CN105431550A - 多重等位基因检测 - Google Patents

Abstract

本文提供了涉及核酸检测的技术和特别地，但不排他地，涉及用于同时检测多个核酸的方法和组合物的技术。

Description

多重等位基因检测

本申请要求于2013年3月15日提交的美国临时专利申请序列号61/792,202的优先权，该临时专利申请通过引用以其整体结合到本文中。

发明领域

本文提供了涉及核酸检测的技术并且特别地，但不排他地，涉及用于同时检测多个核酸的方法和组合物的技术。

发明背景

单核苷酸多态性(SNPs)的检测可用于生物医学领域例如人类遗传学、癌症诊断学、药物遗传学和微生物基因分型。通常，许多常见的技术用等位基因特异性引物检测SNPs，所述等位基因特异性引物设计为具有有效延伸特异性的SNP模板而非野生型模板或其它非靶SNP序列。由于其特异性，相对于其它技术例如等位基因特异性探针，这类等位基因特异性引物通常优选用于SNP检测。然而，使用等位基因特异性引物的PCR和实时PCR方法局限于其多重性能力，这是因为扩增产物的检测基于与共有序列结合的探针，或基于不具有充分区分小的核苷酸变更例如个别SNPs的能力的技术。

一些常规的解决方案使用在其3′末端包含SNP-检测核苷酸的等位基因特异性引物和引物特异性杂交标签(美国专利号6,794,133)。然而，这项技术取决于固相技术，并且具有危及其对于实时PCR的效用的引物特异性问题。其他常规的单体型分析解决方案提供了使用在其3′末端包含SNP-检测核苷酸的等位基因特异性引物的多重检测，但SNPs的检测通过大小而非通过实时PCR荧光信号完成(国际专利公布号WO2008143367)。最后，一些现存常规技术使用通用引物序列进行多重分析，但检测通过电泳进行，并且不提供多重实时PCR(美国专利号6,207,372、5,882,856)。因此，在生物医学领域存在对使用等位基因特异性引物的多重SNPs的多重PCR检测的需求。

发明概述

本文提供了涉及使用等位基因特异性引物进行核酸序列多重检测的技术。例如，提供了用于在一个检测反应(例如，PCR，如，实时PCR)中同时检测多个SNPs的方法的实施方案。在一些实施方案中，所述技术在本文中被称为多重等位基因特异性引发检测(Masp)和FRET-介导的多重等位基因特异性引发检测(F-Masp)。

在一些实施方案中，并且随着该技术可用在一些应用中，F-Masp相对于Masp在其探针的使用方面提供了一种或多种优势，在一些实施方案中，如果需要，所述探针为该技术提供了额外的特异性。例如，在一些测定中，F-Masp减少或消除来自非特异性信号的干扰，例如，来自非特异性引发、引物二聚体的形成和/或包含相同或相似靶序列的非靶向区(例如，假基因)的存在。

本文所提供的该技术允许从一个均一扩增反应检测、鉴定和/或报告多个SNPs或基因型。因此，该技术为临床医生和患者更加有效提供信息、改善测定流程并提供一种所需的技术。

该技术，在一些实施方案中，提供用于检测样品中的核酸(例如，包含BRAF基因或部分BRAF基因的核酸，如，包含BRAF突变的核酸，如，包含编码含有氨基酸置换的B-Raf蛋白的BRAF突变的核酸，如，包含编码含有V600E、V600K和/或V600D氨基酸置换的B-Raf蛋白的BRAF突变的核酸)的方法，所述方法包括使包含核酸的样品与猝灭状态的引物接触；和如果引物与核酸杂交并产生扩增产物，则检测来自可检测状态的引物的信号，其中检测到信号时，在样品中检测到核酸。在一些实施方案中，所述猝灭状态的引物包含双链的双链体区域。在一些实施方案中，所述信号为荧光。在一些实施方案中，所述引物包含荧光团，并且当引物在猝灭状态下时荧光团被猝灭剂猝灭。所述技术不限制与寡核苷酸连接的荧光部分、猝灭剂部分和FRET对。例如，一些实施方案提供一种方法，其中荧光团为FAM、TET、JOE、HEX、TAMRA、ROX、Cy3、Cy5或Cy5.5；并且猝灭剂为BHQ-1、BHQ-2或BHQ-3。

在一些实施方案中，可检测状态的引物与核酸杂交；在一些实施方案中，猝灭状态的引物通过聚合酶掺入到核酸链中。在一些实施方案中，猝灭状态的引物通过聚合酶掺入核酸链中并且引物保留双链的双链体区域；然后，在一些实施方案中，当丧失双链的双链体区域时，例如，当合成置换双链的双链体区域的互补链时引物处于可检测状态。

所述技术的引物以多种形式提供。例如，在一些实施方案中猝灭状态的引物由包含荧光团和猝灭剂的一个寡核苷酸组成。在一些实施方案中，猝灭状态的引物由包含荧光团的第一寡核苷酸和包含猝灭剂的第二寡核苷酸组成，其中第一寡核苷酸与第二寡核苷酸杂交。在一些实施方案中，未激发状态的引物由包含荧光团的第一寡核苷酸和第二寡核苷酸组成，其中第一寡核苷酸与第二寡核苷酸杂交。

在一些实施方案中，所述技术的引物通过聚合酶(例如，在PCR期间)或另一合成过程掺入到核酸中。在一些实施方案中，被掺入的引物处于可检测状态、猝灭状态或未激发状态。因此，在一些实施方案中扩增子包含可检测状态的引物。所述技术的引物以多种形式提供。例如，在一些实施方案中，所述引物为茎-环引物或双链线性引物。在一些实施方案中，所述引物为等位基因特异性引物。

在一些实施方案中，所述技术进一步包括用聚合酶和核苷酸延伸可检测状态的引物，并且在一些实施方案中所述技术进一步包括进行聚合酶链反应，例如，在一些实施方案中所述聚合酶链反应为实时聚合酶链反应。

在一些实施方案中所述方法为用于检测超过一个核酸(例如，超过一个包含BRAF基因或部分BRAF基因的核酸，如，包含BRAF突变的核酸，如，包含编码含有氨基酸置换的B-Raf蛋白的BRAF突变的核酸，如，包含编码含有V600E、V600K和/或V600D氨基酸置换的B-Raf蛋白的BRAF突变的核酸)，例如，超过一个等位基因、SNP、基因、突变等的多重方法。因此，在一些实施方案中所述方法包括使包含第二核酸的样品与猝灭状态的第二引物接触；和如果第二引物与第二核酸杂交并产生扩增产物，则检测来自可检测状态的第二引物的第二信号，其中当检测到第二信号时，在样品中检测到第二核酸。

在一些实施方案中所述技术包括使用引物和探针。例如，在一些实施方案中提供用于检测样品中核酸的方法，所述方法包括使包含核酸的样品与猝灭状态或未激发状态的引物和探针接触；和如果探针与核酸杂交，则检测来自引物的信号，其中当检测到信号时，在样品中检测到核酸。在一些实施方案中，所述探针包含双链的双链体区域。在一些实施方案中，所述信号为荧光。在一些实施方案中，所述探针包含荧光团(例如，荧光共振能量转移供体)，并且引物包含荧光团(例如，荧光共振能量转移受体)。

所述技术的探针以多种形式提供。例如，在一些实施方案中猝灭状态的探针由包含荧光团和猝灭剂的一个寡核苷酸组成。在一些实施方案中，猝灭状态的探针由包含荧光团的第一寡核苷酸和包含猝灭剂的第二寡核苷酸组成，其中第一寡核苷酸与第二寡核苷酸杂交。在一些实施方案中，未激发状态的探针由包含荧光团的第一寡核苷酸和第二寡核苷酸组成，其中第一寡核苷酸与第二寡核苷酸杂交。在一些实施方案中，探针(例如，在其3′末端)被修饰以使其不能提供通过聚合酶来延伸的底物(例如，聚合酶不能将核苷酸加到探针中)。在一些实施方案中所述探针为如本文所述的茎-环探针或双链的线性探针。所述技术可用于检测等位基因、SNPs、突变等，并且在一些实施方案中所述引物为等位基因特异性引物。

在一些实施方案中，当探针处于猝灭状态时，探针荧光团被猝灭剂猝灭。所述技术不限制与所述技术的寡核苷酸连接的荧光团和猝灭剂。例如，在一些实施方案中荧光团为FAM、TET、JOE、HEX、TAMRA、ROX、Cy3、Cy5或Cy5.5；并且猝灭剂为BHQ-1、BHQ-2或BHQ-3。在一些实施方案中，所述引物包含第二荧光团，其为与探针的荧光共振能量转移(FRET)供体的荧光团相容的荧光共振能量转移(FRET)受体。

在一些实施方案中，所述方法包括用聚合酶和核苷酸延伸引物，例如，如在进行聚合酶链反应中的那样。在一些实施方案中，聚合酶链反应为实时聚合酶链反应。

在一些实施方案中，所述方法为用于检测超过一个核酸(例如，超过一个包含BRAF基因或部分BRAF基因的核酸，如，包含BRAF突变的核酸，如，包含编码含有氨基酸置换的B-Raf蛋白的BRAF突变的核酸，如，包含编码含有V600E、V600K和/或V600D氨基酸置换的B-Raf蛋白的BRAF突变的核酸)，例如，超过一个等位基因、SNP、基因、突变等的多重方法。在一些实施方案中包括使用FRET，同一供体部分与两个(或更多个)不同的受体部分一起使用，并且在一些实施方案中两个(或更多个)不同的供体部分与两个(或更多个)受体部分一起使用。因此，在一些实施方案中所述方法进一步包括使包含第二核酸的样品与第二引物接触；和如果探针与第二核酸杂交，则检测来自第二引物的第二信号，其中当检测到第二信号时，在样品中检测到第二核酸。

所述技术提供可用于检测一个或多个等位基因、SNPs、基因、突变等的组合物的实施方案。在一些实施方案中提供包含下列之一的组合物：

与可检测引物杂交的核酸，其中所述可检测的引物包含荧光团和猝灭剂；

包含可检测引物的核酸，其中所述可检测引物包含荧光团和猝灭剂；

与可检测引物杂交的核酸，其中所述可检测引物包含荧光团；和包含猝灭剂的猝灭剂寡核苷酸；

包含可检测引物的核酸，其中所述可检测引物包含荧光团；和包含猝灭剂的猝灭剂寡核苷酸；

包含引物并且与探针杂交的核酸，其中所述探针包含第一荧光团和猝灭剂，所述引物包含第二荧光团，并且所述第一荧光团和第二荧光团为FRET对；或

包含引物并且与探针杂交的核酸，其中所述探针包含第一荧光团，所述引物包含第二荧光团，并且所述第一荧光团和第二荧光团为FRET对；和包含猝灭剂的猝灭剂寡核苷酸。

在一些实施方案中所述组合物为反应混合物。在一些实施方案中所述组合物进一步包含聚合酶和/或核苷酸(例如，在PCR如实时PCR中)。在一些实施方案中荧光团为FAM、TET、JOE、HEX、TAMRA、ROX、Cy3、Cy5或Cy5.5；并且猝灭剂为BHQ-1、BHQ-2或BHQ-3。一些实施方案包含超过一种荧光团和/或超过一种猝灭剂。

一些实施方案提供使用本文所提供的探针和引物，例如，多重引物(例如，等位基因特异性引物)的组合进行两个或更多个等位基因、SNPs、突变、基因等的多重检测。因此，在一些实施方案中提供用于两个(或更多个)等位基因、SNPs、突变、基因等的多重检测的组合物、方法、系统和试剂盒。这些实施方案涉及如本文所述的两个或更多个引物(例如，两个或更多个等位基因特异性引物)的使用，各引物用单独的可检测荧光团标记。在这些实施方案中，与两个或更多个引物相关的猝灭剂可为相同的猝灭剂或与两个或更多个引物相连的猝灭剂可为两个或更多个不同的猝灭剂。在包含探针和/或使用探针的实施方案中，与两个或更多个引物相连的探针可为相同的探针或与两个或更多个引物相连的探针可为两个或更多个不同的探针。因此，用于多重测定的探针可包含相同的序列或用于多重测定的探针可包含两个或更多个不同的序列(例如，与相同的靶序列杂交或与两个或更多个不同的靶序列杂交)。在一些实施方案中，与探针杂交的两个或更多个不同的序列可相差仅单个核苷酸。对于包含猝灭剂的探针的实施方案，两个或更多个不同探针的每一个可包含相同的猝灭剂或包含猝灭剂的两个或更多个不同的探针的每一个可包含两种或更多种不同的猝灭剂。在一些实施方案中，两个或更多个引物用于多重检测并且一个探针用于所述两个或更多个引物的检测。在一些实施方案中，两个或更多个引物用于多重检测并且两个或更多个探针用于所述两个或更多个引物的检测。

一些实施方案与探针上的供体荧光团与两个或更多个引物上的两个或更多个受体荧光团之间的荧光共振能量转移(例如，F-Masp)相关。在这些实施方案中，同一探针供体荧光团与两个或更多个引物的受体荧光团一起使用。因此，在测定中至少存在三个荧光团，例如，第一引物上的受体荧光团、第二引物上的不同的受体荧光团和探针上的与两个或更多个引物荧光团的每个形成FRET对的供体荧光团。在一些实施方案中，两个或更多个引物的每个使用两个或更多个不同的探针。在这些实施方案中，两个或更多个不同的探针供体荧光团与两个或更多个引物受体荧光团一起使用。因此，在测定中至少存在四个荧光团，例如，第一引物上的受体荧光团、第二引物上的不同的受体荧光团、探针上与第一引物相关的供体荧光团和探针上与第二引物相关的不同的供体荧光团。每个相关的引物-探针对的引物和探针荧光团为FRET对。在一些实施方案中，未杂交的探针包含双链的双链体区域；在一些实施方案中未杂交的探针包含猝灭剂(例如，探针处于未激发状态)。

因此，在一些实施方案中(例如，多重实施方案)所述组合物进一步包含下列之一：

与第二可检测引物杂交的第二核酸，其中所述第二可检测引物包含第二荧光团和猝灭剂或第二猝灭剂；

包含第二可检测引物的第二核酸，其中所述第二可检测引物包含第二荧光团和猝灭剂或第二猝灭剂；

与第二可检测引物杂交的第二核酸，其中所述第二可检测引物包含第二荧光团；

包含第二可检测引物的第二核酸，其中所述第二可检测引物包含第二荧光团；

包含第二引物并且与探针杂交的第二核酸，其中所述探针包含第一荧光团和猝灭剂，所述第二引物包含第三荧光团，并且所述第一荧光团与第三荧光团为FRET对；或

包含第二引物并且与探针杂交的第二核酸，其中所述探针包含第一荧光团，所述第二引物包含第三荧光团，并且所述第一荧光团与第三荧光团为FRET对。

在一些包含猝灭剂寡核苷酸的实施方案中，所述猝灭剂寡核苷酸为包含猝灭剂或第二猝灭剂的第二猝灭寡核苷酸。相关的实施方案提供如本文所提供的组合物用于检测一个或多个等位基因、检测一个或多个单核苷酸多态性和/或在多重测定中检测同一样品中的超过一个等位基因的用途。

进一步的实施方案提供包含(例如，用于检测核酸(例如，包含BRAF基因或部分BRAF基因的核酸，如，包含BRAF突变的核酸，如，包含编码含有氨基酸置换的B-Raf蛋白的BRAF突变的核酸，例如，包含编码含有V600E、V600K和/或V600D氨基酸置换的B-Raf蛋白的BRAF突变的核酸)的)检测试剂的试剂盒，其中所述检测试剂包含下列之一：

包含荧光团和猝灭剂的茎-环引物；

包含含有荧光团的等位基因特异性单链引物和互补的猝灭寡核苷酸的双链线性引物；

包含含有荧光团的等位基因特异性单链引物和互补寡核苷酸的双链线性引物；

包含荧光团的等位基因特异性引物和包含含有第二荧光团的探针链和猝灭剂寡核苷酸的双链探针；

包含荧光团的等位基因特异性引物和包含含有第二荧光团的探针链的双链探针；或

包含荧光团的等位基因特异性引物和包含第二荧光团和猝灭剂的茎-环探针。

在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包含对照核酸。

在一些实施方案中，所述试剂盒提供超过一个等位基因、SNP、基因、突变等的多重检测。因此，在一些实施方案中所述试剂盒进一步包含第二检测试剂，其中所述第二检测试剂包含下列之一：

包含第二荧光团和猝灭剂或第二猝灭剂的第二茎-环引物；

包含含有第二荧光团的第二等位基因特异性单链引物和互补的猝灭寡核苷酸或第二互补的猝灭寡核苷酸的第二双链线性引物；或

包含第三荧光团的第二等位基因特异性引物。

试剂盒包含探针，在一些实施方案中，例如：

包含含有第四荧光团的第二探针链和猝灭剂寡核苷酸的第二双链探针；

包含含有第四荧光团的第二探针链和第二猝灭剂寡核苷酸的第二双链探针；

包含第四荧光团和猝灭剂的第二茎-环探针；或

包含第四荧光团和第二猝灭剂的第二茎-环探针。

在一些实施方案中，包含第二等位基因特异性引物的试剂盒还包括：包含含有第二荧光团的探针链和猝灭剂寡核苷酸的双链探针(例如，同样与第一等位基因特异性引物一起使用的探针)。在一些实施方案中，包含第二等位基因特异性引物的试剂盒还包括：包含含有第二荧光团的探针链的双链探针(例如，同样与第一等位基因特异性引物一起使用的探针)。

如上所述，在一些实施方案中，所有的探针均包含与每个引物受体荧光团的荧光团形成FRET对的相同供体荧光团。在一些实施方案中，不同的引物-探针对使用不同的受体-供体FRET对。因此，在一些实施方案中荧光团与第二荧光团为FRET对，第三荧光团与第二荧光团为FRET对，或第三荧光团与第四荧光团为FRET对。

因此，本文提供用于检测样品中核酸的方法的实施方案，所述方法包含使包含核酸的样品与猝灭状态的探针接触；和如果引物与核酸杂交或引物与核酸杂交并且引物掺入到扩增子中，则检测来自可检测状态的引物的信号，其中所述核酸包含BRAF基因或部分BRAF基因并且当检测到信号时在样品中检测到核酸。在一些实施方案中，猝灭状态的引物包含双链的双链体区域。在一些实施方案中，所述信号为荧光。在一些实施方案中，所述引物包含荧光团，并且当引物处于猝灭状态时荧光团被猝灭剂猝灭。在一些实施方案中，荧光团为FAM、TET、JOE、HEX、TAMRA、ROX、Cy3、Cy5或Cy5.5；并且猝灭剂为BHQ-1、BHQ-2或BHQ-3。在一些实施方案中，猝灭状态的引物通过聚合酶掺入到核酸链中。

此外，在一些实施方案中，所述猝灭状态的引物由包含荧光团和猝灭剂的一个寡核苷酸组成；或由包含荧光团的第一寡核苷酸和包含猝灭剂的第二寡核苷酸组成，其中第一寡核苷酸与第二寡核苷酸杂交。

在一些实施方案中，扩增子包含可检测状态的引物。在一些实施方案中，所述引物为茎-环引物或双链线性引物。

在一些实施方案中，所述引物为用于检测BRAF中的突变的等位基因特异性引物，例如，所述引物为用于检测编码包含氨基酸置换的B-Raf蛋白的BRAF中的突变的等位基因特异性引物，例如，所述引物为用于检测编码包含V600E、V600K和/或V600D氨基酸置换的B-Raf蛋白的BRAF中的突变的等位基因特异性引物。

在一些实施方案中，方法进一步包括，例如，通过进行聚合酶链反应，例如，实时聚合酶链反应，用聚合酶和核苷酸延伸杂交的猝灭状态引物。

在一些实施方案中，方法进一步包含使包含核酸的样品与猝灭状态的第二引物接触；和如果第二引物与核酸杂交或第二引物与核酸杂交并且第二引物掺入到扩增子中，则检测来自可检测状态的第二引物的第二信号，其中当检测到第二信号时，在样品中检测到核酸。

一些实施方案提供用于检测样品中核酸的方法，所述方法包括使包含核酸的样品与猝灭状态的引物和探针或未激发状态的探针接触；和如果探针与包含引物的核酸的互补序列杂交，则检测来自引物的信号，其中检测到信号时在样品中检测到核酸。在一些实施方案中，猝灭状态的探针包含双链的双链体区域。在一些实施方案中，所述信号为荧光。在一些实施方案中，所述探针包含荧光团，并且当探针在猝灭状态下时荧光团被猝灭剂猝灭。在一些实施方案中，荧光团选自FAM、TET、JOE、HEX、TAMRA、ROX、Cy3、Cy5和Cy5.5；并且猝灭剂选自BHQ-1、BHQ-2和BHQ-3。在一些实施方案中，所述引物包含第二荧光团，其为与探针荧光团相容的荧光共振能量转移(FRET)受体。

一些实施方案提供猝灭状态的探针由包含荧光团和猝灭剂的一个寡核苷酸组成；或由包含荧光团的第一寡核苷酸和包含猝灭剂的第二寡核苷酸组成，其中第一寡核苷酸与第二寡核苷酸杂交。

在一些实施方案中，核酸的互补序列包含引物并且探针与核酸的互补序列杂交。在一些实施方案中，探针为茎-环探针或双链线性探针。

在一些实施方案中，所述引物为用于检测BRAF中的突变的等位基因特异性引物，例如，引物为用于检测编码包含氨基酸置换的B-Raf蛋白的BRAF中的突变的等位基因特异性引物，例如，引物为用于检测编码包含V600E、V600K和/或V600D氨基酸置换的B-Raf蛋白的BRAF中的突变的等位基因特异性引物。

在一些实施方案中，所述方法进一步包括，例如，通过进行聚合酶链反应，例如，实时聚合酶链反应，用聚合酶和核苷酸延伸猝灭状态的杂交引物。

在一些实施方案中，所述方法进一步包括使包含核酸的样品与第二引物接触；和如果探针与包含第二引物的核酸的互补序列杂交，则检测来自第二引物的信号，其中当检测到第二信号时在样品中检测到核酸。

另外的实施方案提供一种组合物(例如，反应混合物)，其包含聚合酶、核苷酸和下列之一：与可检测的引物杂交的核酸(例如，包含BRAF基因或部分BRAF基因的核酸)，其中可检测的引物包含荧光团和猝灭剂；包含可检测的引物的核酸(例如，包含BRAF基因或部分BRAF基因的核酸)，其中可检测的引物包含荧光团和猝灭剂；与可检测的引物杂交的核酸(例如，包含BRAF基因或部分BRAF基因的核酸)，其中可检测的引物包含荧光团，和包含猝灭剂的猝灭剂寡核苷酸；包含可检测的引物的核酸(例如，包含BRAF基因或部分BRAF基因的核酸)，其中可检测的引物包含荧光团，和包含猝灭剂的猝灭剂寡核苷酸；包含引物并且与探针杂交的核酸(例如，包含BRAF基因或部分BRAF基因的核酸)，其中探针包含第一荧光团和猝灭剂，引物包含第二荧光团，并且第一荧光团与第二荧光团为FRET对；或包含引物并且与探针杂交的核酸(例如，包含BRAF基因或部分BRAF基因的核酸)，其中探针包含第一荧光团，引物包含第二荧光团，并且第一荧光团与第二荧光团为FRET对，和包含猝灭剂的猝灭剂寡核苷酸。实施方案提供荧光团为FAM、TET、JOE、HEX、TAMRA、ROX、Cy3、Cy5或Cy5.5；并且猝灭剂为BHQ-1、BHQ-2或BHQ-3。

实施方案提供进一步包含以下的组合物：与第二可检测的引物杂交的第二核酸(例如，包含BRAF基因或部分BRAF基因的核酸)，其中第二可检测的引物包含第二荧光团和猝灭剂或第二猝灭剂；包含第二可检测的引物的第二核酸(例如，包含BRAF基因或部分BRAF基因的核酸)，其中第二可检测的引物包含第二荧光团和猝灭剂或第二猝灭剂；与第二可检测的引物杂交的第二核酸(例如，包含BRAF基因或部分BRAF基因的核酸)，其中第二可检测的引物包含第二荧光团；包含第二可检测的引物的第二核酸(例如，包含BRAF基因或部分BRAF基因的核酸)，其中第二可检测的引物包含第二荧光团；包含第二引物并且与探针杂交的第二核酸(例如，包含BRAF基因或部分BRAF基因的核酸)，其中探针包含第一荧光团和猝灭剂，第二引物包含第三荧光团，并且第一荧光团与第三荧光团为FRET对；或包含第二引物并且与探针杂交的第二核酸(例如，包含BRAF基因或部分BRAF基因的核酸)，其中探针包含第一荧光团，第二引物包含第三荧光团，并且第一荧光团与第三荧光团为FRET对。一些实施方案提供所述组合物包含含有猝灭剂或第二猝灭剂的第二猝灭剂寡核苷酸。

所述技术可用于例如，检测一个或多个BRAF等位基因，检测一个或多个BRAF单核苷酸多态性，和在多重测定中检测同一样品中的超过一个BRAF等位基因。

因此，实施方案提供一种用于检测BRAF等位基因的试剂盒。例如，试剂盒的实施方案包含用于检测一个或多个BRAF等位基因的检测试剂和含有BRAF基因或部分BRAF基因的对照核酸，其中所述检测试剂包含下列之一：包含荧光团和猝灭剂的茎-环引物；包含含有荧光团的等位基因特异性单链引物和互补猝灭寡核苷酸的双链线性引物；包含含有荧光团的等位基因特异性单链引物和互补寡核苷酸的双链线性引物；包含荧光团的等位基因特异性引物和包含含有第二荧光团的探针链和猝灭寡核苷酸的双链探针；包含荧光团的等位基因特异性引物和包含含有第二荧光团的探针链的双链探针；包含荧光团的等位基因特异性引物和包含第二荧光团的单链探针；或包含荧光团的等位基因特异性引物和包含第二荧光团和猝灭剂的茎-环探针。

在一些实施方案中，试剂盒进一步包含用于检测第二BRAF等位基因的第二检测试剂，其中第二检测试剂包含下列之一：包含第二荧光团和猝灭剂或第二猝灭剂的第二茎-环引物；包含含有第二荧光团的第二等位基因特异性单链引物和互补猝灭寡核苷酸或第二互补猝灭寡核苷酸的第二双链线性引物；或包含第三荧光团的第二等位基因特异性引物。

一些试剂盒的实施方案进一步包括第二双链探针，其包含含有第四荧光团的第二探针链和猝灭剂寡核苷酸；第二双链探针，其包含含有第四荧光团的第二探针链和第二猝灭剂寡核苷酸；包含第四荧光团和猝灭剂的第二茎-环探针；包含第四荧光团和第二猝灭剂的第二茎-环探针或包含第四荧光团的第二单链探针。实施方案提供荧光团的两个或更多个(例如，荧光团、第二荧光团、第三荧光团、第四荧光团等)为FRET对，例如，荧光团与第二荧光团为FRET对，第三荧光团与第二荧光团为FRET对，或第三荧光团与第四荧光团为FRET对。试剂盒提供用于检测BRAF等位基因，例如，编码包含氨基酸置换的B-Raf蛋白的BRAF等位基因，例如，编码包含V600E、V600K和/或V600D氨基酸置换的B-Raf蛋白的BRAF等位基因的检测试剂。

此外，提供用于检测样品中核酸(例如，BRAF核酸)的方法的实施方案，例如，包括以下的方法：使包含核酸的样品与猝灭状态(例如，引物包含双链的双链体区域和/或当引物为猝灭状态时荧光团被猝灭剂(例如，BHQ-1、BHQ-2和BHQ-3)猝灭(例如，引物由包含荧光团和猝灭剂的寡核苷酸组成(例如，引物为茎-环引物)或引物由包含荧光团的第一寡核苷酸和包含猝灭剂的第二寡核苷酸组成，其中第一寡核苷酸与第二寡核苷酸杂交(例如，引物为双链线性引物)))的引物(例如，等位基因特异性引物(例如，编码包含V600E、V600K和/或V600D氨基酸置换的B-Raf蛋白的BRAF突变的等位基因特异性引物)，例如，包含荧光团(例如，FAM、TET、JOE、HEX、TAMRA、ROX、Cy3、Cy5和Cy5.5)的引物))；引物(例如，等位基因特异性引物(例如，编码包含V600E、V600K和/或V600D氨基酸置换的B-Raf蛋白的BRAF突变的等位基因特异性引物))和猝灭状态(例如，探针包含双链的双链体区域和/或当探针为猝灭状态时荧光团被猝灭剂(例如，BHQ-1、BHQ-2和BHQ-3)猝灭(例如，探针由包含荧光团和猝灭剂的寡核苷酸组成(例如，探针为茎-环探针)或探针由包含荧光团的第一寡核苷酸和包含猝灭剂的第二寡核苷酸组成，其中第一寡核苷酸与第二寡核苷酸杂交(例如，探针为双链线性探针)))的探针(例如，包含荧光团(例如，FAM、TET、JOE、HEX、TAMRA、ROX、Cy3、Cy5和Cy5.5)的探针)；或引物(例如，编码包含V600E、V600K和/或V600D氨基酸置换的B-Raf蛋白的BRAF突变的等位基因特异性引物)，例如，包含荧光团(例如，FAM、TET、JOE、HEX、TAMRA、ROX、Cy3、Cy5和Cy5.5)的引物)和未激发状态的探针(例如，包含荧光团(例如，FAM、TET、JOE、HEX、TAMRA、ROX、Cy3、Cy5和Cy5.5)的探针)接触，然后如果引物与核酸杂交，则检测来自可检测状态的引物的信号(例如，荧光信号)；如果引物与核酸杂交并且该引物被掺入到扩增子中(例如，猝灭状态的引物被聚合酶掺入核酸链中)，则检测来自可检测状态的引物的信号(例如，荧光信号)，或如果探针与包含引物的核酸的互补序列杂交(例如，引物包含为与包含荧光团的探针的荧光团相容的荧光共振能量转移(FRET)受体的荧光团)，则检测来自引物的信号(例如，荧光信号)；和，在一些实施方案中，进行聚合酶链反应(例如，实时聚合酶链反应)，其中所述核酸包含BRAF基因或部分BRAF基因并且当检测到信号时在样品中检测到该核酸。

在一些实施方案中，所述技术提供包括以下的方法：使包含核酸的样品与猝灭状态(例如，每个引物包含双链的双链体区域和/或当各引物处于猝灭状态时每个引物的荧光团被猝灭剂(例如，BHQ-1、BHQ-2和BHQ-3)猝灭(例如，引物由包含荧光团和猝灭剂的一个寡核苷酸组成(例如，引物为茎-环引物)或引物由包含荧光团的第一寡核苷酸和包含猝灭剂的第二寡核苷酸组成，其中第一寡核苷酸与第二寡核苷酸杂交(例如，引物为双链线性引物)))的多个引物(例如，多个等位基因特异性引物(例如，编码包含V600E、V600K和/或V600D氨基酸置换的B-Raf蛋白的一个或多个BRAF突变的多个等位基因特异性引物，例如每个包含荧光团(例如，FAM、TET、JOE、HEX、TAMRA、ROX、Cy3、Cy5和Cy5.5)的多个引物)；多个引物(例如，多个等位基因特异性引物(例如，编码包含V600E、V600K和/或V600D氨基酸置换的B-Raf蛋白的一个或多个BRAF突变的多个等位基因特异性引物))和猝灭状态(例如，探针包含双链的双链体区域和/或当探针处于猝灭状态时荧光团被猝灭剂(例如，BHQ-1、BHQ-2和BHQ-3)猝灭(例如，探针由包含荧光团和猝灭剂的一个寡核苷酸组成(例如，探针为茎-环探针)或探针由包含荧光团的第一寡核苷酸和包含猝灭剂的第二寡核苷酸组成，其中第一寡核苷酸与第二寡核苷酸杂交(例如，探针为双链线性探针)))的探针(例如，包含荧光团(例如，FAM、TET、JOE、HEX、TAMRA、ROX、Cy3、Cy5和Cy5.5)的探针)；或多个引物(例如，多个等位基因特异性引物(例如，编码包含V600E、V600K和/或V600D氨基酸置换的B-Raf蛋白的一个或多个BRAF突变的多个等位基因特异性引物)，例如，每个引物包含荧光团(例如，FAM、TET、JOE、HEX、TAMRA、ROX、Cy3、Cy5和Cy5.5))和未激发状态的探针(例如，包含荧光团(例如，FAM、TET、JOE、HEX、TAMRA、ROX、Cy3、Cy5和Cy5.5)的探针)接触；然后如果一个或多个引物与核酸杂交，则检测来自多个引物中可检测状态的一个或多个引物的一个或多个信号(例如，一个或多个荧光信号)；如果一个或多个引物与核酸杂交并且一个或多个引物掺入到扩增子中(例如，猝灭状态的引物被聚合酶掺入到核酸链中)，则检测来自多个引物中可检测状态的一个或多个引物的一个或多个信号(例如，一个或多个荧光信号)；或如果探针与包含多个引物的一个引物的核酸的互补序列杂交(例如，每个引物包含一个为与包含荧光团的探针的荧光团相容的荧光共振能量转移(FRET)受体的荧光团)，则检测来自一个或多个引物的一个或多个信号(例如，一个或多个荧光信号)；和在一些实施方案中，进行聚合酶链反应(例如，实时聚合酶链反应)，其中核酸包含BRAF基因或部分BRAF基因并且当检测到信号时在样品中检测到该核酸。

实施方案提供用于检测BRAF等位基因的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包含用于检测一个或多个BRAF等位基因(例如，包含编码含有V600E、V600K和/或V600D氨基酸置换的B-Raf蛋白的突变)的检测试剂，例如，包含荧光团和猝灭剂的茎-环引物、包含含有荧光团的等位基因特异性单链引物和互补猝灭寡核苷酸的双链线性引物、包含含有荧光团的等位基因特异性单链引物和互补寡核苷酸的双链线性引物、包含荧光团的等位基因特异性引物和包含含有第二荧光团的探针链和猝灭寡核苷酸的双链探针、包含荧光团的等位基因特异性引物和包含含有第二荧光团的探针链的双链探针、包含荧光团的等位基因特异性引物和包含第二荧光团的单链探针、或包含荧光团的等位基因特异性引物和包含第二荧光团和猝灭剂的茎-环探针，任选地，用于检测第二BRAF等位基因的第二检测试剂，其中第二检测试剂包括含有第二荧光团和猝灭剂或第二猝灭剂的第二茎-环引物、包含含有第二荧光团的第二等位基因特异性单链引物和互补猝灭寡核苷酸或第二互补猝灭寡核苷酸的第二双链线性引物，或包含第三荧光团的第二等位基因特异性引物(和，任选地，包含含有第四荧光团的第二探针链和猝灭剂寡核苷酸的第二双链探针，包含含有第四荧光团的第二探针链和第二猝灭剂寡核苷酸的第二双链探针，包含第四荧光团和猝灭剂的第二茎-环探针，包含第四荧光团和第二猝灭剂的第二茎-环探针，和/或包含第四荧光团的第二单链探针)；和包含来自BRAF基因或来自部分BRAF基因的核苷酸序列的对照核酸。在一些实施方案中，本文所提供的试剂盒包含为FRET对的两个荧光团(例如，荧光团、第二荧光团、第三荧光团和第四荧光团中的任两个(或多个)荧光团为FRET对)。

基于本文所包含的教导，额外的实施方案将对相关领域的技术人员显而易见。

附图简述

本技术的这些和其他特征、方面和优点将关于下列附图变得更容易理解：

图1为显示本技术的实施方案的绘图。

图2为显示本技术的实施方案的绘图。

图3为显示使用本技术的实施方案所进行的实验的示意图的绘图。

图4为显示使用本技术的实施方案所进行的实验的示意图的绘图。

图5为在检验本技术的实施方案期间收集的实时PCR数据的图。

图6为来自用本技术的实施方案进行的检测BRAF突变体核酸的实时PCR实验的数据的图。

图7为来自用本技术的实施方案进行的检测BRAF突变体核酸的实时PCR实验的数据的图。

应理解的是，图不一定按比例绘制，图中的物件也不一定按彼此的关系成比例绘制。附图为意在使本文所公开的装置、系统和方法的各种实施方案清楚和便于理解的描述。只要有可能，相同的参考编号将应用于整个附图来指相同或相似的部分。此外，应理解的是附图并不意在以任何方式限制本教导的范围。

发明详述

本文提供了涉及核酸检测和特别地，但不排他地，涉及用于同时检测多个核酸(例如，多个等位基因例如多个SNPs)的方法和组合物的技术。一般而言，所述技术使用如下文更详细描述的用荧光团和猝灭剂标记的引物和探针。在一些实施方案中，本文所提供的技术允许从一个均一扩增反应，检测、鉴定和/或报告多重SNPs或基因型。

本文所用的部分标题仅仅是为了组织目的而不被理解为以任何方式限制所述的主题。

在该各种实施方案的详述中，为了解释目的，阐述了许多具体的细节以提供对所公开实施方案的透彻理解。然而，本领域技术人员将理解的是，这些各种各样的实施方案可有或没有这些具体的细节而实践。在其他情况中，结构和装置以方框图的形式示出。此外，本领域技术人员可容易地理解方法被呈现和实施的具体顺序为说明性的，并且可以预见的是，顺序可被改变且仍然在本文所公开的各种实施方案的精神和范围内。

本申请所引用的所有文献和相似材料，包含但不限于专利、专利申请、文章、书籍、论文和因特网网页均通过引用以其整体明确结合到本文中用于任何目的。除非另外定义，本文所用的所有技术和科学术语具有与本文所述各种实施方案所属领域的普通技术人员所通常理解的相同的含义。当结合的参考中术语的定义似乎与本教导所提供的定义不同时，应以本教导所提供的定义为准。

定义

为了便于理解所述技术，下文定义了多个术语和短语。额外的定义贯穿整个详述说明。

在整个说明书和权利要求书中，下列术语取与本文明确相关的含义，除非上下文明确指出。如本文所使用的短语“在一个实施方案中”虽然有可能，但并不一定指相同的实施方案。此外，如本文所使用的短语“在另一个实施方案中”虽然有可能，但并不一定指不同的实施方案。因此，如下所述，所述发明的多个实施方案可容易地组合，而不脱离发明的范围或精神。

另外，如本文所使用的术语“或者”为包括在内的“或”操作符并且相当于术语“和/或”，除非上下文明确指出。术语“基于”并非排他地，并且允许基于非所述的额外因素，除非上下文明确指出。另外，在整个说明书中，“一个”、“一种”和“所述”的含义包括复数对象。“在其中”的含义包括“在其中”和“在其上”。

如本文所使用的，“多态性序列”指能够变更的任何核苷酸序列并且“等位基因”指一种这样的变更。优选地，这样的变更在生物群体中常见并且以孟德尔方式遗传。这种等位基因可能或可能不与表型相关。“单核苷酸多态性”(或“SNP”)为以仅一个核苷酸的序列变更为特征的“多态性序列”的一个类型。术语“单体型”指个体单染色体上的基因座中一个或多个多态性位点(优选地，至少两个多态位点)上存在的核苷酸的5′到3′序列。术语“基因型”指个体同源染色体对上的基因座中一个或多个多态性位点上存在的核苷酸对的5′到3′序列。术语“核苷酸变更”指DNA序列中特定位置上的在除此之外序列相似的连续DNA片段之间的核苷酸多态性。这样的连续DNA片段包括基因或染色体的任何其它部分。核苷酸变更的实例为缺失、插入和置换。

术语“寡核苷酸”或“多核苷酸”或“核苷酸”或“核酸”是指由两个或更多个，优选地超过三个并且通常超过十个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸组成的分子。精确的大小将取决于许多因素，其继而取决于寡核苷酸最终的功能或用途。寡核苷酸可以以多种方式产生，包括化学合成、DNA复制、逆转录或其组合。

如本文所使用的术语“引物”是指当放置在诱导与核酸链(模板)互补的引物延伸产物合成的条件下时(例如，在核苷酸和聚合试剂例如DNA聚合酶的存在下以及在合适的温度和pH下)，能够充当合成起始点的寡核苷酸。在一些实施方案中，引物为单链的并且在一些实施方案中引物为部分或完全双链的。在一些实施方案中，引物为寡脱氧核糖核苷酸。

在一些实施方案中，引物以若干备选的构象或状态存在，其中的一些包含双链的双链体区域和/或单链区域。在一些实施方案中，双链的双链体区域的杂交单链组分解离(“熔解”)形成单链引物。在一些实施方案中，引物包含可检测的标记(例如，荧光团)。在一些实施方案中引物可采取猝灭状态(例如，荧光团，例如被猝灭部分猝灭，并且引物为“猝灭的引物”)和可检测(未猝灭)状态(例如，荧光团处于未猝灭状态并且引物为“可检测引物”)；此外，在一些实施方案中，引物可从猝灭状态(如本文所使用的“猝灭引物”)转化为可检测状态(如本文所使用的“可检测引物”)并且引物可从可检测状态转化为猝灭状态。例如，在一些实施方案中引物群包含两种状态，例如，互相平衡的猝灭和可检测状态。引物的化学和/或物理环境的变化可改变从猝灭状态向可检测状态转化和从可检测状态向猝灭状态转化的热力学和/或动力学以至于猝灭状态的引物群和可检测状态的引物群发生变化。

引物可包含天然存在的dNMP(例如，dAMP、dGMP、dCMP和dTMP)、修饰的核苷酸或非天然核苷酸。引物也可包含核糖核苷酸。例如，该技术所使用的引物可包括骨架修饰的核苷酸，例如肽核酸(PNA)(Egholm等(1993)Nature,365:566–568)、硫代磷酸酯DNA、二硫代磷酸酯DNA、氨基磷酸酯DNA、连接酰胺的DNA、连接MMI的DNA、2′-O-甲基RNA、α-DNA和甲基膦酸酯DNA，糖基修饰的核苷酸例如2′-O-甲基RNA、2′-氟RNA、2′-氨基RNA、2′-O-烷基DNA、2′-O-烯丙基DNA、2′-O-炔基DNA、己糖DNA、吡喃糖基RNA和失水己糖醇DNA和碱基修饰的核苷酸例如C-5取代的嘧啶类(取代基包括氟、溴、氯、碘、甲基、乙基、乙烯基、甲酰基、乙炔基、丙炔基、炔基、噻唑基、咪唑基和吡啶基)、具有C-7取代基的7-去氮嘌呤(取代基包括氟、溴、氯、碘、甲基、乙基、乙烯基、甲酰基、炔基、烯基、噻唑基、咪唑基和吡啶基)、肌苷和二氨基嘌呤。

引物足够长以在聚合试剂存在下引发延伸产物的合成。引物的精确长度取决于许多因素，包括温度、应用和引物来源。如本文所使用的术语“退火”或“引发”指寡脱氧核苷酸或核酸与模板核酸的并置(apposition)，借此并置使聚合酶能够将核苷酸聚合到与模板核酸或其部分互补的核酸分子内。如本文所使用的术语“杂交”指从互补单链核酸形成双链核酸。无意区分术语“退火”和“杂交”，并且这些术语将可交换地使用。引物序列可包含一些错配，只要其可与模板杂交并且充当引物。术语“基本互补的”在本文中用于表示在指定的退火条件下或严格条件下引物的互补性足以选择性地与模板核酸序列杂交，以至于退火的引物可以被聚合酶延伸形成模板的互补拷贝。

如本文所使用的，术语“探针”指能够与另一目的寡核苷酸的至少一部分杂交的寡核苷酸(即，核苷酸序列)，无论是在纯化的限制酶消化产物中天然存在还是合成、重组或通过PCR扩增生成。探针可为单链的或双链的。探针可用于检测、鉴定和分离特定基因序列。

在一些实施方案中，核酸(例如，引物和探针)包含通用的或修饰的碱基例如脱氧肌苷、肌苷、7-去氮-2′-脱氧肌苷、2-氮杂-2′-脱氧肌苷、2′-O-甲基肌苷、2′-F肌苷、脱氧3-硝基吡咯、3-硝基吡咯、2′-O-甲基3-硝基吡咯、2′-F3-硝基吡咯、1-(2′-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯、脱氧5-硝基吲哚、5-硝基吲哚、2′-O-甲基5-硝基吲哚、2′-F5-硝基吲哚、脱氧4-硝基苯并咪唑、4-硝基苯并咪唑、脱氧4-氨基苯并咪唑、4-氨基苯并咪唑、脱氧水粉蕈素、2′-F水粉蕈素、2′-F4-硝基苯并咪唑、PNA-5-硝基吲哚、PNA-水粉蕈素、PNA-肌苷、PNA-4-硝基苯并咪唑、PNA-3-硝基吡咯、吗啉基-5-硝基吲哚、吗啉基-水粉蕈素、吗啉基-肌苷、吗啉基-4-硝基苯并咪唑、吗啉基-3-硝基吡咯、氨基磷酸酯基-5-硝基吲哚、氨基磷酸酯基-水粉蕈素、氨基磷酸酯基-肌苷、氨基磷酸酯基-4-硝基苯并咪唑、氨基磷酸酯基-3-硝基吡咯、2′-O-甲氧乙基肌苷、2′-O-甲氧乙基水粉蕈素、2′-O-甲氧乙基5-硝基吲哚、2′-O-甲氧乙基4-硝基-苯并咪唑、2′-O-甲氧乙基3-硝基吡咯和其组合。

下述术语用于描述两个或更多个多核苷酸之间的序列关系：“参考序列”、“序列同一性”、“序列同一性百分比”和“基本同一性”。“参考序列”为用作序列比较基础的定义序列；参考序列可为较大序列的子集，例如，作为序列表中所给出的全长cDNA序列的片段或可包含完整的基因序列。通常，参考序列在至少20个核苷酸长，往往至少25个核苷酸长，并且经常至少50个核苷酸长。由于两个多核苷酸可各自(1)包含在两个多核苷酸之间相似的序列(即，完整多核苷酸序列的一部分)，和(2)可进一步包含在两个多核苷酸之间相异的序列，两个(或多个)多核苷酸之间的序列比较通常通过在“比较窗口”中比较两个多核苷酸序列而进行以鉴定和比较序列相似性的局部区域。“比较窗口”，如本文所使用的，是指至少20个连续核苷酸位置的概念性片段，其中可将多核苷酸序列与至少20个连续核苷酸的参考序列比较，并且其中对于两个序列的最佳对齐所述多核苷酸序列在比较窗口中的部分与参考序列(其不包含添加和缺失)相比可包含20%或更少的添加或缺失(即，缺口)。用于对齐比较窗口的序列的最佳对齐可通过Smith和Waterman[Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)]的局部同源性算法、通过Needleman和Wunsch[Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)]的同源性比对算法、通过搜索Pearson和Lipman[Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)85:2444(1988)]的相似性方法、通过这些算法的计算机化实施方式(WisconsinGeneticsSoftwarePackageRelease7.0,GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.,Madison,Wis.中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)或通过检查来进行，并且选择通过多种方法选择的最佳比对(即，在比较窗口中产生最高同源性百分比)。术语“序列同一性”意指两个多核苷酸序列在比较窗口中是同一的(即在核苷酸接核苷酸(nucleotide-by-nucleotide)的基础上)。术语“序列同一性百分比”如下计算：在比较窗口中比较两个最佳比对的序列，测定在两个序列中出现的同一核酸碱基(例如，A、T、C、G、U或I)位置的数目以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗口中的位置总数(即窗口大小)并将结果乘以100，得到序列同一性的百分数。如本文所使用的术语“基本同一性”表示多核苷酸序列的特征，其中所述多核苷酸包含在至少20个核苷酸位置的比较窗口中，往往至少25-50个核苷酸的窗口中与参考序列相比具有至少85%序列同一性，优选地至少90%-95%序列同一性，通常99%序列同一性的序列，其中序列同一性百分数通过比较参考序列与可包含总共比较窗口中参考序列的20%或更少的缺失或增加的多核苷酸序列计算。参考序列可为较大序列的子集，例如，作为本发明中所要求保护的组合物的全长序列的部分。

当关于双链核酸序列例如cDNA或基因组克隆使用时，术语“基本同源的”是指在如上所述由低至高严格性的条件下可与双链核酸序列中的一条或两条杂交的任何探针。

当关于单链核酸序列使用时，术语“基本同源的”是指在如上所述由低至高严格性的条件下可与单链核酸序列杂交(即，为其互补序列)的任何探针。

如本文所使用的，术语“互补的”或“互补性”参照通过碱基配对规则相关的多核苷酸(例如，核苷酸序列)使用。例如，序列5′-A-G-T-3′与序列3′-T-C-A-5′互补。互补性可为“部分的”，其中仅核酸碱基的一些依照碱基配对规则匹配。或者在核酸之间可存在“完全的”或“总体的”互补性。核酸链之间互补性的程度对核酸链之间杂交的效率和强度具有显著作用。这在扩增反应和取决于杂交的检测方法中特别重要。如本文所使用的，寡核苷酸、多核苷酸、核苷酸或核酸的“互补序列(complement)”指根据碱基配对规则与所述寡核苷酸、多核苷酸、核苷酸或核酸完全或部分互补的寡核苷酸、多核苷酸、核苷酸或核酸。

如本文所使用的，术语“杂交(hybridization)”或“杂交(hybridize)”关于互补核酸的配对使用。杂交和杂交的强度(例如，核酸之间的结合强度)受到诸如核酸之间的互补程度、所涉及条件的严格性、所形成的杂交体的熔解温度(T_m)和核酸内部G:C的比率等因素的影响。在其结构中包含互补核酸对的单分子被称为“自我-杂交”。对核酸杂交的广泛指导可见于Tijssen的生物化学与分子生物学实验室技术-与核酸探针的杂交，第I部分，第2章，“Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidprobeassays(杂交原理与核酸探针测定策略综述)”,Elsevier(1993)，其通过引用结合。

生物聚合物(例如，核酸)的“序列”指该生物聚合物中单体单元(例如，核苷酸等)的顺序和同一性。核酸的序列(例如，碱基序列)通常从5′到3′方向阅读。

术语“检测(detect)”、“检测(detecting)”或“检测(detection)”指确定样品中一个或多个靶(例如，核酸、扩增子等)出现或存在情况的行为。

术语“野生型”当关于基因使用时指具有从天然存在的来源分离的基因的特征的基因。术语“野生型”当关于基因产物使用时指具有从天然存在的来源中分离的基因产物的特征的基因产物。术语“天然存在”应用于物体时指该物体可在自然界中找到。例如，存在于生物体(包括病毒)中的可从自然来源分离的并且未在实验室中被人有意修饰的多肽或多核苷酸序列为天然存在的。野生型基因往往为在群体中最频繁地观察到的基因，因此被任意指定为“正常的”或“野生型的”基因形式。相反地，术语“修饰的”或“突变的”当关于基因或基因产物使用时分别指当与野生型基因或基因产物相比时显示序列和/或功能性质修饰(即，改变的性质)的基因或基因产物。应指出的是天然存在的突变体可被分离；这些可通过与野生型基因或基因产物相比时其具有改变的性质这一事实来鉴定。

如本文所使用的，核酸(DNA、RNA等)的“扩增”指在核酸序列混合物中特定核酸序列浓度的增加。“扩增子”为扩增的靶核酸序列。在一些实施方案中，扩增依照PCR(聚合酶链反应)实施。用于通过引物退火、引物延伸和变性扩增DNA分子的过程为本领域技术人员所熟知。合适的退火和杂交条件依惯例而定。条件例如温度、组分的浓度、杂交和洗涤时间、缓冲液组分和其pH及离子强度随多种因素，包括引物长度和GC含量以及靶核苷酸序列变化。杂交的详细条件可见于JosephSambrook等，MolecularCloning,ALaboratoryManual(分子克隆，实验室手册),ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(2001);和M.L.M.Anderson,NucleicAcidHybridization(核酸杂交),Springer-VerlagNewYorkInc.N.Y.(1999)。在一些实施方案中，信号可在PCR(例如，“实时PCR”)期间连续或在多个离散的时间点监测并且在一些实施方案中信号在PCR完成后监测(有时称为““终点PCR”)。实时PCR的数据常常报告为作为PCR循环函数的所监测到的荧光报告部分的强度。

当mRNA用作起始原料时，进行退火步骤之前逆转录步骤是有用的，详见JosephSambrook等，MolecularCloning,ALaboratoryManual(分子克隆，实验室手册),ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(2001)和Noonan,K.F.等(1988)nucleicacidsRes. 16:10366)。对于逆转录，常常使用能够与mRNApolyA尾巴杂交的寡核苷酸dT引物。寡核苷酸dT引物包含dTMPs，其中的一个或多个可被其它dTMPs替换，只要该dT引物可用作引物。逆转录用具有RNaseH活性的逆转录酶进行。如果使用具有RNaseH活性的酶，常常通过仔细选择反应条件而省略单独的RNaseH消化步骤。

本方法的延伸步骤可使用多种DNA聚合酶，包括E.coliDNA聚合酶I的“Klenow”片段、热稳定的DNA聚合酶和噬菌体T7DNA聚合酶。优选地，所述聚合酶为热稳定的DNA聚合酶，其从多种细菌物种获得，包括栖热水生菌(Thermusaquaticus，Taq)、嗜热栖热菌(Thermusthermophilus，Tth)、丝状栖热菌(Thermusfiliformis)、黄栖热菌(Thermisflavus，Tfl)、嗜热高温球菌(Thermococcusliteralis)和强烈火球菌(Pyrococcusfuriosus，Pfu)。当聚合反应正在进行时，一些实施方案提供在反应容器中过量的该反应所需的组分。关于延伸反应的组分过量是指每个组分的量使得达到期需延伸的能力不受到该组分浓度的显著限制。合乎需要的是，以足以支持所需延伸程度的数量提供给反应混合物一定量的所需辅因子，例如Mg²⁺、dATP、dCTP、dGTP和dTTP。

术语“样品”以其最广泛的含义使用。在某种意义上其可指动物细胞或组织。在另一种意义上，其意味着包括从任何来源获得的样本或培养物，以及生物和环境样品。生物样品可从植物或动物(包括人类)获得并且包括液体、固体、组织和气体。环境样品包括环境材料例如表面物质、土壤、水和工业样品。这些实例不解释为限制适用于本发明的样品类型。任何核酸样品均可用于实践本技术，包括但不限于真核、原核和病毒核酸。在一些实施方案中，靶核酸代表从患者分离的基因组DNA样品。该DNA可从任何细胞源或体液中获得。临床实践中可获得的细胞源的非限制性实例包括血细胞、口颊细胞、宫颈阴道细胞、尿上皮细胞、胎儿细胞或存在于通过活组织检查获得的组织中的任何细胞。体液包括血液、尿液、脑脊髓液、精液和感染或炎症部位的组织渗出液。核酸用本领域标准的许多方法中的任一种从细胞源或体液中提取。将理解的是用于提取核酸的特定方法将取决于源的性质。

如本文所使用的“多重”指在单个样品中同时检测或鉴定多个核酸靶。

本技术的实施方案

虽然本文的公开内容涉及某些说明性的实施方案，应理解的是这些实施方案通过举例的方式而非通过限制的方式呈现。

多重等位基因特异性引发检测(Masp)

Masp技术与下列基本概念相关(参见图1)。每个等位基因特异性引物包含该引物特异的独特荧光团。缺乏靶时，由于游离引物形成的茎-环结构或部分双链结构，引物上的荧光团被猝灭剂猝灭(例如，参见Huang(2007)nucleicacidsRes. 35:e101，对于所有目的通过引用以其整体结合到本文中)。靶存在时，引物与靶结合并延伸，导致荧光团与猝灭剂分离并且输出荧光信号。

在一些方法中，等位基因特异性引物的部分不与靶序列互补。例如，等位基因特异性引物可具有非互补区域例如尾巴区域或茎-环引物对于靶，例如，在环区域是非互补的。或者，引物的双链的双链体区域可与模板中的靶序列或其在模板中互补序列是完全或部分非互补的。在与这些类型的引物相关的一些实施方案中，荧光团与猝灭剂的分离并非杂交的结果，而是荧光团与猝灭剂分离由在穿过引物的靶区域另一侧的反向引物的延伸引起。等位基因特异性标记的引物延伸后，反向引物在等位基因特异性标记的引物延伸所产生的模板上延伸。这种延伸导致与引物互补的链的合成，并且，这样做，随着聚合酶移动穿过双链的双链体区域(例如，双链体被熔解)，聚合酶使荧光团与猝灭剂分离。因此，从反向引物延伸的链在双链线性引物设计的情况下置换猝灭寡核苷酸或在单链茎-环设计的情况下由于延伸序列与环序列的杂交而分离猝灭剂标记与荧光团标记。因此，在一些实施方案中，荧光团与猝灭剂的分离由杂交和延伸的组合引起。

茎-环引物和部分双链引物结构的设计提供对延伸的和未延伸的引物之间的信号的区分并且提供非特异性引发的最小化或消除。所述技术在本领域普通技术内的测定设计中的适当改变正如适用于反向引物一样同样适用于正向引物。因此，与“引物”、“等位基因特异性引物”和/或“正向引物”相关的术语和概念适用于反向引物。基于该技术的测定，在一些实施方案中，在实时PCR测定中并且在一些实施方案中，在终点PCR测定中实现。

FRET介导的多重等位基因特异性引发检测(F-Masp)

F-Masp技术与下列基本概念相关(参见图2)。每个等位基因特异性引物包含该引物特异的独特FRET受体荧光团。缺乏靶时，无引发发生并且FRET受体不发荧光。同样，FRET供体探针不与扩增子结合，这是因为由于缺乏扩增反应未产生扩增子。在一些实施方案中，由于游离探针形成的茎-环结构或部分双链结构，探针上的供体荧光团被猝灭剂猝灭(例如，参见Huang(2007)nucleicacidsRes. 35:e101，对于所有目的通过引用以其整体结合到本文中)。或者，探针为包含供体荧光团(例如，其不包含猝灭剂)的单链探针。在这样的实施方案中，当无激发能量激发荧光团时，荧光团处于未激发状态(例如，荧光团未被适当激发波长的光源、相干(例如，激光)光源等激发)。

在靶的存在下，引物杂交并延伸，探针结合到包含引物的延伸链上。由于该结合，使供体和受体在一起(例如，在FRET耦合所需的距离内)，FRET在探针上的供体和引物上的受体之间发生，并且受体将发出荧光以产生信号。所述技术在本领域普通技术内的测定设计中的适当改变正如适用于反向引物一样同样适用于正向引物。基于所述技术的测定，在一些实施方案中，在实时PCR测定中并且在一些实施方案中在终点PCR测定中实现。同样，实施方案还提供等价的技术，其中FRET对的供体和受体可互换，例如，使得供体荧光团存在于引物上并且受体荧光团存在于探针上。

等位基因特异性PCR标志

“等位基因特异性PCR”为其中可基于扩增产物区分相差一个或多个核苷酸的等位基因的PCR应用(Ugozzoli和Wallace(1991)Methods:ACompaniontoMethodsinEnzymology 2:42–48)。该技术利用在或接近3′末端具有允许相对于另一个等位基因(非靶等位基因)优先扩增一个等位基因(靶等位基因)的特异性错配的引物(Ugozzoli和Wallace,supra;Cha等(1992)PCRMethodsandApplications 2:14–20)。该程序例如，为建立连锁图谱提供产生基于单核苷酸多态性(SNP)的标志的可能性并且代表建立完全由这些标志构成的密度图谱的极好选择。等位基因特异性PCR先前已被用于尝试通过扩增检测一个或多个变体核苷酸序列的存在或缺失情况(参见，例如，欧洲专利申请号No.89302331.7，公布号No.0332435)，包括尝试检测与多种遗传疾病相关的点突变(Ugozzoli和Wallace,supra;Wenham等(1991)ClinicalChemistry 37:241–244;Chang(1997)BioTechniques 22:520–527)。

茎-环引物

所述技术的一些实施方案使用等位基因特异性茎-环引物。茎-环引物为在一个末端或靠近一个末端处包含荧光团并在另一个末端或靠近另一个末端包含猝灭剂的寡核苷酸，例如，荧光团在该寡核苷酸的5′末端或靠近5′末端并且猝灭剂在该寡核苷酸的3′末端或靠近其3′末端。3′末端的猝灭剂或荧光团连接到核苷酸中的一个以便当形成茎-环结构时荧光团被猝灭，并且引物不与靶结合以便3′末端提供用于引物被聚合酶(例如，在PCR中)延伸的引发位点(例如，3′羟基)。茎-环引物技术与茎-环探针例如分子信标的不同在于探针设计为与靶结合而不提供引发位点，而本文提供的茎-环引物与靶位点结合并且提供引发位点。虽然一些概念是相似的，但是茎-环引物在引发核酸合成中与不同于茎-环探针的茎-环引物的特征相关，例如，3′部分(荧光团或猝灭剂)的位置。

在一些实施方案中，茎-环引物与包含需要被检测的序列(例如，突变(例如，SNP、插入、缺失、碱基变化等)或野生型序列)的靶序列互补。

例如，在一些实施方案中茎-环引物约18-50个核苷酸长并且包含三个区域：约4-10个核苷酸的5′茎-形成区域、包含10-30个核苷酸的中心环区域和包含约4-10个核苷酸的3′茎-形成区域。环区域包含与靶DNA或RNA互补的序列并且与自身或茎-环引物的其它区域不碱基配对；引物与靶核酸不结合时，5′茎-形成区域的序列和3′茎-形成区域的序列彼此互补并且形成双链“茎”结构。

3′茎-形成区域和5′茎-形成区域在所述技术的不同实施方案中与靶核酸具有不同程度的互补性(例如，3′茎-形成区域和/或5′茎-形成区域与靶序列无互补性，3′茎-形成区域和/或5′茎-形成区域与靶序列具有完全的互补性，3′茎-形成区域和/或5′茎-形成区域与靶序列具有中等程度的互补性，例如，3′茎-形成区域和/或5′茎-形成区域相对于靶序列具有1个或多个错配或缺口(例如，(例如，形成凸起的)插入或缺失)，例如，1、2、3、4、5个错配或具有与靶序列约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的互补性。

3′茎-形成区域和5′茎-形成区域与靶序列不需要具有相同程度的互补性，但是其可与靶序列具有相同程度的互补性。因此，在一些实施方案中，3′茎-形成区域和5′茎-形成区域与靶序列具有相同程度的互补性，并且在一些实施方案中3′茎-形成区域和5′茎-形成区域与靶序列具有不同程度的互补性。另外，5′茎-形成区域和3′茎-形成区域可具有适合所述技术的任何程度的互补性(例如，5′茎-形成区域的序列和3′茎-形成区域的序列彼此完全互补或者包含1个或多个错配或缺口(例如，相对于彼此(例如，形成凸起的)插入或缺失)。茎双链体可由完全互补的5′茎-形成区域和3′茎-形成区域或具有一个或多个错配或缺口的5′茎-形成区域和3′茎-形成区域形成。

在茎-环引物的一个末端(例如，5′末端或3′末端)共价连接荧光染料。在另一个末端(例如，3′末端或5′末端)共价连接非荧光猝灭剂染料。当茎-环引物处于闭环构象时，猝灭剂靠近荧光团并且猝灭剂猝灭(例如，最小化、减少和/或消除)荧光团在一个或多个监测荧光发射的波长下的荧光发射。

如果待检测的核酸与茎-环引物序列的互补性足以产生待检测核酸与茎-环引物的杂交，茎-环引物线性化(例如，从闭环构象展开)并且其与靶序列杂交。靶核酸与线性化茎-环引物之间形成的双链体比茎的3′茎-形成区域和5′茎-形成区域形成的茎双链体更加稳定，例如，在一些实施方案中因为与靶核酸形成的双链体在热力学上更稳定，例如，因为其涉及更多碱基对。在这种线性构象中，荧光团和猝灭剂分离并且引物处于可在合适的反应条件下被聚合酶延伸的状态。当荧光团与猝灭剂分离，荧光团将在查询(queried)时发出荧光产生信号(例如，吸收激发波长的光子并且发射一个或多个所监测发射波长的光子时)。发射与杂交有关，因此表示靶核酸在检验样品中存在。在一些实施方案中，在通过所述方法产生的荧光标记的扩增子中特异性地检测荧光并且在一些实施方案中检测样品的一般荧光。

当所述技术在多重测定中用于检测两个或更多个靶核酸(例如，两个或更多个等位基因、SNPs等)时，使用两个或更多个等位基因特异性茎-环引物。所述两个或更多个等位基因特异性茎-环引物包含两个或更多个不同的荧光团(例如，可通过不同的发射光谱和/或通过在两个波长处监测发射检测的)并且包含对于两个或更多个靶核酸特异性的(例如，互补的)序列。两个或更多个等位基因特异性茎-环引物可包含相同的猝灭剂或可包含不同的猝灭剂。两个或更多个等位基因特异性茎-环引物可包含相同的互补性3′和5′茎-形成区域或可包含不同的互补性3′和5′茎-形成区域。在一些实施方案中，各个等位基因特异性茎-环引物对不同的靶核酸特异的并且在一些实施方案中各个等位基因特异性茎-环引物对靶核酸(例如，由两个或更多个组成的组)的不同组特异。作为一个说明性和非限制性的实例，在一些实施方案中，四个不同的等位基因A、B、C和D可通过四个不同的等位基因特异性茎-环引物检测；或者，在一些实施方案中，等位基因A和B可通过一个等位基因特异性茎-环引物检测并且等位基因C和D可通过另一个等位基因特异性茎-环引物检测。

双链线性引物

所述技术的一些实施方案使用等位基因特异性双链线性引物。等位基因特异性双链线性引物包含两条链：等位基因特异性(单链)引物和互补的猝灭寡核苷酸。等位基因特异性引物具有与常规引物相似的长度(例如，15-50个核苷酸)并且包含共价连接的荧光团。荧光团共价连接到等位基因特异性引物的任何核苷酸，但通常在等位基因特异性引物的5′末端或靠近其5′末端。猝灭寡核苷酸通常比等位基因特异性引物短(例如，10-20个核苷酸)，但是可能更长(例如，20个核苷酸或更多，包括与等位基因特异性引物一样长或更长的长度)。猝灭寡核苷酸包含共价连接的猝灭剂。猝灭剂共价连接到猝灭寡核苷酸的任何核苷酸，但通常在猝灭寡核苷酸的3′末端或靠近其3′末端。当等位基因特异性引物和猝灭寡核苷酸形成双链体时，猝灭剂靠近荧光团并且猝灭剂猝灭(例如，最小化、减少和/或消除)荧光团在监测荧光发射的一个或多个波长下的荧光发射。

双链体可为任何长度直至等位基因特异性引物和猝灭剂寡核苷酸中较短者的长度。等位基因特异性引物和猝灭剂寡核苷酸可具有适合所述技术的任何程度的互补性(例如，等位基因特异性引物的序列与猝灭剂寡核苷酸的序列彼此完全互补或包含1个或多个错配或缺口(例如，相对于彼此(例如，形成凸起的)插入或删除))。双链体可由完全互补的等位基因特异性引物和猝灭寡核苷酸或由具有一个或多个错配或缺口的等位基因特异性引物和猝灭寡核苷酸形成。

在一些实施方案中，等位基因特异性引物包含与靶不互补的和/或与猝灭寡核苷酸不互补的尾巴区域。在一些实施方案中，猝灭剂寡核苷酸包含与靶不互补的和/或与等位基因特异性寡核苷酸不互补的尾巴区域。例如，在一些实施方案中等位基因特异性引物与猝灭剂寡核苷酸之间的互补性程度和/或等位基因特异性引物与靶之间的互补性程度设计为控制相关的双链的双链体区域和等位基因特异性引物与靶形成的杂交体的熔解温度和/或相关的双链的双链体区域和通过等位基因特异性引物和靶形成的杂交体的相对熔解温度。

等位基因特异性引物与靶序列在所述技术的不同实施方案中具有不同程度的互补性(例如，等位基因特异性引物与靶序列具有完全的互补性或具有1个或多个错配或缺口(例如，相对于靶序列(例如，形成凸起的)插入或删除)。在一些实施方案中，为了特异性检测靶核酸(例如，等位基因例如SNP)，等位基因特异性引物与靶核酸完全互补。

荧光染料共价连接到等位基因特异性引物。非荧光猝灭染料共价连接到猝灭剂寡核苷酸。当等位基因特异性引物与猝灭剂寡核苷酸形成双链体(例如，缺乏靶)时，猝灭剂靠近荧光团并且猝灭剂猝灭(例如，最小化、减少和/或消除)荧光团在一个或多个监测荧光发射的波长下的荧光发射。

如果待检测核酸(例如，靶核酸)与等位基因特异性引物的序列的互补性足以产生待检测核酸与等位基因特异性引物的杂交，则等位基因特异性引物与猝灭剂寡核苷酸分离(例如，等位基因特异性引物与猝灭寡核苷酸形成的双链体熔解)并且等位基因特异性引物与靶序列杂交。靶核酸与等位基因特异性引物之间形成的双链体比等位基因特异性引物与猝灭寡核苷酸形成的双链体更加稳定，例如，在一些实施方案中因为与靶核酸形成的双链体热力学上更加稳定，例如，因为其包括更多碱基对。在该构象中，荧光团和猝灭剂分离并且等位基因特异性引物处于可在合适的反应条件下被聚合酶延伸的状态。

在一些方法中，等位基因特异性引物的部分与靶序列不互补。例如，等位基因特异性引物可包含非互补区域例如尾巴区域。或者，引物的双链的双链体区域与模板中的靶序列或其在模板中的互补序列可为完全或部分非互补的。在一些与这些引物类型相关的实施方案中，荧光团与猝灭剂分离并非杂交的结果，而是荧光团与猝灭剂分离由在穿过掺入引物的靶区域另一侧的反向引物的延伸引起。等位基因特异性标记的引物延伸后，反向引物在等位基因特异性标记的引物延伸所产生的模板上延伸。这种延伸导致与引物互补的链的合成，并且，这样做，随着聚合酶移动穿过双链的双链体区域(例如，双链体被熔解)聚合酶使荧光团与猝灭剂分离。因此，从反向引物延伸的链置换双链线性引物的猝灭寡核苷酸。因此，在一些实施方案中，荧光团与猝灭剂的分离由杂交和延伸的组合引起。

当荧光团与猝灭剂分离时，荧光团将在查询(queried)时发出荧光产生信号(例如，吸收激发波长的光子并且发射一个或多个所监测发射波长的光子时)。发射与杂交有关因此表示靶核酸在检验样品中的存在。在一些实施方案中，在通过所述方法产生的荧光标记的扩增子中特异性地检测荧光并且在一些实施方案中检测样品的一般荧光。

当所述技术在多重测定中用于检测两个或更多个靶核酸(例如，两个或更多个等位基因、SNPs等)时，使用两个或更多个等位基因特异性双链线性引物。两个或更多个等位基因特异性双链线性引物包含两个或更多个不同的荧光团(例如，通过不同的发射光谱和/或通过在两个波长处监测发射而可检测的)并且包含对于两个或更多个靶核酸特异性的(例如，互补的)序列。两个或更多个等位基因特异性双链线性引物可包含相同的猝灭剂或可包含不同的猝灭剂。两个或更多个等位基因特异性双链线性引物可包含相同的互补性双链体-形成区域或可包含不同的互补性双链体-形成区域或。在一些实施方案中，各个等位基因特异性双链线性引物对不同的靶核酸特异，并且在一些实施方案中各个等位基因特异性双链线性引物对靶核酸(例如，包含两个或更多个组成的组)的不同组特异。作为一个说明性和非限制性的实例，在一些实施方案中，四个不同的等位基因A、B、C和D可通过四个不同的等位基因特异性双链线性引物检测；或者，在一些实施方案中，等位基因A和B可通过一个等位基因特异性双链线性引物检测并且等位基因C和D可通过另一个等位基因特异性双链线性引物检测。

F-Masp

在一些实施方案中，例如，FRET-介导的多重等位基因引发检测(F-Masp)，使用等位基因特异性引物和双链探针。在一些实施方案中，使用等位基因特异性引物和单链探针。等位基因特异性引物包含荧光标记(例如，受体荧光团)。所述标记共价连接到等位基因特异性引物。标记连接到等位基因特异性引物的任何核苷酸上，并且通常在等位基因特异性引物的3′末端或靠近其3′末端。

等位基因特异性引物具有与常规引物相似的长度(例如，15-50个核苷酸)并且包含共价连接的荧光团。荧光团共价连接到等位基因特异性引物的任何核苷酸上，但是通常在等位基因特异性引物的3′末端或靠近其3′末端。等位基因特异性引物与靶序列在所述技术的不同实施方案中具有不同程度的互补性(例如，等位基因特异性引物与靶序列完全互补或具有1个或多个错配或缺口(例如，相对于靶序列(例如，形成凸起的)插入或删除)。在一些实施方案中为了特异性检测靶核酸(例如，等位基因例如SNP)，等位基因特异性引物与靶核酸完全互补。

单链探针包含一条探针链。所述探针链具有与常规探针相似的长度(例如，15-100或更多个核苷酸)，并且包含共价连接的荧光团(例如，供体荧光团)。荧光团共价连接到探针链的任何核苷酸，但是通常在探针链的3′末端或靠近其3′末端。在这样的实施方案中，当无激发能量激发荧光团时，荧光团和/或探针处于“未激发”状态(例如，荧光团未被适当激发波长的光源、相干(例如，激光)光源等激发)。在这种状态下，荧光团也不转移能量到FRET对的受体上，因此无信号被检测到。

双链探针包含两条链：探针链和互补的猝灭寡核苷酸(参见，例如，Huang(2007)nucleicacidsRes. 35:e101，对于所有目的通过引用以其整体结合到本文中)。探针链具有与常规探针相似的长度(例如，15-100或更多个核苷酸)，并且包含共价连接的荧光团(例如，供体荧光团)。所述荧光团共价连接到探针链的任何核苷酸上，但是通常在探针链的3′末端或靠近其3′末端。猝灭寡核苷酸通常比探针链短(例如，10-20个核苷酸)，但是可能更长(例如，20个核苷酸或更多，包括与探针链一样长或更长的长度)。猝灭寡核苷酸包含共价连接的猝灭剂。猝灭剂共价连接到猝灭剂寡核苷酸的任何核苷酸，但是通常在猝灭寡核苷酸的3′末端或靠近其3′末端。当探针链与猝灭寡核苷酸形成双链体时，猝灭剂靠近荧光团，并且猝灭剂猝灭(例如，最小化、减少和/或消除)荧光团在一个或多个该荧光团发射辐射的波长下的荧光发射。

双链体可为任何长度直至探针链和猝灭剂寡核苷酸中较短者的长度。探针链和猝灭剂寡核苷酸具有适合所述技术的任何程度的互补性(例如，探针链的序列与猝灭剂寡核苷酸的序列彼此完全互补或包含1个或多个错配或缺口(例如，相对于彼此(例如，形成凸起的)插入或删除))。双链体可由完全互补的探针链和猝灭寡核苷酸或由具有一个或多个错配或缺口的探针链和猝灭寡核苷酸形成。

探针链与靶序列在所述技术的不同实施方案中具有不同程度的互补性(例如，探针链与靶序列完全互补或具有1个或多个错配或缺口(例如，相对于靶序列(例如，形成凸起的)插入或删除))。优选探针链在毗邻或靠近结合等位基因特异性引物的序列的序列上与靶核酸完全互补。

对于包含猝灭剂寡核苷酸的探针的实施方案，如果待检测核酸(例如，靶核酸)与探针链序列的互补性足以产生探针链与靶核酸的杂交，则探针链与猝灭剂寡核苷酸分离(例如，探针链与猝灭剂寡核苷酸形成的双链体熔解)，并且探针链与靶序列杂交。靶核酸与探针链之间形成的双链体比探针链与猝灭寡核苷酸形成的双链体更加稳定，例如，在一些实施方案中因为与靶核酸形成的双链体在热力学上更加稳定，例如，因为其包括更多碱基对。在这种构象中，荧光团与猝灭剂分离并且荧光团可发射辐射，例如，以激发受体荧光团。在一些实施方案中，探针设计为非可延伸的，例如3′末端(3′羟基)被封闭或另外阻止被聚合酶延伸(例如，通过添加核苷酸到探针的3′末端)。

对于单链探针的实施方案(例如，其不包含猝灭剂寡核苷酸)，如果待检测核酸(例如，靶核酸)与探针链序列的互补性足以产生探针链与靶核酸的杂交，则探针链与靶序列杂交。在该构象中，荧光团可激发受体荧光团。在一些实施方案中，探针设计为非可延伸的，例如3′末端(3′羟基)被封闭或另外阻止被聚合酶延伸(例如，通过添加核苷酸到探针的3′末端)。

等位基因特异性引物的荧光标记和探针链的荧光标记形成FRET对。FRET对包含两个具有发射和激发特征的荧光团，从而一个荧光团为供体荧光团，另一个荧光团为受体荧光团。供体荧光团，最初处于其电子激发状态，通过非辐射偶极-偶极偶联将能量转移至受体荧光团上。供体荧光团的发射光谱在某种程度上与受体荧光团的激发光谱重叠。转移的效率取决于供体与受体之间的距离、供体发射光谱与受体吸收光谱的重叠以及供体发射偶极矩与受体吸收偶极矩的相对定向。特别地，能量转移的效率与供体和受体之间的距离的六次方成反比例关系。因此，当受体和供体分开极微小的距离(例如，约1-10nm的距离)时，可检测的能量转移发生。

当1)等位基因特异性引物被聚合酶掺入到扩增子的链中，和2)探针链与包含荧光团的扩增子的链结合时，FRET发生。因为扩增子从包含荧光团的等位基因特异性引物产生，探针链与扩增子的结合将等位基因特异性引物的荧光团放置在使能量转移发生的与探针链的荧光团合适的距离。因此，受体荧光团的发射是可检测的(例如，通过在一个或多个波长处监测发射)，并且表示靶核酸在样品中的存在。在一些实施方案中，包括在等位基因特异性引物掺入和探针链结合时检测信号的F-Masp技术，与Masp实施方案相比，提供了一种更加灵敏和/或更加特异的技术。

当所述技术用于多重性测定中以检测两个或更多个靶核酸(例如，两个或更多个等位基因、SNPs等)时，使用两个或更多个等位基因特异性引物。两个或更多个等位基因特异性引物包含两个或更多个不同的荧光团(例如，可通过不同的发射光谱和/或通过在两个波长处监测发射检测的受体荧光团)并且包含对两个或更多个靶核酸特异的(例如，互补的)序列。在一些实施方案中，使用相同的探针链检测两个或更多个靶核酸，并且在一些实施方案中，使用不同的探针链检测两个或更多个靶核酸。探针链的组成(例如，长度、序列等)取决于毗邻或靠近等位基因特异性引物所结合的靶位点的靶核酸的序列。探针链的荧光团(例如，供体荧光团)可为相同的或可为不同的。探针链的荧光团(例如，供体荧光团)用作连接到两个或更多个等位基因特异性引物上的两个不同的荧光团的供体。在一些实施方案中，各个等位基因特异性引物对不同的靶核酸特异，并且在一些实施方案中各个等位基因特异引物对靶核酸(例如，包含两个或更多的组)的不同组特异。作为一个说明性和非限制性的实例，在一些实施方案中，四个不同的等位基因A、B、C和D可通过四个不同的等位基因特异性引物检测；或者，在一些实施方案中，等位基因A和B可通过一个等位基因特异性引物检测并且等位基因C和D可通过另外一个等位基因特异性引物检测。

分子信标F-Masp

在一些F-Masp技术的实施方案中，使用分子信标探针代替双链探针(参见，例如，Tyagi等(1996)Nat.Biotechnol. 14:303;Drake等(2004)Appl.Spectrosc. 58:269A，对于所有目的通过引用以其整体结合到本文中)。因此，所述技术包括其中在本文所述的F-Masp技术中将术语“双链探针”替换为术语“分子信标探针”的实施方案，如本领域普通技术人员所理解的。

分子信标探针为在其一个末端或靠近该末端包含荧光团和在其另一个末端或靠近另一个末端包含猝灭剂的寡核苷酸，例如，荧光团在寡核苷酸的5′末端或靠近其5′末端并且猝灭剂在寡核苷酸的3′末端或靠近其3′末端，或者猝灭剂在寡核苷酸的5′末端或靠近其5′末端并且荧光团在寡核苷酸的3′末端或靠近其3′末端。3′末端的猝灭剂或荧光团连接到核苷酸中的一个以便当形成茎-环结构和探针不与靶结合时，荧光团被猝灭。

例如，在一些实施方案中分子信标探针约18-50个核苷酸长，并且包含三个区域：约4-10个核苷酸的5′茎-形成区域、包含10-30个核苷酸的中心环区域和包含约4-10个核苷酸的3′茎-形成区域。环区域包含与靶DNA或RNA互补的序列并且不与自身或分子信标探针的其它区域碱基配对；当分子信标探针不与靶核酸结合时，5′茎-形成区域的序列和3′茎-形成区域的序列彼此充分互补形成双链“茎”结构。

3′茎-形成区域和5′茎-形成区域与靶核酸在所述技术的不同实施方案中具有不同程度的互补性(例如，3′茎-形成区域和/或5′茎-形成区域与靶序列无互补性，3′茎-形成区域和/或5′茎-形成区域与靶序列具有完全的互补性，3′茎-形成区域和/或5′茎-形成区域与靶序列具有中等程度的互补性，例如，3′茎-形成区域和/或5′茎-形成区域相对于靶序列具有1个或多个错配或缺口(例如，相对于靶序列(例如，形成凸起的)插入或缺失)，例如，1、2、3、4、5个错配或与靶序列具有约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的互补性。

3′茎-形成区域和5′茎-形成区域不需要与靶序列具有相同程度的互补性，但是其与靶序列可具有相同程度的互补性。因此，在一些实施方案中，3′茎-形成区域和5′茎-形成区域与靶序列具有相同程度的互补性，并且在一些实施方案中3′茎-形成区域和5′茎-形成区域与靶序列具有不同程度的互补性。另外，5′茎-形成区域与3′茎-形成区域可具有适合所述技术的任何程度的互补性(例如，5′茎-形成区域的序列与3′茎-形成区域的序列彼此完全互补或者包含1个或多个错配或缺口(例如，相对于彼此(例如，形成凸起的)插入或缺失)。茎双链体可由完全互补的5′茎-形成区域和3′茎-形成区域或由具有一个或多个错配或缺口的5′茎-形成区域和3′茎-形成区域形成。

在分子信标探针的一个末端(例如，5′末端或3′末端)共价结合荧光染料。在另一个末端(例如，3′末端或5′末端)共价结合非荧光猝灭染料。当分子信标探针处于闭环构象时，猝灭剂靠近荧光团并且猝灭剂猝灭(例如，最小化、减少和/或消除)荧光团(例如，供体荧光团)的荧光发射。

如果待检测核酸与分子信标探针序列的互补性足以产生待检测核酸与分子信标探针的杂交，分子信标探针线性化(例如，从闭环构象展开)并且其与靶序列杂交。靶核酸与线性化分子信标探针之间形成的双链体比3′茎-形成区域和5′茎-形成区域形成的茎双链体更加稳定，例如，在一些实施方案中因为与靶核酸形成的双链体在热力学上更稳定，例如，因为其包括更多碱基对。在该线性构象中，荧光团和猝灭剂分离并且分子信标探针处于当两个荧光团在合适的能量转移距离(例如，约1-10nm)内时激发与等位基因特异性引物连接的受体荧光团的状态。

分子信标探针实施方案可用于多个靶核酸的多重检测，与本文所述应用双链探针的实施方案相似。当所述技术在多重性测定中用于检测两个或更多个靶核酸(例如，两个或更多个等位基因、SNPs等)时，使用两个或更多个等位基因特异性引物。两个或更多个等位基因特异性引物包含两个或更多个不同的荧光团(例如，可通过不同的发射光谱和/或通过在两个波长处监测发射而检测的受体荧光团)并且包含对两个或更多个靶核酸特异的(例如，互补的)序列。在一些实施方案中，使用相同的分子信标探针检测两个或更多个靶核酸，并且在一些实施方案中，使用不同的分子信标探针检测两个或更多个靶核酸。分子信标探针的组成(例如，长度、序列等)取决于毗邻或靠近等位基因特异性引物所结合的靶位点的靶核酸的序列。分子信标探针的荧光团(例如，供体荧光团)可为相同的或可为不同的。分子信标探针的荧光团(例如，供体荧光团)用作连接到两个或更多个等位基因特异性引物上的两个不同的荧光团的供体。在一些实施方案中，各个等位基因特异性引物对不同的靶核酸特异，并且在一些实施方案中各个等位基因特异引物对靶核酸(例如，包含两个或更多个的组)的不同组特异。作为一个说明性和非限制性的实例，在一些实施方案中，四个不同的等位基因A、B、C和D可通过四个不同的等位基因特异性引物检测；或者，在一些实施方案中，等位基因A和B可通过一个等位基因特异性引物检测并且等位基因C和D可通过另一个等位基因特异性引物检测。

荧光部分

在一些实施方案中，所述技术中使用的寡核苷酸(例如，茎-环引物、等位基因特异性引物、双链线性引物和/或分子信标)包含荧光部分(例如，有机染料)。本领域已知各种各样的荧光部分。可用作荧光部分的化合物的实例包括但不限于氧杂蒽、蒽、花青、卟啉和香豆素染料。可用于所述技术的氧杂蒽染料的实例包括但不限于荧光素、6-羧基荧光素(6-FAM)、5-羧基荧光素(5-FAM)、5-或6-羧基-4,7,2',7'-四氯荧光素(TET)、5-或6-羧基-4',5',2',4',5',7'-六氯荧光素(HEX)、5'或6'-羧基-4',5'-二氯-2,'7'-二甲氧基荧光素(JOE)、5-羧基-2',4',5',7'-四氯荧光素(ZOE)、对甲氨基酚(rhodol)、罗丹明、四甲基罗丹明(TAMRA)、4,7-二氯四甲基罗丹明(DTAMRA)、罗丹明X(ROX)和德克萨斯红。可用于本发明的花青染料的实例包括但不限于Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7和Cy7.5。可用于本技术的其它荧光部分和/或染料包括但不限于能量转移染料、复合染料和其它产生荧光信号的芳香族化合物。在一些实施方案中，荧光部分包含量子点。

因此，根据所述技术，可用的示例性的荧光团和染料包括，但不限于，荧光染料或猝灭荧光染料的荧光的分子。荧光染料包括，但不限于，d-罗丹明受体染料(包括Cy5、二氯[R110]、二氯[R6G]、二氯[TAMRA]、二氯[ROX]等)、荧光素供体染料(包括荧光素、6-FAM、5-FAM等)、吖啶(包括吖啶橙、吖啶黄、原黄素、pH7等)、芳香烃(包括2-甲基苯并噁唑、对二甲氨基苯甲酸乙酯、苯酚、吡咯、苯、甲苯等)、芳基甲川型染料(包括金胺O、结晶紫、结晶紫-甘油、孔雀石绿等)、香豆素染料(包括7-甲氧基香豆素-4-乙酸、香豆素1、香豆素30、香豆素314、香豆素343、香豆素6等)、花青染料(包括1,1'-二乙基-2,2'-花青碘化物、隐花青、吲哚羰花青(C3)染料、吲哚二羰花青(C5)染料、吲哚三羰花青(C7)染料、氧羰花青(C3)染料、氧二羰花青(C5)染料、氧三羰花青(C7)染料、碘化频那氰醇、全染色剂、硫羰花青(C3)染料-乙醇、硫羰花青(C3)染料-正丙醇、硫二羰花青(C5)染料、硫三羰花青(C7)染料等)、二吡咯甲烯(Dipyrrin)染料(包括N,N'-二氟硼基-1,9-二甲基-5-(4-碘苯基)-二吡咯甲烯、N,N'-二氟硼基-1,9-二甲基-5-[(4-(2-三甲基硅烷基乙炔基)、N,N'-二氟硼基-1,9-二甲基-5-苯基二吡咯甲烯等)、部花青(包括4-(二氰亚甲基)-2-甲基-6-(对二甲氨基苯乙烯基)-4H-吡喃(DCM)-乙腈、4-(二氰亚甲基)-2-甲基-6-(对二甲氨基苯乙烯基)-4H-吡喃(DCM)-甲醇、4-二甲氨基-4'-硝基芪、部花青540等)、杂染料(包括4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)-二甲基亚砜、7-苄氨基-4-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑、丹磺酰甘氨酸、丹磺酰甘氨酸-二氧六环、Hoechst33258-DMF、Hoechst33258、荧光黄CH、吡罗昔康、硫酸奎宁、硫酸奎宁、方酸箐染料III等)、寡苯撑类(包括2,5-二苯基噁唑(PPO)、联苯、POPOP、对四联苯、对三联苯等)、噁嗪类(包括甲酚紫高氯酸盐、尼罗蓝-甲醇、尼罗红-乙醇、噁嗪1、噁嗪170等）、多环芳香烃(包括9,10-双(苯乙炔基)蒽、9,10-二苯基蒽、蒽、萘、二萘嵌苯、芘等)、多烯/聚炔类(包括1,2-二苯基乙炔、1,4-二苯基丁二烯、1,4-二苯基丁二炔、1,6-二苯基己三烯、β-胡萝卜素、茋类等)、氧化还原活性的发色团类(包括蒽醌、偶氮苯、苯醌、二茂铁、核黄素、三(2,2'-联吡啶)钌络合物(II)、四吡咯、胆红素、叶绿素a-乙醚、叶绿素a-甲醇、叶绿素b、二质子化-四苯基卟啉、血色素、八乙基卟啉镁、八乙基卟啉镁(MgOEP)、酞菁镁(MgPc)-PrOH、酞菁镁(MgPc)-吡啶、四-三甲苯基卟啉镁(MgTMP)、四苯基卟啉镁(MgTPP)、八乙基卟啉、酞菁(Pc)、卟吩、ROX、TAMRA、四叔丁基氮杂卟吩、四叔丁基萘酞菁、四(2,6-二氯苯基)卟啉、四(邻氨基苯基)卟啉、四-三甲苯基卟啉(TMP)、四苯基卟啉(TPP)、维生素B12、八乙基卟啉锌(ZnOEP)、酞菁锌(ZnPc)-吡啶、四-三甲苯基卟啉锌(ZnTMP)、四-三甲苯基卟啉锌自由基阳离子、四苯基卟啉锌(ZnTPP)等)、氧杂蒽类(包括曙红Y、荧光素-碱性乙醇、荧光素-乙醇、罗丹明123、罗丹明6G、罗丹明B、孟加拉玫瑰红、磺酰罗丹明101等)或其混合物或组合或其合成衍生物。

荧光共振能量转移(FRET)为两个染料分子的电子激发态之间的距离依赖型相互作用，其中激发从供体分子转移到受体分子而无光子发射。在一些实施方案中，所述技术使用的寡核苷酸(例如，茎-环引物、等位基因特异性引物、双链线性引物和/或分子信标)包含适合用于FRET(例如，FRET对的一个成员，例如，FRET供体或FRET受体)的部分。一些合适的FRET对在表1中提供：

表1：FRET对

猝灭剂

在一些实施方案中，所述技术使用的寡核苷酸(例如，茎-环引物、等位基因特异性引物、双链线性引物和/或分子信标)包含猝灭剂部分。本领域已知各种各样的猝灭剂部分。例如，在一些实施方案中寡核苷酸包含为BlackHole猝灭剂(例如，BHQ-0、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3)、Dabcyl、IowaBlack猝灭剂(例如，IowaBlackFQ、IowaBlackRQ)、Eclipse猝灭剂的猝灭剂。

在一些实施方案中，BHQ-1与具有约500-600nm发射波长的荧光部分一起使用。在一些实施方案中，BHQ-2与具有约550-675nm发射波长的荧光部分一起使用。在一些实施方案中，FRET对为提供猝灭的荧光团-猝灭剂对。

一些示例性的荧光团-猝灭剂对包括FAM和BHQ-1、TET和BHQ-1、JOE和BHQ-1、HEX和BHQ-1、Cy3和BHQ-2、TAMRA和BHQ-2、ROX和BHQ-2、Cy5和BHQ-3、Cy5.5和BHQ-3、FAM和BHQ-1、TET和BHQ-1、JOE和3'-BHQ-1、HEX和BHQ-1、Cy3和BHQ-2、TAMRA和BHQ-2、ROX和BHQ-2、Cy5和BHQ-3、Cy5.5和BHQ-3或可从其它商业实体例如BiosearchTechnologies,Inc.ofNovato,Calif获得的相似荧光团-猝灭剂对。

试剂盒

本文还提供包含本文所述的一种或多种组合物的试剂盒。在一些实施方案中，所述试剂盒可用于实施一种或多种本文所提供的方法。在一些实施方案中，方法在试剂盒中提供的用于使用本文所述方法和组合物的一组说明书中描述。组合物在一种或多种容器中提供(例如，瓶、小瓶、安瓿、管等)，并且可为立即使用的形式或可为可重构的形式(例如，以向其中加入水的冻干形式。水可由试剂盒或使用者提供)。所述试剂盒可包括一种或多种与本文所述荧光团一起使用的光滤波器。在一些实施方案中，试剂盒包含对照。对照的实例为阳性对照，例如，包含试剂盒的组合物和/或方法所针对使用的一个或多个靶序列的核酸，和阴性对照，例如，不包含试剂盒的组合物和/或方法所针对使用的一个或多个靶序列的核酸。在一些实施方案中，所提供的对照为包含野生型等位基因序列的核酸和/或包含相对于野生型序列而突变的一个或多个序列的核酸(例如，包含一个或多个突变体等位基因、SNPs等)。在涉及PCR或实时PCR的实施方案中，试剂盒可包含聚合酶、缓冲液、一种或多种核苷酸(dNTPs，例如，dATP、dCTP、dGTP、dTTp和/或其类似物或衍生物)和其它试剂。一些试剂盒实施方案以多重形式提供预分配和即用型的所述技术的组合物，例如，以多孔板的形式，例如96孔板、384孔板、1536孔板或包含根据待运行的检验数目更多或更少孔的板。在一些实施方案中，样品加入到即用型板中，并且使用者通过使板热循环进行测定，例如，PCR或实时PCR。

所述技术的实施方案在下文相关的实施例中进一步理解和描述。

实施例

实施例1-BRAF突变的多重检测

在所述技术实施方案的开发期间，收集了检测BRAF突变的测定的数据。BRAF为产生被称为B-Raf的蛋白的人类基因。该基因为丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶家族中的原癌基因，并且已显示在人类癌症例如非霍奇金淋巴瘤、结直肠癌、恶性黑色素瘤、乳头状甲状腺癌、非小细胞肺癌和肺腺癌中包含氨基酸置换。另外，B-Raf中的某些其它置换导致出生缺陷。

已经鉴定了超过30个与人类癌症相关的BRAF基因突变。在90%的情况下，BRAF基因外显子15中核苷酸1799处的胸腺嘧啶被腺嘌呤置换。这导致已在人类癌症中发现的活化片段在密码子600处缬氨酸(V)被谷氨酸(E)置换(现在称为V600E)。这一突变已在乳头状甲状腺癌、结直肠癌、黑色素瘤和非小细胞肺癌中广泛观察到。BRAF中的其它突变导致在密码子600处缬氨酸被赖氨酸(K)和天冬氨酸(D)置换，分别表示为V600K和V600D突变。

为了检测与这些致癌B-Raf蛋白相关的核酸，根据所述技术设计等位基因特异性引物检测BRAF中引起B-Raf蛋白V600E、V600K和V600D置换的突变。一种实时PCR使用三个等位基因特异性正向引物(AS-FP)和一个常规反向引物(RP)。该三个等位基因特异性引物每一种用不同的荧光团标记，并且在多重测定中使用一个PCR检测BRAF的三种突变体形式。因此，SNP突变通过在三个不同的荧光信道检测荧光发射来区别。用于扩增BRAF基因外显子13部分的引物设计为内部的内源性对照。参见，例如，图3。

特别地，该三个等位基因特异性引物为本文所述的双链引物。双链引物由包含荧光团的引物链和包含猝灭剂的猝灭剂链组成。当引物包含双链的双链体区域时(例如，非杂交状态和双链体熔解前的掺入状态)，引物荧光团被猝灭并且引物为不可检测的。参见，例如，图4，其中星形元件为荧光团，并且“Q”为猝灭剂。

将检验样品混合为具有已知量的BRAF突变体核酸。特别地，样品包含野生型BRAF核酸和包括0.5%、1%、5%、25%和50%浓度的突变核酸。用等位基因特异性引物实施实时PCR，以在野生型核酸背景中检测这些水平的突变体核酸。

一组实验收集数据来证实双链等位基因特异性引物的特异性和灵敏度。一个证实双链等位基因特异性引物检测V600E的特异性和灵敏度的非多重实验的结果在图5中示出。荧光信号作为循环数的函数绘制。如该图所示，通过突变体等位基因特异性引物检测突变体核酸发生在比通过突变体等位基因特异性引物检测野生型BRAF早的循环。检测的循环数取决于样品中存在的突变体核酸的量。因此，相对于包含0.5%BRAF的样品，在更早的循环检测到包含50%V600EBRAF的样品，并且二者都在比检测到野生型BRAF早的循环检测到。插图显示了来自阳性内部对照PCR的信号。

第二组实验涉及收集来自细胞DNA中V600E和V600K的多重检测的数据。通过本文所提供的技术的实施方案测定由10ng总输入细胞DNA组成的样品。反应混合物包含V600E等位基因特异性引物、V600K等位基因特异性引物、野生型BRAFDNA和0.5%V600E突变体DNA、50%V600EDNA、1%、V600KDNA或50%V600KDNA中的一种。收集实时PCR数据并且绘制在图6中。在图6中，Y轴显示作为循环数函数的检验样品与内部内源性对照(dCt)之间的荧光信号的差异。如图6所示，当以存在1%或更少存在于样品中时，V600E突变体DNA和V600K突变体DNA二者均被检测到。特别地，当相对于野生型检测突变体时，数据显示了循环的统计学显著性差异。当以0.5%存在时，V600E突变体在dCt13.30处被检测到，当以50%存在时，在dCt5.35处被检测到，而野生型在dCt18.80处被检测到。同样地，当以1%存在时，V600K突变体在dCt9.33处被检测到，当以50%存在时，在dCt3.85处被检测到，而野生型在dCt20.77处被检测到。

使用10ng从合成的经福尔马林固定的石蜡包裹的(FFPE)组织样品中提取的总DNA进行了相似的实验。图7显示了来自该实验的数据。数据显示了当以0.5%存在于样品中时自FFPE样品中提取的V600E突变体核酸的检测。V600E突变体核酸在dCt10.06处检测到，野生型BRAF核酸在dCt11.59处检测到。

对于所有目的，上述说明书中提及的所有出版物和专利通过引用以其整体结合到本文中。所述技术的所述组合物、方法和用途的多种修饰和变更将对本领域技术人员显而易见而不脱离所述技术的范围和精神。虽然所述技术已结合具体的示例性实施方案进行描述，但应理解的是所要求保护的本发明不应被过度地限制于这些具体的实施方案。实际上，对本领域技术人员显而易见的所述用于实施本发明的方式的多种修饰意在落入所附权利要求书的范围内。

Claims (43)

1.一种用于检测样品中核酸的方法，所述方法包括：

1)使包含核酸的样品与猝灭状态的引物接触；和

2)如果：

a)引物与核酸杂交；或

b)引物与核酸杂交，并且引物被掺入扩增子中，

则检测来自可检测状态的引物的信号，其中所述核酸包含BRAF基因或部分BRAF基因，并且当检测到信号时在样品中检测到该核酸。

2.权利要求1的方法，其中所述猝灭状态的引物包含双链的双链体区域。

3.权利要求1的方法，其中所述信号为荧光。

4.权利要求1的方法，其中所述引物包含荧光团，并且当引物在猝灭状态时所述荧光团被猝灭剂猝灭。

5.权利要求4的方法，其中所述荧光团选自FAM、TET、JOE、HEX、TAMRA、ROX、Cy3、Cy5和Cy5.5；并且所述猝灭剂选自BHQ-1、BHQ-2和BHQ-3。

6.权利要求1的方法，其中所述猝灭状态的引物通过聚合酶掺入核酸链中。

7.权利要求1的方法，其中所述猝灭状态的引物：

a)由包含荧光团和猝灭剂的一个寡核苷酸组成；或

b)由包含荧光团的第一寡核苷酸和包含猝灭剂的第二寡核苷酸组成，其中所述第一寡核苷酸与第二寡核苷酸杂交。

8.权利要求1的方法，其中所述扩增子包含可检测状态的引物。

9.权利要求1的方法，其中所述引物为茎-环引物或双链线性引物。

10.权利要求1的方法，其中所述引物为用于检测编码包含氨基酸置换V600E、V600K和/或V600D的B-Raf蛋白的BRAF中的突变的等位基因特异性引物。

11.权利要求1的方法，进一步包括用聚合酶和核苷酸延伸杂交的猝灭状态引物。

12.权利要求1的方法，进一步包括实施聚合酶链反应。

13.权利要求12的方法，其中所述聚合酶链反应为实时聚合酶链反应。

14.权利要求1的方法，进一步包括：

3)使包含核酸的样品与猝灭状态的第二引物接触；和

4)如果：

a)第二引物与核酸杂交；或

b)第二引物与核酸杂交，并且第二引物掺入到扩增子中，

则检测来自可检测状态的第二引物的第二信号，其中当检测到第二信号时在样品中检测到核酸。

15.一种用于检测样品中核酸的方法，所述方法包括：

1)使包含核酸的样品与引物和：

a)猝灭状态的探针；或

b)未激发状态的探针；

接触，和

2)如果探针与包含引物的核酸的互补序列杂交，则检测来自引物的信号，

其中当检测到信号时，在样品中检测到核酸。

16.权利要求15的方法，其中所述猝灭状态的探针包含双链的双链体区域。

17.权利要求15的方法，其中所述信号为荧光。

18.权利要求15的方法，其中所述探针包含荧光团，并且当探针为猝灭状态时荧光团被猝灭剂猝灭。

19.权利要求18的方法，其中所述荧光团选自FAM、TET、JOE、HEX、TAMRA、ROX、Cy3、Cy5和Cy5.5；并且所述猝灭剂选自BHQ-1、BHQ-2和BHQ-3。

20.权利要求18的方法，其中所述引物包含第二荧光团，其为与探针的荧光团相容的荧光共振能量转移(FRET)受体。

21.权利要求15的方法，其中所述猝灭状态的探针：

a)由包含荧光团和猝灭剂的一个寡核苷酸组成；或

b)由包含荧光团的第一寡核苷酸和包含猝灭剂的第二寡核苷酸组成，其中第一寡核苷酸与第二寡核苷酸杂交。

22.权利要求15的方法，其中所述核酸的互补序列包含引物，并且探针与该核酸的互补序列杂交。

23.权利要求15的方法，其中所述探针为茎-环探针或双链线性探针。

24.权利要求15的方法，其中所述引物为用于检测编码包含氨基酸置换V600E、V600K和/或V600D的B-Raf蛋白的BRAF中的突变的等位基因特异性引物。

25.权利要求15的方法，进一步包括用聚合酶和核苷酸延伸引物。

26.权利要求15的方法，进一步包括实施聚合酶链反应。

27.权利要求26的方法，其中所述聚合酶链反应为实时聚合酶链反应。

28.权利要求15的方法，进一步包括：

3)使包含核酸的样品与第二引物接触；和

4)如果探针与包含第二引物的核酸的互补序列杂交，则检测来自第二引物的信号，

其中当检测到第二信号时，在样品中检测到核酸。

29.包含下列之一的组合物：

a)与可检测引物杂交的核酸，其中所述可检测引物包含荧光团和猝灭剂；

b)包含可检测引物的核酸，其中所述可检测引物包含荧光团和猝灭剂；

c)与可检测引物杂交的核酸，其中所述可检测引物包含荧光团；和包含猝灭剂的猝灭剂寡核苷酸；

d)包含可检测引物的核酸，其中所述可检测引物包含荧光团；和包含猝灭剂的猝灭剂寡核苷酸；

e)包含引物并且与探针杂交的核酸，其中所述探针包含第一荧光团和猝灭剂，所述引物包含第二荧光团，并且所述第一荧光团和第二荧光团为FRET对；或

f)包含引物并且与探针杂交的核酸，其中所述探针包含第一荧光团，所述引物包含第二荧光团，并且所述第一荧光团和第二荧光团为FRET对；和包含猝灭剂的猝灭剂寡核苷酸，

其中所述核酸包含BRAF基因或部分BRAF基因。

30.权利要求29的组合物，其中所述组合物为反应混合物。

31.权利要求29的组合物，进一步包含聚合酶。

32.权利要求29的组合物，进一步包含核苷酸。

33.权利要求29的组合物，其中所述荧光团选自FAM、TET、JOE、HEX、TAMRA、ROX、Cy3、Cy5和Cy5.5；并且所述猝灭剂选自BHQ-1、BHQ-2和BHQ-3。

34.权利要求29的组合物，进一步包含：

g)与第二可检测引物杂交的第二核酸，其中所述第二可检测引物包含第二荧光团和猝灭剂或第二猝灭剂；

h)包含第二可检测引物的第二核酸，其中所述第二可检测引物包含第二荧光团和猝灭剂或第二猝灭剂；

i)与第二可检测引物杂交的第二核酸，其中所述第二可检测引物包含第二荧光团；

j)包含第二可检测引物的第二核酸，其中所述第二可检测引物包含第二荧光团；

k)包含第二引物并且与探针杂交的第二核酸，其中所述探针包含第一荧光团和猝灭剂，所述第二引物包含第三荧光团，并且所述第一荧光团与第三荧光团为FRET对；或

l)包含第二引物并且与探针杂交的第二核酸，其中所述探针包含第一荧光团，所述第二引物包含第三荧光团，并且所述第一荧光团与第三荧光团为FRET对，

其中第二核酸包含BRAF基因或部分BRAF基因。

35.权利要求34的组合物，进一步包含含有猝灭剂或第二猝灭剂的第二猝灭剂寡核苷酸。

36.权利要求29-35中任一项的组合物检测一个或多个BRAF等位基因的用途。

37.权利要求29-35中任一项的组合物检测一个或多个BRAF单核苷酸多态性的用途。

38.权利要求29-35中任一项的组合物在多重测定中检测同一样品中的超过一个的BRAF等位基因的用途。

39.用于检测BRAF等位基因的试剂盒，包含：

1)用于检测一个或多个BRAF等位基因的检测试剂，

其中所述检测试剂包含下列之一：

a)包含荧光团和猝灭剂的茎-环引物；

b)包含含有荧光团的等位基因特异性单链引物和互补的猝灭寡核苷酸的双链线性引物；

c)包含含有荧光团的等位基因特异性单链引物和互补的寡核苷酸的双链线性引物；

d)包含荧光团的等位基因特异性引物和包含含有第二荧光团的探针链和猝灭剂寡核苷酸的双链探针；

e)包含荧光团的等位基因特异性引物和包含含有第二荧光团的探针链的双链探针；

f)包含荧光团的等位基因特异性引物和包含第二荧光团的单链探针；或

g)包含荧光团的等位基因特异性引物和包含第二荧光团和猝灭剂的茎-环探针；和

2)包含BRAF基因或部分BRAF基因的对照核酸。

40.权利要求39的试剂盒，进一步包含：

3)用于检测第二BRAF等位基因的第二检测试剂，

其中第二检测试剂包含：

a)包含第二荧光团和猝灭剂或第二猝灭剂的第二茎-环引物；

b)包含含有第二荧光团的第二等位基因特异性单链引物和互补的猝灭寡核苷酸或第二互补的猝灭寡核苷酸的第二双链线性引物；或

c)包含第三荧光团的第二等位基因特异性引物。

41.权利要求40(c)的试剂盒，进一步包含：

i)包含含有第四荧光团的第二探针链和猝灭剂寡核苷酸的第二双链探针；

ii)包含含有第四荧光团的第二探针链和第二猝灭剂寡核苷酸的第二双链探针；

iii)包含第四荧光团和猝灭剂的第二茎-环探针；

iv)包含第四荧光团和第二猝灭剂的第二茎-环探针；或

v)包含第四荧光团的第二单链探针。

42.权利要求39-41中任一项的试剂盒，其中所述荧光团与所述第二荧光团为FRET对，其中所述第三荧光团与所述第二荧光团为FRET对，或所述第三荧光团与所述第四荧光团为FRET对。

43.权利要求39-41中任一项的试剂盒，其中所述BRAF等位基因编码包含氨基酸置换V600E、V600K和/或V600D的B-Raf蛋白。