JP2008306935A - 核酸の迅速な検出方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】標的核酸の存在または量を確認したい試料と少なくともインターカレーターと標識プローブとプライマーの存在下、連続的または間欠的にインターカレーターの励起波長の光を与えかつ標識プローブからの蛍光を測定しながら、高速PCRを行い、該標的核酸の存在または量を調べることを特徴とする検出方法。
【選択図】 なし
Description
a)90〜105℃の範囲内の温度で(好ましくは90〜100℃)0.5〜5分間(好ましくは0.5〜3分間)、変性させる工程、b)35〜65℃の範囲内の温度で(好ましくは37〜60℃)0.5〜5分間(好ましくは1〜3分間)、プライマーと鋳型のハイブリッドを形成させる(アニーリング)工程、及びc)40〜80℃の範囲内の温度で(好ましくは50〜75℃)0.5〜40分間(好ましくは1〜3分間)、プライマー伸長生成物を形成させる(伸長)工程。
(a)インターカレーター
(b)次の(i)〜(iii)の性質を有する標識プローブ
(i) 標的核酸に相補的な配列と二重鎖核酸構造を形成でき、かつ14塩基以上30塩基以下の長さのオリゴヌクレオチドを有する
(ii) 前記インターカレーターからの蛍光エネルギーを吸収し自ら蛍光を発することができる1個または複数の蛍光物質で該オリゴヌクレオチドが標識されている
(iii)該標識プローブの濃度が、(c)の第二プライマーの濃度に対して3倍以上15倍以下である
(c)次の(i)〜(iii)の性質を有する第一プライマーおよび第二プライマー
(i) 第一プライマーの伸長産物が標的核酸と相補的な配列を有しかつ第二プライマーの鋳型となる性質を有し、該第二プライマーの伸長産物が標的核酸と相同な配列を有しかつ該第一プライマーの鋳型となる性質を有する
(ii) 該第一プライマーおよび該第二プライマーによる増幅産物の長さが50bp以上500bp以下である
(iii) 該第一プライマー及び該第二プライマーのTm値が70℃以上90℃以下であり、かつ該第二プライマーのTm値は(b)の標識プローブのTm値より大きい
2.第一プライマーの濃度が第二プライマーの濃度に対して4倍以上であることを特徴とする1の検出方法。
3.高速PCRが、10℃/秒以上の速度で温度の上昇及び下降を繰り返すことを特徴とする1または2の検出方法。
4.さらに、
(d)100塩基/秒以上のDNA合成速度を有するDNAポリメラーゼ
の存在下、
高速PCRを行うことを特徴とする1〜3のいずれかの検出方法。
5.DNAポリメラーゼが、さらに5’エキソヌクレアーゼ活性を持たないことを特徴とする4の検出方法。
6.DNAポリメラーゼが、KOD DNAポリメラーゼ(Thermococcus kodakaraensis KOD1由来)またはその変異体であることを特徴とする4または5の検出方法。
7.(c)の第一プライマーおよび第二プライマーが、さらに
(iv) 該第一プライマーの伸長産物において、該伸長産物の5’末端から前記標識プローブが二重鎖核酸構造を形成する領域までの距離を(A)、該標識プローブが二重鎖核酸構造を形成する領域から該伸長産物の3’末端までの距離を(B)とした場合に(A/B)の値が0.1以上3.0以下であること、
を特徴とする1〜6のいずれかの検出方法。
8.(b)の標識プローブが、さらに
(iv) 標的部位と3個以下の非相補的塩基を有すること、
を特徴とする1〜7のいずれかの検出方法。
9.標識プローブの中央部に、非相補的塩基が位置することを特徴とする8の検出方法。
10.インターカレーターが、SYBR Green I(商標)、LC Green I(商標)、LC Green Plus(商標)、または[2-[N-[(3-dimethylaminopropyl)-N- propylamino]-4-[2,3-dihydro-3-methyl-(benzo-1,3-thiazol-2-yl)-methylidene]-1-phenyl-qunolinium]のうちのいずれかであり、標識プローブの蛍光物質がTexas Red(商標)であることを特徴とする1〜9のいずれかの検出方法。
11.標的核酸がピロリ菌の23S rRNA遺伝子のセンス鎖であり、
(b)の標識プローブのオリゴヌクレオチドの配列が、配列番号2より選ばれる14塩基以上30塩基以下の連続した塩基配列であり、
(c)の第一プライマーが、配列番号3より選ばれる20塩基以上35塩基以下の連続した塩基配列であり、
(c)の第二プライマーが、配列番号4より選ばれる20塩基以上35塩基以下の連続した塩基配列であり、
連続的または間欠的にインターカレーターの励起波長の光を与えかつ標識プローブからの蛍光を測定しながら、高速PCRを行い、ピロリ菌の23S rRNA遺伝子の存在または量を調べることを特徴とする1〜10のいずれかの検出方法。
12.標的核酸がピロリ菌の23S rRNA遺伝子のアンチセンス鎖であり、
(a)の標識プローブのオリゴヌクレオチドの配列が配列番号1より選ばれる14塩基以上30塩基以下の連続した塩基配列であり、
(c)の第一プライマーが、配列番号4より選ばれる20塩基以上35塩基以下の連続した塩基配列であり、
(c)の第二プライマーが、配列番号3より選ばれる20塩基以上35塩基以下の連続した塩基配列であり、
連続的または間欠的にインターカレーターの励起波長の光を与えかつ標識プローブからの蛍光を測定しながら、高速PCRを行い、ピロリ菌の23S rRNA遺伝子の存在または量を調べることを特徴とする1〜10のいずれかの検出方法。
13.1〜12のいずれかの方法に引き続いて、密封状態のまま、インターカレーターの励起波長の光を与えかつ標識プローブからの蛍光を測定しながら、0.1℃/秒以上の連続的な温度上昇又は下降を伴う融解曲線解析を行い、標的核酸中の変異の存在を調べることを特徴とする検出方法。
14.変異が、ピロリ菌の抗生物質耐性を判別する23S rRNA遺伝子の第2142位または第2143位における変異の存在を調べることを特徴とする13の検出方法。
15.標識プローブの中央部に変異の部位が位置することを特徴とする13または14にの検出方法。
16.少なくとも次の(a)〜(c)を含むことを特徴とするピロリ菌の存在および/またはピロリ菌の抗生物質耐性の存在を検出するためのキット。
(a)インターカレーター
(b)配列番号1または配列番号2より選ばれる14塩基以上30塩基以下の連続した塩基配列のオリゴヌクレオチドを有し、該オリゴヌクレオチドがインターカレーターからの蛍光エネルギーを吸収し自ら蛍光を発することができる1個又は複数の蛍光物質で標識されたピロリ菌の存在および/またはピロリ菌の抗生物質耐性の存在を検出するための標識プローブ
(c)20塩基以上35塩基以下であり配列番号3より選ばれる連続した塩基配列を含む第一プライマーと、20塩基以上35塩基以下であり配列番号4より選ばれる連続した塩基配列を含む第二プライマー
17.(b)の標識プローブと二重鎖核酸構造を形成しうる伸長産物を生成せしめる側のプライマーの濃度が、他方のプライマーの濃度に対して4倍以上であることを特徴とする16のキット。
18.さらに、
(d)100塩基/秒以上のDNA合成速度を有するDNAポリメラーゼ
を含むことを特徴とする16または17のキット。
19.DNAポリメラーゼが、さらに5’エキソヌクレアーゼ活性を持たないことを特徴とする18のキット。
20.DNAポリメラーゼが、KOD DNAポリメラーゼ(Thermococcus kodakaraensis KOD1由来)またはその変異体であることを特徴とする18または19のキット。
21.インターカレーターが、SYBR Green I(商標)、LC Green I(商標)、LC Green Plus(商標)、または[2-[N-[(3-dimethylaminopropyl)-N- propylamino]-4-[2,3-dihydro-3-methyl-(benzo-1,3-thiazol-2-yl)-methylidene]-1-phenyl-qunolinium]のうちのいずれかであり、標識プローブの蛍光物質がTexas Red(商標)であることを特徴とす16〜20のいずれかのキット。
22.標識プローブの中央部に、ピロリ菌の23S rRNA遺伝子の第2142位または第2143位に相当する部位が位置することを特徴とする16〜21のキット。
23.配列番号1または配列番号2より選ばれる14塩基以上30塩基以下の長さのオリゴヌクレオチドを有し、2個の蛍光物質で標識されたピロリ菌の存在および/またはピロリ菌の抗生物質耐性の存在を検出するための標識プローブ。
24.蛍光物質が、Texas Red(商標)であることを特徴とする23の標識プローブ。
さらに、本発明を利用し、ピロリ菌の23S rRNA遺伝子の存在または量を調べること、ピロリ菌の23S rRNA遺伝子の変異の存在を調べること、23S rRNA遺伝子の第2142位または第2143位における変異の存在を調べピロリ菌の抗生物質耐性を判別することも迅速かつ高感度に行えるようになった。
標的核酸の存在または量を確認したい試料と少なくとも下記(a)〜(c)の存在下、連続的または間欠的にインターカレーターの励起波長の光を与えかつ標識プローブからの蛍光を測定しながら、高速PCRを行い、該標的核酸の存在または量を調べ、引き続いて、密封状態のまま、インターカレーターの励起波長の光を与えかつ標識プローブからの蛍光を測定しながら、0.1℃/秒以上の連続的な温度上昇又は下降を伴う融解曲線解析を行い、標的核酸中の変異の存在を調べることを特徴とする検出方法。この場合において、
(a)インターカレーター
(b)次の(i)〜(iii)の性質を有する標識プローブ
(i) 標的核酸に相補的な配列と二重鎖核酸構造を形成でき、かつ14塩基以上30塩基以下の長さのオリゴヌクレオチドを有する
(ii) 前記インターカレーターからの蛍光エネルギーを吸収し自ら蛍光を発することができる1個または複数の蛍光物質で該オリゴヌクレオチドが標識されている
(iii)該標識プローブの濃度が、(c)の第二プライマーの濃度に対して3倍以上15倍以下である
(c)次の(i)〜(iii)の性質を有する第一プライマーおよび第二プライマー
(i) 第一プライマーの伸長産物が標的核酸と相補的な配列を有しかつ第二プライマーの鋳型となる性質を有し、該第二プライマーの伸長産物が標的核酸と相同な配列を有しかつ該第一プライマーの鋳型となる性質を有する
(ii) 該第一プライマーおよび該第二プライマーによる増幅産物の長さが50bp以上500bp以下である
(iii) 該第一プライマー及び該第二プライマーのTm値が70℃以上90℃以下であり、かつ該第二プライマーのTm値は前記標識プローブのTm値より大きい
を示すものである。
連続的または間欠的に(a)のインターカレーターの励起波長の光を与えかつ(b)の標識プローブからの蛍光を測定しながら、(c)の第一プライマーと第二プライマーを用いて高速PCRを行い、ピロリ菌の23S rRNA遺伝子の存在または量を調べることを特徴とする検出方法。
連続的または間欠的に(a)のインターカレーターの励起波長の光を与えかつ(b)の標識プローブからの蛍光を測定しながら、(c)の第一プライマーと第二プライマーを用いて高速PCRを行い、ピロリ菌の23S rRNA遺伝子の存在または量を調べ、引き続いて、密封状態のまま、(a)のインターカレーターの励起波長の光を与えかつ標識プローブからの蛍光を測定しながら、0.1℃/秒以上の連続的な温度上昇又は下降を伴う融解曲線解析を行い、ピロリ菌の23S rRNA遺伝子の変異の存在を調べることを特徴とする検出方法。
連続的または間欠的に(a)のインターカレーターの励起波長の光を与えかつ(b)の標識プローブからの蛍光を測定しながら、(c)の第一プライマーと第二プライマーを用いて高速PCRを行い、ピロリ菌の23S rRNA遺伝子の存在または量を調べ、引き続いて、密封状態のまま、(a)のインターカレーターの励起波長の光を与えかつ(b)の標識プローブからの蛍光を測定しながら、0.1℃/秒以上の連続的な温度上昇又は下降を伴う融解曲線解析を行い、23S rRNA遺伝子の第2142位または第2143位における変異の存在を調べピロリ菌の抗生物質耐性を判別することを特徴とする検出方法。
(b)の標識プローブのオリゴヌクレオチドの配列が、配列番号2より選ばれる14塩基以上30塩基以下の連続した塩基配列であり、
(c)の第一プライマーが、配列番号3より選ばれる20塩基以上35塩基以下の連続した塩基配列であり、
(c)の第二プライマーが、配列番号4より選ばれる20塩基以上35塩基以下の連続した塩基配列であり、
標的核酸がピロリ菌の23S rRNA遺伝子のアンチセンス鎖の場合は、
(a)の標識プローブのオリゴヌクレオチドの配列が配列番号1より選ばれる14塩基以上30塩基以下の連続した塩基配列であり、
(c)の第一プライマーが、配列番号4より選ばれる20塩基以上35塩基以下の連続した塩基配列であり、
(c)の第二プライマーが、配列番号3より選ばれる20塩基以上35塩基以下の連続した塩基配列
であればよい。
(検体の採取)
胃生検材料より遺伝子をQIAamp(登録商標) DNA micro Kit(Qiagen社製)を用いて抽出した。抽出されたDNAは-20℃で保存した。
(テンプレートプラスミドの調製)
1μlの抽出されたDNA溶液を鋳型として用い、PCRを実施した。ここで使用したプライマーペアは、ピロリ菌23SrRNA遺伝子を全長増幅できるプライマーを使用した。いずれもピロリ菌の23SrRNA遺伝子 (GenBank accession number U27270)の公知の配列から設計した。
得られたプラスミドの核酸配列をオートシークエンサーにより解析し、野生型の塩基配列を有するプラスミド、ピロリ菌の23S rRNA遺伝子の第2142位または第2143位のアデニンがグアニンに変異した塩基配列を持つプラスミドの計3種類を得た。以下、野生型はWT、23S rRNA遺伝子の2142位変異型は2142G、同じく23S rRNA遺伝子の2143位変異型は2143Gと示す。
(プライマー及び標識プローブの合成)
検出に使用するプライマー及び標識プローブは核酸合成受託会社((株)日本バイオサービス、(株)サワディー、GENSET KK、シグマアルドリッチジャパン(株)等)に依頼した。
(野生型ピロリ菌の検出)
WT、2142G、2143Gの各プラスミドDNAは表2に示す反応液にテンプレートとして混合した。以下、表2の反応組成を基準とし、反応液を構成するいずれかの溶液の最終濃度を変更した場合はミリQ水で調節し全量20μLを維持した。また、表2の組成は一例であり反応組成の最適化は同業者であれば容易に行えるものである。プラスミド量は104コピー及び102コピーを使用した。プライマーは表1に記載のプライマーF1とプライマーR1を使用した。標識プローブは表1記載の標識プローブAを使用した。標識プローブAは野生型に対して完全に一致する塩基配列の標識プローブに故意の非相補的塩基1塩基を導入したものである。例えば標識プローブAにおいて、故意の非相補的塩基とは、変異部位に相当する標識プローブ中の非相補的塩基、すなわち2142位および2143位を除いた標識プローブの塩基配列に非相補的塩基を導入することをいう。標識プローブAはCAM耐性ピロリ菌(変異型)2142G、2143Gに対して、いずれも非相補的塩基2塩基が存在している標識プローブである。PCR増幅時の反応条件は表3で示される(核酸増幅サイクル)を用いた。増幅及び蛍光の測定にはロシュ・ダイアグノスティック社製ライトサイクラー(登録商標)を使用した。測定モードは530nmと640nmを利用した。以下特に記載がない場合はすべてライトサイクラー(登録商標)での測定とする。
FL530(n):第nサイクルにおける、ライトサイクラー測定モード530nmによる蛍光測定値、
k:k×FL530(n)が、第nサイクルにおける、SYBR Green I (商標)の波長640nmにおけるバックグラウンド蛍光シグナル値となるような補正係数、
FLtb(n):第nサイクルにおける、Texas Red(商標) の波長640nmにおけるバックグラウンド蛍光シグナル値。
なお、バックグラウンド蛍光シグナルとは、標的核酸または第一プライマーの伸長産物への標識プローブのハイブリダイゼーションとは無関係に発生した蛍光シグナルを指す。
(ピロリ菌CAM耐性遺伝子変異の検出)
表1に記載の標識プローブBを用いてCAM耐性ピロリ菌(変異型)の検出を行った。標識プローブBは2142G変異型に対して完全一致する塩基配列中、2142位および2143位を除く位置に故意の非相補的塩基1塩基を導入したものである。野生型に対しては変異部位に存在する非相補的塩基1塩基と故意の非相補的塩基1塩基で合計非相補的塩基が2塩基存在していることになる。2143G変異型に対しては非相補的塩基3塩基が存在する標識プローブである。標識プローブ以外は実施例3の条件を用いた。
標識プローブBでは図4、図5とは異なり2142G変異型のプラスミドをテンプレートとした場合にのみ蛍光シグナル値の増加が確認できた。NC、WT、2143Gのテンプレートを用いた時は蛍光シグナル値が得られなかった。本発明によれば標的核酸の塩基配列特異的に蛍光シグナルを得られることがわかる。
実施例3におけるプライマーF1を表1に記載のプライマーF2〜F5に、プライマーR1を表1に記載のプライマーR2〜R5に変更し、F1〜F5とR1〜R5で組み合わせを変えた検討を行った。その他の条件は実施例3に従った。テンプレートはWTの104コピープラスミドを使用した。その結果を表4に示す。表4の数値は、式(I)から求めた標識プローブのTexas Red(商標)の蛍光シグナル値がある一定値(0.25)をこえた時のサイクル数を示している。蛍光シグナルの増加が見られない組み合わせは数値の記載の代わりに(−)を示した。(A/B)の数値は(標的核酸におけるプライマーRの5‘末端相同的な塩基から標識プローブの3’末端と相補的な塩基までの距離/標的核酸におけるプライマーFの5‘末端と相補的な塩基から標識プローブの5’末端と相補的な塩基までの距離)を示している。
(標識プローブのTm値検討)
故意の変異の入っていない標識プローブのTm値(長さ)を39.64(12塩基)、50.68(14塩基)、60.07(16塩基)、63.68(18塩基)、69.39(20塩基)、76.29(22塩基)とした表1に記載の6種類の標識プローブC〜Hをそれぞれ用いて、標識プローブのTm値が本発明の迅速な核酸検出法に及ぼす影響を検討した。標識プローブ以外は実施例3と同様の条件、組成を使用した。標識プローブC〜Hはそれぞれ配列番号17〜22で示される塩基配列を持つ。テンプレートはWT、2142G、2143Gの各プラスミド(プラスミド量104コピー)を使用した。各標識プローブは中央に変異塩基部位が位置する設計になっている。核酸プローブD(Tm値60.07)による結果を図6に示す。
(標識プローブ濃度の検討)
標識プローブ濃度を150 nM、1000 nMとした時の検出を検討した。実施例3の標識プローブ、プライマー、試薬組成及び反応条件をそのまま用い、標識プローブ濃度1000 nMを150 nMに変更して標識プローブ濃度検討を行った。上記標識プローブ濃度と第二プライマー濃度との関係は、第二プライマー濃度に対して標識プローブがそれぞれ1.0倍、6.7倍となっている。テンプレートはWT、2142G、2143Gの各プラスミド(プラスミド量102コピー)を使用した。標識プローブ濃度1000 nMの検討結果を図5に示す。
標識プローブ濃度1000 nMではWTピロリ菌を特異的に検出できた。1000 nMの濃度では標識プローブがハイブリダイゼーションする増幅産物に対して、標識プローブが十分量存在するためピロリ菌検出に十分な蛍光シグナルを得ることができた。標識プローブ濃度が150 nMの時は、増幅産物とハイブリダイゼーションした標識プローブの割合が少なくなり高感度にピロリ菌を検出することが難しいことがわかる。
(第一プライマー濃度及び第二プライマー濃度比の検討)
第二プライマーに対する第一プライマーの濃度比が1倍と10倍の検討を行った。1倍ではプライマーF1 500 nM、プライマーR1 500 nMを使用した。また、10倍ではプライマーF1 150 nM、プライマーR1 1500 nMを使用した。プライマー濃度以外の条件は実施例3と同じ条件を使用した。テンプレートはWT、2142G、2143Gの各プラスミド(プラスミド量102コピー)を使用した。濃度比1倍の結果を図8(比較例)、10倍の結果を図5に示す。
(高速増幅用DNAポリメラーゼの選択)
核酸増幅工程の高速化に適用し得るDNAポリメラーゼを検討した。DNAポリメラーゼとしてはTaqポリメラーゼ(Thermus aquaticus由来)とKODポリメラーゼ(Thermococcus kodakaraensis KOD1由来)の2種類を検討した。Taqポリメラーゼは東洋紡積社製Blend Taq-Plus-(登録商標)、KODポリメラーゼは東洋紡績社製KOD-Plus- ver.2(登録商標)を使用した。Taqポリメラーゼに関しては表1に示す標識プローブA、プライマーF1,R1を使用し、その他の試薬組成はプロトコール記載の試薬組成を参考にした。反応条件は表3に示す(核酸増幅サイクル)を利用した。KODポリメラーゼに関してはTaqポリメラーゼと同じく標識プローブA、プライマーF1,R1を使用し、基本反応条件は実施例3と同様の条件を使用した。テンプレートはWT、2142G、2143Gの各プラスミド(プラスミド量104コピー)を使用した。KODポリメラーゼを用いた場合の結果は図4に示すとおりである。また、それぞれの増幅産物を3%アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色して増幅産物量を確認した結果を表5に示す。
核酸増幅工程に引き続き融解曲線解析を行うことでテンプレートに存在する1塩基変異を1つの標識プローブで検出できるかどうかを検討した。テンプレートはピロリ菌WT、2142G、2143Gの三種類のプラスミドを使用し、プラスミド量は104コピー及び102コピーを使用した。実施例3と同じ試薬組成ならびに反応条件は表3の(核酸増幅サイクル)・(融解曲線解析)・(クールダウン)に示すものを使用した。プライマー及び標識プローブはそれぞれ表1に示すプライマーF1,R1、核酸プローブAを使用した。得られた蛍光シグナル値の補正は行わず、ライトサイクラー(登録商標)における融解曲線解析の結果をそのまま利用した。測定レンジは640nmを使用した。
(菌体を直接テンプレートとした融解曲線解析による検出)
ピロリ菌のATCC株2種(野生型26695株及び2143G変異型UA1182株)を入手した。そのうちそれぞれ109菌体を分取し、95℃5分の熱処理を行った。その後それぞれ105熱処理後菌体溶液を表2のテンプレートとした。その他は融解曲線解析を行った実施例10と同様の方法にてピロリ菌の検出を行った。その結果を図11に示す。
融解曲線解析によりピロリ菌野生型及びCAM耐性ピロリ菌の検出を行ったところ、いずれも融解曲線解析によって単独ピークとして検出することができた。菌体をサンプルとして検出(CAM耐性判定)まで30分以内で行うことが可能である。
(ピロリ菌の検出までの時間)
一般的に使用されるPCRサイクル94℃15秒、65℃30秒、68℃30秒でPCRを行い、融解曲線解析で検出を行った場合、サーマルサイクラーの中でも温度の上昇・下降速度の早いとされているライトサイクラー(登録商標)でも増幅・検出あわせて1時間以上を要した。
Claims (24)
- 標的核酸の存在または量を確認したい試料と少なくとも下記(a)〜(c)の存在下、連続的または間欠的にインターカレーターの励起波長の光を与えかつ標識プローブからの蛍光を測定しながら、高速PCRを行い、該標的核酸の存在または量を調べることを特徴とする検出方法。
(a)インターカレーター
(b)次の(i)〜(iii)の性質を有する標識プローブ
(i) 標的核酸に相補的な配列と二重鎖核酸構造を形成でき、かつ14塩基以上30塩基以下の長さのオリゴヌクレオチドを有する
(ii) 前記インターカレーターからの蛍光エネルギーを吸収し自ら蛍光を発することができる1個または複数の蛍光物質で該オリゴヌクレオチドが標識されている
(iii)該標識プローブの濃度が、(c)の第二プライマーの濃度に対して3倍以上15倍以下である
(c)次の(i)〜(iii)の性質を有する第一プライマーおよび第二プライマー
(i) 第一プライマーの伸長産物が標的核酸と相補的な配列を有しかつ第二プライマーの鋳型となる性質を有し、該第二プライマーの伸長産物が標的核酸と相同な配列を有しかつ該第一プライマーの鋳型となる性質を有する
(ii) 該第一プライマーおよび該第二プライマーによる増幅産物の長さが50bp以上500bp以下である
(iii) 該第一プライマー及び該第二プライマーのTm値が70℃以上90℃以下であり、かつ該第二プライマーのTm値は(b)の標識プローブのTm値より大きい - 第一プライマーの濃度が第二プライマーの濃度に対して4倍以上であることを特徴とする請求項1に記載の検出方法。
- 高速PCRが、10℃/秒以上の速度で温度の上昇及び下降を繰り返すことを特徴とする請求項1または2に記載の検出方法。
- さらに、
(d)100塩基/秒以上のDNA合成速度を有するDNAポリメラーゼ
の存在下、
高速PCRを行うことを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載の検出方法。 - DNAポリメラーゼが、さらに5’エキソヌクレアーゼ活性を持たないことを特徴とする請求項4に記載の検出方法。
- DNAポリメラーゼが、KOD DNAポリメラーゼ(Thermococcus kodakaraensis KOD1由来)またはその変異体であることを特徴とする請求項4または5に記載の検出方法。
- (c)の第一プライマーおよび第二プライマーが、さらに
(iv) 該第一プライマーの伸長産物において、該伸長産物の5’末端から前記標識プローブが二重鎖核酸構造を形成する領域までの距離を(A)、該標識プローブが二重鎖核酸構造を形成する領域から該伸長産物の3’末端までの距離を(B)とした場合に(A/B)の値が0.1以上3.0以下であること、
を特徴とする請求項1〜6のいずれかに記載の検出方法。 - (b)の標識プローブが、さらに
(iv) 標的部位と3個以下の非相補的塩基を有すること、
を特徴とする請求項1〜7のいずれかに記載の検出方法。 - 標識プローブの中央部に、非相補的塩基が位置することを特徴とする請求項8に記載の検出方法。
- インターカレーターが、SYBR Green I(商標)、LC Green I(商標)、LC Green Plus(商標)、または[2-[N-[(3-dimethylaminopropyl)-N- propylamino]-4-[2,3-dihydro-3-methyl-(benzo-1,3-thiazol-2-yl)-methylidene]-1-phenyl-qunolinium]のうちのいずれかであり、標識プローブの蛍光物質がTexas Red(商標)であることを特徴とする請求項1〜9のいずれかに記載の検出方法。
- 標的核酸がピロリ菌の23S rRNA遺伝子のセンス鎖であり、
(b)の標識プローブのオリゴヌクレオチドの配列が、配列番号2より選ばれる14塩基以上30塩基以下の連続した塩基配列であり、
(c)の第一プライマーが、配列番号3より選ばれる20塩基以上35塩基以下の連続した塩基配列であり、
(c)の第二プライマーが、配列番号4より選ばれる20塩基以上35塩基以下の連続した塩基配列であり、
連続的または間欠的にインターカレーターの励起波長の光を与えかつ標識プローブからの蛍光を測定しながら、高速PCRを行い、ピロリ菌の23S rRNA遺伝子の存在または量を調べることを特徴とする請求項1〜10のいずれかに記載の検出方法。 - 標的核酸がピロリ菌の23S rRNA遺伝子のアンチセンス鎖であり、
(a)の標識プローブのオリゴヌクレオチドの配列が配列番号1より選ばれる14塩基以上30塩基以下の連続した塩基配列であり、
(c)の第一プライマーが、配列番号4より選ばれる20塩基以上35塩基以下の連続した塩基配列であり、
(c)の第二プライマーが、配列番号3より選ばれる20塩基以上35塩基以下の連続した塩基配列であり、
連続的または間欠的にインターカレーターの励起波長の光を与えかつ標識プローブからの蛍光を測定しながら、高速PCRを行い、ピロリ菌の23S rRNA遺伝子の存在または量を調べることを特徴とする請求項1〜10のいずれかに記載の検出方法。 - 請求項1〜12のいずれかに記載の方法に引き続いて、密封状態のまま、インターカレーターの励起波長の光を与えかつ標識プローブからの蛍光を測定しながら、0.1℃/秒以上の連続的な温度上昇又は下降を伴う融解曲線解析を行い、標的核酸中の変異の存在を調べることを特徴とする検出方法。
- 変異が、ピロリ菌の抗生物質耐性を判別する23S rRNA遺伝子の第2142位または第2143位における変異の存在を調べることを特徴とする請求項13に記載の検出方法。
- 標識プローブの中央部に変異の部位が位置することを特徴とする請求項13または14に記載の検出方法。
- 少なくとも次の(a)〜(c)を含むことを特徴とするピロリ菌の存在および/またはピロリ菌の抗生物質耐性の存在を検出するためのキット。
(a)インターカレーター
(b)配列番号1または配列番号2より選ばれる14塩基以上30塩基以下の連続した塩基配列のオリゴヌクレオチドを有し、該オリゴヌクレオチドがインターカレーターからの蛍光エネルギーを吸収し自ら蛍光を発することができる1個又は複数の蛍光物質で標識されたピロリ菌の存在および/またはピロリ菌の抗生物質耐性の存在を検出するための標識プローブ
(c)Tm値が70℃以上90℃以下であり配列番号3より選ばれる20塩基以上35塩基以下の連続した塩基配列を含むプライマーと、Tm値が70℃以上90℃以下であり配列番号4より選ばれる20塩基以上35塩基以下の連続した塩基配列を含むプライマー - (b)の標識プローブと二重鎖核酸構造を形成しうる伸長産物を生成せしめる側のプライマーの濃度が、他方のプライマーの濃度に対して4倍以上であることを特徴とする請求項16に記載のキット。
- さらに、
(d)100塩基/秒以上のDNA合成速度を有するDNAポリメラーゼ
を含むことを特徴とする請求項16または17に記載のキット。 - DNAポリメラーゼが、さらに5’エキソヌクレアーゼ活性を持たないことを特徴とする請求項18に記載のキット。
- DNAポリメラーゼが、KOD DNAポリメラーゼ(Thermococcus kodakaraensis KOD1由来)またはその変異体であることを特徴とする請求項18または19に記載のキット。
- インターカレーターが、SYBR Green I(商標)、LC Green I(商標)、LC Green Plus(商標)、または[2-[N-[(3-dimethylaminopropyl)-N- propylamino]-4-[2,3-dihydro-3-methyl-(benzo-1,3-thiazol-2-yl)-methylidene]-1-phenyl-qunolinium]のうちのいずれかであり、標識プローブの蛍光物質がTexas Red(商標)であることを特徴とする請求項16〜20のいずれかに記載のキット。
- 標識プローブの中央部に、ピロリ菌の23S rRNA遺伝子の第2142位または第2143位に相当する部位が位置することを特徴とする請求項16〜21に記載のキット。
- 配列番号1または配列番号2より選ばれる14塩基以上30塩基以下の長さのオリゴヌクレオチドを有し、2個の蛍光物質で標識されたピロリ菌の存在および/またはピロリ菌の抗生物質耐性の存在を検出するための標識プローブ。
- 蛍光物質が、Texas Red(商標)であることを特徴とする請求項23に記載の標識プローブ。
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