-端延伸或扩增方向；

野生型和突变型基因的等位基因特异性蝎形引物和共用引物存在于同一个反应体系中；

野生型和突变型基因的等位基因特异性蝎形引物3'-末端与其基因型序列完全匹配，并通过此3'-末端识别基因型。

1.根据蝎形引物原理设计单碱基变异基因的野生型和突变型序列的等位基因特异性蝎形引物(如：TPMT*2(dbSNP ID: rs1142345)野生型基因对应的SEQ No. 1；TPMT*2突变型基因对应的SEQ No. 2)，并且，每种基因型所对应的等位基因特异性蝎形引物均靶向待测基因的同一条模板链(即：同时靶向正链或负链；或者说具有相同的3'-端延伸方向)，且分别标记有不同颜色的荧光报告基团及其对应的淬灭基团(图1；SEQ No. 1；SEQ No. 2)，用于实时荧光PCR过程中实时定性和定量判断单碱基变异的基因型(图2，图3)。上述野生型和突变型基因对应的蝎形引物在本发明中被称之为等位基因特异性蝎形引物。等位基因特异性蝎形引物的特征是通过其3'-末端碱基识别基因型：当引物与特定基因型完全匹配时才能产生扩增产物并释放荧光信号，而对于其它基因型，则由于3'-末端碱基的错配而无法形成扩增产物。等位基因特异性蝎形引物具有引物和探针双重功能：引物延伸产生扩增产物，探针与引物延伸片段以分子内杂交的形式结合在扩增产物内部，并导致探针释放其荧光报告基团的荧光信号。由于不同基因型对应的等位基因特异性蝎形引物标记有不同的荧光报告基团，因此，当单碱基变异的所有基因型对应的等位基因特异性蝎形引物置于同一个PCR反应管时，可以通过其探针释放的荧光信号种类和丰度实现单个反应管内同时定性和定量检测单碱基变异的所有基因型。

SEQ No. 1

(CY5) ACCGCGC CACCAACTACACTGTGTCCC GCGCGGT (BHQ2)(HEG)AATGTATGATTTTATGCAGGTTAG

SEQ No. 2

(FAM) ACCGCGC CACCAACTACACTGTGTCCC GCGCGGT (BHQ1)(HEG)GTATGATTTTATGCAGGTTCC

SEQ No. 3

TACCCAAATCAAAACAAACC

具体而言，本发明所述等位基因特异性蝎形引物具有下述共性：

⑴等位基因特异性蝎形引物是一条单链DNA，在本发明中，将其称之为单链型等位基因特异性蝎形引物(图1-4)。单链型等位基因特异性蝎形引物由两部分构成，分别是3'-端的引物序列区(图1绿色线条)和5'-端具有分子信标结构与特性的探针序列区(图1红色和蓝色线条)，并且，引物序列区与探针序列区之间用PCR阻断剂连接，以阻止PCR产物沿探针序列区延伸(图1)。探针序列区呈亚稳定状态的茎环结构，其中，环部(loop)序列(图1红色线条)与引物序列区3'-端延伸产物互补，可与其3'-端延伸产物形成分子内杂交双链(图2)。探针序列区的茎部(stem)序列(图1蓝色线条)完全互补(图1)，但与待检核酸模板无序列同源性，其茎部5'-末端和3'-末端分别标记荧光报告基团和淬灭基团(图1)。当引物序列区无3'-端延伸产物时，探针序列区呈亚稳定状态的茎环结构，其茎部结构使5'-末端荧光报告基团和3'-末端淬灭基团紧密相邻，5'-末端荧光报告基团在吸收能量后FRET方式将能量转移给邻近的3'-末端淬灭基团，因此，5'-末端荧光报告基团受到3'-末端淬灭基团的制约而不能发出荧光。当引物序列区有3'-端延伸产物时，在PCR 复性阶段，探针序列区的环部序列与延伸产物结合，形成更稳定的分子内杂交体，从而破坏了茎部结构产生的FRET，3'-末端淬灭基团的淬灭作用被解除，5'-末端荧光基团的发出可被检测荧光信号(图3)。随着每次扩增产物的积累，荧光强度增加，可反映出每次扩增产物积累的量。因此，将野生型和突变型基因对应的等位基因特异性蝎形引物置于同一个反应管时，就可通过上述等位基因特异性蝎形引物在PCR过程中荧光信号的种类和强弱判断基因型的种类和丰度(图3,图4)。

⑵或者，等位基因特异性蝎形引物是一条部分双链DNA，在本发明中，将其称之为双链型等位基因特异性蝎形引物(图5-7)。在此情况下，引物由部分完全互补的两条单链DNA组成(图5)：较短的一条单链DNA在本发明中被称之为探针淬灭单体(图5蓝色线条)；较长的一条单链DNA在本发明中被称之为探针-引物序列单体(图5红色和绿色线条)。探针淬灭单体的3'-末端标记有淬灭基团；探针-引物序列单体的5'-末端标记有荧光报告基团，并且，在其探针序列区(图5中红色线条)和引物序列区(图5绿色线条)之间用PCR阻断剂连接，以阻止PCR产物沿探针序列区延伸(图5, 图6)。探针-引物序列单体的探针序列区与引物序列区3'-端延伸产物互补，可与引物3'-端延伸产物形成分子内杂交双链；引物序列区的碱基序列具有等位基因特异性，与特定基因型的碱基序列互补，从而可以选择性地扩增其对应的基因型序列(图6, 图7)。探针淬灭单体的碱基序列与探针-引物序列单体的探针序列区5'-端部分序列完全互补，且探针淬灭单体的碱基序列比探针-引物序列单体的探针序列区碱基序列少4～10个碱基(图5)。当引物序列区无3'-端延伸产物时，探针淬灭单体与探针-引物单体的探针序列区呈亚稳定状态的茎状结构，探针淬灭单体的3'-末端淬灭基团与探针-引物序列单体的5'-末端荧光报告基团紧密相邻，荧光报告基团在吸收能量后FRET方式将能量转移给邻近的淬灭基团，因此，5'-末端荧光报告基团受到3'-末端淬灭基团的制约而不能发出荧光(图6A)。当引物序列区有3'-端延伸产物时，在PCR 复性阶段，探针序列区的探针序列区序列与延伸产物结合，形成更稳定的分子内杂交体，从而破坏了茎状结构产生的FRET，探针淬灭单体3'-末端淬灭基团的淬灭作用被解除，探针-引物序列单体5'-末端荧光基团的发出可被检测荧光信号(图6B)。随着每次扩增产物的积累，荧光强度增加，可反映出每次扩增产物积累的量。因此，将野生型和突变型基因对应的等位基因特异性蝎形引物置于同一个反应管时，就可通过上述等位基因特异性蝎形引物在PCR过程中荧光信号的种类和强弱判断基因型的种类和丰度(图6,图7)。

⑶本发明所述的等位基因特异性蝎形引物具有探针和引物的双重功能。等位基因特异性蝎形引物的探针序列区行使探针功能，通过与引物序列区3'-端延伸产物形成分子内杂交体而释放荧光信号；引物序列区行使引物功能，其碱基序列与对应的基因型序列互补，并通过其3'-末端碱基识别基因型，同时，为了进一步提高等位基因特异性蝎形引物的扩增特异性，可以在其3'-末端碱基倒数第二位和/或第三位引入错配碱基，或者，进一步采用包括硫代碱基、锁核酸(locked nucleic acids, LNA)和肽核酸(peptide nucleic acids, PNA)在内的修饰碱基。

⑷上述等位基因特异性蝎形引物中所用到的荧光报告基团包括如羧基荧光素(6-FAM)、六氯荧光素(HEX)、四氯荧光素(TET)、JOE、VIC、异硫氰酸荧光素(FITC)、吲哚二羧菁(Cy3、Cy5)、TAMRA和ROX及其它荧光分子；淬灭基团既可以荧光淬灭剂(如：TAMRA、ROX)，也可以是非荧光淬灭剂(如：DABCYL, BHQ1, BHQ2)。所用到的PCR阻断剂可以是聚六乙二醇(HEG)、C3(三个碳原子的碳链)等，其特征是可以阻止引物的延伸。此外，还可以调换荧光报告基团和淬灭基团的位置，或者在引物的适当位置引入两个或以上的荧光报告基团和淬灭基团，以提高荧光报告基团的荧光强度。

⑸不同基因型的等位基因特异性蝎形引物均靶向同一条模板链，因此，具有相同的引物延伸与扩增方向。并且，单碱基变异所有基因型对应的等位基因特异性蝎形引物置于同一个PCR反应管，并通过其探针释放的荧光信号种类和丰度实现单个反应管内同时定性和定量检测单碱基变异的所有基因型。

2.设计与等位基因特异性蝎形引物(如：SEQ No. 1和SEQ No. 2)相对应的共用引物(如：SEQ No. 3)，该引物不具备等位基因识别能力，可同时扩增所有基因型(图4, 图7)。

3.构建PCR反应体系：将共用引物、各基因型对应的等位基因特异性蝎形引物和待检模板(如：TPMT*2野生型、突变型和杂合型)置于单个PCR反应管中进行双色或多色实时荧光定量PCR(图4, 图7)。

4.应用实时荧光PCR检测技术与设备记录PCR实时扩增曲线，并根据每种等位基因特异性蝎形引物荧光信号的种类和强度判断基因型的类别和丰度。

本发明的技术问题是这样被解决的：

野生型和突变型等位基因特异性蝎形引物及其共用引物置于同一个PCR反应管中。无论反应体系中存在野生型、突变型和杂合型中的任何一种待检测模板，均有其匹配的等位基因特异性蝎形引物，并在PCR扩增过程中释放其对应的荧光信号。例如，TPMT*2野生型基因是野生型等位基因特异性蝎形引物(如：SEQ No. 1)和共用引物(如：SEQ No. 3)扩增形成扩增产物并释放对应的CY5荧光信号；TPMT*2突变型基因是突变型等位基因特异性蝎形引物(如：SEQ No. 2)和共用引物(如：SEQ No. 3)扩增形成扩增产物并释放对应的FAM荧光信号；TPMT*2杂合型基因是同时存在上述两种情况而同时释放稳各自对应的CY5和FAM荧光信号(图4, 图7)。可见，当野生型和突变型等位基因特异性蝎形引物存在于同一个PCR反应管中时，无论待检模板是何种基因型，均有其完全匹配的等位基因特异性蝎形引物存在，从而完全满足了耐热DNA聚合酶的热动力学，确保每种等位基因特异性蝎形引物均特异性地扩增其匹配的基因型模板序列。

等位基因特异性蝎形引物具有探针和引物双重功能。由于每种等位基因型特异性蝎形引物均标记有特定种类的荧光报告基团，并且，只在其产生扩增产物的情况下才释放荧光信号，因此，可以通过PCR扩增过程中荧光信号的种类来判断待检核酸序列的基因型，并且，检测结果不受引物二聚体的干扰。同时，由于一个延伸产物只能产生一个荧光信号，因此，可以通过PCR扩增过程中荧光信号的强度或其对应的荧光扩增曲线拐点(即：CT值)来判断某种特定基因型的丰度。最后，由于PCR扩增体系中总是存在至少与一种等位基因特异性蝎形引物相匹配的待检核酸模板，因此，此检测体系中至少有一种等位基因特异性蝎形引物会产生阳性扩增信号，从而可彼此作为PCR扩增检测体系的阳性内对照，避免假阴性结果。

可见，本发明主要解决了以下关键技术难道：野生型和突变型等位基因特异性蝎形引物存在于同一个PCR扩增体系，满足了耐热DNA聚合酶的热动力学特征，每种待检核酸模板都只被其对应的等位基因特异性蝎形引物特异性扩增，确保检测结果的准确性和特异性；可在单个反应管内通过荧光信号的种类和强度实现单碱基变异基因型的定性和定量检测；野生型和突变型特异性等位基因特异性蝎形引物的扩增产物可作为彼此的阳性内对照，避免假阴性结果。

附图说明

图1.单链型等位基因特异性蝎形引物的结构示意图；

图2.单链型等位基因特异性蝎形引物的荧光信号释放原理示意图；

图3.单链型等位基因特异性蝎形引物的CAST-PCR基本原理示意图；

图4.单链型等位基因特异性蝎形引物的CAST-PCR判断基因型原理示意图；

图5.双链型等位基因特异性蝎形引物的结构示意图；

图6.双链型等位基因特异性蝎形引物的荧光信号释放原理示意图；

图7.双链型等位基因特异性蝎形引物的CAST-PCR判断基因型原理示意图；

图8.TPMT*2的CAST-PCR检测特异性；

图9.TPMT*2的CAST-PCR检测的线性范围；

图10.TPMT*2的CAST-PCR检测的灵敏度；

图11. TPMT*2的全血样本CAST-PCR检测结果示例；

图12. TPMT*3B和TPMT*3C和CAST-PCR检测结果示例；

图13. BRAF基因点突变的CAST-PCR检测结果示例。

Loop: 环；Stem: 茎；Reporter: 报告基团；Quencher：淬灭基团；Priming：引发；WT-F: 野生型上游引物；MT-F: 突变型上游引物；CO-R: 共用下游引物；Amplification: 扩增；PCR Blockers: PCR阻断物；Fluorescent Queancer:荧光淬灭基团；Fluorescent dyes quenched: 处于淬灭状态的荧光基团；Fluorescent dyes releasing fluorescence: 释放荧光的荧光基团；wild-type alleles: 野生型等位基因；Mutant alleles: 突变型等位基因；Fluorescence: 荧光；Cycles: 循环；WT-QC plasmid: 野生型质控质粒；MT-QC plasmid: 突变型质控质粒；Cycles number: 循环数；Log concentration of QC plasmid copies: 质控质粒拷贝数的对数浓度；% Mutations: 突变比例；Wild-type template: 野生型模板；Mutant template: 突变型模板。

具体实施方式

下面将通过具体的例子来进一步阐述本发明方法，但本发明方法并不限于以下有限的例子。本领域技术人员可以根据说明书的内容和实际的需要对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施案例一：TPMT*2基因型的检测

1.等位基因特异性蝎形引物的设计与合成

根据TPMT*2(dbSNP ID: rs1800462; G238C)基因型核酸序列特征，分别设计与其野生型和突变型序列相匹配的等位基因特异性蝎形引物，其中，SEQ No. 1和SEQ No. 2与TPMT*2(G238C)反向序列互补，均是PCR扩增上游引物，分别用于特异性扩增TPMT*2(G238C)野生型和突变型核酸序列。SEQ No. 1和SEQ No. 2中的PCR阻断剂HEG的5'-端和3'-端寡核苷酸序列分别是探针序列区和引物序列区，此PCR阻断剂的作用是阻止野生型和突变型等位基因特异性蝎形引物的共用下游引物(即：SEQ No. 3)沿探针序列延伸。上述等位基因特异性蝎形引物序列中，下划线加粗者是蝎形引物的茎部结构，二者是完全互补序列，其5'-末端和3'-末端分别标记有荧光报告基团(SEQ No. 1是CY5荧光报告基因；SEQ No. 2是FAM荧光报告基团)和淬灭基团(SEQ No. 1是BHQ2淬灭基团；SEQ No. 2是BHQ1淬灭基团)。在上述等位基因特异性蝎形引物的3'-末端倒数第二位碱基均引入了一个错配碱基，以提高其等位基因的识别能力。

SEQ No. 1

SEQ No. 2

(FAM) ACCGCGC CACCAACTACACTGTGTCCC GCGCGGT (BHQ1)(HEG)GTATGATTTTATGCAGGTTCC

SEQ No. 3

TACCCAAATCAAAACAAACC

2.等位基因特异性蝎形引物的共用下游共用引物的设计与合成

根据TPMT*2(G238C)基因型核酸序列特征及其等位基因特异性蝎形引物SEQ No. 1和SEQ No. 2所在位置，设计SEQ No. 1和SEQ No. 1的下游共用引物SEQ No. 3。

3.实时荧光定量PCR反应体系的构建

PCR反应体系共计20 μl，该体系中包括以下组分：1x Premix Ex Taq master mix (Perfect Real Time; TaKaRa公司)，系列终浓度(0 μM、0.2 μM、0.4 μM、0.6 μM、0.8 μM) TPMT*2(G238C)野生型和突变型等位基因特异性蝎形引物(即：SEQ No. 1和SEQ No. 2)，系列终浓度(0.2 μM、0.4 μM、0.6 μM、0.8 μM) TPMT*2(G238C)共用下游引物(即：SEQ No. 3)，系列终浓度(1x10⁸ to 1x10¹ copies)的野生型质控(wild-type quality control, WT-QC)质粒)和突变型质控质粒，或者20~100 ng人类全血基因组DNA。实时荧光PCR反应条件为： 95oC预变性30秒; 95oC变性30秒，特定温度(即：53oC、55oC、57oC、59oC)条件下复性与延伸30秒(并同时采集荧光)。所用设备为Exicycler 96 Real-time Quantitative Thermal Block (Bioneer, Daejeon, Korea)，荧光信号采集与分析软件为Exicycler 96 Software (Bioneer)。

4.结果与分析

4.1 特异性：当反应体系中只存在某种特定基因型特异性蝎形引物时，如图8A和图8B显示，均会导致非特异性扩增。图8A所述反应体系中只存在野生型等位基因特异性蝎形引物(即：SEQ No. 1)和下游共用引物(即：SEQ No. 2)，此时，突变型质控质粒在理论上不应该出现荧光信号，但是结果表明，在几乎所有的实验条件下均出现了非特异性扩增信号，从而产生假阳性结果。与图8A相类似，图8B所述反应体系中只存在突变型等位基因特异性蝎形引物(即：SEQ No. 2)和下游共用引物(即：SEQ No. 3)，此时，野生质控质粒在理论上不应该出现荧光信号，但是结果表明，在几乎所有的实验条件下均出现了非特异性扩增信号，从而产生假阳性结果。图8C和图8D所述反应体系中同时存在野生型和突变型等位基因特异性蝎形引物(即：SEQ No. 1和SEQ No. 2)和下游共用引物(即：SEQ No. 3)，在此反应体系中，红色和绿色荧光信号分别代表待检样本中存在野生型序列和突变型模板。检测结果表明，在所有实验条件下，当反应体系中只存在野生型模板(图8C)或突变型模板(图8D)，均只出现其基因型对应的荧光信号，无任何非特异性扩增。上述结果证明了本发明(图8C和图8D对应的检测方法)完全消除了现有AS-PCR(图8A和图8B)所存在的非特异性扩增。

4.2 线性范围：当反应体系中同时存在0.2 μM终浓度的野生型等位基因特异性蝎形引物(即：SEQ No. 1)、0.2 μM终浓度的突变等位基因特异性蝎形引物(即：SEQ No. 1)、0.2 μM终深度共用下游引物(即：SEQ No. 3)时，系列终浓度(1x10⁸ to 1x10¹ copies)的野生型质控质粒(图9A)和突变型质控质粒(图9B)均只产生其对应的荧光信号，无任何非特异性扩增信号。在此线性范围内，野生型和突变型基因型的扩增效率(图9C)分别是96.59% (R²=0.999)和99.11% (R²=0.998)，杂合型模板中的野生型和突变型基因型的扩增效率(图3D)分别是95.07% (R²=0.998)和98.27% (R²=0.999)。该结果进一步说明野生型和突变型在本发明方法中具有等效扩增。

4.3 灵敏度：当特定浓度的野生型质粒(图10A-C: 1x10⁶ copies；图10D-F: 1x10⁴ copies)与系列浓度(1x10⁶ copies ~ 1x10¹ copies)的突变型质粒共同存在时，本发明所述方法对突变型的检测灵敏度达到1%。

4.4 临床验证：采用4.2所述反应体系共计检测了254例人类外周血全血基因组DNA的基因型(图11A)，其检测结果与核酸测序完全一致，并且，在检测过程中平行检测的质控质粒的基因型结果完全正确(图11B)，说明检测结果准确可靠。

实施案例二：TPMT*3B和TPMT*3C基因型的检测

1.单链型等位基因特异性蝎形引物及其共用引物的设计与合成

根据TPMT*3B(dbSNP ID: rs1800460; G460A)和TPMT*3C(dbSNP ID: 1142345; A719G)基因型核酸序列特征，分别设计其野生型和突变型匹配的等位基因特异性蝎形引物及其共用引物。TPMT*3B野生型和突变型匹配的等位基因特异性蝎形引物分别是Seq No. 4和Seq No. 5，均是上游引物，分别标记HEX和FAM荧光报告基团；共用引物为下游引物Seq No. 6。TPMT*3C野生型和突变型匹配的等位基因特异性蝎形引物分别是Seq No. 8和Seq No. 9，均是下游引物，分别标记HEX和FAM荧光报告基团；共用引物为上游引物Seq No. 7。在上述等位基因特异性蝎形引物的3'-末端倒数第二位碱基均引入了一个错配碱基，以提高其等位基因的识别能力。

SEQ No. 4

(HEX) ACCGCGC TCACCTGGATTGATGGCAACTA GCGCGGT (BHQ1)(HEG)ACATGATTTGGGATAGAGGTG

SEQ No. 5

(HEX) ACCGCGC TCACCTGGATTGATGGCAACTA GCGCGGT (BHQ1)(HEG)GACATGATTTGGGATAGAGGTA

SEQ No. 6

TAGAAGTCTAAGCTGATTTTCT

SEQ No. 7

CGTTGTCTTGAGAAGGTTGA

SEQ No. 8

(HEX) ACCGCGC AAAGTTGGGGAATTGACTGTCT GCGCGGT (BHQ1)(HEG)CTCATTTACTTTTCTGTAAGTAGCT

SEQ No. 9

(FMA) ACCGCGC AAAGTTGGGGAATTGACTGTCT GCGCGGT (BHQ1)(HEG)GT CTCATTTACTTTTCTGTAAGTAGTC

2.实时荧光定量PCR反应体系的构建

TPMT*3B的PCR反应体系共计20 μl，该体系中包括以下组分：1x Premix Ex Taq master mix，0.2 μM野生型和突变型等位基因特异性蝎形引物(即：SEQ No. 4和SEQ No. 5)，0.2 μM下游共用引物(即：SEQ No. 6)、1x10⁴拷贝的野生型质控质粒和突变型质控质粒，或者20~100 ng人类全血基因组DNA。实时荧光PCR反应条件为： 95oC预变性30秒; 95oC变性30秒，57oC复性与延伸30秒(并同时采集荧光)。所用设备为Bio-Rad CFX96型实时荧光定量PCR仪，荧光信号采集与分析软件为Bio-Rad CFX Manager V3.1。

TPMT*3C的PCR反应体系共计20 μl，该体系中包括以下组分：1x Premix Ex Taq master mix，0.2 μM野生型和突变型等位基因特异性蝎形引物(即：SEQ No. 8和SEQ No. 9)，0.2 μM下游共用引物(即：SEQ No. 6)，1x10⁴拷贝的野生型质控质粒和突变型质控质粒，或者20~100 ng人类全血基因组DNA。实时荧光PCR反应条件为： 95oC预变性30秒; 95oC变性30秒，57oC复性与延伸30秒(并同时采集荧光)。所用设备为Bio-Rad CFX96型实时荧光定量PCR仪，荧光信号采集与分析软件为Bio-Rad CFX Manager V3.1。

3.结果与分析

3.1 特异性：当反应体系中只存在野生型核酸序列时，TPMT*3B和TPMT*3C反应体系均只能检测到HEX荧光通道信号(图12A,C)；当反应体系中只存在突变型核酸序列时，TPMT*3B和TPMT*3C反应体系均只能检测到FAM荧光通道信号(图12C,D)；当反应体系同时存在野生型和突变型时，则能同时检测到HEX和FAM荧光通道信号。

3.2 灵敏度：野生型质粒(1x10⁶ copies)与系列浓度(1x10⁶ copies ~ 1x10¹ copies)突变型质粒共同存在时，本发明所述方法对突变型的检测灵敏度达到1%。

3.3 临床验证： 254例人类外周血全血基因组DNA的基因型检测结果表明，无TPMT*3B变异，4例为TPMT*3C杂合型，共变异比例为1.6%，且杂合型与核酸测序结果一致。

实施案例三：BRAF基因第600位密码子突变检测

1.双链型等位基因特异性蝎形引物及其共用引物的设计与合成

根据BRAF第600位密码子(V600; GTG)第二位碱基的所有突变情况，设计分别靶向野生型(V600; GTG)和V600E(GTG>GAG)、V600A(GTG>GCG)、V600G(GTG>GGG)等三种突变型的双链型等位基因特异性蝎形引物的探针-引物单体。靶向野生型(V600; GTG)的探针-引物单体是SEQ No. 11，靶向突变型V600E(GTG>GAG)的探针-引物单体是SEQ No. 12，靶向突变型V600A(GTG>GCG)的探针-引物单体是SEQ No. 13，靶向突变型V600G(GTG>GGG)的探针-引物单体是SEQ No. 14。SEQ No. 11~14的5'-末端分别标记有CY5、FAM、HEX和Texas Red荧光报告基团，在探针序列区和引物序列区之间是PCR阻断剂HEG。各引物的3'-末端是等位基因特异性碱基，在3'-末端倒数第三位碱基引入一个错配碱基G，以进一步提高错配识别能力。

SEQ No. 10

ACTACACCTCAGATATATTTCTTCATG

SEQ No. 11

(CY5) gtaaaaataggtgattttggtctagcta (HEG)CCCACTCCATCGAGATTgCA

SEQ No. 12

(FAM) gtaaaaataggtgattttggtctagcta (HEG)CCCACTCCATCGAGATTgCT

SEQ No. 13

(HEX) gtaaaaataggtgattttggtctagcta (HEG)CCCACTCCATCGAGATTgCG

SEQ No. 14

(Texas Red) gtaaaaataggtgattttggtctagcta (HEG)CCCACTCCATCGAGATTgCC

SEQ No. 15

gaccaaaatcacctatttttac(BHQ1)

SEQ No. 16

gaccaaaatcacctatttttac(BHQ2)

2.上游共用引物及探针淬灭单体的设计与合成

根据探针-引物单体及其探针序列区的序列特征，设计合成探针淬灭单体SEQ No. 15和SEQ No. 16，二者的3'-末端分别标记淬灭基团BHQ1和BHQ2。根据荧光报告基团和淬灭基团的特征，SEQ No. 12和SEQ No. 15、SEQ No. 13和SEQ No. 15、SEQ No. 11和SEQ No. 16、SEQ No. 14和SEQ No. 16两两配伍构成双链型等位基因特异性蝎形引物。同时，设计上述蝎形引物的上游共用引物SEQ No. 10。

2.实时荧光定量PCR反应体系的构建

PCR反应体系共计20 μl，该体系中包括以下组分：1x Premix Ex Taq master mix、0.2 μM野生型和突变型等位基因特异性蝎形引物的探针-引物单体(即：SEQ No. 11~14)，2.0 μM野生型和突变型等位基因特异性蝎形引物的探针淬灭单体(即：SEQ No. 15和SEQ No. 16)，0.4 μM上游共用引物(即：SEQ No. 10)、1x10⁴拷贝的野生型质控质粒和各突变型质控质粒，或者20~100 ng人类结直肠癌组织细胞DNA。实时荧光PCR反应条件为： 95oC预变性30秒; 95oC变性30秒，60oC复性与延伸30秒(并同时采集荧光)。所用设备为Bio-Rad CFX96型实时荧光定量PCR仪，荧光信号采集与分析软件为Bio-Rad CFX Manager V3.1。

3.结果与分析

3.1 特异性：当反应体系中只存在某种特定基因型的模板时，PCR体系均只能特异性地检测到各基因型对应荧光信号，无任何非特异性扩增(图12A-D)。当反应体系中同时存在4种模板时，能够检测到所有基因型对应的荧光信号(图13E)。

3.3 临床验证：100例人类结直肠癌组织细胞DNA的基因型检测结果表明，所有样本中仅存在V600E突变，V600E阳性样本共计8例，突变比例为8.0%。图13F显示一例V600E阳性的临床样本检测结果。

Claims

1.一种基因单碱基变异的CRAS-PCR检测方法，其检测体系中包括野生型和突变型等位基因特异性蝎形引物、上述等位基因特异性蝎形引物的共用引物，其特征在于：

2.如权利要求1所述基因单碱基变异的CRAS-PCR检测方法，其特征在于：等位基因特异性蝎形引物是单链型等位基因特异性蝎形引物，引物序列由探针序列区和引物序列区构成，并且，引物序列区和探针序列区通过PCR阻断剂连接；探针序列区呈亚稳定茎环结构，其中，茎部结构两末端分别标记有荧光报告基团和淬灭基团，环部结构序列与引物序列区的3'-端延伸产物形成分子内杂交双链而使茎部结构解体，并释放标记的荧光信号；每种基因型的等位基因特异性蝎形引物均标记某种特定的荧光报告基团，通过PCR反应体系中的荧光信号种类和强度实现基因型的定性和定量检测。

3.如权利要求1所述基因单碱基变异的CRAS-PCR检测方法，其特征在于：等位基因特异性蝎形引物是双链型等位基因特异性蝎形引物，引物由探针淬灭单体和探针-引物单体两条单链DNA组成；探针-引物单体由探针序列区和引物序列区构成，并且，引物序列区和探针序列区通过PCR阻断剂连接；探针淬灭单体与探针-引物单体探针序列区呈亚稳定状态，探针淬灭单体的3'-末端标记有淬灭基团，探针-引物单体探针序列区的5'-末端标记有荧光报告基团，探针-引物单体探针序列区与引物序列区的3'-端延伸产物形成分子内杂交双链而使茎部结构解体，并释放标记的荧光信号；每种基因型的等位基因特异性蝎形引物均标记某种特定的荧光报告基团，通过PCR反应体系中的荧光信号种类和强度实现基因型的定性和定量检测。

4.如权利要求1所述基因单碱基变异的CRAS-PCR检测方法，其特征在于：等位基因特异性蝎形引物的PCR阻断剂是聚六乙二醇(HEG)，或者是三个碳原子的碳链(C3)，或者是其它PCR阻断剂。

5.如权利要求1所述基因单碱基变异的CRAS-PCR检测方法，其特征在于：所述等位基因特异性蝎形引物的荧光报告基团是羧基荧光素(6-FAM)、六氯荧光素(HEX)、四氯荧光素(TET)、JOE、VIC、异硫氰酸荧光素(FITC)、吲哚二羧菁(Cy3、Cy5)、TAMRA、ROX，或者其它类别的荧光基团。

6.如权利要求1所述基因单碱基变异的CRAS-PCR检测方法，其特征在于：等位基因特异性蝎形引物的淬灭基团是荧光淬灭剂TAMRA、ROX、或者其它荧光基团，也是非荧光淬灭剂DABCYL、BHQ1、BHQ2、或者其它荧光基团。

7.如权利要求1所述基因单碱基变异的CRAS-PCR检测方法，其特征在于：等位基因特异性蝎形引物中的碱基有一个或者多个硫代碱基，或者是锁核酸，或者是其它修饰碱基；等位基因特异性蝎形引物的3'-端部分碱基是硫代碱基，或者是锁核酸，或者是其它修饰碱基；等位基因特异性蝎形引物的3'-末端碱基倒数第2位和/或第3位碱基进一步引入与待检测核酸序列错配的碱基，或者在其它位置引入错配碱基。

8.如权利要求1所述基因单碱基变异的CRAS-PCR检测方法，其特征在于：所述反应体系包括：野生型和突变型基因型的等位基因特异性蝎形引物、上述等位基因特异性蝎形引物的共用引物、耐热DNA聚合酶、PCR扩增所需dNTPs、待检测模板、PCR扩增所需缓冲液和离子强度，

该反应体系中加入尿嘧啶-N-糖基化酶(uracil-N-glycosylase, UNG)或尿嘧啶-DNA-糖基化酶(uracil-DNA-glycocasylase, UDG)；

耐热DNA聚合酶是不具有3'->5'核酸外切酶活性的耐热DNA聚合酶，或具是有3'->5'核酸外切酶活性的耐热DNA聚合酶，或者是具有5'->3'核酸外切酶活性的耐热DNA聚合酶，或者是具有链置换活性的耐热DNA聚合酶，或者是同时具有上述一种以上特征的耐热DNA聚合酶；

PCR扩增所需dNTPs是dATP、dTTP、dGTP和dCTP的混合液，或者是dATP、dTTP、dGTP、dCTP和dUTP的混合液；

待检测模板是人类基因组DNA，或者质粒DNA，或者其它核酸序列；

待检测基因型是野生型基因，或者是突变型基因，或者是杂合型基因；

PCR扩增促进剂：甜菜碱(betaine)，或者二甲基亚砜(DMSO)，或者牛血清白蛋白(BSA)，或者其它PCR扩增促进剂。

9.如权利要求书1至8所述的基因单碱基变异的CRAS-PCR检测方法，其特征在于：PCR反应条件包括95~98oC预变性30~60秒; 35~55个循环的95~98oC变性30秒，50~65oC复性与延伸30~90秒(并同时采集荧光)，

在第一步进行50oC孵育5～20分钟，通过该步骤去除前次PCR扩增产物存在的污染；

根据等位基因特异性蝎形引物的荧光信号种类和强度(或者是扩增曲线CT值)判断待检测模板的基因型类别和丰度。

10.一种包含有权利要求1～9中的所称反应体系的检测试剂或者试剂盒。