CN107760764B

CN107760764B - 一种基于引物荧光和淬灭标记的靶核酸检测方法和试剂盒

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Publication number: CN107760764B
Application number: CN201710991419.1A
Authority: CN
Inventors: 陈云弟; 赵萱; 陈薇; 罗俊峰
Original assignee: Shanghai Yueer Gene Technology Co ltd
Current assignee: Shanghai Yueer Gene Technology Co ltd
Priority date: 2017-10-23
Filing date: 2017-10-23
Publication date: 2023-04-07
Anticipated expiration: 2037-10-23
Also published as: CN107760764A

Abstract

本发明提供了一种基于引物荧光和淬灭标记的靶核酸检测方法，命名为PrimQuant™，用于靶核酸的实时荧光定量和等位基因鉴定，属于实时荧光定量PCR领域。不同于探针法与染料法两类经典的实时荧光定量PCR技术，本发明建立了qPCR领域的第三类技术——引物法。本发明包括：1）PrimQuant™设计方法，包括实时荧光定量和等位基因鉴定两种方案；2）用PrimQuant™进行靶核酸实时荧光定量的方法；3）用PrimQuant™进行靶核酸等位基因鉴定的方法；4）用PrimQuant™进行靶核酸实时荧光定量的试剂盒；5）用PrimQuant™进行靶核酸等位基因鉴定的试剂盒。本发明所提供的靶核酸检测方法具有以下优势：1）设计简单：2）特异性强；3）定量精密4）灵敏度高；5）可多重定量。

Description

一种基于引物荧光和淬灭标记的靶核酸检测方法和试剂盒

技术领域

本发明属于实时荧光定量PCR技术领域。

技术背景

1992年，Higuchi提出实时PCR设想。1996年，美国Applied Biosystems公司实现了实时荧光定量的商品化。从那时起一直到现在，定量PCR技术在临床诊断和基础研究中始终发挥着巨大的作用，产生了极大的经济效益和社会效益，而且至今没有减弱的迹象。

现有的实时荧光定量PCR技术分为染料法和探针法两大类。染料法通过可与双链DNA结合的嵌入型荧光染料来定量，所用染料包括溴乙锭、SYBR Green I、SYBR Gold、YO-PRO和YOYO等。这些染料与双链DNA结合后发出的荧光，比游离状态或者与单链DNA结合时强得多，所以可用于核酸的定量检测。染料法的优点是设计简单，不需要探针；缺点是非特异性，只能检测核酸总量，不能分辨不同的靶核酸，不能分辨靶核酸和引物二聚体等其他种类双链DNA，需要在PCR后通过熔解曲线进行确认；另外，染料法不能进行多重定量。

探针法克服了染料法的这些缺点。实时荧光PCR技术的基本原理是荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)。当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的激发光谱波长重叠时，供体的荧光强度衰减，受体的荧光强度增强，这种现象即是FRET。

现有的荧光探针种类较多，分为5类。

1)TaqMan探针。TaqMan探针的5’端标记报告基团(R)，3’端标记淬灭基团(Q)，报告基团(R)可以是FAM、TET、VIC、JOE或HEX，淬灭基团(Q)可以是TAMRA或MGB。当探针游离时，由于荧光共振能量转移，R荧光被Q淬灭。在PCR过程中，由于Taq DNA聚合酶的5’-3’外切活性，探针被切断，R远离Q而使荧光恢复。TaqMan探针有一种衍生形式叫单标记探针，其寡核苷酸探针只在5’端标记发射基团，由带有荧光素的铋螯合物构成。铋螯合物游离时发出的荧光比连接有单链寡核苷酸时强。在PCR过程中，铋螯合物被TaqDNA聚合酶的5’-3’外切活性切断而游离出来，发出较强的荧光信号，实现对靶核酸的定量分析。

2)分子信标。分子信标技术由Tyagi和Krammer提出。分子信标呈发夹型茎-环结构，环的序列与靶DNA互补，茎的序列与靶序列无关且相互互补。5’端标记报告基团，3’端标记淬灭基团。游离状态时，发夹结构的两个末端靠近，R被淬灭；当分子信标与靶序列结合时，茎杆区被拉开，R不被淬灭，可检测到荧光。常用的荧光-淬灭分子对有：Coumarin-DABCYL、EADNS-DABCYL、FAM-DABCYL、TET-DABCYL、TAMRA-DABCYL、TexasRed-DABYCL等。分子信标的衍生探针类型有Amplifluor、Sunrise、Amplisensor、Scorpion等，其中Scorpion应用比较广泛。Scorpion是在分子信标的3’端通过连接臂连接一段引物，扩增出包含发夹结构的PCR产物。该产物在退火时形成分子内杂交，发夹结构被破坏，两个基团之间不能发生共振能量转移，发出荧光。

3)双链探针。也称为复合探针。由互补的两条链构成，长链的5’端标记报告基团，短链的3’标记淬灭基团。没有靶核苷酸存在时，两链形成复合体，荧光被淬灭；有靶序列存在时，带有报告基团的长链探针优先与靶基因结合，发出荧光。

4)杂交探针。有三种形式。1、探针-探针。由两条相邻的探针构成，荧光供体标记在一条探针上，长波长的荧光受体标记在另一条探针上。退火时，两条探针都与靶序列特异性结合，结合后两条探针相隔1-5个碱基，供体与受体之间发生FRET，供体荧光强度减弱，受体荧光强度增强，检测受体荧光信号(而不是供体信号)。2、引物-探针。由一条单标记引物和一条单标记探针构成。上游引物3’端3-6个碱基的T碱基经过修饰可以标记报告荧光；探针的3’端标记淬灭荧光。当探针与荧光标记的PCR产物杂交时，供体基团和受体基团在相反的链上相距4-6个碱基，发生FRET，受体基团发光。3、G淬灭探针。只用一条单标记的探针。探针杂交时，报告基团FAM或BODIPY-FL在接近核苷酸G时发生荧光淬灭。

5)单标记荧光探针与染料相结合的检测模式。DNA嵌入剂可以用作荧光供体或受体。供体可以用SYBRGreen I、SYBRGold；受体可用CY5、CY5.5。在退火阶段，SYBRGold染料嵌入到探针-模板DNA双螺旋里作为荧光供体，与探针上的受体基团产生FRET，受体发射荧光。有ResonSense和Angler两种形式。ResonSense为单标记探针。Angler探针通过连接臂与引物相连，扩增出包含Angler的PCR产物，退火时形成分子内杂交，探针上的受体基团与嵌入的荧光染料SYBRGold发生FRET而发射荧光。

实时荧光定量PCR技术实现了PCR从定性到定量的飞跃；采用闭管检测，不需PCR后处理，避免了交叉污染；配合荧光PCR仪实现了自动化，耗时短，操作方便，易于标准化。实时荧光定量PCR技术可以应用于：病原体的定量监测及药效评价、基因点突变及单核苷酸多态性(SNP)分析、肿瘤基因检测和诊断等。

发明内容

本发明提供了一种独创的、全新的基于引物荧光标记和引物淬灭标记的靶核酸检测方案，在染料法和探针法之外，开辟了第三类实时荧光定量PCR方法：引物法。与探针法一样，PrimQuant^TM也是基于荧光能量共振转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer，也叫Forster Resonance Energy Transfer，FRET)的原理，实现了荧光信号强度与PCR产物分子数同步。不与模板退火的时候，上游和下游PrimQuant^TM引物通过粘连子互补配对形成局部双链，R与Q接近，发生FRET，R发射的荧光信号被Q淬灭；在变性阶段，引物双链分开形成单链；在退火及延伸阶段，上下游引物分别与靶核酸的3’端和5’端特异性结合，R与Q远离，不能发生FRET，R发射的荧光信号被检测到。每个模板DNA分子只能特异结合一个PrimQuant^TM，检测到的荧光信号强度与反应体系中PCR产物的分子数是对应的、成正比的。这是迄今最完美的实时荧光定量PCR方案。它不仅完美地集中了探针法和染料法的优点，而且完全克服了它们的缺点。

本发明提供了一种基于引物荧光标记和淬灭标记的靶核酸检测方法和试剂盒，简化了实时荧光定量PCR反应体系的设计和组成，可以提高设计成功率，提高灵敏度，使得实时荧光定量PCR的技术手段和应用范围都得到进一步拓展。本发明的主要优势在于：

1)设计简便：反应体系中所加入的两条寡核苷酸既是引物，也起到荧光探针的作用，不需要另外设计探针，简化了反应体系，提高了实验设计的成功率，使更多的靶核酸位点可以被检测到；

2)特异性强：不仅能够定量，而且能够精确区分不同种类的核酸，可用于等位基因鉴定；

3)数据精密：荧光信号强度与PCR反应产物分子数严格成正比，避免了引物结合而探针未能结合的情况所造成的定量误差；

4)灵敏度高：淬灭基团和近邻G碱基双重淬灭的设计，使报告荧光被淬灭得更彻底，降低背景信号，提高了信噪比和检测的灵敏度；

5)多重定量和检验：既可用于实时荧光定量，也可用于等位基因鉴定；可以进行多重基因定量和多重等位基因鉴定。

本发明包括：

1)PrimQuant^TM设计方法，包括实时荧光定量PrimQuant^TM和等位基因鉴定PrimQuant^TM两种形式；

2)用PrimQuant^TM进行靶核酸实时荧光定量的方法；

3)用PrimQuant^TM进行靶核酸等位基因鉴定的方法；

4)用PrimQuant^TM进行靶核酸实时荧光定量的试剂盒；

5)用PrimQuant^TM进行靶核酸等位基因鉴定的试剂盒。

其中PrimQuant^TM是一种带有报告荧光基团标记和淬灭荧光基团标记的引物对，兼具探针的作用，适用于靶核酸的实时荧光定量(real-time quantification)和等位基因鉴定(allele discrimination)。

用于实时荧光定量的PrimQuant^TM称为RT-PrimQuant^TM(real-time PrimQuant^TM)，其结构见附图1。RT-PrimQuant^TM由2条靶核酸特异性的引物组成，两条引物的5’端分别有一段互补配对的通用序列，称为粘连子(sticker)。粘连子的5’端分别标记报告基团(Reporter,R)或者淬灭基团(Quencher,Q)。当引物不与模板DNA退火的时候，粘连子互补配对，以局部双链的形式存在于反应体系中。在同管一反应体系中，可以加入多组RT-PrimQuant^TM以实现多重定量。

用于等位基因鉴定的PrimQuant^TM称为GT-PrimQuant^TM(genotypingPrimQuant^TM)，其结构见附图2。GT-PrimQuant^TM由2组PrimQuant^TM组成，分别针对同一基因的两种等位基因。每组PrimQuant^TM中都有一条引物的3’末端或者3’端区域包含有1个或多个碱基与成对等位基因中的一种特异性互补，该引物的粘连子5’端标记报告基团。两组PrimQuant^TM的报告基团发射波长不同，比如FAM和VIC。另一条引物的粘连子5’端标记淬灭基团，淬灭基团可以是一样的。当引物不与模板DNA退火的时候，粘连子互补配对，以局部双链的形式存在于反应体系中。在同一反应体系中可以加入多组GT-PrimQuant^TM以实现多重等位基因鉴定。

本发明所采取的技术方案是：

一种基于引物荧光和淬灭标记的靶核酸检测方法和试剂盒，其中包括引物对(PrimQuant^TM)的设计方法、相关试剂盒和相关检验步骤：

1)一组或多组荧光基团和淬灭基团标记的用于靶核酸实时荧光定量的引物对，命名为RT-PrimQuant^TM；

2)一组或多组荧光基团和淬灭基团标记的用于靶核酸等位基因鉴定的引物对，命名为GT-PrimQuant^TM；

3)用PrimQuant^TM进行靶核酸实时荧光定量的试剂盒；

4)用PrimQuant^TM进行靶核酸等位基因鉴定的试剂盒；

5)已知浓度的标准品或标准品梯度，阴性质控样本，阳性质控样本；

6)检验步骤1：混合模板DNA、PrimQuant^TM引物、PCR反应母液(master mix)，必要时用水找补反应体积；

7)检验步骤2：对于基因定量检验，设置重复反应、标准品梯度、阳性对照和阴性对照；对于等位基因鉴定检验，设置阳性对照和阴性对照；

8)检验步骤3：设置PCR反应参数和荧光信号采集点；

9)检验步骤4：启动仪器，进行PCR循环和信号采集；

10)检验步骤5：分析数据。

其中PrimQuant^TM的设计方案如下所述：

1)用于实时荧光定量的RT-PrimQuant^TM由2条引物组成，两条引物的5’端各自连有一段互补配对的通用序列，称为粘连子；

2)RT-PrimQuant^TM其中一条引物的粘连子5’端标记报告基团(Reporter,R)；

3)RT-PrimQuant^TM其中另一条引物的粘连子5’端标记淬灭基团(Quencher,Q)；

4)在同一个反应体系中，可以根据需要加入针对不同靶核酸的多组RT-PrimQuant^TM，实现多重基因定量；

5)用于等位基因鉴定的GT-PrimQuant^TM由2组PrimQuant^TM组成；

6)GT-PrimQuant^TM的上游引物或者下游引物分别标记不同的报告荧光基团，比如FAM和VIC；

7)GT-PrimQuant^TM标记报告基团的那条引物的3’端或者3’端区域内有1个或多个碱基分别与成对等位基因中的一种特异性互补，比如G/T SNP位点的G和T；

8)GT-PrimQuant^TM的另一条引物标记淬灭基团，淬灭基团可以是一样的；

9)在同一反应体系中，可以根据需要加入针对不同靶核酸的多组GT-PrimQuant^TM，实现多重基因分型。

其中基于引物荧光标记的靶核酸检测试剂盒的特征在于：

1)所述的1)报告基团和淬灭基团标记的引物对RT-PrimQuant^TM，可以用任何种类的适当的报告基团和任何种类的与报告基团相匹配的淬灭基团；

2)所述的2)报告基团和淬灭基团标记的引物对GT-PrimQuant^TM，可以用任何种类的适当的报告基团和任何种类的与报告基团相匹配的淬灭基团；

3)所述的8)PCR反应参数，可以用2步法PCR或者3步法PCR。

其中靶核酸检测试剂盒包括：

1)一组或多组荧光标记的、针对不同靶核酸位点的RT-PrimQuant^TM或者GT-PrimQuant^TM；

2)含有DNA聚合酶、dNTP、缓冲液的PCR反应母液(master mix)；

3)去离子水；

4)已知浓度的标准品或标准品梯度；

5)阴性质控样本；

6)阳性质控样本。

本发明提供的基于引物荧光标记的靶核酸检测方法和试剂盒可以应用于靶基因的实时荧光定量、等位基因鉴定和等位基因鉴定。

本发明还提供了基于引物荧光标记的靶核酸检测试剂盒在实时荧光定量和等位基因鉴定中的使用方法，包括下述步骤：

1)对于基因定量检验，用所述的3)试剂盒里的试剂，混合待测模板DNA、RT-PrimQuant^TM、PCR反应母液(master mix)，必要时用水找补体积，并设置重复反应；

2)对于基因定量检验，用所述的3)试剂盒里的试剂以及所述的5)标准品和对照品，设置标准品梯度、阳性对照和阴性对照；

3)对于等位基因鉴定检验，用所述的4)试剂盒里的试剂，混合待测模板DNA、2组或多组GT-PrimQuant^TM引物、PCR反应母液(master mix)，必要时用水找补体积；

4)对于等位基因鉴定检验，用所述的4)试剂盒里的试剂以及所述的5)对照品，设置阳性对照和阴性对照；

5)设置PCR反应参数和荧光信号采集点；

6)启动仪器，进行PCR循环和信号采集；

7)对检测结果进行分析获得靶核酸的基因定量或等位基因鉴定信息；

8)每个批次检测都需要用所述的5)阴性质控样本和阳性质控样本作为质量控制；

9)对于基因定量检验，每个批次检测都需要用所述的5)标准品或者标准品梯度生成标准曲线。

附图说明

图1RT-PrimQuant^TM结构图。

图2GT-PrimQuant^TM结构图。

图3运用PrimQuant^TM技术对CFTR基因进行实时荧光PCR检测。

具体实施例

为了使本发明更容易理解，下面将结合实施例和附图来进行详细说明。这些实施例仅仅起到说明和示范的作用，不用于限制本发明的应用范围。下列实施例中未提及的具体实验方法，按常规的标准实验方法进行。

1.实施例1方案设计

以囊性纤维化跨膜转运调节因子(cystic fibrosis transmembraneconductance regulator，CFTR)基因的实时荧光检测为例，所设计的引物序列及其荧光报告基团和荧光淬灭基团标记信息如下。

1)cf3f0:5'-TAMRA-GACTCCGCTCTCCGACTCTTTGGTAATAGGACATCTCCAA-3'

2)cf3r1:5'-6-FAM-GAGTCGGAGAGCGGAGTCCCACCTTCTCCAAGAACTATA-3'

3)在本发明的其他实施方案中，荧光报告基团还可以选择TET、NED、HEX等其他种类，荧光淬灭基团也可以选择DABCYL、BHQ2、BHQ3等其他种类。

2.模板及探针稀释

1)待测未知样本DNA在冰上融化，振荡混匀后，分别稀释成5-50ng/μL；

2)阴性对照样本为去离子水；

3)将合成好的上述2种引物用TE buffer稀释至50-900nM。

3.PCR反应体系配制

1)在0.2mLPCR管中加入如下组分，振荡混匀

2)每次实验可设置一个阴性对照，作为产品使用的质量控制。

4.将各反应管置于荧光定量PCR扩增仪中，按照如下反应程序进行荧光PCR反应：

在60℃1min步骤采集荧光信号。检测并记录样品的扩增曲线与C_T值。

5.数据分析

多个CFTR基因样本和阴性对照的实时荧光检测结果如附图3所示。

可以看到：(1)全部9个未知样本的C_T<35，且样本浓度越高，C_T越小，符合预期。(2)全部3个阴性对照样本的C_T>35，符合预期。

Claims

1.一种基于引物荧光和淬灭标记的靶核酸检测方法，其特征在于

所述靶核酸为囊性纤维化跨膜转运调节因子基因，所述检测为实时荧光定量检测，其中引物对RT-PrimQuant为：

cf3f0: 5'-TAMRA-GACTCCGCTCTCCGACTCTTTGGTAATAGGACATCTCCAA-3'

cf3r1: 5'-6-FAM-GAGTCGGAGAGCGGAGTCCCACCTTCTCCAAGAACTATA-3'；

模板及探针稀释步骤为：

1）待测未知样本DNA在冰上融化，振荡混匀后，分别稀释成5-50 ng/μL；

2）阴性对照样本为去离子水；

3）将合成好的上述2种引物用TE buffer稀释至50-900 nM；

PCR反应体系为：

其PCR反应程序为：

在60℃ 1 min步骤采集荧光信号。

2.一种用于权利要求1所述的基于引物荧光和淬灭标记的靶核酸检测方法的引物对PrimQuant，其特征在于所述引物对的序列为：

cf3f0: 5'-TAMRA-GACTCCGCTCTCCGACTCTTTGGTAATAGGACATCTCCAA-3'；

cf3r1: 5'-6-FAM-GAGTCGGAGAGCGGAGTCCCACCTTCTCCAAGAACTATA-3'。

3.一种用于权利要求1所述的基于引物荧光标记和淬灭的靶核酸检测方法的试剂盒，其特征在于所述试剂盒含有：

1）引物对RT-PrimQuant：

cf3f0: 5'-TAMRA-GACTCCGCTCTCCGACTCTTTGGTAATAGGACATCTCCAA-3'

cf3r1: 5'-6-FAM-GAGTCGGAGAGCGGAGTCCCACCTTCTCCAAGAACTATA-3'；

2）含有DNA聚合酶、dNTP、缓冲液的PCR反应母液；

3）去离子水；

4）已知浓度的标准品或标准品梯度；

5）阴性质控样本；

6）阳性质控样本。