WO2016194552A1 - 複数の標的核酸の検出キット及びそれを用いる検出方法 - Google Patents

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WO2016194552A1
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nucleic acid
target
temperature
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長野隆志
宮島兼佑
楢原謙次
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株式会社ミズホメディー
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    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/107—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties fluorescence

Definitions

  • the present invention relates to a detection kit for improving a PCR method and measuring a plurality of target nucleic acids and related techniques.
  • influenza A and B examples include influenza A and B, influenza and RSV, human metapneumovirus, chlamydia and gonorrhea of sexually transmitted diseases, mycoplasma and its resistance factors.
  • the disease is similar and the infection spreads simultaneously at the same time, it may be possible to make a diagnosis by distinguishing these and making a treatment policy.
  • the presence of resistance factors is also used to make decisions on medication selection.
  • an internal control as a means of confirming whether or not the measurement has progressed really well even for a single measurement item. This is prepared in advance so as to amplify a nucleic acid sequence unrelated to the target gene to be detected, and it can be confirmed whether or not the reaction has proceeded successfully regardless of the presence or absence of the target gene. This makes it possible to confirm in the measurement whether or not the measuring reagent or device has worked effectively.
  • thermo melting curve analysis method After performing the amplification reaction at the same time, gradually increase (or decrease) the temperature, and discriminate and judge from the temperature at which the change rate of the fluorescence signal shows a peak and the melting temperature of the target nucleic acid (thermal melting curve analysis method) Is also possible.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 2002-136300
  • a plurality of reaction containers containing different reaction solutions are prepared, and each is amplified and detected.
  • reagent preparation and dispensing work are required for each item, which is troublesome.
  • Patent Document 2 Japanese Patent Laid-Open No. 2004-203
  • Identification is made by changing the labeling dye for each gene.
  • the cost of the apparatus is increased because a plurality of optical systems for the detection apparatus are required as many as the number of labeling dyes to be used.
  • Patent Document 3 Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 2008-173127
  • dissociation curve analysis synthetic with “thermal melting curve analysis”
  • the temperature is gradually increased from the low temperature side to the high temperature side to monitor the fluorescence value.
  • the identification is performed by monitoring the presence or absence of a peak at each dissociation temperature depending on the base sequence.
  • Patent Document 4 Japanese Patent Special Publication No. 2012-513215
  • a plurality of genes are simultaneously amplified in one reaction solution container.
  • the dissociation temperature of the PCR product and the melting temperature of the primer are changed, and fluorescence is monitored and identified at each melting temperature.
  • a normal PCR profile is provided with denaturation, annealing, and extension steps in one cycle.
  • Patent Document 4 since the melting temperature of the PCR product is changed for each item, there are many conditions to be considered and it is difficult to design the profile. Yes, the measurement time becomes longer. Since the temperature change is severe, there is a problem that the burden on the apparatus is heavy.
  • Japanese Unexamined Patent Publication No. 2002-136300 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2004-203 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2008-173127 Japan Special Table 2012-513215 Japanese Patent No. 4724380
  • an object of the present invention is to provide a plurality of target nucleic acid detection kits capable of simultaneously amplifying and detecting a plurality of genes using a single reaction container containing a single type of reaction solution and a single label. To do.
  • the detection kit for a plurality of target nucleic acids according to the first invention satisfies T0> T2 ⁇ T1> T3, where T0 is the denaturation temperature, T1 is the annealing temperature, T2 is the extension temperature, and T3 is the second target detection temperature.
  • T0 is the denaturation temperature
  • T1 is the annealing temperature
  • T2 is the extension temperature
  • T3 is the second target detection temperature.
  • a plurality of target nucleic acid detection kits that are temperature-set at the first target nucleic acid and the second target, each having a double-strand hydrogen bond cleaved and dissociated into two single-strands at the denaturation temperature T0.
  • a first target primer that specifically binds to one of the two single strands from which the first target nucleic acid has been dissociated at the annealing temperature T1, and two ones from which the second target nucleic acid has been dissociated at the annealing temperature T1.
  • a second target primer that specifically binds to one of the strands, and a first target probe that specifically binds to one of the two single strands from which the first target nucleic acid is dissociated at the annealing temperature T1 The first target nucleic acid whose fluorescence signal changes upon binding, the DNA polymerase, and the two single strands from which the first target nucleic acid is dissociated by the action of the DNA polymerase at the extension temperature T2.
  • the first and second labeled substances are selected from the group consisting of a QProbe (registered trademark) probe, an Eprobe (registered trademark) probe, and a TaqMan (registered trademark) probe.
  • Fluorescent signal may be either one that quenches when annealed or one that emits light when annealed.
  • the first target nucleic acid and the second target nucleic acid are preferably mycoplasma P1 gene and internal control, or Chlamydia endogenous plasmid gene and Neisseria gonorrhoeae CMT gene.
  • a plurality of target nucleic acids can be detected with a single mixed solution using a single label. Since a plurality of target nucleic acids can be identified without thermal melting curve analysis, the measurement time can be greatly shortened and the practical effect is high.
  • the present inventors detect a plurality of nucleic acids using a single fluorescent label in a single reaction vessel containing a single type of reaction solution, which combines a probe annealing temperature condition setting and a temperature change profile.
  • a kit was developed.
  • a denaturation temperature T0 95 ° C.
  • an annealing temperature T1 70 ° C.
  • an extension temperature T2 72 ° C.
  • a second target detection temperature T3 55 ° C.
  • the plurality of target nucleic acids are the first target nucleic acid and the second target nucleic acid. If necessary, the third target nucleic acid and others can be increased by increasing the set temperature such as the third target detection temperature T4 (T3> T4). The target nucleic acid can also be added.
  • the first target nucleic acid 10 and the second target nucleic acid 20 are to be detected.
  • the solution 2 in the container 1 contains both the first target nucleic acid 10 and the second target nucleic acid 20 (that is, positive and positive). Only).
  • the first target nucleic acid 10 and the second target nucleic acid 20 are not included in the solution 2, and are not included in the following description. There will be no fluorescence signal and amplification for the target nucleic acid.
  • the first target nucleic acid 10 and the second target nucleic acid 20 are both cleaved by double-stranded hydrogen bonds, Single strands (the first target nucleic acid 10 is the first single strand 11 and the second single strand 12, the second target nucleic acid 20 is the first single strand 21 and the second single strand Dissociate into chain 22).
  • the first target F primer 13 is complementary to the first single strand 11 for the first target nucleic acid 10.
  • the first target R primer 14 specifically binds to a complementary sequence of the second single strand 12.
  • the second target F primer 23 specifically binds to the complementary sequence of the first single strand 21, and the second target R primer 24 has the second one. It binds specifically to the complementary sequence of strand 22.
  • the first target probe 15 labeled with the first label 16 is specific to the specific site of the first single strand 11 derived from the first target nucleic acid 10 at the annealing temperature T1 shown in FIG.
  • the first label 16 generates a fluorescent signature.
  • the second target probe 25 labeled with the second label 26 has a higher temperature at the annealing temperature T1 than the second target detection temperature T3, the first single strand 21 derived from the second target nucleic acid 20 is used.
  • the second label 26 does not generate a fluorescent signature.
  • Deoxyribonucleotide triphosphate 31 binds and extends.
  • Deoxyribonucleotide triphosphate 31 binds and extends.
  • both the first target nucleic acid 10 and the second target nucleic acid 20 are doubled, as can be seen by comparing FIG. 37 (d) with FIG.
  • the change of the fluorescence signal by the first target 16 and the amplification reaction may be repeated. it can.
  • the state is the same as in FIG. 37 (a). However, when the temperature is lowered to the second target temperature detection temperature T3, unlike FIG. 37 (b), the state shown in FIG. 38 (b) is obtained.
  • the first target probe 15 labeled with the first label 16 specifically binds to a specific site of the first single strand 11 derived from the first target nucleic acid 10.
  • the second target probe 25 labeled with the second label 26 is also the second target detection temperature in the same manner as FIG. 37B in that it binds and the fluorescence signal of the first label 16 changes. Since it is T3, it binds to the first single strand 21 derived from the second target nucleic acid 20, and the fluorescence signal of the second label 26 changes.
  • the first labeled object 16 and the second labeled object 26 are preferably the same.
  • the presence or absence (positive / negative) of the second label 20 can be determined by capturing the difference due to the change in the fluorescence signal by the second label 26.
  • a plurality of target nucleic acids can be detected during a series of steps using a single reaction vessel containing a single type of reaction solution.
  • SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 used the sequences described in Ieven et al. (The Journal of Infectious Diseases, 1996; 173; 1445-52) (primer pair for the P1 adhesin gene).
  • nucleic acid sample The nucleic acid sample used in the PCR method in Embodiment 1 is shown below.
  • PMYC A gene fragment (sequence amplified by the primer pair of SEQ ID NO: 1 and 2) encoding a P1 protein that is a membrane protein derived from Mycoplasma pneumoniae, a pathogen of Mycoplasma pneumonia, is artificially synthesized, and then inserted into a pMD20T vector. is there.
  • This plasmid DNA was produced by consigning synthesis to Takara Bio Inc.
  • PICM5 A plasmid DNA in which a sequence containing a base sequence complementary to a primer pair is artificially synthesized and then incorporated into a pMD20T vector so that the primer pair of SEQ ID NOs: 1 and 2 can be amplified as a common primer.
  • This plasmid DNA was prepared by consigning synthesis to Takara Bio Inc.
  • the length of the above plasmid is 2942 bp for pMYC and 2886 bp for pICM5.
  • a TE buffer solution (10 mM Tris-HCl, 1.0 mM EDTA pH 8.0) was used, and pMYC was 1 ⁇ 10. ⁇ 5 copies / ⁇ l, pICM5 was diluted to 1 ⁇ 10 ⁇ 3 copies / ⁇ l.
  • SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 are identified with reference to the Tm value calculated using the QProbe design support tool on the J-Bio21 Center homepage. Selected area.
  • BODIPY (registered trademark) FL was used as the fluorescent dye of MYC QP, which is a QProbe that specifically anneals to pMYC, and IC QP, which is a QProbe that specifically anneals to pICM5, and labeled with C at the 3 ′ end.
  • QProbe was produced by consigning synthesis to Nippon Steel & Sumikin Environment Co., Ltd.
  • the Tm value of QProbe (MYC QP) that specifically anneals to the first target pMYC is used as a primer.
  • the temperature was set higher than the Tm value of and detected during the amplification reaction.
  • the Tm value of QProbe (IC QP) that specifically anneals to the second target, pICM5 was set to a temperature lower than the change temperature (70 ° C.-95 ° C.) during the amplification reaction, and was detected after the amplification reaction. .
  • LightCycler registered trademark
  • nano Roche Diagnostics Co., Ltd.
  • the combination of excitation wavelength and fluorescence wavelength at the time of fluorescence measurement was selected to be 510-528 nm.
  • the fluorescence value was measured at the denaturation step (95 ° C.) and the extension step (72 ° C.) of each cycle, and further the fluorescence measurement was performed at the steps (95 ° C. and 55 ° C.) for detecting the second target after the amplification reaction. .
  • Fig. 2 shows the final cycle of the amplification reaction and the fluorescence measurement conditions in the second target detection step.
  • F44 which is the value of Fn in the final cycle of the amplification reaction, was used to determine the presence or absence of the first target nucleic acid.
  • Fs Fe-F44 (Equation 3)
  • Fs The measured value Fs of the second target was used to determine the presence or absence of the second target nucleic acid.
  • the determination in the QProbe method was performed by the method shown below.
  • the presence or absence of the first target nucleic acid was determined by comparing the value of F44 of the measurement sample with the threshold 1 [F44 of measurement sample ⁇ threshold 1] as positive.
  • Threshold value 1 was a negative control (reagent added with TE buffer instead of DNA) F44 average value-three times the standard deviation (hereinafter mean-3SD).
  • the presence or absence of the second target nucleic acid was determined as [Fs ⁇ threshold 2] positive by comparing the Fs value with the threshold 2 regardless of whether the first target nucleic acid was positive or negative.
  • PCR was performed using pMYC for the mycoplasma P1 gene and pICM5 for the internal control, respectively, as nucleic acid samples.
  • the MYC QP array had a Tm value of 72.5 ° C, and the IC QP array had a Tm value of 57.5 ° C. Therefore, in the temperature range during PCR (70 ° C. to 95 ° C.), it was speculated that only MYC QP annealed as a probe.
  • the fluorescence measurement in the second target detection step is performed at 95 ° C. and 55 ° C., which is lower than the Tm value of IC QP, it was estimated that the measurement value in the second target detection step detects quenching of MYC QP and IC QP simultaneously. .
  • the amplification curve of the negative control shows no quenching until the 44th cycle when PCR ends (because the F44 value of 0.998 is not lower than the threshold 1 value of 0.997) and the mean-3SD at this time is 0 It is set to the threshold 1 for the first target detection of the first embodiment, and is shown in (Table 5). The amplification curve is shown in FIG.
  • the F44 value of 0.913 was lower than the threshold value 1, indicating that the target region of pMYC was amplified.
  • mean-3SD of Fs is ⁇ 0.056, and is set as a threshold value 2 for detecting the second target, as shown in (Table 5).
  • the amplification curve is shown in FIG.
  • the amplification curve of the second target nucleic acid pICM5 shows no quenching during the amplification reaction (because the F44 value of 0.997 is not lower than the threshold 1 value of 0.997), and the Fs value is ⁇ 0.118. Was lower than threshold 2.
  • Fs ⁇ 0.116 was lower than threshold 2, indicating that the target region of pICM5 was amplified.
  • the value of Fs is shown in (Table 5).
  • the amplification curve is shown in FIG.
  • PCR products were subjected to agarose electrophoresis after the completion of PCR, and the target PCR product was confirmed around 206 bp in the sample added with pMYC and around 150 bp in the sample added with pICM5.
  • the QProbe method can detect the mycoplasma P1 gene and the internal control by combining a probe design method and a temperature change profile and using a single fluorescent label in one reaction vessel containing one type of reaction solution. Indicated.
  • the mycoplasma P1 gene and internal control in the QProbe method were detected by the method of changing the profile of the second target detection step of the first embodiment.
  • FIG. 8 shows the final cycle of the amplification reaction and the fluorescence measurement conditions in the second target detection step.
  • fe uses the following calculation, and otherwise performs the same calculation process as in the first embodiment.
  • fe fhyb. e / fden. 44
  • fe fluorescence intensity value fhyb. in the second target detection step.
  • e Second target detection step
  • Fluorescence intensity value fden. 44 Fluorescence intensity value at 95 ° C. of the final cycle of the amplification reaction
  • Embodiment 2 The determination method of Embodiment 2 is shown below. The presence or absence of the first target nucleic acid was determined by comparing the F44 value of the measurement sample with the threshold 3 and [F44 of the measurement sample ⁇ threshold 3] being positive.
  • mean-3SD a value of the average value of F44 of negative control-three times the standard deviation
  • the presence or absence of the second target nucleic acid was determined as [Fs ⁇ threshold 4] positive by comparing the Fs value with the threshold 4 regardless of whether the first target nucleic acid was positive or negative.
  • the threshold 4 the value of mean-3SD of Fs of a sample to which only pMYC was added was used.
  • the amplification curve of the negative control shows no quenching until the 44th cycle when the amplification reaction ends (because the F44 value of 0.998 is not lower than the threshold 3 value of 0.997), and mean-3SD at this time is It becomes 0.997, and is set as the threshold value 3 for the first target detection of this example, and is shown in (Table 7).
  • the amplification curve is as shown in FIG.
  • the amplification curve of pMYC which is the first target nucleic acid, shows that quenching accompanying annealing of MYC QP was observed from around 28 cycles, F44 value 0.912 was lower than threshold 3, indicating that the target region of pMYC was amplified. It was done.
  • the mean-3SD of Fs at this time is ⁇ 0.052, and it is shown as (Table 7) as the threshold value 4 for detecting the second target.
  • the amplification curve is as shown in FIG.
  • Fs ⁇ 0.114 was lower than the threshold value 4, indicating that the target region of pICM5 was amplified.
  • the value of Fs is shown in (Table 7).
  • the amplification curve is shown in FIG.
  • the Mycoplasma P1 gene and internal control were detected by the Eprobe method.
  • Eprobe selected a specific region with reference to the Tm value calculated using “Design”, which is software created by DanaForm Co., Ltd.
  • MYC EP which is an probe that specifically anneals to pMYC
  • D514 are used as the fluorescent dye of IC EP, which is an probe that specifically anneals to pICM5
  • MYC EP labels the 19th T from the 5 ′ end, IC EP labeled the 9th T from the 5 'end.
  • Eprobe was produced by consigning synthesis to Eurofin Genomics.
  • the PCR reaction solution composition and reaction conditions are shown in (Table 9) and (Table 10).
  • 530-548 nm was selected as the combination of excitation wavelength and fluorescence wavelength during fluorescence measurement.
  • Fs in the third embodiment uses the following calculation, and otherwise performs the same calculation process as in the first embodiment.
  • Fs Fe-F40
  • Embodiment 3 was performed by the following method.
  • the presence or absence of the first target nucleic acid was determined by comparing the F40 value of the measurement sample with the threshold 5 and [F40 of measurement sample> threshold 5] as positive.
  • the presence or absence of the second target nucleic acid was determined as [Fs> threshold 6] positive by comparing the Fs value with the threshold 6 regardless of whether the first target nucleic acid was positive or negative.
  • the MYC EP array had a Tm value of 76.4 ° C, and the IC EP array had a Tm value of 59.8 ° C. Therefore, in the temperature range during PCR (70 ° C. to 95 ° C.), it was speculated that only the MYC EP probe annealed.
  • the fluorescence measurement in the second target detection step is carried out at 95 ° C. and 55 ° C., which is lower than the Tm value of IC EP, it is assumed that the measurement value in the second target detection step simultaneously detects luminescence of MYC EP and IC EP It was done.
  • the threshold value 5 for detecting the first target nucleic acid is set as shown in (Table 11).
  • the amplification curve is shown in FIG.
  • the amplification curve of pMYC which is the first target nucleic acid, shows that light emission accompanying MYC EP annealing was observed from around 29 cycles, F40 value 2.314 was higher than threshold 5, and the target region of pMYC was amplified. It was done.
  • mean + 3SD of Fs at this time is 3.695, which is shown in Table 11 as a threshold 6 for detecting the second target.
  • the amplification curve is shown in FIG.
  • the amplification curve when adding both the first target nucleic acid pMYC and the second target nucleic acid pICM5 is similar to the amplification curve of pMYC, and light emission accompanying annealing of MYC EP is observed from around 29 cycles.
  • the value of 2.355 was higher than the threshold value 5, indicating that the target region of pMYC was amplified.
  • Fs value 4.254 was higher than threshold 6, indicating that the target region of pICM5 was amplified.
  • the value of Fs is shown in (Table 11).
  • the amplification curve is shown in FIG.
  • the mycoplasma P1 gene and internal control were detected in the TaqMan probe method.
  • the same primers and nucleic acid samples used for PCR as in Embodiment 1 were used.
  • the fluorescent dyes of MYC Taq which is a TaqMan probe that specifically anneals to pMYC
  • IC Taq which is a TaqMan probe that specifically anneals to pICM5
  • FAM registered trademark
  • TAMRA (Registered trademark).
  • the TaqMan probe was produced by consigning synthesis to Takara Bio Inc.
  • the PCR reaction solution composition and reaction conditions are shown in (Table 13) and (Table 14).
  • 530-548 nm was selected as the combination of excitation wavelength and fluorescence wavelength during fluorescence measurement.
  • fluorescence measurement was performed at 95 ° C. and 50 ° C.
  • the determination method in Embodiment 4 was performed by the following method.
  • the presence or absence of the first target nucleic acid was determined by comparing the F44 value of the measurement sample with the threshold 7 and [F44 of measurement sample> threshold 7] as positive.
  • the presence or absence of the second target nucleic acid was determined as [Fs> threshold 8] positive by comparing the Fs value with the threshold 8 regardless of whether the first target nucleic acid was positive or negative.
  • the threshold value 8 the value of mean + 3SD of Fs of the sample to which only pMYC was added was used.
  • the MYC Taq array had a Tm value of 75.8 ° C, and the IC Taq array had a Tm value of 53.7 ° C. Therefore, in the temperature range during PCR (70 ° C. to 95 ° C.), it was speculated that only MYC Taq annealed as a probe.
  • the fluorescence measurement in the second target detection step is performed at 95 ° C. and 50 ° C., which is lower than the Tm value of IC Taq, the measurement value in the second target detection step is estimated to detect luminescence of MYC Taq and IC Taq simultaneously. It was done.
  • the threshold value 7 for detecting the first target nucleic acid is set as shown in (Table 15).
  • the amplification curve is shown in FIG.
  • the amplification curve of pMYC which is the first target nucleic acid, shows that luminescence accompanying MYC Taq annealing was observed from around 28 cycles, F44 value 1.427 was higher than threshold 7, and the target region of pMYC was amplified. It was done.
  • the mean + 3SD of Fs at this time is 0.110, which is shown as a threshold value 8 for detecting the second target (Table 15).
  • the amplification curve is shown in FIG.
  • the amplification curve of the second target nucleic acid pICM5 shows no luminescence during the amplification reaction (because the F44 value of 1.028 is not higher than the threshold 7 value of 1.028) and the Fs value of 0.130. Was higher than threshold 8.
  • the amplification curve when adding both the first target nucleic acid pMYC and the second target nucleic acid pICM5 is similar to the amplification curve of pMYC, and light emission accompanying annealing of MYC EP is observed from around 29 cycles. A value of 1.348 was higher than threshold 7, indicating that the target region of pMYC was amplified.
  • Fs value 0.177 was higher than threshold 8, indicating that the target region of pICM5 was amplified.
  • the value of Fs is shown in (Table 15).
  • the amplification curve is shown in FIG.
  • the TaqMan probe method can detect the mycoplasma P1 gene and internal control using a single fluorescent label in one reaction vessel containing one type of reaction solution by combining the probe design method and temperature change profile. It has been shown.
  • the mycoplasma P1 gene and internal control were detected in the QProbe method using real samples.
  • the mycoplasma P1 gene was determined to be positive for Mycoplasma pneumoniae by the LAMP method (Japanese Patent No. 3313358) (examination was entrusted to BML Inc.) QIAamp (registered trademark) DNA mini from the throat swab Total DNA extracted using Kit (QIAGEN) was used.
  • Embodiment 5 The determination method of Embodiment 5 is shown below. The presence or absence of the first target nucleic acid was determined by comparing the F44 value of the measurement sample with the threshold 9 and [F44 of the measurement sample ⁇ threshold 9] being positive.
  • the presence or absence of the second target nucleic acid was determined as [Fs ⁇ threshold 10] positive by comparing the Fs value with the threshold 10 regardless of whether the first target nucleic acid was positive or negative.
  • the threshold 10 the value of mean-3SD of Fs of a positive sample was used.
  • the mean-3SD of Fs at this time is ⁇ 0.132, and is set as a threshold 10 for detecting the second target, as shown in (Table 16).
  • the amplification curve is shown in FIG.
  • the amplification curve of pICM5 which is the second target nucleic acid, shows no quenching during the amplification reaction (because the F44 value of 0.998 is not lower than the threshold 9 value of 0.997), and the Fs value is ⁇ 0. 227 was below threshold 10.
  • Fs ⁇ 0.235 was lower than the threshold value 10, indicating that the target region of pICM5 was amplified.
  • the value of Fs is shown in (Table 16).
  • the amplification curve is shown in FIG.
  • the mycoplasma P1 gene and internal control can be detected using a single fluorescent dye in a single reaction vessel containing one type of reaction solution by combining the probe design method and temperature change profile in an actual clinical sample. It was shown that it can be done.
  • the present invention can also be applied to subtype identification of pathogens of infectious diseases and single nucleotide polymorphism identification.
  • Chlamydia endogenous plasmid gene and Neisseria gonorrhoeae CMT gene were detected by the QProbe method.
  • PCT PCT After artificial synthesis of an endogenous plasmid (pLGV440) gene fragment common to Chlamydia trachomatis, a pathogen of genital chlamydia infection, plasmid DNA incorporated into the pUC57 vector was prepared by consigning synthesis to Hokkaido System Science Co., Ltd.
  • PNG cytosine DNA methyltransferase
  • the length of the above plasmid is 3064 bp for pCT and 3059 bp for pNG.
  • Primer pairs used in the PCR method in Embodiment 6 are as shown in (Table 17).
  • CT QP refers to the Tm value calculated using the QProbe design support tool on the website of J-Bio21 Center of Nippon Steel & Sumikin Environment Co., Ltd. from the base sequence of the PCR product that can be amplified with the primer pair of SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7. Selected a specific area.
  • NG QP selects a specific region from the base sequence of the PCR product that can be amplified with the primer pair of SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9, referring to the Tm value calculated using the QProbe design support tool on the J-Bio21 Center website. did.
  • BODIPY (registered trademark) FL was used as a fluorescent dye for CT QP, a QProbe that specifically anneals to pCT, and NG QP, a QProbe that specifically anneals to pNG. .
  • the combination of excitation wavelength and fluorescence wavelength at the time of fluorescence measurement was selected to be 510-528 nm.
  • the fluorescence value was measured at the denaturation step (95 ° C.) and the extension step (68 ° C.) of each cycle, and further the fluorescence measurement was performed at the steps (95 ° C. and 55 ° C.) for detecting the second target after the amplification reaction. .
  • the determination method of this embodiment is shown below.
  • the presence or absence of the first target nucleic acid was determined by comparing the value of F44 of the measurement sample with the threshold 11 and [F44 of the measurement sample ⁇ threshold 11] being positive.
  • the presence or absence of the second target nucleic acid was determined as [Fs ⁇ threshold 12] positive by comparing the Fs value with the threshold 12 regardless of whether the first target nucleic acid was positive or negative.
  • the CT QP array had a Tm value of 73.4 ° C, and the NG QP array had a Tm value of 62.5 ° C. Therefore, in the temperature range during PCR (68 ° C. to 95 ° C.), it was speculated that only CT QP annealed for the probe.
  • the fluorescence measurement in the second target detection step is performed at 55 ° C. which is lower than the Tm value of 95 ° C. and NG QP, it is assumed that the measurement value in the second target detection step simultaneously detects the emission of CT QP and NG QP. It was done.
  • the amplification curve of the negative control shows no quenching until the 44th cycle when PCR ends (because the F44 value of 0.998 is not lower than the threshold 11 value of 0.996) and the mean-3SD at this time is 0 996, which is the threshold 11 for detecting the first target in this example, and is shown in (Table 21).
  • the amplification curve is shown in FIG.
  • the amplification curve of pCT which is the first target nucleic acid, shows that quenching accompanying annealing of CT QP was observed from around 28 cycles, and F44 value 0.720 was lower than threshold 11, indicating that the target region of pCT was amplified. It was done.
  • the mean-3SD of Fs at this time is ⁇ 0.039, which is set as a threshold 12 for detecting the second target, and is shown in (Table 21).
  • the amplification curve is shown in FIG.
  • the amplification curve of pNG, the second target nucleic acid shows no quenching during the amplification reaction (because the F44 value of 0.998 is not lower than the threshold 11 value of 0.996), and the Fs value is ⁇ 0. 065 was lower than threshold 12.
  • Fs ⁇ 0.111 was lower than the threshold value 12, indicating that the target region of pNG was amplified.
  • the value of Fs is shown in (Table 21).
  • the amplification curve is shown in FIG.
  • the probe design method and temperature change profile were combined for two genes, and a single fluorescent dye was used in one reaction vessel containing one type of reaction solution to detect the Mycoplasma P1 gene and internal control. It was shown that it can be done.
  • the detection of the mycoplasma P1 gene and internal control in the QProbe method was performed not only after the final cycle but also by a method in which the second target detection step was folded during the amplification reaction.
  • FIG. 30 shows a graph of the temperature change of the amplification reaction.
  • fen fhyb. en / fden. en (Equation 4)
  • fen The fluorescence intensity value fhyb. in the n-th second target detection step calculated by (Expression 4).
  • en n-th second target detection step 55 ° C.
  • fluorescence intensity value fden. en nth second target detection step Fluorescence intensity value at 95 ° C.
  • Fen fen / f10 (Equation 5)
  • Fs1 Fe1-F20 in the n-th second target detection step when the fluorescence intensity value obtained by (Expression 4) in the 10th cycle is set to 1 (Expression 6)
  • Fs2 Fe2-F27 (Equation 6 ′)
  • Fs3 Fe3-F34 (Equation 6 '')
  • Fs4 Fe4-F41 (Formula 6 ''')
  • Fs4 Fourth measurement value of second target detection step measured value
  • Determination was performed by the method shown below.
  • the presence or absence of the first target nucleic acid was determined by comparing the F41 value of the measurement sample with the threshold 13 and [F41 of the measurement sample ⁇ threshold 13] as positive.
  • As the threshold 13 a value of the average value of F41 of the negative control minus 3 times the standard deviation (hereinafter mean-3SD) was used.
  • [Fs1 ⁇ threshold 14] was determined as positive for the presence or absence of the second target nucleic acid.
  • the threshold value 14 the value of mean-3SD of Fs1 of the sample added with only pMYC was used.
  • the threshold value 15 the value of mean-3SD of Fs2 of the sample to which only pMYC was added was used.
  • the threshold value 17 the value of mean-3SD of Fs4 of the sample to which only pMYC was added was used.
  • the amplification curve of the negative control shows no quenching until the 41st cycle when PCR is completed except for each second target detection step (because the F41 value of 0.999 is not lower than the threshold 13 value of 0.998),
  • the mean-3SD at this time is 0.998, which is the threshold 13 for detecting the first target in this example, and is shown in (Table 23).
  • the amplification curve is shown in FIG.
  • the amplification curve of pMYC which is the first target nucleic acid, showed that quenching accompanying annealing of MYC QP was observed from around 30 cycles, F41 value 0.892 was lower than threshold 13, indicating that the target region of pMYC was amplified. It was done.
  • mean-3SD of Fs1 is -0.058
  • mean-3SD of Fs2 is -0.070
  • mean-3SD of Fs3 is -0.080
  • mean-3SD of Fs4 is -0.087.
  • the thresholds 14, 15, 16, and 17 for detecting the second target are shown in (Table 23).
  • the amplification curve is shown in FIG.
  • Fs2 value -0.057 was also higher than threshold value 15, indicating that the target region of pICM5 was not amplified beyond the detection limit by the second second target detection step.
  • Fs3 value -0.084 was lower than threshold 16, indicating that the target region of pICM5 was amplified beyond the detection limit by the third second target detection step.
  • Fs4 -0.192 was also lower than the threshold value 17.
  • the values of Fs1, Fs2, Fs3, and Fs4 are shown in (Table 23).
  • the amplification curve is shown in FIG.
  • the amplification curve when both pMYC as the first target nucleic acid and pICM5 as the second target nucleic acid were added was observed to be quenched due to annealing of MYC QP from around 30 cycles.
  • a value of 0.897 was lower than threshold 13, indicating that the target region of pMYC was amplified.
  • Fs1 value ⁇ 0.058 is higher than threshold 14, indicating that the target region of pICM5 has not been amplified beyond the detection limit by the first second target detection step.
  • Fs2 value -0.068 is also higher than threshold value 15, indicating that the target region of pICM5 has not been amplified beyond the detection limit by the second second target detection step.
  • Fs3 value -0.109 was lower than threshold 16, indicating that the target region of pICM5 had been amplified beyond the detection limit by the third second target detection step.
  • Fs4—0.154 was also lower than the threshold value 17.
  • the values of Fs1, Fs2, Fs3, and Fs4 are as shown in (Table 23).
  • the amplification curve is shown in FIG.
  • the graph which shows the temperature change of the liquid mixture in Embodiment 1 of this invention Explanatory drawing of timing of fluorescence measurement in Embodiment 1 of the present invention
  • the graph which shows the fluorescence intensity change of the negative control in Embodiment 1 of this invention The graph which shows the fluorescence intensity change of the 1st target nucleic acid in Embodiment 1 of this invention
  • the graph which shows the fluorescence intensity change of the 2nd target nucleic acid in Embodiment 1 of this invention The graph which shows the fluorescence intensity change of the 1st, 2nd target nucleic acid in Embodiment 1 of this invention Timing explanatory diagram of fluorescence measurement in Embodiment 2 of the present invention
  • the graph which shows the fluorescence intensity change of the negative control in Embodiment 2 of this invention The graph which shows the fluorescence intensity change of the 1st target nucleic acid in Embodiment 2 of this invention
  • the graph which shows the fluorescence intensity change of the negative control in Embodiment 3 of this invention The graph which shows the fluorescence intensity change of the 1st target nucleic acid in Embodiment 3 of this invention
  • the graph which shows the fluorescence intensity change of the 2nd target nucleic acid in Embodiment 3 of this invention Graph showing changes in fluorescence intensity of the first and second target nucleic acids in Embodiment 3 of the present invention
  • the graph which shows the fluorescence intensity change of the negative control in Embodiment 4 of this invention The graph which shows the fluorescence intensity change of the 1st target nucleic acid in Embodiment 4 of this invention
  • the graph which shows the fluorescence intensity change of the 2nd target nucleic acid in Embodiment 4 of this invention The graph which shows the fluorescence intensity change of the 1st, 2nd target nucleic acid in Embodiment 4 of this invention

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Abstract

１種類の反応液が入った１つの反応容器及び単一の標識を用いて、複数の遺伝子を同時に増幅・検出できる、複数の標的核酸の検出キットを提供する。変性温度Ｔ０にて解離する、第１標的核酸１０及び第２標的核酸２０を含むと疑われる溶液に、ＤＮＡポリメラーゼ３０と、アニーリング温度Ｔ１において、第１標的核酸由来の１本鎖に結合する第１標的用プライマー１３と、アニーリング温度Ｔ１において、第２標的核酸由来の１本鎖に結合する第２標的用プライマー２３と、アニーリング温度Ｔ１において、第１標的核酸由来の１本鎖に結合する第１標的用プローブ１５と、アニーリング温度Ｔ１及び伸長温度Ｔ２よりも低い、第２標的検出温度Ｔ３において、第２標的核酸由来の１本鎖に結合する第２標的用プローブ２５とを含有させてなり、Ｔ０＞Ｔ２≧Ｔ１＞Ｔ３を満たす。

Description

複数の標的核酸の検出キット及びそれを用いる検出方法
　本発明は、ＰＣＲ法を改善し、複数の標的核酸を測定する検出キット及びその関連技術に関する。
　遺伝子検査において、複数の標的遺伝子の測定が必要なことも多い。たとえばインフルエンザのＡ型とＢ型、インフルエンザとＲＳＶ、さらにはヒトメタニューモウイルス、性感染症のクラミジアと淋菌、マイコプラズマとその耐性因子などである。
　病状が似ている上に同じ時期に同時に感染が拡大する場合などは、これらを鑑別して診断し、治療方針を立てることも考えられる。また、耐性因子の存在は投薬の選定判断などにも使われる。
　一方、単独の測定項目においても、その測定が本当にうまく進んだかどうかを確認する手段として内部コントロールを設定することも有用である。これは検出目的である標的遺伝子とは関係ない核酸配列を増幅するようにあらかじめ準備しておき、標的遺伝子の有無にかかわらず反応がうまく進んだかどうかを確認できるものである。このことで測定試薬や装置が有効に作用したかどうかを測定内で確認できる。
　この様に、複数の標的核酸を検出するには、別々の測定を実施するか、或いは、それぞれの標的核酸の検出に異なる標識色素などを用いて識別する手段が考えられる。
　または、同時に増幅反応を行った後に、緩やかに温度を上昇（または下降）させて、蛍光シグナルの変化率がピークを示す温度と標的核酸の融解温度から識別判断すること（熱融解曲線分析法）も可能である。
　しかしながら、別々の測定では時間やコストがかかり、異なる標識物を識別することも、複数の標識試薬の準備のみならず分析装置の波長設定などでコストがかかってしまう。
　熱融解曲線分析法を用いる場合には、コストは低いが緩やかに温度の変化をさせる必要があるため、正確な分析を行うためには５～１０分ほどの時間をかけて温度変化を行わなければならない。
　特許文献１（日本国特開２００２－１３６３００号公報）では、異なる反応液が入った複数の反応容器を用意し、それぞれ増幅検出する。項目ごとに試薬調製、分注作業があり手間がかかるという問題点がある。
　特許文献２（日本国特開２００４－２０３号公報）では、１種類の反応液が入った１つの反応容器で複数の遺伝子を同時増幅する。遺伝子ごとに標識色素を変えておくことで識別する。用いる標識色素の数だけ、検出する装置の光学系が複数必要になってくるため装置のコストが高くなってしまうという問題点がある。
　特許文献３（日本国特開２００８－１７３１２７号公報）では、１種類の反応液が入った１つの反応容器で複数の遺伝子を同時増幅する。項目ごとに、ＰＣＲ産物や標識プローブの解離温度を変え、増幅後に低温側から高温側に徐々に温度を上昇させ蛍光値をモニタリングする解離曲線分析（「熱融解曲線分析」と同義。）を行い、塩基配列に依存するそれぞれの解離温度におけるピークの有無をモニタリングすることによって識別する。
　融解曲線分析時の温度変化の速度を上げると各項目の融解温度を識別するのが困難になるため、ＰＣＲ反応後５～１０分ほど時間が余計にかかってしまうという問題点がある。
　特許文献４（日本国特表２０１２－５１３２１５号公報）では、１個の反応液容器で複数の遺伝子を同時増幅する。遺伝子ごとに、ＰＣＲ産物の解離温度とプライマーの融解温度を変え、それぞれの融解温度で蛍光をモニタリングして識別する。
　通常のＰＣＲプロファイルは１サイクル中に、変性、アニーリング・伸長ステップを設けるが、特許文献４では、項目ごとにＰＣＲ産物の融解温度を変えるため、考慮すべき条件が多く、プロファイルの設計が困難であり、測定時間も長くなる。温度変化が激しいため、装置の負担も大きいという問題点がある。
日本国特開２００２－１３６３００号公報 日本国特開２００４－２０３号公報 日本国特開２００８－１７３１２７号公報 日本国特表２０１２－５１３２１５号公報 日本国特許第４７２４３８０号公報
　そこで本発明は、１種類の反応液が入った１つの反応容器及び単一の標識を用いて、複数の遺伝子を同時に増幅・検出できる、複数の標的核酸の検出キットを提供することを目的とする。
　第１の発明に係る複数の標的核酸の検出キットは、変性温度をＴ０、アニーリング温度をＴ１、伸長温度をＴ２、第２標的検出温度をＴ３とすると、Ｔ０＞Ｔ２≧Ｔ１＞Ｔ３を満たすように温度設定される複数の標的核酸の検出キットであって、変性温度Ｔ０において、２本鎖の水素結合が切断され、それぞれ２本の１本鎖に解離する、第１標的核酸及び第２標的核酸を含み得る溶液に、
　アニーリング温度Ｔ１において、第１標的核酸が解離した２本の１本鎖のいずれかに特異的に結合する第１標的用プライマーと、アニーリング温度Ｔ１において、第２標的核酸が解離した２本の１本鎖のいずれかに特異的に結合する第２標的用プライマーと、アニーリング温度Ｔ１において、第１標的核酸が解離した２本の１本鎖のいずれかに特異的に結合する第１標的用プローブであって、結合により蛍光シグナルが変化する第１標識物を有するものと、ＤＮＡポリメラーゼと、伸長温度Ｔ２において、ＤＮＡポリメラーゼの作用により、第１標的核酸が解離した２本の１本鎖及び第２標的核酸が解離した２本の１本鎖に結合するデオキシリボヌクレオチド３リン酸と、アニーリング温度Ｔ１においては、第１標的核酸が解離した２本の１本鎖及び第２標的核酸が解離した２本の１本鎖のいずれにも結合せず、第２標的検出温度Ｔ３において、第２標的核酸が解離した２本の１本鎖のいずれかに特異的に結合する第２標的用プローブであって、結合により蛍光シグナルが変化する第２標識物を有するものとを含有する。
　好ましくは、第１、第２標識物は、ＱＰｒｏｂｅ（登録商標）プローブ、Ｅｐｒｏｂｅ（登録商標）プローブ及びＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブからなる群から選択される。
　蛍光シグナルは、アニールすると消光するもの、アニールすると発光するもののいずれであってもよい。
　第１標的核酸及び第２標的核酸は、好ましくは、マイコプラズマＰ１遺伝子と内部コントロール、或いは、クラミジア内在性プラスミド遺伝子と淋菌ＣＭＴ遺伝子である。
　以上述べたように、本発明によれば、１種類の標識物を用いて複数の標的核酸を、１種類の混合液で検出できる。熱融解曲線分析なしで複数の標的核酸の識別が可能であるため、測定時間を大幅に短縮でき、実用的効果が高い。
　本発明者らは、ＰＣＲ法における、プローブのアニーリング温度の条件設定と温度変化プロファイルを組み合わせた、１種類の反応液が入った１つの反応容器で単一蛍光標識を用いた複数核酸を検出するキットを開発した。
　本キットでは、図３５に示すように、４つの温度、即ち、変性温度Ｔ０（９５℃）、アニーリング温度Ｔ１（７０℃）、伸長温度Ｔ２（７２℃）及び第２標的検出温度Ｔ３（５５℃）を使用する。これらの温度は、Ｔ０＞Ｔ２≧Ｔ１＞Ｔ３を満たすように温度設定される。勿論、これらの温度数値は、例示に過ぎず、後述するように、種々変更することができる。
　複数の標的核酸とは、第１標的核酸及び第２標的核酸であるが、必要とあれば、第３標的検出温度Ｔ４（Ｔ３＞Ｔ４）等の設定温度を増やすことにより、第３標的核酸その他の標的核酸を追加することもできる。
　図３６を参照しながら、本キットの内容について説明する。まず、本キットでは、第１標的核酸１０と、第２標的核酸２０とを検出対象とする。以下説明の便宜のため、容器１内の溶液２（詳細は後述する。）には、第１標的核酸１０と第２標的核酸２０の両方が含まれている場合（つまり、陽性と陽性である場合）のみを説明する。
　勿論、片方又は両方が陰性である場合には、第１標的核酸１０と第２標的核酸２０の少なくとも一方又は両方が溶液２に含まれていないことになり、以下の説明において、含まれていない標的核酸に関する、蛍光シグナル及び増幅が行われないことになる。
　図３７（ａ）に示すように、溶液２の温度を上昇させ変性温度Ｔ０になると、第１標的核酸１０及び第２標的核酸２０は、いずれも２本鎖の水素結合が切断され、それぞれ２本の１本鎖（第１標的核酸１０は、第１の１本鎖１１と第２の１本鎖１２に、第２標的核酸２０は、第１の１本鎖２１と第２の１本鎖２２に）解離する。
　図３７（ｂ）に示すように、変性温度Ｔ０から温度を下げてアニーリング温度Ｔ１になると、第１標的核酸１０について、第１標的用Ｆプライマー１３が第１の１本鎖１１の相補的な配列に特異的に結合し、第１標的用Ｒプライマー１４が第２の１本鎖１２の相補的な配列に特異的に結合する。同様に、第２標的核酸２０について、第２標的用Ｆプライマー２３が第１の１本鎖２１の相補的な配列に特異的に結合し、第２標的用Ｒプライマー２４が第２の１本鎖２２の相補的な配列に特異的に結合する。
　また、第１標識物１６により標識された第１標的用プローブ１５が、図３７（ｂ）に示すアニーリング温度Ｔ１において、第１標的核酸１０由来の第１の１本鎖１１の特定部位に特異的に結合し、第１標識物１６は蛍光サインを発生する。しかしながら、第２標識物２６により標識された第２標的用プローブ２５は、アニーリング温度Ｔ１では第２標的検出温度Ｔ３よりも温度が高いため、第２標的核酸２０由来の第１の１本鎖２１には結合せず、第２標識物２６は蛍光サインを発生しない。
　図３７（ｃ）に示すように、温度をアニーリング温度Ｔ１から伸長温度Ｔ２に上げると、溶液２に、ＰＣＲサイクルを繰り返すために十分な量の、ＤＮＡポリメラーゼ３０とデオキシリボヌクレオチド３リン酸３１とが含まれているため、次のように増幅反応が進行する。
　即ち、第１標的核酸１０について、第１の１本鎖１１に結合する第１標的用Ｆプライマー１３から、また、第２の１本鎖１２に結合する第１標的用Ｒプライマー１４から、それぞれデオキシリボヌクレオチド３リン酸３１が結合し伸長してゆく。
　また、第２標的核酸２０について、第１の１本鎖２１に結合する第２標的用Ｆプライマー２３から、また、第２の１本鎖２２に結合する第２標的用Ｒプライマー２４から、それぞれデオキシリボヌクレオチド３リン酸３１が結合し伸長してゆく。
　そして、増幅反応が完了すると、図３７（ｄ）を図３６と比較すると分かるように、第１標的核酸１０及び第２標的核酸２０の両方が、２倍に増えたことになる。
　再び、図３７（ａ）に示すステップに戻り、以上のステップ（図３７（ａ）～図３７（ｄ））を繰り返すと、第１標的物１６による蛍光シグナルの変化と増幅反応を繰り返すことができる。
　次に、図３８を参照しながら、変性温度Ｔ０から温度を下げて第２標的温度検出温度Ｔ３となる場合について説明する。
　変性温度Ｔ０では、図３８（ａ）に示すように、図３７（ａ）と同様の状態となる。ところが、温度を第２標的温度検出温度Ｔ３に下げると、図３７（ｂ）とは異なり、図３８（ｂ）に示す状態となる。
　即ち、図３８（ｂ）に示すように、第１標識物１６により標識された第１標的用プローブ１５が、第１標的核酸１０由来の第１の１本鎖１１の特定部位に特異的に結合し、第１標識物１６の蛍光シグナルが変化する点では、図３７（ｂ）と同様であるが、第２標識物２６により標識された第２標的用プローブ２５も、第２標的検出温度Ｔ３となっているため、第２標的核酸２０由来の第１の１本鎖２１に結合し、第２標識物２６の蛍光シグナルが変化する。なお、第１標識物１６と第２標識物２６は同一であるのが好ましい。
　その結果、第２標識物２６による蛍光シグナルの変化による差分を捉えれば、第２標識物２０の有無（陽性／陰性）を判定できることになる。
　しかも、以上説明したところから明らかなように、１種類の反応液が入った１つの反応容器を用いて一連でとぎれないステップ中に複数の標的核酸を検出できることが理解されよう。
　以下、さらに具体的に、ＱＰｒｏｂｅ（登録商標）法、Ｅｐｒｏｂｅ（登録商標）法、ＴａｑＭａｎ（登録商標）法による、３種類のプローブを用いた複数核酸を検出する実施の形態を示す。実施するのに必要なプライマー配列及び各プローブの塩基配列、核酸試料の情報もあわせて示す。
　（実施の形態１）
　＜ＱＰｒｏｂｅ法におけるマイコプラズマＰ１遺伝子と内部コントロールの検出＞
　ＱＰｒｏｂｅ法におけるマイコプラズマＰ１遺伝子と内部コントロールの検出を行った。
　＜材料及び方法＞
　（プライマー）
　実施の形態１におけるＰＣＲ法に用いたプライマー対は、（表１）に示すとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　配列番号１、配列番号２は、Ｉｅｖｅｎらの報告（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　Ｏｆ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ，１９９６；１７３；１４４５－５２）に記載されている（Ｐ１アドへシン遺伝子に対するプライマー対）配列を使用した。
　（核酸試料）
　実施の形態１でＰＣＲ法に用いた核酸試料を以下に示す。
　（ｐＭＹＣ）
　マイコプラズマ肺炎の病原体であるマイコプラズマ・ニューモニエ由来の膜タンパク質であるＰ１タンパク質をコードする遺伝子断片（配列番号１と２のプライマー対で増幅される配列）を人工合成後、ｐＭＤ２０Ｔベクターに組み込んだプラスミドＤＮＡである。このプラスミドＤＮＡは、タカラバイオ株式会社に合成を委託して作製した。
　（ｐＩＣＭ５）
　配列番号１と２のプライマー対を共通プライマーとして増幅できるように、プライマー対と相補的な塩基配列を含む配列を人工合成後、ｐＭＤ２０Ｔベクターに組み込んだプラスミドＤＮＡである。このプラスミドＤＮＡはタカラバイオ株式会社に合成を委託して作製した。
　（核酸試料の調製）
　上記のプラスミドの長さは、ｐＭＹＣは２９４２ｂｐ、ｐＩＣＭ５は２８８６ｂｐである。
　各プラスミドの長さとプラスミド溶液の濃度（μｇ／μｌ）から１μＬあたりのコピー数を計算した後、ＴＥ緩衝溶液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１．０ｍＭ　ＥＤＴＡ　ｐＨ８．０）を用い、ｐＭＹＣは１×１０＾５ｃｏｐｉｅｓ／μｌ、ｐＩＣＭ５は１×１０＾３ｃｏｐｉｅｓ／μｌとなるように希釈した。
　（プローブ）
　実施の形態１におけるＰＣＲ法に用いるプローブの情報は、（表２）に示すとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　（表１）のプライマー対で増幅し得るＰＣＲ産物の塩基配列から、配列番号３及び配列番号４は、Ｊ－Ｂｉｏ２１センターのホームページ上のＱＰｒｏｂｅ設計支援ツールを用い計算したＴｍ値を参考にし、特定領域を選択した。
　ｐＭＹＣに特異的にアニールするＱＰｒｏｂｅであるＭＹＣ　ＱＰと、ｐＩＣＭ５に特異的にアニールするＱＰｒｏｂｅであるＩＣ　ＱＰの蛍光色素にはＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬを使用し、それぞれ３’末端のＣを標識した。ＱＰｒｏｂｅは日鉄住金環境株式会社に合成を委託して作製した。
　（ＰＣＲ・蛍光測定条件）
　実施の形態１では、１種類の反応液が入った１つの反応容器中で増幅する２つの標的核酸について、第１標的であるｐＭＹＣに特異的にアニールするＱＰｒｏｂｅ（ＭＹＣ　ＱＰ）のＴｍ値をプライマーのＴｍ値よりも高い温度に設定し、増幅反応中に検出した。
　次に、第２標的であるｐＩＣＭ５に特異的にアニールするＱＰｒｏｂｅ（ＩＣ　ＱＰ）のＴｍ値を増幅反応中の変化温度（７０℃―９５℃）よりも低い温度に設定し、増幅反応後に検出した。
　ＰＣＲ反応液組成、反応条件を（表３）と（表４）に示し、また、混合液の温度変化をグラフ化したものを図１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　ＰＣＲ及び蛍光測定には、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）ｎａｎｏ（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）を使用した。
　蛍光測定時の励起波長と蛍光波長の組み合わせは５１０－５２８ｎｍを選択した。各サイクルの変性ステップ（９５℃）と伸長ステップ（７２℃）で蛍光値を測定し、更に、増幅反応後に第２標的を検出するためのステップ（９５℃と５５℃）において蛍光測定を行った。
　増幅反応の最終サイクルと、第２標的検出ステップにおける蛍光測定条件を図２に示す。
　（データの処理方法）
　ＱＰｒｏｂｅを用いた際の解析方法は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ　ｎａｎｏに備え付けの解析ソフトが対応していないため、特許文献５（日本国特許第４７２４３８０号公報）に記載されている方法を参考に、得られた生データに対して補正演算処理を行った。
　増幅反応と第２標的検出ステップの全てのサイクル毎に、次の数式による演算を行った。
ｆｎ＝ｆｈｙｂ．ｎ／ｆｄｅｎ．ｎ　（数１）
ｆｅ＝ｆｈｙｂ．ｅ／ｆｄｅｎ．ｅ　（数１’）
ｆｎ：（数１）により算出されたｎサイクルにおける蛍光強度値
ｆｈｙｂ．ｎ：ｎサイクル目の伸長ステップの蛍光強度値
ｆｄｅｎ．ｎ：ｎサイクル目の変性ステップの蛍光強度値
ｆｅ：（数１’）により算出された第２標的検出ステップにおける蛍光強度値
ｆｈｙｂ．ｅ：第２標的検出ステップ５５℃の蛍光強度値
ｆｄｅｎ．ｅ：第２標的検出ステップ９５℃の蛍光強度値
　次に、増幅反応の全てのサイクルと第２標的検出ステップについて、次の数式で演算を行った。
Ｆｎ＝ｆｎ／ｆ１０　（数２）
Ｆｅ＝ｆｅ／ｆ１０　（数２’）
Ｆｎ：１０サイクル目の（数１）により得られた蛍光強度値を１とした時のｎサイクル目の相対値
Ｆｅ：１０サイクル目の（数１’）により得られた蛍光強度値を１とした時の第２標的検出ステップの相対値
　増幅反応の最終サイクルのＦｎの値であるＦ４４を、第１標的核酸の有無の判定に用いた。
　更に、次の数式による演算を行った。
Ｆｓ＝Ｆｅ－Ｆ４４　　（数３）
Ｆｓ：第２標的の測定値
Ｆｓの値を、第２標的核酸の有無の判定に用いた。
　ＱＰｒｏｂｅ法における判定は下記に示す方法で行った。
　第１標的核酸の有無は、測定試料のＦ４４の値と閾値１を比較して［測定試料のＦ４４＜閾値１］を陽性と判定した。
　閾値１は、陰性対照（ＤＮＡの代わりにＴＥ緩衝液を添加した試薬）のＦ４４の平均値－標準偏差の３倍（以下ｍｅａｎ－３ＳＤ）の値を用いた。
　第２標的核酸の有無は、第１標的核酸が陽性、陰性に関わらず、Ｆｓの値と閾値２を比較して［Ｆｓ＜閾値２］を陽性と判定した。
　閾値２は、ｐＭＹＣだけを添加した試料のＦｓのｍｅａｎ－３ＳＤの値を用いた。判定方法のフローチャートは、図３に示すとおりである。
　マイコプラズマＰ１遺伝子はｐＭＹＣ、内部コントロールはｐＩＣＭ５を、それぞれ核酸試料に用いてＰＣＲを実施した。
　ＭＹＣ　ＱＰの配列はＴｍ値を７２．５℃、ＩＣ　ＱＰの配列はＴｍ値を５７．５℃に設定した。そのため、ＰＣＲ中の温度範囲（７０℃から９５℃）では、プローブはＭＹＣ　ＱＰだけがアニールすると推測された。
　第２標的検出ステップの蛍光測定は、９５℃とＩＣ　ＱＰのＴｍ値よりも低い５５℃で行うため、第２標的検出ステップの測定値はＭＹＣ　ＱＰとＩＣ　ＱＰの消光を同時に検出すると推測された。
　陰性対照の増幅曲線は、ＰＣＲが終了する４４サイクル目まで消光が見られず（Ｆ４４の値０．９９８が閾値１の値０．９９７よりも低くないため）、この時のｍｅａｎ－３ＳＤは０．９９７となり、実施の形態１の第１標的検出のための閾値１とし、（表５）に示す。増幅曲線を図４に示す。
　第１標的核酸であるｐＭＹＣの増幅曲線は、２８サイクル付近からＭＹＣ　ＱＰのアニーリングに伴う消光が観察された。
　Ｆ４４の値０．９１３は閾値１より低く、ｐＭＹＣの目的の領域が増幅したことが示された。この時のＦｓのｍｅａｎ－３ＳＤは－０．０５６であり、第２標的検出のための閾値２とし、（表５）に示す。増幅曲線を図５に示す。
　第２標的核酸であるｐＩＣＭ５の増幅曲線は、増幅反応中は全く消光が見られず（Ｆ４４の値０．９９７が閾値１の値０．９９７よりも低くないため）Ｆｓの値－０．１１８は、閾値２より低かった。
　この結果より、ｐＭＹＣの目的の領域が増幅しなかったことと、ｐＩＣＭ５の目的の領域が増幅したことが示された。
　Ｆｓの値を（表５）に示す。増幅曲線を図６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　第１標的核酸であるｐＭＹＣと第２標的核酸であるｐＩＣＭ５の両方を添加した際の増幅曲線は、ｐＭＹＣの増幅曲線と同様に、２８サイクル付近からＭＹＣ　ＱＰのアニーリングに伴う消光が観察され、Ｆ４４の値０．９１２は閾値１より低く、ｐＭＹＣの目的の領域が増幅したことが示された。
　Ｆｓの値－０．１１６は、閾値２より低く、ｐＩＣＭ５の目的の領域が増幅したことが示された。Ｆｓの値を（表５）に示す。増幅曲線を図７に示す。
　これらのＰＣＲ産物はＰＣＲ終了後にアガロース電気泳動し、ｐＭＹＣを添加した試料では２０６ｂｐ付近、ｐＩＣＭ５を添加した試料では１５０ｂｐ付近に目的のＰＣＲ産物が確認された。
　以上の結果より、ＱＰｒｏｂｅ法において、プローブの設計方法と温度変化プロファイルを組み合わせ、１種類の反応液が入った１つの反応容器で単一蛍光標識を用い、マイコプラズマＰ１遺伝子と内部コントロールを検出できることが示された。
　（実施の形態２）
　＜第２検出ステップのプロファイルを変更したＱＰｒｏｂｅ法におけるマイコプラズマＰ１遺伝子と内部コントロールの検出＞
　実施の形態１の第２標的検出ステップのプロファイルを変更した方法でＱＰｒｏｂｅ法におけるマイコプラズマＰ１遺伝子と内部コントロールの検出を行った。
　ＰＣＲに用いたプライマー、プローブ、反応液組成と核酸試料は実施の形態１と同じものを用いた。本形態の反応条件は、（表６）に示すとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　実施の形態２では、第２標的検出ステップで５５℃において蛍光測定を行った。増幅反応の最終サイクルと、第２標的検出ステップにおける蛍光測定条件を図８に示す。
　実施の形態２においてｆｅは次の演算を用い、その他は実施の形態１と同様な演算処理を行った。
ｆｅ＝ｆｈｙｂ．ｅ／ｆｄｅｎ．４４
ｆｅ：第２標的検出ステップにおける蛍光強度値
ｆｈｙｂ．ｅ：第２標的検出ステップ５５℃の蛍光強度値
ｆｄｅｎ．４４：増幅反応の最終サイクルの９５℃の蛍光強度値
　以下に、実施の形態２の判定方法を示す。第１標的核酸の有無は、測定試料のＦ４４の値と閾値３を比較して［測定試料のＦ４４＜閾値３］を陽性と判定した。
　閾値３は、陰性対照のＦ４４の平均値－標準偏差の３倍（以下ｍｅａｎ－３ＳＤ）の値を用いた。
　第２標的核酸の有無は、第１標的核酸が陽性、陰性に関わらず、Ｆｓの値と閾値４を比較して［Ｆｓ＜閾値４］を陽性と判定した。
　閾値４は、ｐＭＹＣだけを添加した試料のＦｓのｍｅａｎ－３ＳＤの値を用いた。
　陰性対照の増幅曲線は、増幅反応が終了する４４サイクル目まで消光が見られず（Ｆ４４の値０．９９８が閾値３の値０．９９７よりも低くないため）、この時のｍｅａｎ－３ＳＤは０．９９７となり、本例の第１標的検出のための閾値３とし、（表７）に示す。増幅曲線は、図９に示すとおりである。
　第１標的核酸であるｐＭＹＣの増幅曲線は、２８サイクル付近からＭＹＣ　ＱＰのアニーリングに伴う消光が観察され、Ｆ４４の値０．９１２は閾値３より低く、ｐＭＹＣの目的の領域が増幅したことが示された。
　また、この時のＦｓのｍｅａｎ－３ＳＤは－０．０５２であり、第２標的検出のための閾値４とし、（表７）に示す。増幅曲線は、図１０に示すとおりである。
　第２標的核酸であるｐＩＣＭ５の増幅曲線は、増幅反応中は全く消光が見られず（Ｆ４４の値０．９９７が閾値３の値０．９９７よりも低くないため）、Ｆｓの値－０．１７０は、閾値４より低かった。
　この結果より、ｐＭＹＣの目的の領域が増幅しなかったことと、ｐＩＣＭ５の目的の領域が増幅したことが示された。Ｆｓの値を（表７）に示す。増幅曲線を図１１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　第１標的核酸であるｐＭＹＣと第２標的核酸であるｐＩＣＭ５の両方を添加した際の増幅曲線は、ｐＭＹＣの増幅曲線と同様に、２８サイクル付近からＭＹＣ　ＱＰのアニーリングに伴う消光が観察され、Ｆ４４の値０．９１１は閾値３より低く、ｐＭＹＣの目的の領域が増幅したことが示された。
　Ｆｓの値－０．１１４は、閾値４より低く、ｐＩＣＭ５の目的の領域が増幅したことが示された。Ｆｓの値を（表７）に示す。増幅曲線を図１２に示す。
　以上の結果より、ｆｅの算出に、増幅反応の最終サイクルの９５℃の蛍光強度値（ｆｄｅｎ．４４）を用いても、第２標的を検出できることが示された。
　（実施の形態３）
　＜Ｅｐｒｏｂｅ法におけるマイコプラズマＰ１遺伝子と内部コントロールの検出＞
　Ｅｐｒｏｂｅ法におけるマイコプラズマＰ１遺伝子と内部コントロールの検出を行った。
　ＰＣＲに用いたプライマーと核酸試料は実施の形態１と同じものを用いた。実施の形態３におけるＰＣＲ法に用いるプローブの情報は、（表８）に示すとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　Ｅｐｒｏｂｅは、株式会社ダナフォームが作製したソフトウェアである「Ｅｄｅｓｉｇｎ」を用い計算したＴｍ値を参考にし、特定領域を選択した。
　ｐＭＹＣに特異的にアニールするＥｐｒｏｂｅであるＭＹＣ　ＥＰとｐＩＣＭ５に特異的にアニールするＥｐｒｏｂｅであるＩＣ　ＥＰの蛍光色素にはＤ５１４を使用し、ＭＹＣ　ＥＰは５’末端から１９番目のＴを標識し、ＩＣ　ＥＰは５’末端から９番目のＴを標識した。
　Ｅｐｒｏｂｅはユーロフィンジェノミクス株式会社に合成を委託して作製した。ＰＣＲ反応液組成、反応条件を（表９）と（表１０）に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　蛍光測定時の励起波長と蛍光波長の組み合わせは５３０－５４８ｎｍを選択した。
　実施の形態３におけるＦｓは次の演算を用い、その他は実施の形態１と同様な演算処理を行った。
Ｆｓ＝Ｆｅ－Ｆ４０
　実施の形態３における判定は下記に示す方法で行った。第１標的核酸の有無は、測定試料のＦ４０の値と閾値５を比較して［測定試料のＦ４０＞閾値５］を陽性と判定した。
　閾値５は、陰性対照のＦ４０の平均値＋標準偏差の３倍（以下ｍｅａｎ＋３ＳＤ）の値を用いた。
　第２標的核酸の有無は、第１標的核酸が陽性、陰性に関わらず、Ｆｓの値と閾値６を比較して［Ｆｓ＞閾値６］を陽性と判定した。
　閾値６は、ｐＭＹＣだけを添加した試料のＦｓのｍｅａｎ＋３ＳＤの値を用いた。判定方法のフローチャートは、図１３に示すとおりである。
　ＭＹＣ　ＥＰの配列はＴｍ値を７６．４℃に、ＩＣ　ＥＰの配列はＴｍ値を５９．８℃に設定した。そのため、ＰＣＲ中の温度範囲（７０℃から９５℃）では、プローブはＭＹＣ　ＥＰだけがアニールすると推測された。
　又、第２標的検出ステップの蛍光測定は、９５℃とＩＣ　ＥＰのＴｍ値よりも低い５５℃で行うため、第２標的検出ステップの測定値はＭＹＣ　ＥＰとＩＣ　ＥＰの発光を同時に検出すると推測された。
　陰性対照の増幅曲線は、ＰＣＲが終了する４０サイクル目まで発光が見られず（Ｆ４０の値１．００７が閾値５の値１．０１３よりも高くないため）、この時のｍｅａｎ＋３ＳＤは１．０１３となり、第１標的核酸検出のための閾値５とし、（表１１）に示す。増幅曲線を図１４に示す。
　第１標的核酸であるｐＭＹＣの増幅曲線は、２９サイクル付近からＭＹＣ　ＥＰのアニーリングに伴う発光が観察され、Ｆ４０の値２．３１４が閾値５より高く、ｐＭＹＣの目的の領域が増幅したことが示された。
　また、この時のＦｓのｍｅａｎ＋３ＳＤは３．６９５であり、第２標的検出のための閾値６とし（表１１）に示す。増幅曲線を図１５に示す。
　第２標的核酸であるｐＩＣＭ５の増幅曲線は、増幅反応中は全く発光が見られず（Ｆ４０の値１．０１２が閾値５の値１．０１３よりも高くないため）、Ｆｓの値４．０１２は、閾値６より高かった。
　この結果より、ｐＭＹＣの目的の領域が増幅しなかったことと、ｐＩＣＭ５の目的の領域が増幅したことが示された。Ｆｓの値を（表１１）に示す。増幅曲線を図１６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　第１標的核酸であるｐＭＹＣと第２標的核酸であるｐＩＣＭ５の両方を添加した際の増幅曲線は、ｐＭＹＣの増幅曲線と同様に、２９サイクル付近からＭＹＣ　ＥＰのアニーリングに伴う発光が観察され、Ｆ４０の値２．３５５は閾値５より高く、ｐＭＹＣの目的の領域が増幅したことが示された。
　Ｆｓの値４．２５４は、閾値６より高く、ｐＩＣＭ５の目的の領域が増幅したことが示された。Ｆｓの値を（表１１）に示す。増幅曲線を図１７に示す。
　以上の結果より、Ｅｐｒｏｂｅ法においてもプローブの設計方法と温度変化プロファイルを組み合わせ、１種類の反応液が入った１つの反応容器で単一蛍光標識を用い、マイコプラズマＰ１遺伝子と内部コントロールを検出できることが示された。
　（実施の形態４）
　＜ＴａｑＭａｎプローブ法におけるマイコプラズマＰ１遺伝子と内部コントロールの検出＞
　ＴａｑＭａｎプローブ法におけるマイコプラズマＰ１遺伝子と内部コントロールの検出を行った。ＰＣＲに用いたプライマーと核酸試料は実施の形態１と同じものを用いた。
　実施の形態４におけるＰＣＲ法に用いるプローブの情報は、（表１２）に示すとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　ＴａｑＭａｎプローブは、ｎｅａｒｅｓｔ　ｎｅｉｇｈｂｏｒ法を用い計算したＴｍ値を参考にし、特定領域を選択した。
　ｐＭＹＣに特異的にアニールするＴａｑＭａｎプローブであるＭＹＣ　ＴａｑとｐＩＣＭ５に特異的にアニールするＴａｑＭａｎプローブであるＩＣ　Ｔａｑの蛍光色素には、それぞれ５’末端にＦＡＭ（登録商標）、３’末端にＴＡＭＲＡ（登録商標）を標識した。
　ＴａｑＭａｎプローブはタカラバイオ株式会社に合成を委託して作製した。ＰＣＲ反応液組成、反応条件を（表１３）と（表１４）に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　蛍光測定時の励起波長と蛍光波長の組み合わせは５３０－５４８ｎｍを選択した。
　増幅反応後の第２標的を検出するためのステップでは９５℃と５０℃において蛍光測定を行った。
　実施の形態４ではｆｈｙｂ．ｅ：第２標的検出ステップ５０℃の蛍光強度値とし、その他は実施の形態１と同様な演算ステップを行った。
　実施の形態４における判定方法は下記に示す方法で行った。第１標的核酸の有無は、測定試料のＦ４４の値と閾値７を比較して［測定試料のＦ４４＞閾値７］を陽性と判定した。
　閾値７は、陰性対照のＦ４４の平均値＋標準偏差の３倍（以下ｍｅａｎ＋３ＳＤ）の値を用いた。
　第２標的核酸の有無は、第１標的核酸が陽性、陰性に関わらず、Ｆｓの値と閾値８を比較して［Ｆｓ＞閾値８］を陽性と判定した。
　閾値８は、ｐＭＹＣだけを添加した試料のＦｓのｍｅａｎ＋３ＳＤの値を用いた。
　ＭＹＣ　Ｔａｑの配列はＴｍ値を７５．８℃に、ＩＣ　Ｔａｑの配列はＴｍ値を５３．７℃に設定した。そのため、ＰＣＲ中の温度範囲（７０℃から９５℃）では、プローブはＭＹＣ　Ｔａｑだけがアニールすると推測された。
　又、第２標的検出ステップの蛍光測定は、９５℃とＩＣ　ＴａｑのＴｍ値よりも低い５０℃で行うため、第２標的検出ステップの測定値はＭＹＣ　ＴａｑとＩＣ　Ｔａｑの発光を同時に検出すると推測された。
　陰性対照の増幅曲線は、ＰＣＲが終了する４４サイクル目まで発光が見られず（Ｆ４４の値１．０２８が閾値７の値１．０２８よりも高くないため）、この時のｍｅａｎ＋３ＳＤは１．０２８となり、第１標的核酸検出のための閾値７とし、（表１５）に示す。増幅曲線を図１８に示す。
　第１標的核酸であるｐＭＹＣの増幅曲線は、２８サイクル付近からＭＹＣ　Ｔａｑのアニーリングに伴う発光が観察され、Ｆ４４の値１．４２７が閾値７より高く、ｐＭＹＣの目的の領域が増幅したことが示された。
　また、この時のＦｓのｍｅａｎ＋３ＳＤは０．１１０であり、第２標的検出のための閾値８とし（表１５）に示す。増幅曲線を図１９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　第２標的核酸であるｐＩＣＭ５の増幅曲線は、増幅反応中は全く発光が見られず（Ｆ４４の値１．０２８が閾値７の値１．０２８よりも高くないため）、Ｆｓの値０．１３０は、閾値８より高かった。
　この結果より、ｐＭＹＣの目的の領域が増幅しなかったことと、ｐＩＣＭ５の目的の領域が増幅したことが示された。
　Ｆｓの値を（表１５）に示す。増幅曲線を図２０に示す。
　第１標的核酸であるｐＭＹＣと第２標的核酸であるｐＩＣＭ５の両方を添加した際の増幅曲線は、ｐＭＹＣの増幅曲線と同様に、２９サイクル付近からＭＹＣ　ＥＰのアニーリングに伴う発光が観察され、Ｆ４０の値１．３４８は閾値７より高く、ｐＭＹＣの目的の領域が増幅したことが示された。
　Ｆｓの値０．１７７は、閾値８より高く、ｐＩＣＭ５の目的の領域が増幅したことが示された。Ｆｓの値を（表１５）に示す。増幅曲線を図２１に示す。
　以上の結果より、ＴａｑＭａｎプローブ法においてもプローブの設計方法と温度変化プロファイルを組み合わせ、１種類の反応液が入った１つの反応容器で単一蛍光標識を用い、マイコプラズマＰ１遺伝子と内部コントロールを検出できることが示された。
　（実施の形態５）
　＜実検体を用いたＱＰｒｏｂｅ法におけるマイコプラズマＰ１遺伝子と内部コントロールの検出＞
　実検体を用いた、ＱＰｒｏｂｅ法におけるマイコプラズマＰ１遺伝子と内部コントロールの検出を行った。
　マイコプラズマＰ１遺伝子は、ＬＡＭＰ法（日本国特許第３３１３３５８号）によって、マイコプラズマ・ニューモニエが陽性と判定された（検査は株式会社ビー・エム・エルに委託）咽頭拭い液からＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ　ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて抽出したトータルＤＮＡを用いた。
　また、陰性試料としてＬＡＭＰ法によって、マイコプラズマ・ニューモニエが陰性と判定された咽頭拭い液からＱＩＡａｍｐ　ＤＮＡ　ｍｉｎｉ　Ｋｉｔを用いて抽出したトータルＤＮＡを用いた。その他条件は、実施の形態１と同様にＰＣＲを実施した。
　得られた生データに対して実施の形態１と同様の演算処理を行った。
　以下に、実施の形態５の判定方法を示す。第１標的核酸の有無は、測定試料のＦ４４の値と閾値９を比較して［測定試料のＦ４４＜閾値９］を陽性と判定した。
　閾値９は、陰性試料のＦ４４の平均値－標準偏差の３倍（以下ｍｅａｎ－３ＳＤ）の値を用いた。
　第２標的核酸の有無は、第１標的核酸が陽性、陰性に関わらず、Ｆｓの値と閾値１０を比較して［Ｆｓ＜閾値１０］を陽性と判定した。閾値１０は、陽性試料のＦｓのｍｅａｎ－３ＳＤの値を用いた。
　陰性試料の増幅曲線は、ＰＣＲが終了する４４サイクル目まで消光が見られず（Ｆ４４の値０．９９７が閾値９の値０．９９７よりも低くないため）、この時のｍｅａｎ－３ＳＤは０．９９７となり、本例の第１標的検出のための閾値９とし、（表１６）に示す。増幅曲線を図２２に示す。
　第１標的核酸である陽性試料の増幅曲線は、３５サイクル付近からＭＹＣ　ＱＰのアニーリングに伴う消光が観察され、Ｆ４４の値０．９５１は閾値９より低く、ｐＭＹＣの目的の領域が増幅したことが示された。
　また、この時のＦｓのｍｅａｎ－３ＳＤは－０．１３２であり、第２標的検出のための閾値１０とし、（表１６）に示す。増幅曲線を図２３に示す。
　第２標的核酸であるｐＩＣＭ５の増幅曲線は、増幅反応中は全く消光が見られず（Ｆ４４の値０．９９８が閾値９の値０．９９７よりも低くないため）、Ｆｓの値－０．２２７は、閾値１０より低かった。
　この結果より、ｐＭＹＣの目的の領域が増幅しなかったことと、ｐＩＣＭ５の目的の領域が増幅したことが示された。Ｆｓの値を（表１６）に示す。増幅曲線を図２４に示す。
　第１標的核酸である陽性試料に第２標的核酸であるｐＩＣＭ５を添加した際の増幅曲線は、陽性試料の増幅曲線と同様に、３５サイクル付近からＭＹＣ　ＱＰのアニーリングに伴う消光が観察され、Ｆ４４の値０．９５３は閾値９より低く、ｐＭＹＣの目的の領域が増幅したことが示された。
　Ｆｓの値－０．２３５は、閾値１０より低く、ｐＩＣＭ５の目的の領域が増幅したことが示された。Ｆｓの値を（表１６）に示す。増幅曲線を図２５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　以上の結果より、実際の臨床検体でも、プローブの設計方法と温度変化プロファイルを組み合わせ、１種類の反応液が入った１つの反応容器で単一蛍光色素を用い、マイコプラズマＰ１遺伝子と内部コントロールを検出できることが示された。
　本発明は、感染症の病原体の亜型識別や一塩基多型の識別にも応用可能である。
　（実施の形態６）
　＜ＱＰｒｏｂｅ法におけるクラミジア内在性プラスミド遺伝子と淋菌ＣＭＴ遺伝子の検出＞
　ＱＰｒｏｂｅ法におけるクラミジア内在性プラスミド遺伝子と淋菌ＣＭＴ遺伝子の検出を行った。
　（ｐＣＴ）
　性器クラミジア感染症の病原体であるクラミジア・トラコマチス共通の内在性プラスミド（ｐＬＧＶ４４０）遺伝子断片を人工合成後、ｐＵＣ５７ベクターに組み込んだプラスミドＤＮＡは、北海道システムサイエンス株式会社に合成を委託して作製した。
　（ｐＮＧ）
　淋病の病原体であるナイセリア・ゴノレアのシトシンＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＣＭＴ）遺伝子断片を人工合成後、ｐＵＣ５７ベクターに組み込んだプラスミドＤＮＡは北海道システムサイエンス株式会社に合成を委託して作製した。
　上記のプラスミドの長さは、ｐＣＴは３０６４ｂｐ、ｐＮＧは３０５９ｂｐである。
　各プラスミドの長さとプラスミド溶液の濃度（μｇ／μｌ）から１μＬあたりのコピー数を計算した後、ＴＥ緩衝溶液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１．０ｍＭ　ＥＤＴＡ　ｐＨ８．０）を用いて、ｐＣＴ、ｐＮＧ共に１×１０＾５ｃｏｐｉｅｓ／μｌとなるように希釈した。
　実施の形態６におけるＰＣＲ法に用いたプライマー対は、（表１７）に示すとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
　実施の形態６におけるＰＣＲ法に用いるプローブの情報は、（表１８）に示すとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
　ＣＴ　ＱＰは配列番号６と配列番号７のプライマー対で増幅し得るＰＣＲ産物の塩基配列から日鉄住金環境株式会社Ｊ－Ｂｉｏ２１センターのホームページ上のＱＰｒｏｂｅ設計支援ツールを用い計算したＴｍ値を参考にし、特定領域を選択した。
　ＮＧ　ＱＰは配列番号８と配列番号９のプライマー対で増幅し得るＰＣＲ産物の塩基配列から、Ｊ－Ｂｉｏ２１センターのホームページ上のＱＰｒｏｂｅ設計支援ツールを用い計算したＴｍ値を参考にし、特定領域を選択した。
　ｐＣＴに特異的にアニールするＱＰｒｏｂｅであるＣＴ　ＱＰとｐＮＧに特異的にアニールするＱＰｒｏｂｅであるＮＧ　ＱＰの蛍光色素にはそれぞれＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬを使用し、それぞれ３’末端のＣを標識した。
　ＱＰｒｏｂｅは日鉄住金環境株式会社に合成を委託して作製した。ＰＣＲ反応液組成、反応条件を（表１９）と（表２０）に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
　蛍光測定時の励起波長と蛍光波長の組み合わせは５１０－５２８ｎｍを選択した。
　各サイクルの変性ステップ（９５℃）と伸長ステップ（６８℃）で蛍光値を測定し、更に、増幅反応後に第２標的を検出するためのステップ（９５℃と５５℃）において蛍光測定を行った。
　得られた生データに対して実施の形態１と同様の演算処理を行った。
　以下に、本実施の形態の判定方法を示す。第１標的核酸の有無は、測定試料のＦ４４の値と閾値１１を比較して［測定試料のＦ４４＜閾値１１］を陽性と判定した。
　閾値１１は、陰性対照のＦ４４の平均値－標準偏差の３倍（以下ｍｅａｎ－３ＳＤ）の値を用いた。
　第２標的核酸の有無は、第１標的核酸が陽性、陰性に関わらず、Ｆｓの値と閾値１２を比較して［Ｆｓ＜閾値１２］を陽性と判定した。
　閾値１２は、ｐＮＧだけを添加した試料のＦｓのｍｅａｎ－３ＳＤの値を用いた。
　ＣＴ　ＱＰの配列はＴｍ値を７３．４℃に、ＮＧ　ＱＰの配列はＴｍ値を６２．５℃に設定した。そのため、ＰＣＲ中の温度範囲（６８℃から９５℃）では、プローブはＣＴ　ＱＰだけがアニールすると推測された。
　又、第２標的検出ステップの蛍光測定は、９５℃とＮＧ　ＱＰのＴｍ値よりも低い５５℃で行うため、第２標的検出ステップの測定値はＣＴ　ＱＰとＮＧ　ＱＰの発光を同時に検出すると推測された。
　陰性対照の増幅曲線は、ＰＣＲが終了する４４サイクル目まで消光が見られず（Ｆ４４の値０．９９８が閾値１１の値０．９９６よりも低くないため）、この時のｍｅａｎ－３ＳＤは０．９９６となり、本例の第１標的検出のための閾値１１とし、（表２１）に示す。増幅曲線を図２６に示す。
　第１標的核酸であるｐＣＴの増幅曲線は、２８サイクル付近からＣＴ　ＱＰのアニーリングに伴う消光が観察され、Ｆ４４の値０．７２０は閾値１１より低く、ｐＣＴの目的の領域が増幅したことが示された。
　また、この時のＦｓのｍｅａｎ－３ＳＤは－０．０３９であり、第２標的検出のための閾値１２とし、（表２１）に示す。増幅曲線を図２７に示す。
　第２標的核酸であるｐＮＧの増幅曲線は、増幅反応中は全く消光が見られず（Ｆ４４の値０．９９８が閾値１１の値０．９９６よりも低くないため）、Ｆｓの値－０．０６５は、閾値１２より低かった。
　この結果より、ｐＣＴの目的の領域が増幅しなかったことと、ｐＮＧの目的の領域が増幅したことが示された。Ｆｓの値を（表２１）に示す。増幅曲線を図２８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
　第１標的核酸であるｐＣＴと第２標的核酸であるｐＮＧの両方を添加した際の増幅曲線は、ｐＣＴの増幅曲線と同様に、２８サイクル付近からＣＴ　ＱＰのアニーリングに伴う消光が観察され、Ｆ４４の値０．７２９は閾値１１より低く、ｐＣＴの目的の領域が増幅したことが示された。
　Ｆｓの値－０．１１１は、閾値１２より低く、ｐＮＧの目的の領域が増幅したことが示された。Ｆｓの値を（表２１）に示す。増幅曲線を図２９に示す。
　以上の結果より、２項目の遺伝子においてもプローブの設計方法と温度変化プロファイルを組み合わせ、１種類の反応液が入った１つの反応容器で単一蛍光色素を用い、マイコプラズマＰ１遺伝子と内部コントロールを検出できることが示された。
　（実施の形態７）
　＜増幅反応中に複数回第２標的を検出するＱＰｒｏｂｅ法におけるマイコプラズマＰ１遺伝子と内部コントロールの検出＞
　第２標的検出ステップを最終サイクルの後だけではなく、増幅反応中に折り込んだ方法でＱＰｒｏｂｅ法におけるマイコプラズマＰ１遺伝子と内部コントロールの検出を行った。
　ＰＣＲに用いたプライマー、プローブ、反応液組成と核酸試料は実施の形態１と同じものを用いた。反応条件は、（表２２）に示すとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
　また増幅反応の温度変化をグラフ化したものを図３０に示す。
　実施の形態７の解析においては次の演算を行い、その他は実施の形態１同様のステップを行った。
ｆｅｎ＝ｆｈｙｂ．ｅｎ／ｆｄｅｎ．ｅｎ　（数４）
ｆｅｎ：（数４）により算出されたｎ回目の第２標的検出ステップにおける蛍光強度値
ｆｈｙｂ．ｅｎ：ｎ回目の第２標的検出ステップ５５℃の蛍光強度値
ｆｄｅｎ．ｅｎ：ｎ回目の第２標的検出ステップ９５℃の蛍光強度値
Ｆｅｎ＝ｆｅｎ／ｆ１０　（数５）
Ｆｅｎ：１０サイクル目の（数４）により得られた蛍光強度値を１とした時のｎ回目の第２標的検出ステップの相対値
Ｆｓ１＝Ｆｅ１－Ｆ２０　（数６）
Ｆｓ２＝Ｆｅ２－Ｆ２７　（数６’）
Ｆｓ３＝Ｆｅ３－Ｆ３４　（数６’’）
Ｆｓ４＝Ｆｅ４－Ｆ４１　（数６’’’）
Ｆｓ１：１回目の第２標的検出ステップの測定値
Ｆｓ２：２回目の第２標的検出ステップの測定値
Ｆｓ３：３回目の第２標的検出ステップの測定値
Ｆｓ４：４回目の第２標的検出ステップの測定値
　判定は下記に示す方法で行った。第１標的核酸の有無は、測定試料のＦ４１の値と閾値１３を比較して［測定試料のＦ４１＜閾値１３］を陽性と判定した。
　閾値１３は、陰性対照のＦ４１の平均値－標準偏差の３倍（以下ｍｅａｎ－３ＳＤ）の値を用いた。
　第２標的核酸の有無は、１回目の第２標的検出ステップでは、［Ｆｓ１＜閾値１４］を陽性と判定した。
　閾値１４は、ｐＭＹＣだけを添加した試料のＦｓ１のｍｅａｎ－３ＳＤの値を用いた。
　２回目の第２標的検出ステップでは、［Ｆｓ２＜閾値１５］を陽性と判定した。
　閾値１５は、ｐＭＹＣだけを添加した試料のＦｓ２のｍｅａｎ－３ＳＤの値を用いた。
　３回目の第２標的検出ステップでは、［Ｆｓ３＜閾値１６］を陽性と判定した。
　閾値１６は、ｐＭＹＣだけを添加した試料のＦｓ３のｍｅａｎ－３ＳＤの値を用いた。
　４回目の第２標的検出ステップでは、［Ｆｓ４＜閾値１７］を陽性と判定した。
　閾値１７は、ｐＭＹＣだけを添加した試料のＦｓ４のｍｅａｎ－３ＳＤの値を用いた。
　陰性対照の増幅曲線は、各第２標的検出ステップ以外ではＰＣＲが終了する４１サイクル目まで消光が見られず（Ｆ４１の値０．９９９が閾値１３の値０．９９８よりも低くないため）、この時のｍｅａｎ－３ＳＤは０．９９８となり、本例の第１標的検出のための閾値１３とし、（表２３）に示す。増幅曲線を図３１に示す。
　第１標的核酸であるｐＭＹＣの増幅曲線は、３０サイクル付近からＭＹＣ　ＱＰのアニーリングに伴う消光が観察され、Ｆ４１の値０．８９２は閾値１３より低く、ｐＭＹＣの目的の領域が増幅したことが示された。
　また、この時のＦｓ１のｍｅａｎ－３ＳＤは－０．０５８、Ｆｓ２のｍｅａｎ－３ＳＤは－０．０７０、Ｆｓ３のｍｅａｎ－３ＳＤは－０．０８０、Ｆｓ４のｍｅａｎ－３ＳＤは－０．０８７でそれぞれ第２標的検出のための閾値１４、１５，１６，１７とし、（表２３）に示す。増幅曲線を図３２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
　第２標的核酸であるｐＩＣＭ５の増幅曲線は、各第２標的検出ステップ以外では増幅反応中は全く消光が見られず（Ｆ４１の値０．９９９が閾値１３の値０．９９８よりも低くないため）、Ｆｓ１の値－０．０５８は、閾値１４より高く、ｐＩＣＭ５の目的の領域が１回目の第２標的検出ステップまでに検出限界以上に増幅していないことが示された。
　Ｆｓ２の値－０．０５７も閾値１５より高く、ｐＩＣＭ５の目的の領域が２回目の第２標的検出ステップまでに検出限界以上に増幅していないことが示された。
　Ｆｓ３の値－０．０８４は閾値１６より低く、ｐＩＣＭ５の目的の領域が３回目の第２標的検出ステップまでに検出限界以上に増幅していることが示された。
　Ｆｓ４の値－０．１９２も閾値１７より低かった。Ｆｓ１、Ｆｓ２、Ｆｓ３、Ｆｓ４の値を（表２３）に示す。増幅曲線を図３３に示す。
　第１標的核酸であるｐＭＹＣと第２標的核酸であるｐＩＣＭ５の両方を添加した際の増幅曲線は、ｐＭＹＣの増幅曲線と同様に、３０サイクル付近からＭＹＣ　ＱＰのアニーリングに伴う消光が観察され、Ｆ４１の値０．８９７は閾値１３より低く、ｐＭＹＣの目的の領域が増幅したことが示された。
　Ｆｓ１の値－０．０５８は、閾値１４よりも高く、ｐＩＣＭ５の目的の領域が１回目の第２標的検出ステップまでに検出限界以上に増幅していないことが示された。
　Ｆｓ２の値－０．０６８も閾値１５よりも高く、ｐＩＣＭ５の目的の領域が２回目の第２標的検出ステップまでに検出限界以上に増幅していないことが示された。
　Ｆｓ３の値－０．１０９は閾値１６より低く、ｐＩＣＭ５の目的の領域が３回目の第２標的検出ステップまでに検出限界以上に増幅していることが示された。
　Ｆｓ４の値―０．１５４も閾値１７よりも低かった。Ｆｓ１、Ｆｓ２、Ｆｓ３、Ｆｓ４の値は、（表２３）に示すとおりである。増幅曲線を図３４に示す。
　以上の結果より、第２標的検出ステップを最終サイクルの後だけではなく、増幅反応中に折り込んだ方法でもマイコプラズマＰ１遺伝子と内部コントロールを検出できることが示された。
本発明の実施の形態１における混合液の温度変化を示すグラフ 本発明の実施の形態１における蛍光測定のタイミング説明図 本発明の実施の形態１における判定方法を示すフローチャート 本発明の実施の形態１における陰性対照の蛍光強度変化を示すグラフ 本発明の実施の形態１における第１標的核酸の蛍光強度変化を示すグラフ 本発明の実施の形態１における第２標的核酸の蛍光強度変化を示すグラフ 本発明の実施の形態１における第１、第２標的核酸の蛍光強度変化を示すグラフ 本発明の実施の形態２における蛍光測定のタイミング説明図 本発明の実施の形態２における陰性対照の蛍光強度変化を示すグラフ 本発明の実施の形態２における第１標的核酸の蛍光強度変化を示すグラフ 本発明の実施の形態２における第２標的核酸の蛍光強度変化を示すグラフ 本発明の実施の形態２における第１、第２標的核酸の蛍光強度変化を示すグラフ 本発明の実施の形態３における判定方法を示すフローチャート 本発明の実施の形態３における陰性対照の蛍光強度変化を示すグラフ 本発明の実施の形態３における第１標的核酸の蛍光強度変化を示すグラフ 本発明の実施の形態３における第２標的核酸の蛍光強度変化を示すグラフ 本発明の実施の形態３における第１、第２標的核酸の蛍光強度変化を示すグラフ 本発明の実施の形態４における陰性対照の蛍光強度変化を示すグラフ 本発明の実施の形態４における第１標的核酸の蛍光強度変化を示すグラフ 本発明の実施の形態４における第２標的核酸の蛍光強度変化を示すグラフ 本発明の実施の形態４における第１、第２標的核酸の蛍光強度変化を示すグラフ 本発明の実施の形態５における陰性対照の蛍光強度変化を示すグラフ 本発明の実施の形態５における第１標的核酸の蛍光強度変化を示すグラフ 本発明の実施の形態５における第２標的核酸の蛍光強度変化を示すグラフ 本発明の実施の形態５における第１、第２標的核酸の蛍光強度変化を示すグラフ 本発明の実施の形態６における陰性対照の蛍光強度変化を示すグラフ 本発明の実施の形態６における第１標的核酸の蛍光強度変化を示すグラフ 本発明の実施の形態６における第２標的核酸の蛍光強度変化を示すグラフ 本発明の実施の形態６における第１、第２標的核酸の蛍光強度変化を示すグラフ 本発明の実施の形態７における混合液の温度変化を示すグラフ 本発明の実施の形態７における陰性対照の蛍光強度変化を示すグラフ 本発明の実施の形態７における第１標的核酸の蛍光強度変化を示すグラフ 本発明の実施の形態７における第２標的核酸の蛍光強度変化を示すグラフ 本発明の実施の形態７における第１、第２標的核酸の蛍光強度変化を示すグラフ 本発明の実施の形態１における温度変化の拡大図 本発明の実施の形態１における混合液成分を示す説明図 （ａ）本発明の実施の形態１における変性ステップの説明図　（ｂ）本発明の実施の形態１におけるアニーリングステップの説明図　（ｃ）本発明の実施の形態１における伸長ステップの説明図　（ｄ）本発明の実施の形態１における伸長完了ステップの説明図 （ａ）本発明の実施の形態１における変性ステップの説明図　（ｂ）本発明の実施の形態１におけるアニーリングステップの説明図
１　容器
２　溶液
１０　第１標的核酸
１３　第１標的用Ｆプライマー
１４　第１標的用Ｒプライマー
１５　第１標的用プローブ
１６　第１標識物
２０　第２標的核酸
２３　第２標的用Ｆプライマー
２４　第２標的用Ｒプライマー
２５　第２標的用プローブ
２６　第２標識物
３０　ＤＮＡポリメラーゼ
３１　デオキシリボヌクレオチド３リン酸
Ｔ０　変性温度
Ｔ１　アニーリング温度
Ｔ２　伸長温度
Ｔ３　第２標的検出温度

Claims (7)

  1. 変性温度をＴ０、アニーリング温度をＴ１、伸長温度をＴ２、第２標的検出温度をＴ３とすると、Ｔ０＞Ｔ２≧Ｔ１＞Ｔ３を満たすように温度設定される複数の標的核酸の検出キットであって、
    　前記変性温度Ｔ０において、２本鎖の水素結合が切断され、それぞれ２本の１本鎖に解離する、第１標的核酸及び第２標的核酸を含み得る溶液に、
    　前記アニーリング温度Ｔ１において、前記第１標的核酸が解離した２本の１本鎖のいずれかに特異的に結合する第１標的用プライマーと、
    　前記アニーリング温度Ｔ１において、前記第２標的核酸が解離した２本の１本鎖のいずれかに特異的に結合する第２標的用プライマーと、
    　前記アニーリング温度Ｔ１において、前記第１標的核酸が解離した２本の１本鎖のいずれかに特異的に結合する第１標的用プローブであって、結合により蛍光シグナルが変化する第１標識物を有するものと、
    　ＤＮＡポリメラーゼと、
    　前記伸長温度Ｔ２において、前記ＤＮＡポリメラーゼの作用により、前記第１標的核酸が解離した２本の１本鎖及び前記第２標的核酸が解離した２本の１本鎖に結合するデオキシリボヌクレオチド３リン酸と、
    　前記アニーリング温度Ｔ１においては、前記第１標的核酸が解離した２本の１本鎖及び前記第２標的核酸が解離した２本の１本鎖のいずれにも結合せず、前記第２標的検出温度Ｔ３において、前記第２標的核酸が解離した２本の１本鎖のいずれかに特異的に結合する第２標的用プローブであって、結合により蛍光シグナルが変化する第２標識物を有するものとを含有することを特徴とする複数の標的核酸の検出キット。
  2. 前記第１標識物及び前記第２標識物は、ＱＰｒｏｂｅ（登録商標）プローブ、Ｅｐｒｏｂｅ（登録商標）プローブ及びＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブからなる群から選択される請求の範囲第１項記載の複数の標的核酸の検出キット。
  3. 前記蛍光シグナルは、アニールすると消光するものである請求の範囲第１項または第２項記載の複数の標的核酸の検出キット。
  4. 前記蛍光シグナルは、アニールすると発光するものである請求の範囲第１項または第２項記載の複数の標的核酸の検出キット。
  5. 前記第１標的核酸はマイコプラズマＰ１遺伝子であり、前記第２標的核酸は内部コントロールである請求の範囲第１項から第４項のいずれかに記載の複数の標的核酸の検出キット。
  6. 前記第１標的核酸はクラミジア内在性プラスミド遺伝子であり、前記第２標的核酸は淋菌ＣＭＴ遺伝子である請求の範囲第１項から第４項のいずれかに記載の複数の標的核酸の検出キット。
  7. 請求の範囲第１項から第６項のいずれかに記載の複数の標的核酸を測定する検出キットを用いる検出方法であって、
    　前記溶液の温度を前記変性温度Ｔ０に上げて、含有が疑われる前記第１標的核酸及び前記第２標的核酸のそれぞれを、２本の１本鎖に解離させる解離ステップと、
    　前記溶液の温度を前記アニーリング温度Ｔ１まで下げて、前記第１標的用プローブによる蛍光シグナルに基づき、第１標的核酸の存否を検出する第１標的核酸検出ステップと、
    　前記溶液の温度を前記伸長温度Ｔ２とし、含有が疑われる前記第１標的核酸及び前記第２標的核酸が解離した、それぞれの２本の１本鎖を２本鎖の第１標的核酸及び第２標的核酸に増幅する増幅ステップと、
    　前記溶液の温度を前記第２標的検出温度Ｔ３まで下げて、前記第２標的用プローブによる蛍光シグナルに基づき、第２標的核酸の存否を検出する第２標的核酸検出ステップとを含む検出方法。
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