JP2003500001A - 核酸の蛍光定量的検出システム - Google Patents
核酸の蛍光定量的検出システムInfo
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Abstract
Description
標的ポリヌクレオチドを検出する方法、およびこれらの方法において利用するプ
ローブとキットを提供する。この方法は多型性または対立遺伝子変異の同定に特
に適切であり、よって診断法で使用され得る。
世代PCRサーマルサイクリング装置で利用可能な、鎖特異的および一般的なD
NAインターカレーター技術の両方を含む。
挿入色素を利用する。増幅中のDNA濃度の上昇による蛍光増強は、反応の進行
を測定するのに、および標的分子のコピー数を決定するのに利用できる。さらに
、制御された温度変化に伴う蛍光をモニターすることにより、例えばPCRサー
マルサイクリングの終了時点で、DNA解曲線が作成できる。
らの過程は(以下で考察するいくつかの他の既知アッセイ法と比較して)時間的
不利益を最小限にしてモニターすることができる。各反応の同じ時点で、単一の
蛍光読み取り値が取得される。最終時点の融解曲線解析は、アンプリコンから人
為的副産物を識別するのに、およびアンプリコンを識別するのに利用され得る。
アガロースゲル電気泳動では可視化できない濃度についても、産物の融解ピーク
を決定することができる。
を要する既存のハードウェアで融解実験をゆっくりと実施しなくてはならない。
しかし、蛍光増幅を連続的にモニターすることにより、融解とハイブリダイゼー
ションのヒステリシスの三次元像を作成することが可能となる。この三次元像は
アンプリコン依存的であり、産物の識別に十分な情報を提供し得る。
強力な手段であることが見出された。アンプリコンの融解温度を決定することに
より、後のPCRサイクルでの変性温度をこの温度まで下げることが可能である
。標的DNAよりもむしろ第一の反応産物からの増幅を最適化することで、後の
サイクルで生じる人為的副産物の形成が減少する。プライマーオリゴヌクレオチ
ドとその相補鎖の融解温度はそれらのアニール温度を決定するのに利用され、経
験的な最適化の必要性を減少させる。
異的な検出が必要とされる場合はそれほど有効ではない。
用する。これらの方法は、検出の基本として、蛍光エネルギー移動(FET)を
利用することが多い。一つあるいはそれ以上の核酸プローブを蛍光分子で標識す
るが、そのうちの一つはエネルギー供与体として働くことができ、もう一方はエ
ネルギー受容体分子である。これらは時として、それぞれレポーター分子および
クエンチャー分子として知られる。供与体分子は励起スペクトラム範囲の光の特
異的波長で励起され、引き続いて蛍光放出波長の範囲で光を放出する。受容体分
子も、様々な距離依存性エネルギー移動メカニズムにより、供与体分子からエネ
ルギーを受け取ることにより、この波長で励起される。起こり得る蛍光エネルギ
ー移動の特別の例には、蛍光共鳴エネルギー移動または「FRET」がある。一
般に、受容体分子と供与体分子が近接している時に(例えば、同じまたは隣接す
る分子上)、受容体分子は供与体分子の放出エネルギーを受け取る。蛍光エネル
ギー移動検出の基本は、供与体と受容体放出波長における変化をモニターするこ
とである。
体から供与体を分離するために核酸プローブの加水分解を用いるものと、供与体
と受容体分子の空間的関係を変化させるためにハイブリダイゼーションを利用す
るものである。
る。これらは、供与体および受容体分子で標識されたDNAオリゴヌクレオチド
からなる。このプローブは、PCR産物の一方の鎖の特異的領域に結合するよう
設計される。PCRプライマーがこの鎖にアニールした後、Taq酵素が5’か
ら3’へのポリメラーゼ活性によりDNAを伸長する。TaqMan(登録商標
)プローブは、Taq伸長の開始を防ぐために、3’末端がリン酸化で保護され
ている。もしTaqMan(登録商標)プローブが産物の鎖にハイブリダイズし
ているのならば、伸長するTaq分子がプローブを加水分解し、検出の基本とし
て受容体から供与体を遊離する。この場合のシグナルは累積的であり、遊離の供
与体と受容体分子の濃度は増幅反応の各サイクルで上昇する。
の方法に伴う時間的不利益が存在することを意味する。さらに、プローブの存在
がPCR過程の円滑な操作を妨げることもあり得る。
要な場合、加水分解が非特異的になり得ることが見出された。こうした場合、プ
ローブの非特異的な加水分解は不適切に上昇したシグナルを生じてしまう。
er(登録商標)およびLightCycler(登録商標)のような、ラピッ
ドホットエアサーマルサイクラーの開発でより主要となってきた迅速PCR法と
はうまく適合しないことを意味する。他の迅速PCR装置は、例えば同時係属英
国特許出願第9625224.0号および9716052.7号に記述されてい
る。従来のサーマルサイクリングと比較しての迅速サイクリングの利点は、他の
所で報告されている。そのような技術は、例えば、生命の危機または重篤な障害
が避けられるならば、結果のスピードが重要である細菌戦争の検出システムに特
に有用である。
ブの加水分解に依存するため、加水分解プローブは融解のヒステリシスに関する
重要な情報を提供しない。
ヌクレオチドからのシグナルの修飾を基にした、蛍光性標識プローブの溶解状態
でのクエンチング方法を記述している。ポリメラーゼ連鎖反応中のプローブ切断
(加水分解)に続くプローブ鎖長の減少の結果として起こるこのシグナルの差は
、標的核酸の存在を検出手段を提供することを示唆している。
分子ビーコンは、ヘアピンループを形成するような相補的な5’および3’配列
を有するオリゴヌクレオチドである。末端の蛍光標識は、ヘアピン構造が形成さ
れるためにFRETの近接にある。分子ビーコンの相補的配列へのハイブリダイ
ゼーションに続き、蛍光標識は分離され、そのためFRETは生じず、これが検
出の基本を成す。
で近接してハイブリダイズし、供与体および受容体分子を一緒に運び、そのため
FRETが生じ得る。増強されたFRETが検出の基本となる。このタイプの変
種には、標識増幅プライマーと単一の近接するプローブの利用が含まれる。
その過程に伴うコストを増やす。さらに近接して特異的に結合するに十分な長さ
の二つのプローブを知るため、この方法では合理的な長さの既知配列の存在が必
要となる。これはある診断応用で問題となり得り、例えばHIVウイルスのよう
に、有効なプローブを設計するのに使用されうる生物体で保存されている配列の
長さが比較的短い場合である。
ローブの融解によって生じるシグナルは、両方のプローブの融解作用によるもの
である。小さなミスマッチまたは一方のプローブがスプライス領域にかかって結
合する必要がある場合(例えば、イントロンの両側の配列がプローブ部位として
利用可能な場合に、サンプル中のDNAと比較してRNAを検出するため)の研
究では、もう一方のプローブが先に融解するならば、不正確な結果を生じること
になり得る。
テムについて一般的な見地から記述しており、そこでは供与体分子として挿入色
素を利用している。その過程は、増幅段階を含まない。
た。
よび該標的配列に特異的なプローブを添加し、該プローブは、該DNA二重鎖結
合剤から蛍光を吸収できるあるいはそれに蛍光エネルギーを与えることができる
反応性分子を含み、 (b)そのように作成した混合物を、標的核酸が増幅される増幅反応に供し、 (c)該サンプルを、該プローブが標的配列にハイブリダイズする条件に供し
、および(d)該サンプルからの蛍光をモニターすること からなる、サンプル中の標的核酸分子の存在を検出する方法を提供する。
型のDNAに付着するあるいはそれ自身を二重鎖型のDNAに会合させるいずれ
かの物質を意味する。これらには、当分野で周知である挿入色素が含まれる。
DNA二重鎖結合剤は鎖間にトラップされる。一般に、これにより色素に関連し
た波長での蛍光が上昇する。しかし、反応性分子が色素から蛍光を吸収できる場
合(例えば、それは受容体分子である)、それはFET、特にFRETにより色
素から放出エネルギーを受け取り、そのためその特有の波長において蛍光を放出
する。受容体分子からの蛍光の上昇は、色素での場合とは異なる波長のものであ
り、二重鎖型でのプローブの結合を示す。プローブを含む二重鎖の形成あるいは
不安定化を示す蛍光の変化は、好ましくは段階(d)でモニターされる。同様に
、反応性分子が色素に蛍光を与えることができる場合(例えば、それは供与体分
子である)、供与体分子からの放出はFRETの結果として減少し、この減少が
検出され得る。色素の蛍光は、これらの状況下では予想よりもさらに上昇する。
子である。
ことは、これらの成分が二重に標識されたプローブが必要な他のアッセイ法と比
較して非常に経済的であるという点で有利である。ただ一つのプローブを利用す
ることにより、プローブの基礎を形成するのに必要な既知の配列の長さは比較的
短くても良く、そのため困難な診断状況においてさえもこの方法は利用可能とな
る。
、この明細書の中で後に記述するように、サンプル中の標的核酸配列に関して定
量的および定性的データの両方を生成するのに利用できる。特に、本発明は定量
的増幅のために提供するだけでなく、さらにあるいは代わりに、二重鎖不安定化
温度または融解点のような特徴あるデータを得るためにも利用可能である。
イブリダイズする条件にサンプルを供す。それゆえこの過程により、検出は、最
初に全試薬を添加した一つの容器内で増幅とモニタリングが実施可能な、均一な
方法で達成される。その後の試薬の添加段階は必要としない。固体支持体の存在
下での(これは選択であるが)この方法の達成も必要とされない。
が一本鎖の形である時、標的核酸配列にハイブリダイズしうる。この場合、段階
(c)は標的核酸を一本鎖にする条件での使用を含んでよい。
有用な磁気ビーズ等のビーズの表面、あるいは表面プラズモン共鳴検出器の導波
管等の検出装置の表面に固定化するかどちらでもよい。選別は注目される特定の
アッセイおよび使用されている特定の検出手段の性質に依存しうる。
かが一本鎖になる条件にサンプルを供する段階を含みうる。このような増幅反応
はポリメラーゼ連鎖反応(PCR)あるいはリガーゼ連鎖反応(LCR)を含む
が、好ましくはPCR反応である。
ハイブリダイズすることが可能である。
らの条件を満足するように設計されてよい。したがって増幅反応のそれぞれのサ
イクルの間のいくつかの時点で、プローブは標的配列にハイブリダイズし、プロ
ーブと標的配列間でとらえられる挿入色素のようなDNA二重結合剤の間に、F
ETあるいはFRETの結果としてのシグナルを生成する。増幅が進むにつれ、
プローブは標的配列から分離し、あるいは融解しそれにより生成されるシグナル
は減少するだろう。したがって増幅のそれぞれのサイクルにおいて、反応性分子
からの蛍光ピークが生成される。ピークの強度は、より多くの標的配列がプロー
ブの結合に有用になるので増幅が進むにつれ増加するであろう。
により、増幅反応の進行が様々な方法でモニターできる。例えば、融解ピークに
よって提供されたデータは解析でき、また例えば融解ピーク下面積を計算し、こ
のデータをサイクルの番号に対してプロットすることで解析できる。
倍管電圧の形成におけるこれらからのシグナルを、データ処理装置ボードに送り
、それぞれのサンプルチューブに関連するスペクトルに変換した。多くのチュー
ブ、例えば96チューブを同時に評価することができる。データを反応の間中、
頻繁な間隔、例えば10分間ごとに1回、このように収集してよい。
ピークを形成するために、このように生成されたスペクトルを、例えば先に選択
した色素の「適合」を用いて分離できる。ピーク下面積をそれぞれのシグナルに
ついて強度値を表しているかどうかを決定でき、もし必要ならば、お互いの比率
として示すことができる。シグナルの強度および/または比の差異は、反応を通
してあるいは温度等の異なる反応条件で記録されたFRETを変化させるだろう
。上記で概要を述べたようにこの変化はプローブと標的配列間の結合事象に関連
する。異なるピーク下面積の総体はFRET効果に対する強度値を計算すること
許容するだろう。
を与えるだろう。サンプルからの蛍光の変化は、サンプルへのプローブのハイブ
リダイズの速度を計算することを許容しうる。ハイブリダイズ速度の増加はサン
プル内に存在する標的配列の量に関連するだろう。標的配列の濃度が増幅反応が
進むにつれて増加するので、プローブのハイブリダイズはさらに迅速に起こるだ
ろう。したがってこのパラメーターはまた定量化の基礎として使用できる。この
データ処理の様式は、情報を提供することがシグナル強度に依存してはいないと
きに有用である。
した。これは色素からの蛍光を測定することで提供された一般的なDNA情報を
補足するための鎖特異的測定を提供する。このように、非特異的増幅のシグナル
への寄与は区別でき、したがってこの方法は、内部チェックを提供する。
色素である。これらは従来の様式でプローブへ付着してよい。プローブに沿った
反応性分子の位置は、一般的ではあるけれども重要ではなく、それらはプローブ
の末端領域に位置しうる。
n I、SYBRGold、臭化エチジウム、YOPRO−1等のサンプルSY
BRGreenを含む。
ーブ上の挿入色素あるいは反応性分子のどちらかであってよい)供与体の蛍光放
射は、受容体(たとえば他の色素あるいは反応分子)より波長が短くなければな
らない。
を生成し、放射の波長にほとんどあるいは全く重複部がない。これらの状況下、
DNA二重結合剤シグナルから鎖特異的なピークをのぞくことが必要ではない。
(たとえば反応性分子によって提供された)鎖特異的シグナルのみの簡単な測定
は、標的反応に起因するFRETの程度に関する情報を提供するだろう。臭化エ
チジウム/フルオロセインの組み合わせはこの要求を満たすことができる。この
場合、鎖特異的反応は520nmでの蛍光の減少によって定量性であり、1/蛍
光として適切に表された。
スペクトル重複部が存在する場合、結果として、たとえばスペクトル間の関係を
経験的に決定することおよび2つのシグナルからのシグナルを標準化するために
この関係を使用することで説明されうる。
ラーゼによって加水分解されるように設計することが可能である。これは、それ
ぞれのサイクルで増加している系に存在する遊離の反応性分子の量とともに累積
シグナルを提供する。この型の累積シグナルは特に標的配列の量が定量される場
合、好ましい可能性がある。しかしながら、シグナルはプローブの解離に単に依
存しないのでこのように消費されることはプローブにとってこのアッセイで必要
ではない。
例えば急速PCRにおいて反応の速度が最も重要である場合の十分に反転可能な
シグナルを得るために、プローブを標的配列からそのままの形で放出されるよう
に設計することが好ましい。これは、例えば増幅反応の伸長段階の間であってよ
い。しかしながら、シグナルはプローブの加水分解に依存しないので、プローブ
は反応のアニーリングまたは融解相を含む増幅サイクルの間のいずれかの段階に
おいて標的配列から加水分解され融解するように設計してよい。このようなプロ
ーブは増幅反応阻害を最小限にすることを保証するであろう。
ままの形のプローブの放出が、TaqあるいはPwoのストッフル(Stoff
le)断片等の5’−3’エキソヌクレアーゼ欠損酵素を用いることで成し遂げ
られる。
ないことを保証するため、プローブの3’末端を適切にはリン酸化によってブロ
ックできる。
、増幅反応の最中あるいは終了時の受容体分子の蛍光の増加が、存在する標的配
列の量の増加を示し、増幅反応が進み、したがって標的配列がサンプル内に実際
存在するという事実を示唆する。しかしながら、上記で概要したように、定量は
また増幅反応の間中にモニターすることにより可能である。加えてDNA二重結
合剤とりわけ挿入色素からの放射をサンプル内の核酸の大量の上昇をモニターす
るために使用でき、これは反応性分子と色素シグナル間の関係によって測定され
るような鎖特異的増幅と比較できる。最終的にさらに以下で議論するであろうよ
うな配列についての情報を得るために、終了時点での測定あるいは最中の測定い
ずれかの特性化データおよびとりわけ融解点解析を得ることは可能である。
とも1つの前記標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズできるプライマー、(c
)蛍光DNA二重結合剤、および(d)前記オリゴヌクレオチド配列に結合でき
る、また前記色素からの蛍光を吸収できるオリゴヌクレオチドプローブの存在下
、標的ポリヌクレオチド上で核酸増幅を行うこと、および増幅反応の間の蛍光の
変化をモニターすることを含む、核酸増幅を検出するための方法を含む。
DNA鎖内の標的ヌクレオチド配列のみを当分野でよく理解されているように増
幅するように設計したプライマーの組を用いて適切に行われる。核酸ポリメラー
ゼは適切にはTaqポリメラーゼのような熱耐性ポリメラーゼである。
件は、含有した特定のアプリコン、使用したプライマーの特性、利用した酵素に
依存しているそれぞれの場合で可変であってよい。最適条件は当業者によってそ
れぞれの場合で決定されてよい。典型的な変性温度は95℃のオーダーであり、
典型的なアニーリング温度は55℃のオーダーであり、伸長温度は72℃のオー
ダーである。
ことができる。
前記標的配列に特異的なプローブを添加し、前記プローブは前記DNA二重結合
剤からの蛍光を吸収できあるいは前記DNA二重結合剤への蛍光エネルギーを与
えることができる反応性分子を含み、 (b)前記サンプルを、前記プローブが標的配列にハイブリダイズする条件に
供し、 (c)あるプローブのサンプルへのハイブリダイズあるいはプローブと標的核
酸配列間で形成される二本鎖の不安定化の結果としての蛍光変化をモニターとし
て、特定の反応条件、前記配列の特性を決定すること を含む、配列の特性を決定するための方法を提供する。
在に対する反応を含む。これらの特性が変化する時の蛍光の変化をモニターする
ことによって、配列の正確な性質の特性化の情報が得られる。例えば、温度の場
合、プローブが分離し、標的配列から「融解する」時の温度が決定できる。これ
は例えば遺伝子診断での対立遺伝子変異を含む配列の多形性を検出し、所望なら
定量するためにかなり有用でありうる。「多形」は転位、トランスバージョン、
挿入、とりわけ自然界で起こる可能性のある逆位配列の欠失を含む。
けで異なるであろう。したがって、サンプルが単一対立遺伝子変異体のみを含む
場合、プローブの融解の温度は他の一つの対立遺伝子変異体のみを含むサンプル
で見つかったものと異なる可能性がある。サンプルは、それぞれの対立遺伝子変
異体に対応する融解点を示す両対立遺伝子変異体を含んでいる。
の存在下で適用する。プローブは電気化学的電位が適用されてもよい固体表面上
に固定化されてよい。標的配列は、配列の正確な特性に依存した特定の電気化学
的値において、プローブと結合するかあるいはプローブから拒絶されるだろう。
き、または個々に使用してよい。かさねて反応分子は望ましくは受容体分子であ
る。
は反応性分子を含む標的ヌクレオチド配列に特異的なプローブを含むだろう。さ
らにこれらは前記反応性分子でFETあるいはFRETを行うことができるとい
う点で相容性がある挿入色素等のDNA二重結合剤を含んでよい。このキットの
他の可能性のある成分はDNAポリメラーゼ等の増幅反応に使用した試薬を含む
。
ような挿入色素(1)の作用を例示する。色素はあるレベルでDNA鎖および蛍
光に付着する。しかしながら、DNAが二本鎖(3)になった時、色素が濃縮し
、蛍光がかなり増加する。この蛍光の増加は二本鎖DNAの形成を検出するのに
使用できる。色素の蛍光はたとえばスペクトルの緑色の領域での特定の波長であ
る。
。いくつかの色素はプローブのヌクレオチドに結合し、バックグラウンドレベル
で蛍光を発することができる。しかしながら、FRETの結果、いくつかのエネ
ルギーは矢印で指し示したような受容体分子(5)へ移り、そしてこの分子はま
たたとえばスペクトルの赤色領域でのこの色素の波長とは異なる波長で蛍光を発
することができる。
色素からの蛍光エネルギーの増加がしたがってより高いレベルで蛍光を発する受
容体分子(5)へ移る。受容体分子の蛍光の増加がしたがって標的配列へのプロ
ーブのハイブリダイズを示すことができる。したがって受容体分子の蛍光の増加
を測定することで、たとえば温度減少としてハイブリダイズが起こる点を検出で
きる。同様に受容体蛍光の減少はプローブが標的配列から融解する温度における
温度低下として起こる。これはプローブと標的配列のハイブリダイズ特性に依存
して変化するだろう。たとえば、標的配列に完全に相補的なプローブは標的配列
とハイブリダイズするが一つ以上のミスマッチを含んでいるプローブとは異なっ
た温度で融解するであろう。
かを例示した。プローブ(4)は挿入色素(1)と関連して一本鎖DNAにハイ
ブリダイズでき、したがって増加した受容体シグナルを生成する(図2A)。こ
れはサイクルのアニーリング相の間で起こりうる。標的配列の量が増幅の結果と
して増加したように、シグナルはこれも増加しうる受容体分子によってアニーリ
ング相の間に生成された。
ゼによって標的配列から排除される。この点で、色素(1)からのシグナルが増
強され、標的配列の量の増加を再表示するとはいえ受容体シグナルが減少する。
する標的配列の量を定量できる。
House、6 The Business Centre、 Harvar
d Way、Kimbolton、Cambridge、PE18 0NJ、U
K)、Taq DNA ポリメラーゼ 0.025単位/μl、およびdNTP
’s PCR ヌクレオチド 200μM(BoehringerMannhe
im UK(Diagnostic & Biochemical) Limi
ted、 Bell Lane、Lewes、East Sussex、BN7 1LG、UK)。それぞれ1μMの外注オリゴヌクレオチドプライマー(Cr
uachem Ltd、 Todd Campus、West of Sco
tland Science Park、 Acre Road、 Glasg
ow G20 OUA、 UK)。プラスミドDNAを最終濃度10fg/μl
(〜3000コピー)で加えた。陰性対照実験において、同様のPCRをプラス
ミドDNAが存在しない状態で行った。
AGATCAGCC)およびリバースYPP229R(dGGTCAGAAAT
GAGTATGGATCCCAGGATAT)プライマーがペスト菌(Yers
inia pestis)の抗凝固酵素遺伝子の104bpアンプリコンを選択
した。これはファージミド構築物pYP100MLを形成するためにすでにpB
luescript SK ベクター(Stratagene Europe、 Hogehilweg 15、1101 CB Amersterdam、
Zuidoost、The Netherlands)内にクローン化されてい
る。
ATCCTGG、 Bio/Gene、 Bio/Gene House、 6 The Business Centre、 Harvard Way、 K
imbolton、Cambridge、 PE18、0NJ、 UK)を0.
2Mの最終濃度に添加した。SyberGold DYE(Molecular
Probes)を参照濃度の1:400,000の最終濃度で加えた。
ightcycler (Bio/Gene、Bio Gene House、
6 The Business Centre、 Harvard Way、
Kimbolton、 Cambridge、 PE18 0NJ、 UK)に
て温度循環させた。サイクルは95℃で1秒間、55℃で1秒間、74℃で1秒
間であった。
。反応をLightCyclerTMを用いて光学的に調べ、520&670n
mでの蛍光放射を記録した。
ロットした結果を図3にしめす。520nmにおいてSyberGoldからの
蛍光のみが記録された。明らかなピークが、PCR反応にて増幅された特定の産
物の融解温度と関連した。陰性対照は人工物のみを示した。
からのシグナルの両方が記録された。特定増幅産物のピーク表示が陽性実験で観
察されたが、人工物のみを再び示している陰性対照ではみられなかった。しかし
ながら、この場合においてさらに、プローブの融解による明らかなピークが陽性
実験で確認された。
CTGGGA3’ 相同物:5’TCCCAGGATATATCACCTTTCAGGATAGCG
3’ ミスマッチ1:5’TCCCAGGATATATCAGCTTTCAGGATA
GCG3’ ミスマッチ2:5’TCCCAGGATATATCAGGTTTCAGGATA
GCG3’ ミスマッチ3:5’TCCCAGGATATATCTTTCAGGATAGCG
3’ (Bio/Gene Limited、Bio/Gene House、6 T
he Business Centre、 Harvard Way、 Kim
bolton、 Cambridgeshire、 PE18 0NJ) 挿入物: SYBR Green I (Molecular Probes) ハイブリダイズ緩衝液: PCRM0012 (Bio/Gene Limited、Bio/Gene
House、6 The Business Centre、 Harvard
Way、 Kimbolton、Cambridgeshire、 PE18 0NJ) 蛍光観測器: Idaho Technology LC32 (Bio/Gene Limi
ted、Bio/Gene House、6 The Business Ce
ntre、 Harvard Way、 Kimbolton、 Cambri
dge、 PE18 0NJ) 方法: 4 μl ハイブリダイズ混合液を以下からなるように作成した。 PCRMO12:製造者の規定した作用濃度 SYBR Green I :参照溶液の1/20,000濃度 プローブオリゴヌクレオチド: 100μM 標的オリゴヌクレオチド: 100μM ハイブリダイズ混合液をLightCyclerで以下の温度レジメにかけた
。20℃/秒で95℃まで熱し、20℃/秒で50℃まで冷やし、10秒間50
℃に保持し、0.1℃/秒で80℃まで熱した。蛍光を最終加熱工程中ゲインを
16にセットしたF1(520nm−580nm)、ゲインを128にセットし
たF2(650nm−690nm)の2周波でモニターした。
められた関数 F2重複=0.3232×F1+4.2853を用いてF2から
除去した。F2のSYBR Green I依存成分を標準化し、図4に示すよ
うにX軸の温度に対してY軸にプロットした。結果は標的にした配列の特性のプ
ローブ解離温度の依存を示す。標的化配列の単一塩基の相違をはっきりと区別で
きる。
Claims (34)
- 【請求項1】 (a)標的核酸配列を含むと推測されるサンプルに、DNA
二重鎖結合剤、および該標的配列に特異的なプローブを添加し、該プローブは、
該DNA二重鎖結合剤から蛍光を吸収できるあるいはそれに蛍光エネルギーを与
えることができる反応性分子を含み、 (b)そのように形成された混合物を、標的核酸が増幅される増幅反応に供し
、 (c)該サンプルを、該プローブが標的配列にハイブリダイズする条件に供し
、および (d)該サンプルからの蛍光をモニターすることからなる、サンプル中の標的
核酸配列の存在を検出する方法。 - 【請求項2】 プローブを含む二重鎖の形成および不安定化に関連した蛍光
が決定される、請求項1に記載の方法。 - 【請求項3】 反応性分子が該DNA二重鎖結合剤から蛍光を吸収すること
が可能な受容体分子である、請求項1または請求項2に記載の方法。 - 【請求項4】 DNA二重鎖結合剤が挿入色素である、先行する請求項のい
ずれかに一項に記載の方法。 - 【請求項5】 段階(c)でのプローブへの結合以前に標的核酸が一本鎖化
される、先行する請求項のいずれかに一項に記載の方法。 - 【請求項6】 増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応(PCR)である、先行す
る請求項のいずれかに一項に記載の方法。 - 【請求項7】 増幅反応の各サイクル中にプローブが標的核酸とハイブリダ
イズする、先行する請求項のいずれかに一項に記載の方法。 - 【請求項8】 増幅サイクルの伸長期以外の期中にプローブが標的核酸とハ
イブリダイズする、請求項7に記載の方法。 - 【請求項9】 サンプルからの蛍光が増幅反応を通してモニターされる、請
求項7または請求項8に記載の方法。 - 【請求項10】 生成された蛍光データが反応中の供与体および受容体分子
からの蛍光の相対的な量、またはプローブのハイブリダイゼーション率を決定す
るのに利用される、請求項9に記載の方法。 - 【請求項11】 蛍光データが、サンプル中に存在する標的核酸の量を定量
化するのに利用される、請求項7から10のいずれかに一項に記載の方法。 - 【請求項12】 色素と反応性分子の両方からの蛍光がモニターされる、先
行する請求項のいずれかに一項に記載の方法。 - 【請求項13】 反応性分子がローダミン色素、Cy5、またはフルオレセ
インである、先行する請求項のいずれかに一項に記載の方法。 - 【請求項14】 反応性分子がプローブの末端領域に付着された、先行する
請求項のいずれかに一項に記載の方法。 - 【請求項15】 プローブが増幅反応で利用されるDNAポリメラーゼによ
って加水分解されるように設計された、先行する請求項のいずれかに一項に記載
の方法。 - 【請求項16】 プローブが標的配列から完全な形のまま遊離される、請求
項1から14のいずれかに一項に記載の方法。 - 【請求項17】 増幅反応が5’−3’エキソヌクレアーゼ欠損酵素を利用
して達成される、請求項16に記載の方法。 - 【請求項18】 プローブの3’末端が伸長期におけるその伸長を阻害する
ためにブロックされている、先行する請求項のいずれかに一項に記載の方法。 - 【請求項19】 (a)核酸ポリメラーゼ、(b)該標的ポリヌクレオチド
にハイブリダイズ可能な少なくとも一つのプライマー、(c)蛍光DNA二重鎖
結合剤、および(d)該標的ポリヌクレオチド配列に結合可能で、該DNA二重
鎖結合剤から蛍光を吸収できる受容体分子を含むオリゴヌクレオチドプローブの
存在下で、標的ポリヌクレオチドで核酸増幅を実施すること、および増幅反応中
の蛍光の変化をモニターすることを含む、請求項1に記載の方法。 - 【請求項20】 増幅が一対の増幅プライマーを用いて適切に実施される、
請求項19に記載の方法。 - 【請求項21】 核酸ポリメラーゼが適切には耐熱性のポリメラーゼである
、請求項19または請求項20に記載の方法。 - 【請求項22】 さらなる段階において、ハイブリダイゼーションアッセイ
が実施され、配列に特徴的なハイブリダイゼーション条件が測定される、先行す
る請求項のいずれかに一項に記載の方法。 - 【請求項23】 条件が温度、電気化学ポテンシャル、または酵素あるいは
化学薬品との反応である、請求項22に記載の方法。 - 【請求項24】 条件が温度である、請求項23に記載の方法。
- 【請求項25】 標的配列の対立遺伝子変異または多型性を検出するのに利
用される、請求項24に記載の方法。 - 【請求項26】 ある配列の特徴を決定する方法であって、(a)該配列を
含むと推測されるサンプルに、該標的配列に特異的なプローブ、およびDNA二
重鎖結合剤を添加し、該プローブは、該DNA二重鎖結合剤から蛍光を吸収でき
るあるいはそれに蛍光エネルギーを与えることができる反応性分子を含み、 (b)該サンプルを、該プローブが標的配列にハイブリダイズする条件に供し
、および (c)プローブのサンプルへのハイブリダイゼーションまたはプローブと標的
核酸配列間に形成される二重鎖の不安定化の結果としての蛍光変化をモニターし
、特定の反応条件、該配列の特徴を決定することからなる、配列の特徴を決定す
る方法。 - 【請求項27】 該配列の反応条件の特徴が温度、電気化学ポテンシャル、
または酵素あるいは化学薬品との反応である、請求項26に記載の方法。 - 【請求項28】 条件が温度である、請求項27に記載の方法。
- 【請求項29】 多型性または変異の存在を決定するために、二つの配列か
ら得られた結果を比較する、請求項26から28のいずれかに一項に記載の方法
。 - 【請求項30】 DNA二重鎖結合剤が挿入色素である、請求項26から2
9のいずれかに一項に記載の方法。 - 【請求項31】 反応性分子を含む標的ヌクレオチド配列に特異的なプロー
ブ、および該反応性分子と適合するDNA二重鎖結合剤を含む、先行する請求項
のいずれかに一項に記載の方法に利用されるキット。 - 【請求項32】 DNA二重鎖結合剤が挿入色素である、請求項31に記載
のキット。 - 【請求項33】 増幅反応に利用される一つあるいはそれ以上の試薬をさら
に含む、請求項31または32に記載のキット。 - 【請求項34】 標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズする配列と反応性
分子を含む、先行する請求項のいずれかに一項に記載の方法に利用されるプロー
ブ。
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Cited By (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2006520913A (ja) * | 2003-03-07 | 2006-09-14 | ザ パブリック ヘルス リサーチ インスティテュート オブ ザ シティ オブ ニューヨーク,インコーポレーテッド | 光学的にデコード可能なマイクロキャリア、アレイ及び方法 |
JP2007006890A (ja) * | 2005-06-30 | 2007-01-18 | F Hoffmann La Roche Ag | 発光修飾剤並びに核酸検出、増幅および分析におけるその使用 |
JP2008306935A (ja) * | 2007-06-12 | 2008-12-25 | Toyobo Co Ltd | 核酸の迅速な検出方法 |
JP2009506759A (ja) * | 2005-09-01 | 2009-02-19 | コーベット ライフ サイエンス ピーティーワイ リミテッド | 核酸の増幅、定量化、及び同定の方法。 |
JP2009039104A (ja) * | 2007-07-13 | 2009-02-26 | Toyobo Co Ltd | 抗酸菌属細菌の検出用オリゴヌクレオチドおよびその用途 |
JP2009039105A (ja) * | 2007-07-13 | 2009-02-26 | Toyobo Co Ltd | 抗酸菌属細菌の検出用オリゴヌクレオチドおよびその用途 |
JP2009039106A (ja) * | 2007-07-13 | 2009-02-26 | Toyobo Co Ltd | 抗酸菌属細菌の菌種同定用オリゴヌクレオチドおよびその用途 |
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Families Citing this family (73)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB9425138D0 (en) | 1994-12-12 | 1995-02-08 | Dynal As | Isolation of nucleic acid |
GB9725197D0 (en) * | 1997-11-29 | 1998-01-28 | Secr Defence | Detection system |
GB9821989D0 (en) | 1998-10-08 | 1998-12-02 | Hybaid Ltd | Detection of nucleic acid polymorphism |
US6656692B2 (en) | 1999-12-21 | 2003-12-02 | Ingeneus Corporation | Parallel or antiparallel, homologous or complementary binding of nucleic acids or analogues thereof to form duplex, triplex or quadruplex complexes |
US6420115B1 (en) | 1999-12-21 | 2002-07-16 | Ingeneus Corporation | Cation mediated triplex hybridization assay |
US6403313B1 (en) * | 1999-12-21 | 2002-06-11 | Ingeneus Corporation | Fluorescent intensity assay for duplex and triplex nucleic acid hybridization solution utilizing fluorescent intercalators |
US6900300B1 (en) | 2000-09-19 | 2005-05-31 | Ingeneus Corporation | Quadruplex DNA and duplex probe systems |
US6858390B2 (en) | 1998-12-31 | 2005-02-22 | Ingeneus Corporation | Aptamers containing sequences of nucleic acid or nucleic acid analogues bound homologously, or in novel complexes |
US6197520B1 (en) * | 1999-08-13 | 2001-03-06 | University Of Utah Research Foundation | Solution-based color compensation adjusted for temperature and electronic gains |
GB9928232D0 (en) * | 1999-12-01 | 2000-01-26 | Skelton Stephen | Detection system |
US7309569B2 (en) | 1999-12-21 | 2007-12-18 | Ingeneus, Inc. | Parallel or antiparallel, homologous or complementary binding of nucleic acids or analogues thereof to form duplex, triplex or quadruplex complexes |
US6924108B2 (en) | 1999-12-21 | 2005-08-02 | Ingeneus Corporation | Nucleic acid binding enhancement by conjugation with nucleotides, nucleosides, bases and/or their analogues |
US7052844B2 (en) | 1999-12-21 | 2006-05-30 | Ingeneus, Inc. | Purification of DS-DNA using heteropolymeric capture probes and a triplex, quadruplex or homologous duplex binding mechanism |
US6927027B2 (en) | 1999-12-21 | 2005-08-09 | Ingeneus Corporation | Nucleic acid multiplex formation |
US6911536B1 (en) | 1999-12-21 | 2005-06-28 | Ingeneus Corporation | Triplex and quadruplex catalytic hybridization |
US6982147B2 (en) | 2000-01-24 | 2006-01-03 | Ingeneus Corporation | Apparatus for assaying biopolymer binding by means of multiple measurements under varied conditions |
US7220541B2 (en) | 2000-01-24 | 2007-05-22 | Ingeneus, Inc. | Homogeneous assay of biopolymer binding by means of multiple measurements under varied conditions |
US6613524B1 (en) | 2000-01-24 | 2003-09-02 | Ingeneus Corporation | Amperometric affinity assay and electrically stimulated complexes of nucleic acids |
GB0005281D0 (en) | 2000-03-07 | 2000-04-26 | Secr Defence | Analytical method |
GB2360088A (en) * | 2000-03-07 | 2001-09-12 | Secr Defence | Method and kit for determining PCR amplification reaction conditions |
US6323337B1 (en) * | 2000-05-12 | 2001-11-27 | Molecular Probes, Inc. | Quenching oligonucleotides |
CN1592792B (zh) * | 2000-05-19 | 2010-12-01 | 伊拉根生物科学公司 | 检测核酸的材料和方法 |
AU2002213175B2 (en) * | 2000-10-14 | 2007-09-13 | Luminex Corporation | Solid support assay systems and methods utilizing non-standard bases |
GB0110501D0 (en) | 2001-04-30 | 2001-06-20 | Secr Defence Brit | Amplification process |
GB0111275D0 (en) * | 2001-05-09 | 2001-06-27 | Secr Defence | Analytical method and kit |
GB0112868D0 (en) * | 2001-05-25 | 2001-07-18 | Secr Defence | Detection system |
FI114399B (fi) * | 2001-06-06 | 2004-10-15 | Biohit Oyj | Menetelmä ekstensiotuotteiden määrittämiseksi |
US9261460B2 (en) | 2002-03-12 | 2016-02-16 | Enzo Life Sciences, Inc. | Real-time nucleic acid detection processes and compositions |
CA2473376A1 (en) | 2002-01-16 | 2003-07-31 | Dynal Biotech Asa | Method for isolating nucleic acids and protein from a single sample |
KR100464084B1 (ko) * | 2002-01-17 | 2005-01-03 | (주)지노첵 | 다기능성 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응의 산물을확인하는 방법 |
WO2003062418A1 (fr) * | 2002-01-25 | 2003-07-31 | Olympus Corporation | Procede et systeme de detection de donnees relatives a un acide nucleique |
GB0205455D0 (en) * | 2002-03-07 | 2002-04-24 | Molecular Sensing Plc | Nucleic acid probes, their synthesis and use |
US7166478B2 (en) | 2002-03-12 | 2007-01-23 | Enzo Life Sciences, Inc., C/O Enzo Biochem, Inc. | Labeling reagents and labeled targets, target labeling processes and other processes for using same in nucleic acid determinations and analyses |
US9353405B2 (en) | 2002-03-12 | 2016-05-31 | Enzo Life Sciences, Inc. | Optimized real time nucleic acid detection processes |
ATE378425T1 (de) | 2002-09-02 | 2007-11-15 | Toyo Boseki | Verfahren zu identifizierung von nukleotid- polymorphismen unter verwendung von resonanzenergietransfer |
GB0223563D0 (en) * | 2002-10-10 | 2002-11-20 | Secr Defence | Detection system |
CA2501144C (en) | 2002-10-23 | 2015-10-06 | University Of Utah Research Foundation | Amplicon melting analysis with saturation dyes |
GB0229287D0 (en) * | 2002-12-16 | 2003-01-22 | Dna Res Innovations Ltd | Polyfunctional reagents |
CA2513626C (en) * | 2003-01-17 | 2013-03-19 | Eragen Biosciences, Inc. | Nucleic acid amplification using non-standard bases |
GB0304832D0 (en) | 2003-03-04 | 2003-04-09 | Secr Defence | Assay method |
CA2521127C (en) * | 2003-04-01 | 2014-05-27 | Eragen Biosciences, Inc. | Polymerase inhibitor and method of using same |
US20050142595A1 (en) * | 2003-11-07 | 2005-06-30 | U.S. Genomics, Inc. | Intercalator FRET donors or acceptors |
KR100906749B1 (ko) * | 2004-03-25 | 2009-07-09 | (주)바이오니아 | 인터컬레이팅 형광염료가 표지된 프로브를 이용한 핵산 증폭 측정 방법 |
US7387887B2 (en) * | 2004-04-20 | 2008-06-17 | University Of Utah Research Foundation | Nucleic acid melting analysis with saturation dyes |
US9657347B2 (en) | 2004-04-20 | 2017-05-23 | University of Utah Research Foundation and BioFire Defense, LLC | Nucleic acid melting analysis with saturation dyes |
EP2351766B1 (en) | 2004-10-18 | 2014-12-03 | Brandeis University | Methods for nucleic acid amplification |
GB0503172D0 (en) | 2005-02-16 | 2005-03-23 | Enigma Diagnostics Ltd | Detection method |
US7498136B2 (en) * | 2005-03-18 | 2009-03-03 | Eragen Biosciences, Inc. | Methods for detecting multiple species and subspecies of Neisseria |
EP2489746B1 (en) | 2005-06-07 | 2016-02-03 | Luminex Corporation | Methods for detection and typing of nucleic acids |
GB0517005D0 (en) * | 2005-08-19 | 2005-09-28 | Enigma Diagnostics Ltd | Analytical method and kit |
GB0603190D0 (en) * | 2006-02-16 | 2006-03-29 | Enigma Diagnostics Ltd | Detection system |
US20070264694A1 (en) * | 2006-04-07 | 2007-11-15 | Eragen Biosciences, Inc. | Use of non-standard bases and proximity effects for gene assembly and conversion of non-standard bases to standard bases during dna synthesis |
WO2008060687A2 (en) * | 2006-05-12 | 2008-05-22 | San Diego State University Research Foundation | High-throughput methods for quantifying cells in environmental and laboratory samples |
JP4557014B2 (ja) * | 2008-02-14 | 2010-10-06 | ソニー株式会社 | 核酸検出用蛍光標識オリゴヌクレオチド、及び該核酸検出用蛍光標識オリゴヌクレオチドを用いた二本鎖形成に関わる情報を得る方法 |
US9249455B2 (en) * | 2008-04-18 | 2016-02-02 | Luminex Corporation | Methods for detection and quantification of small RNA |
US20100129796A1 (en) * | 2008-11-24 | 2010-05-27 | Micah Halpern | Dye probe fluorescence resonance energy transfer genotyping |
CN102803506A (zh) | 2009-06-15 | 2012-11-28 | Bg研究有限公司 | 核酸检测 |
GB0915664D0 (en) | 2009-09-08 | 2009-10-07 | Enigma Diagnostics Ltd | Reaction method |
ES2549777T3 (es) | 2009-10-21 | 2015-11-02 | Brandeis University | Métodos para analizar secuencias de ácido nucleico monocatenario |
CN102639712A (zh) | 2009-10-23 | 2012-08-15 | 卢米耐克斯公司 | 用于提高反应特异性的具有非标准碱基的扩增引物 |
US20130029340A1 (en) * | 2010-01-15 | 2013-01-31 | Steffen Mergemeier | Method for detecting more than one target in a pcr-based approach applying an un-specific dye which is not interfering with the emission of fluorophore-labeled probes |
GB201004339D0 (en) | 2010-03-16 | 2010-04-28 | Enigma Diagnostics Ltd | Sequence detection assay |
GB201007868D0 (en) | 2010-05-11 | 2010-06-23 | Enigma Diagnostics Ltd | Sequence detection assay |
WO2011142836A2 (en) * | 2010-05-14 | 2011-11-17 | Fluidigm Corporation | Assays for the detection of genotype, mutations, and/or aneuploidy |
US9416153B2 (en) | 2011-10-11 | 2016-08-16 | Enzo Life Sciences, Inc. | Fluorescent dyes |
US8956815B2 (en) | 2012-04-18 | 2015-02-17 | Toxic Report Llc | Intercalation methods and devices |
CN105378103B (zh) * | 2012-12-27 | 2018-01-16 | 成均馆大学校产学协力团 | 利用温度敏感聚合物合成体的核酸扩增盘装置及利用其的分析方法 |
US9957393B2 (en) | 2015-03-30 | 2018-05-01 | Enzo Biochem, Inc. | Monoazo dyes with cyclic amine as fluorescence quenchers |
US10907216B2 (en) | 2016-05-06 | 2021-02-02 | Public University Corporation Nagoya City University | Prediction of hepatocellular carcinoma onset after clearance of hepatitis C virus |
KR102237237B1 (ko) * | 2017-11-28 | 2021-04-07 | 에스에프씨 주식회사 | 소광자 및 이의 용도 |
KR102246542B1 (ko) * | 2018-12-04 | 2021-04-30 | 에스에프씨 주식회사 | 소광자 및 이의 용도 |
KR102262100B1 (ko) * | 2018-12-04 | 2021-06-08 | 에스에프씨 주식회사 | 소광자 및 이의 용도 |
CN110499151A (zh) * | 2019-08-29 | 2019-11-26 | 青岛科技大学 | 一种树枝状放大的荧光信号探针及其制法和应用 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2000509608A (ja) * | 1996-06-04 | 2000-08-02 | ユニバーシティ オブ ユタ リサーチ ファウンデーション | Pcr中のハイブリダイゼーションのモニタリング |
US6287781B1 (en) * | 1998-02-19 | 2001-09-11 | The Secretary Of State For Defence In Her Britannic Majesty's Government | Method for detection of target nucleic acids using PCR |
Family Cites Families (30)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5200313A (en) * | 1983-08-05 | 1993-04-06 | Miles Inc. | Nucleic acid hybridization assay employing detectable anti-hybrid antibodies |
US4883750A (en) * | 1984-12-13 | 1989-11-28 | Applied Biosystems, Inc. | Detection of specific sequences in nucleic acids |
US4868103A (en) * | 1986-02-19 | 1989-09-19 | Enzo Biochem, Inc. | Analyte detection by means of energy transfer |
US5015570A (en) * | 1988-05-13 | 1991-05-14 | Molecular Therapeutics, Inc. | Molecular diagnosis of Alzheimer Disease |
WO1990012115A1 (en) * | 1989-03-21 | 1990-10-18 | Collaborative Research, Inc. | A dna diagnostic test using an exonuclease activity |
WO1992007093A1 (en) * | 1990-10-17 | 1992-04-30 | Jack Love | Identification and paternity determination by detecting presence or absence of multiple nucleic acid sequences |
IL100908A0 (en) * | 1991-02-22 | 1992-11-15 | Salk Inst Biotech Ind | Invertase genes and their use |
US5512463A (en) * | 1991-04-26 | 1996-04-30 | Eli Lilly And Company | Enzymatic inverse polymerase chain reaction library mutagenesis |
US5994056A (en) * | 1991-05-02 | 1999-11-30 | Roche Molecular Systems, Inc. | Homogeneous methods for nucleic acid amplification and detection |
US5849486A (en) * | 1993-11-01 | 1998-12-15 | Nanogen, Inc. | Methods for hybridization analysis utilizing electrically controlled hybridization |
US5567583A (en) * | 1991-12-16 | 1996-10-22 | Biotronics Corporation | Methods for reducing non-specific priming in DNA detection |
EP0644889A4 (en) * | 1991-12-24 | 1996-01-10 | Isis Pharmaceuticals Inc | COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATION OF -g (b) -AMYLOID. |
US5674682A (en) * | 1992-10-29 | 1997-10-07 | Thomas Jefferson University | Nucleic acid primers for detecting micrometastasis of prostate cancer |
WO1995008642A1 (en) | 1993-09-23 | 1995-03-30 | Zeneca Limited | Nucleic acid detection with energy transfer |
US5925517A (en) | 1993-11-12 | 1999-07-20 | The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. | Detectably labeled dual conformation oligonucleotide probes, assays and kits |
NO301295B1 (no) * | 1994-03-28 | 1997-10-06 | Geberit Technik Ag | Stativ med i det minste to på tvers av hverandre forlöpende hulprofilstenger |
US5491063A (en) * | 1994-09-01 | 1996-02-13 | Hoffmann-La Roche Inc. | Methods for in-solution quenching of fluorescently labeled oligonucleotide probes |
US6106777A (en) * | 1994-11-09 | 2000-08-22 | Hitachi, Ltd. | DNA analyzing method and device therefor |
US5811239A (en) * | 1996-05-13 | 1998-09-22 | Frayne Consultants | Method for single base-pair DNA sequence variation detection |
EP2369007B1 (en) * | 1996-05-29 | 2015-07-29 | Cornell Research Foundation, Inc. | Detection of nucleic acid sequence differences using coupled ligase detection and polymerase chain reactions |
AU5152798A (en) * | 1996-10-29 | 1998-05-22 | University Of Nebraska-Lincoln | Method for detecting point mutations in dna utilizing fluorescence energy transfer |
IL156002A0 (en) * | 1997-02-12 | 2003-12-23 | Eugene Y Chan | Methods and products for analyzing polymers |
US6403311B1 (en) * | 1997-02-12 | 2002-06-11 | Us Genomics | Methods of analyzing polymers using ordered label strategies |
US5830661A (en) * | 1997-02-13 | 1998-11-03 | The University Of Connecticut | Diagnosis and treatment of glaucoma |
GB9725197D0 (en) * | 1997-11-29 | 1998-01-28 | Secr Defence | Detection system |
US7163790B2 (en) * | 2001-11-28 | 2007-01-16 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Parallel polymorphism scoring by amplification and error correction |
WO2004031408A1 (en) * | 2002-09-30 | 2004-04-15 | F.Hoffmann-La Roche Ag | Oligonucleotides for genotyping thymidylate synthase gene |
US7354706B2 (en) * | 2003-09-09 | 2008-04-08 | The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate | Use of photopolymerization for amplification and detection of a molecular recognition event |
EP1694869A2 (en) * | 2003-11-10 | 2006-08-30 | Investigen, Inc. | Methods of preparing nucleic acid for detection |
CA2735250A1 (en) * | 2008-07-30 | 2010-02-04 | Nippon Steel Kankyo Engineering Co., Ltd. | Universal nucleic acid probe set and method for utilization thereof |
-
1997
- 1997-11-29 GB GBGB9725197.9A patent/GB9725197D0/en not_active Ceased
-
1998
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- 1998-11-27 KR KR1020007005864A patent/KR100641595B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1998-11-27 AU AU13425/99A patent/AU743543B2/en not_active Ceased
-
2004
- 2004-10-06 US US10/958,377 patent/US20050112647A1/en not_active Abandoned
-
2009
- 2009-04-21 JP JP2009103044A patent/JP2009195238A/ja active Pending
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2000509608A (ja) * | 1996-06-04 | 2000-08-02 | ユニバーシティ オブ ユタ リサーチ ファウンデーション | Pcr中のハイブリダイゼーションのモニタリング |
US6287781B1 (en) * | 1998-02-19 | 2001-09-11 | The Secretary Of State For Defence In Her Britannic Majesty's Government | Method for detection of target nucleic acids using PCR |
Cited By (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2006520913A (ja) * | 2003-03-07 | 2006-09-14 | ザ パブリック ヘルス リサーチ インスティテュート オブ ザ シティ オブ ニューヨーク,インコーポレーテッド | 光学的にデコード可能なマイクロキャリア、アレイ及び方法 |
JP4646904B2 (ja) * | 2003-03-07 | 2011-03-09 | ユニバーシティー、オブ、メディシン、アンド、デンティストリー、オブ、ニュージャージー | 光学的にデコード可能なマイクロキャリア、アレイ及び方法 |
JP2007006890A (ja) * | 2005-06-30 | 2007-01-18 | F Hoffmann La Roche Ag | 発光修飾剤並びに核酸検出、増幅および分析におけるその使用 |
JP2010162027A (ja) * | 2005-06-30 | 2010-07-29 | F Hoffmann La Roche Ag | 発光修飾剤並びに核酸検出、増幅および分析におけるその使用 |
JP4634340B2 (ja) * | 2005-06-30 | 2011-02-16 | エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲー | 発光修飾剤並びに核酸検出、増幅および分析におけるその使用 |
JP2009506759A (ja) * | 2005-09-01 | 2009-02-19 | コーベット ライフ サイエンス ピーティーワイ リミテッド | 核酸の増幅、定量化、及び同定の方法。 |
JP2008306935A (ja) * | 2007-06-12 | 2008-12-25 | Toyobo Co Ltd | 核酸の迅速な検出方法 |
JP2009039104A (ja) * | 2007-07-13 | 2009-02-26 | Toyobo Co Ltd | 抗酸菌属細菌の検出用オリゴヌクレオチドおよびその用途 |
JP2009039105A (ja) * | 2007-07-13 | 2009-02-26 | Toyobo Co Ltd | 抗酸菌属細菌の検出用オリゴヌクレオチドおよびその用途 |
JP2009039106A (ja) * | 2007-07-13 | 2009-02-26 | Toyobo Co Ltd | 抗酸菌属細菌の菌種同定用オリゴヌクレオチドおよびその用途 |
JP2009039103A (ja) * | 2007-07-13 | 2009-02-26 | Toyobo Co Ltd | 抗酸菌属細菌の検出用オリゴヌクレオチドおよびその用途 |
JP2013208115A (ja) * | 2007-07-13 | 2013-10-10 | Toyobo Co Ltd | 抗酸菌属細菌の検出用オリゴヌクレオチドおよびその用途 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
GB9825924D0 (en) | 1999-01-20 |
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GB2333359A (en) | 1999-07-21 |
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