CN109355360A - 用于检测egfr突变的组合物、试剂盒和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开用于检测EGFR突变的组合物、试剂盒和方法。组合物包含正向引物、反向引物和野生型EGFR基因结合分子,且正向引物和反向引物的组合能够得到包含EGFR突变位置的扩增产物。正向引物包括5’端区域、3’端区域和中间区域,5’端区域的两侧序列能够进行互补形成茎环结构,在5’端区域的第一末端具有荧光基团和第二末端具有淬灭基团,3’端区域的3’端最后一个碱基与待检测的突变碱基互补。反向引物包括位于5’端的标签序列和能够与待检测的突变位置的下游部分序列完全互补的结合区域。野生型EGFR基因结合分子设置为能够特异性识别并结合至野生型EGFR基因的待测突变位置。提高了EGFR检测的灵敏度和特异性。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测,具体涉及用于检测EGFR突变的组合物、试剂盒和方法。
背景技术
随着转化医学的飞速发展,晚期非小细胞肺癌(NSCLC)患者的治疗已从化疗时代转向分子靶向治疗时代,其中表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)是最重要的肺癌驱动基因,EGFR-TKIs是针对此靶点的小分子抑制剂,EGFR基因活化突变的晚期NSCLC患者能从EGFR-TKI显著获益。然而,几乎所有服用EGFR-TKI的患者最终将出现耐药,早期研究发现,约50%耐药的患者具有EGFR 20号外显子第790位密码子错义突变(即T790M突变),并且与EGFR-TKI疗效密切相关,如何敏感、准确地检测T790M基因突变成为关注热点及技术关键。
一直以来,直接测序法是EGFR突变的标准检测方法,但其过程稍繁琐、耗时长,检测10%以下突变率的样本常常出现假阴性。虽然目前还存在其他检测方法,但均存在许多问题。例如,虽然普通的ARMS法灵敏度可达1%左右,但尚不能检测更低突变频率的样本。ddPCR法可对T790M突变进行定量检测,灵敏度可达0.4%甚至更高,但耗材昂贵,操作复杂。NGS是边合成边测序技术(Sequencing by Synthesis,SBS),高通量高深度,价格昂贵,适用于多基因多位点检测,不适合少量位点的检测。
发明内容
为解决现有技术中的至少部分技术问题,本发明提供一种用于检测EGFR突变的新方案。具体地,本发明包括以下内容。
本发明的第一方面,提供一种用于检测EGFR突变的组合物,其包含正向引物、反向引物和野生型EGFR基因结合分子,且所述正向引物和所述反向引物的组合能够得到包含EGFR突变位置的扩增产物,其中:
所述正向引物包括5’端区域、3’端区域和位于所述5’端区域和所述3’端区域之间的中间区域,所述5’端区域包括第一侧序列、第二侧序列以及两者之间的环序列,且第一侧序列和第二侧序列能够进行第一互补,从而形成茎环结构,在所述5’端区域的第一末端具有荧光基团和第二末端具有淬灭基团,所述3’端区域的3’端最后一个碱基与待检测的突变碱基互补,所述中间区域设置为使所述5’端区域和所述3’端区域相对分开;
所述反向引物包括位于5’端的标签序列和能够与待检测突变的下游的一部分序列完全互补的结合区域;和
所述野生型EGFR基因结合分子设置为能够特异性识别并结合至野生型EGFR基因的待测突变位置。
在某些实施方案中,所述正向引物设置为其至少部分序列能够与所述扩增产物的部分序列进行第二互补,且第二互补区的Tm值大于第一互补区的Tm值。
在某些实施方案中,从所述3’端区域的3’端起倒数第2-6个碱基位引入至少一个错配碱基,优选引入一个错配碱基。
在某些实施方案中,所述中间区域的结构为(CH2)m,其中m为5-20之间的自然数。
在某些实施方案中,所述标签序列的长度为5-20nt,且所述标签序列与待检测的EGFR的序列不互补。
在某些实施方案中,所述野生型EGFR基因结合分子由下式(1)的重复单元构成:
其中,n为6-20的整数,B为选自由A、T、G和C组成的组;且所述野生型EGFR基因结合分子与野生型EGFR基因结合的Tm为70℃以上;优选地,式(1)中n=15,且沿从左到右的方向各重复单元中的B依次为CCGTGCAGCTCATCA。
在某些实施方案中,所述正向引物的5’端区域长度为10-20nt。
在某些实施方案中,所述正向引物、所述反向引物和所述野生型EGFR基因结合分子分别以独立的状态存在,或者以两种以上成分的混合物形式存在。
本发明的第二方面,提供一种用于检测EGFR突变的试剂盒,其包含本发明第一方面所述的组合物。
本发明的第三方面,提供一种用于检测EGFR突变的方法,其包括使用本发明第一方面所述的组合物或使用本发明第二方面所述试剂盒的步骤;优选地,所述方法为基于qPCR平台的方法。
本发明可以检测出低含量DNA样品中低至0.1%的点突变,同时可以耐受高达30ng以上的野生型DNA样品,而不产生非特异性扩增。本发明的新型检测方案提高了检测灵敏度和特异性。
附图说明
图1非小细胞肺癌(NSCNC)FFPE样品的检测结果。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式,该详细说明不应认为是对本发明的限制,而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式,并非用于限制本发明。另外,对于本发明中的数值范围,应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明,否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料,但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入,用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时,以本说明书的内容为准。除非另有说明,否则“%”为基于重量的百分数。
[用于检测EGFR突变的组合物]
本发明的第一方面,提供一种用于检测EGFR突变的组合物(本文有时简称为“本发明的组合物”),其用于特异性扩增包含EGFR突变位点的序列,而对于未突变的野生型基因不能进行扩增。
本发明的组合物包含正向引物、反向引物和野生型EGFR基因结合分子,且正向引物和反向引物的组合能够得到包含EGFR突变位置的扩增产物。
正向引物
本发明的正向引物是指用作扩增反应5’端引物的序列。本发明的正向引物为特异性引物,其包括5’端区域、3’端区域和位于5’端区域和3’端区域之间的中间区域。本发明的正向引物的长度不特别限定。例如,可为10-50nt,优选12-48nt,更优选20-45nt等。
本发明中,正向引物的5’端区域包括第一侧序列、第二侧序列和两者之间的环形区,且第一侧序列和第二侧序列的长度各自分别为5-10nt,优选5-8nt,更优选5-6nt。本发明中第一侧序列可为5’侧的序列,第二侧序列可为3’侧的序列。反之亦可。本发明的两侧序列能够进行互补(为了与后面将要描述的另一种互补情况相区分,此处的互补称作“第一互补”,此处的互补的区域称作“第一互补区”)。优选地,第一侧序列和第二侧序列之间的环形区包含多个碱基,从而当进行第一互补时形成该多个碱基为环形区,第一互补区为茎部的茎环结构。第一互补区的长度一般为6-12nt,优选为6-10nt。
本发明中,在5’端区域的第一末端具有荧光基团和第二末端具有淬灭基团。此处的“第一末端”可以是从5’端至3’方向的第一个碱基,在此情况下,第二末端是指从5’端至3’方向的最后一个碱基。本领域技术人员理解,此处的“第一末端”还可以是从5’端至3’方向的最后一个碱基,在此情况下,第二末端是指从5’端至3’方向的第一个碱基。优选地,在5’端区域内从5’端至3’方向的第一碱基不是G。
本发明中,荧光基团的实例包括但不限于基于荧光素的荧光团,例如FAM(6-羧基荧光素)、TET(四氯荧光素)、HEX(六氯荧光素;基于罗丹明的荧光团,例如ROX(6-羧基-X-罗丹明)和TAMRA(6-羧基四甲基罗丹明);Cy染料家族,尤其是Cy3和Cy5,以上所有都可商购获得。本发明还可使用其他荧光素,例如具有不同发射光谱的荧光素,如NED和JOE。可使用其他荧光基团,例如Alexa、Atto、Dyomics、Dyomics Megastokes和Thilyte染料家族中的荧光基团。
本发明中,淬灭基团是指当其与对应的荧光基团接近时能够猝灭荧光的任何基团,其实例包括但不限于(4-二甲氨基苯基偶氮)安息香酸(ciabcyl)、TAMRA、BHQ1、BHQ2和NFQ-MGB。
本发明中,正向引物设置为其至少部分序列能够与扩增产物的部分序列进行互补。为了与前面所述的第一互补相区分,此处称作“第二互补”。此处的“至少部分序列”优选是指位于5’端区域的序列,更优选至少包含环形区的碱基序列,特别优选环形区对扩增产物的部分序列具有结合特异性。
本发明中,在扩增反应的退火温度下第二互补已处于完成状态,即,扩增产物发生分子内部第二互补区与产物相应区域杂交,正在发生扩增的分子不采集荧光。另外,还优选地,第二互补的Tm值大于第一互补的Tm值,从而保证在退火温度时优先使正向引物的至少部分序列与扩增产物的部分序列进行互补,即优选进行第二互补,而不会优先进行第一互补。
本发明中,5’端区域的长度一般为10-20nt,且该长度大于第一互补区的2倍。优选地,5’端区域的长度为12-18nt。
本发明中,3’端区域的3’端最后一个碱基与待检测的突变碱基互补。在本发明的突变为点突变情况时,例如,EGFR_p.T790M时,3’端最后一个碱基与点突变的碱基互补。例如,在EGFR_p.T790M突变的情况下,3’端最后一个碱基为T。优选地,从3’端区域的3’端起倒数第2-6个碱基位可引入至少一个错配碱基,从而增加正向引物的特异性,只有遇到突变模板时才能引发扩增反应,与野生型模板不匹配,无法扩增。优选地,错配碱基的数量为一个,从而保证正向引物能够与模板具有适合的结合性。
本发明中,中间区域设置为使5’端区域和3’端区域相对分开。中间区域也可称作间隔臂。中间区域为柔性分子。优选地,本发明的中间区域的结构为(CH2)m,其中m为5-20之间的自然数。优选地,m为10-20之间的自然数,更优选14-18之间的自然数。
在某些实施方案中,本发明的正向引物为一种引物,其特异性针对EGFR的一种特定类型的点突变。由该正向引物与下面将要说明的反向引物和野生型EGFR基因结合分子可以用于检测EGFR的一种点突变类型。例如,EGFR_p.T790M。
在某些实施方案中,本发明的正向引物为多种不同引物的组合,所述多种不同引物各自分别针对EGFR的不同类型的点突变,由这些正向引物的组合与下面将要说明的反向引物和野生型EGFR基因结合分子可以用于检测EGFR的多种不同点突变类型。
反向引物
本发明的反向引物是指能够与本发明的正向引物组合用于特异性扩增包含EGFR突变位点的序列的序列。反向引物用作扩增反应的3’端引物。本发明的反向引物可为通用引物,其特异性结合的区域可为本领域内通常使用的区域。本发明的反向引物优选包括位于5’端的标签序列和能够与待检测突变的下游的一部分序列完全互补的3’端的结合区域。
本发明中,标签序列(tag sequence)的长度为5-20nt,优选6-18nt,更优选10-16nt,且标签序列与待检测的EGFR不互补。标签序列为人工添加的长度一般为5-18个碱基的随机序列,标签序列的添加能够提高扩增反应的效率。本发明中,结合区域优选能够与靶区域完全匹配的序列。可通过本领域已知的手段(例如,Lasergene 7)来确定结合区域的序列。优选地,结合区域的退火温度60±5℃,且其GC含量为在45-60%之间。
野生型EGFR基因结合分子
本发明的野生型EGFR基因结合分子设置为能够特异性识别并结合至野生型EGFR基因的至少待测突变位置对应的碱基,而对于包含突变的EGFR并不能够进行结合。该分子能够特异性封闭野生型模板,使检测体系在高野生型背景环境下,可以更灵敏地检测为数不多的突变拷贝。
在优选的实施方案中,本发明的野生型EGFR基因结合分子由下式(1)的重复单元构成:
其中,n为6-20的整数,B为选自由A、T、G和C组成的组;且野生型EGFR基因结合分子与野生型EGFR基因结合的Tm为70℃以上;优选地,式(1)中n=15,且沿从左到右的方向各重复单元中的B依次为CCGTGCAGCTCATCA。进一步优选地,野生型EGFR基因结合分子的Tm为80℃以上,更优选为85℃以上;还优选为90℃以下。例如75±5℃,优选75±3℃。
本发明的组合物
本发明的组合物只要包含正向引物、反向引物和野生型EGFR基因结合分子即可,对于其存在形式不特别限定。例如,上述三种成分可以分别以独立的状态存在,也可以两种以上成分的混合物形式存在。例如,以正向引物和反向引物的混合物形式存在,而野生型EGFR基因结合分子以单独的另外的形式存在。另外,本发明的组合物可以是固体形式,例如干粉形式存在,也可以溶液形式(例如,水溶液形式)存在。
[试剂盒]
本发明的第二方面,提供一种用于检测EGFR突变的试剂盒(本文有时简称“本发明的试剂盒”)。本发明的试剂盒包括本发明所述的组合物。如上所述,已对本发明的组合物进行了详细说明,在此不再赘述。
除了本发明的组合物之外,本发明的试剂盒还可包括以政府机构规定的形式与调控制造、使用或销售诊断试剂盒相关的注意事项。另外,本发明的试剂盒还可提供有使用、储存和故障排除的详细说明书。试剂盒还可任选地设置在适合的优选用于以高通量设置的机器人操作的装置中。
在某些实施方案中,本发明的试剂盒的组分(例如,本发明的组合物)可提供为干粉。当试剂和/或组分提供为干粉时,粉末可通过添加适合的溶剂来恢复原状。预期该溶剂还可设置于另一容器中。容器通常会包括至少一种小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器和/或其它容器手段,其中可选等分地放置溶剂。试剂盒还可包括用于包含无菌、药学上可接受的缓冲液和/或其它溶剂的第二容器的手段。
在某些实施方案中,本发明的试剂盒的组分可以溶液形式提供,例如水溶液的形式提供。在以水溶液状态存在的情况下,这些成分的浓度或含量是本领域技术人员能够根据不同需求而方便地确定的。例如,用于储存的目的时,例如引物或分子的浓度可以较高的形式存在,当处于工作状态或使用时,可通过例如稀释上述较高浓度的溶液来将浓度降低至工作浓度。
本发明的试剂盒可进一步包含其他试剂或成分。例如,用于进行PCR所需的DNA聚合酶、各类dNTP和离子如Mg2+等。这些其他试剂或成分是本领域技术人员已知的,并且可通过例如冷泉港的《分子克隆实验指南》第四版等公开出版物容易地获知。
在试剂盒中存在超过一种组分的情况下,该试剂盒还通常会包含可单独放置另外的组分的第二、第三或其它另外的容器。另外,可在容器中包含各多种组分的组合。
本发明的试剂盒还可包括保持或维持DNA的组分,例如抗核酸降解的试剂。此类组分可为例如或无RNase或具有抗RNase的保护的核酸酶。本文所述的任何组合物或试剂可为试剂盒中的组分。
[用于检测EGFR突变的方法]
本发明的第三方面,提供一种用于检测EGFR突变的方法(本文有时简称“本发明的方法”),其使用根据本发明所述的组合物或试剂盒的步骤。
本发明的方法只要使用上述组合物或试剂盒,则不特别限定具体过程或步骤。在示例性方法中,本发明的方法包括PCR扩增步骤。
在示例性实施方案中,本发明的方法为定性检测方法。优选地,在这种情况下,本发明的方法包括使用本发明的组合物或试剂盒的步骤。进一步还优选包括检测、确认或鉴定核酸扩增产物的步骤。例如,通过在支承体(如琼脂糖)上的电泳鉴定核酸扩增产物的步骤。
在另外的示例性实施方案中,本发明的方法为定量检测方法,其进一步包括通过荧光强度来计算样品中的突变含量的步骤。
本发明的方法中,样品的类型不特别限定。优选地,本发明的方法用于检测低DNA含量(例如,15ng)样品中的低频率突变,例如低至0.1%的T790M突变。另外,本发明的样品中可以包含高达30ng以上的野生型DNA样品。
在某些实施方案中,本发明的方法为基于qPCR平台的方法。qPCR平台为本领域已知的平台,在此不再赘述。
实施例
1.实验材料
非小细胞肺癌(NSCNC)FFPE样本提取的gDNA,其紫外分光光度计检测DNA的OD值满足1.8≤A260/A280≤2.0。
2.实验器材
Applied Biosystem 7500荧光定量PCR仪,其他荧光定量PCR实验需要的仪器和耗材。
3.实验方法
3.1引物序列
特异性正向引物:5’-FAM-VCGGACATAGTCCAGGAGGCAN-Quencher-C18-CCACCGTGCAGCTAATCAT-3’(5’-FAM-SEQ ID NO:1-Quencher-C18-SEQ ID NO:2)
反向引物:5’-XGCACACACCAGTTGAGCAGGTA-3’(SEQ ID NO:3)其中,特异正向引物中的V和N分别代表A+C+G和A+C+T+G组成的分子的茎部序列;反向引物中的X代表tag序列GACTGGTTCCAA。
野生型EGFR基因结合分子:由15个式(1)所述的重复单元组成,且沿从左到右的方向各重复单元中的B依次为CCGTGCAGCTCATCA(SEQ ID NO:4)。内参正向引物:5’-FAM-VACATCCTCTGGAGGCTGAGAAAN-Quencher-C18-GCCAAGGCACGAGTAACAAGC-3’(5’-FAM-SEQ IDNO:5-Quencher-C18-SEQ ID NO:6)
内参反向引物:5’-XTCCCAAGGACCACCTCACAG-3’(SEQ ID NO:7)其中,内参正向引物中的V和N分别代表A+C+G和A+C+T+G组成的茎部序列;内参反向引物中X代表tag序列GACTGGTTCCAA。
3.2 qPCR反应体系配置(终浓度):
特异性正向引物:500nM,反向引物:500nM;野生型EGFR基因结合分子:500nM。PCR缓冲液为1X;dNTP为0.2-1.0mM;MgCl2为0.5-5mM;Taq酶为0.05-0.1U/μl;DNA 2-10ng;总体系40ul。
3.3扩增程序
94℃/3min,(94℃/30s,60/30s,72℃/45s)×46,第16个循环开始的60℃开始采集荧光,一共采集31个循环的荧光。
3.4结果分析
HEX内参荧光信号曲线应升起,代表样本未漏加,FAM扩增曲线若升起,则信号值满足:21≤Ct值≤27,且△Ct(FAM荧光Ct-VIC荧光Ct)≤7,即判定为突变频率为0.1%及以上的T790M突变;若FAM无信号,或△Ct>7则为阴性或低于本检测体系检测下限。
本说明书中提供了相应引物或分子的具体序列,同时根据相关规定,本申请还提供了计算机可读形式的序列表。需要说明的是,计算机可读形式的序列表中的序列仅供参考,在本说明书中的序列与计算机可读形式的序列表中的序列不一致的情况下,以本说明书中的序列内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下,可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化,这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
SEQUENCE LISTING
<110> 元码基因科技(北京)股份有限公司
元码基因科技(苏州)有限公司
<120> 用于检测EGFR突变的组合物、试剂盒和方法
<130> 1800361CN
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
acgcggacat agtccaggag gcaactg 27
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ccaccgtgca gctaatcat 19
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n代表5-18个碱基的tag序列
<400> 3
ngcacacacc agttgagcag gta 23
<210> 4
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ccgtgcagct catca 15
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
acgacatcct ctggaggctg agaaaactg 29
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gccaaggcac gagtaacaag c 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n代表5-18个碱基的tag序列
<400> 7
ntcccaagga ccacctcaca g 21
Claims (10)
1.一种用于检测EGFR突变的组合物,其特征在于,包含正向引物、反向引物和野生型EGFR基因结合分子,且所述正向引物和所述反向引物的组合能够得到包含EGFR突变位置的扩增产物,其中:
所述正向引物包括5’端区域、3’端区域以及位于所述5’端区域和所述3’端区域之间的中间区域,所述5’端区域包含第一侧序列、第二侧序列和环形区,且所述第一侧序列和第二侧序列能够进行第一互补,从而形成茎环结构,在所述5’端区域的第一末端具有荧光基团和第二末端具有淬灭基团,所述3’端区域的3’端最后一个碱基与待检测的突变碱基互补,所述中间区域设置为使所述5’端区域和所述3’端区域相对分开;
所述反向引物包括位于5’端的标签序列和能够与待检测的突变位置的下游的一部分序列完全互补的结合区域;和
所述野生型EGFR基因结合分子设置为能够特异性识别并结合至野生型EGFR基因的至少待测突变位置。
2.根据权利要求1所述的用于检测EGFR突变的组合物,其特征在于,所述正向引物设置为其至少部分序列能够与所述扩增产物的部分序列进行第二互补,且第二互补区的Tm值大于第一互补区的Tm值。
3.根据权利要求1所述的用于检测EGFR突变的组合物,其特征在于,从所述3’端区域的3’端起倒数第2-6个碱基位引入至少一个错配碱基。
4.根据权利要求1所述的用于检测EGFR突变的组合物,其特征在于,所述中间区域的结构为(CH2)m,其中m为5-20之间的自然数。
5.根据权利要求1所述的用于检测EGFR突变的组合物,其特征在于,所述标签序列的长度为5-20nt,且所述标签序列与待检测的EGFR的序列不互补。
6.根据权利要求1所述的用于检测EGFR突变的组合物,其特征在于,所述野生型EGFR基因结合分子由下式(1)的重复单元构成:
其中,n为6-20的整数,B为选自由A、T、G和C组成的组;且所述野生型EGFR基因结合分子与野生型EGFR基因结合的Tm为70℃以上;优选地,式(1)中n=15,且沿从左到右的方向各重复单元中的B依次为CCGTGCAGCTCATCA。
7.根据权利要求1所述的用于检测EGFR突变的组合物,其特征在于,所述正向引物的5’端区域长度为10-20nt。
8.根据权利要求1所述的用于检测EGFR突变的组合物,其特征在于,所述正向引物、所述反向引物和所述野生型EGFR基因结合分子分别以独立的状态存在,或者以两种以上成分的混合物形式存在。
9.一种用于检测EGFR突变的试剂盒,其特征在于,包含根据权利要求1-8任一项所述的组合物。
10.一种用于检测EGFR突变的方法,其特征在于,其包括使用根据权利要求1-8任一项所述的组合物,或使用根据权利要求9所述的试剂盒的步骤;优选地,所述方法为基于qPCR平台的方法。
Priority Applications (1)
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