ES2232972T3 - Sistema fluorimetrico de deteccion de un acido nucleico. - Google Patents
Sistema fluorimetrico de deteccion de un acido nucleico.Info
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Abstract
Un método para detectar la presencia de una secuencia de ácido nucleico diana en una muestra, comprendiendo dicho método: (a) añadir a una muestra sospechosa de contener dicha secuencia de ácido nucleico diana, un agente de unión a ADN bicatenario, y una sonda específica para dicha secuencia diana, comprendiendo dicha sonda una molécula reactiva capaz de absorber fluorescencia de, o donar energía de fluorescencia a, dicho agente de unión a ADN bicatenario, (b) someter la mezcla formada de este modo a una reacción de amplificación, en la que el ácido nucleico diana es amplificado, (c) someter dicha muestra a unas condiciones bajo las cuales dicha sonda se hibrida con la secuencia diana, (d) seguir la fluorescencia de dicha muestra, y en el que dicha sonda es liberada intacta de la secuencia diana.
Description
Sistema fluorimétrico de detección de un ácido
nucleico.
La presente invención proporciona un método para
detectar un polinucleótido diana en una muestra, por ejemplo
siguiendo cuantitativamente una reacción de amplificación. El método
es particularmente adecuado para la detección de polimorfismos o una
variación alélica, y de este modo puede usarse en métodos
diagnósticos.
Las técnicas de seguimiento conocidas de reacción
en cadena de la polimerasa (PCR) con fluorescencia incluyen técnicas
de intercalantes de ADN tanto específicos de cadena como genéricos
que pueden usarse en unos pocos dispositivos de termociclado de PCR
de segunda generación.
Los métodos genéricos utilizan colorantes
intercalantes de ADN que muestran una fluorescencia aumentada cuando
se unen a especies de ADN bicatenario. El aumento de fluorescencia
debido a una subida de la concentración de ADN durante las
amplificaciones puede usarse para medir el progreso de la reacción,
y para determinar el número de copias de la molécula diana. Además,
siguiendo la fluorescencia a lo largo de un cambio controlado de la
temperatura, pueden generarse curvas de desnaturalización de ADN,
por ejemplo, al final del termociclado de la PCR.
Cuando se usan métodos genéricos de ADN para
seguir la subida de la concentración de ácidos nucleicos, estos
procedimientos pueden seguirse con una penalización de tiempo mínima
(comparados con algunos otros análisis conocidos discutidos más
adelante). Puede tomarse una única lectura de fluorescencia en el
mismo punto en cada reacción. Puede usarse un análisis de punto
final de la curva de desnaturalización para discriminar artefactos
de amplicones, y para discriminar amplicones. Los picos de
desnaturalización de los productos pueden determinarse para
concentraciones que no pueden visualizarse mediante electroforesis
en gel de agarosa.
Para obtener datos de desnaturalización de alta
resolución, por ejemplo para múltiples muestras, el experimento de
desnaturalización debe llevarse a cabo lentamente en el
hardware existente, tardando hasta cinco minutos. Sin
embargo, puede producirse una imagen 3D de la histéresis de la
desnaturalización y la hibridación siguiendo continuamente la
amplificación con fluorescencia. Esta imagen 3D depende del amplicón
y puede proporcionar información suficiente para la discriminación
del producto.
Se ha encontrado que el análisis de la curva de
desnaturalización de ADN es en general una herramienta potente para
optimizar el termociclado de la PCR. Determinando las temperaturas
de desnaturalización de los amplicones, es posible reducir las
temperaturas de desnaturalización en ciclos de PCR posteriores a
esta temperatura. La optimización de la amplificación a partir de
los productos de reacción de la primera generación y no a partir del
ADN diana, reduce la formación de artefactos que se pueden producir
en ciclos posteriores. Las temperaturas de desnaturalización de los
oligonucleótidos cebadores y sus regiones complementarias pueden
usarse para determinar sus temperaturas de hibridación, reduciendo
la necesidad de una optimización empírica.
Sin embargo, los métodos intercalantes genéricos
son sólo cuasi-específicos de cadena y por lo tanto no son
muy útiles cuando se requiere una detección específica de
cadena.
Los métodos específicos de cadena utilizan
componentes de ácidos nucleicos adicionales para seguir el progreso
de las reacciones de amplificación. Estos métodos usan a menudo la
transferencia de energía de fluorescencia (FET) como la base de
detección. Una o más sondas de ácidos nucleicos se marcan con
moléculas fluorescentes, una de las cuales es capaz de actuar como
donador de energía y la otra es una molécula aceptora de energía.
Éstas se conocen a veces como moléculas indicadoras y moléculas de
extinción, respectivamente. La molécula donadora es excitada con una
longitud de onda de luz específica, que cae dentro de su espectro de
excitación, y posteriormente emitirá luz dentro de su longitud de
onda de emisión de fluorescencia. La molécula aceptora es excitada
también a esta longitud de onda aceptando energía de la molécula
donadora mediante una variedad de mecanismos de transferencia de
energía dependientes de la distancia. Un ejemplo específico de
transferencia de energía de fluorescencia que puede producirse es la
transferencia de energía por resonancia de fluorescencia
"FRET". Generalmente, la molécula aceptora acepta la energía de
emisión de la molécula donadora cuando están muy próximas (por
ejemplo, sobre la misma molécula, o una molécula vecina). La base de
la detección de la transferencia de energía de fluorescencia es
seguir los cambios en las longitudes de onda de emisión de los
donadores y aceptores.
Hay dos tipos de sondas FET o FRET usados
comúnmente, los que usan la hidrólisis de sondas de ácidos nucleicos
para separar el donador del aceptor, y las que usan la hibridación
para alterar la relación espacial de las moléculas donadoras y
aceptoras.
Las sondas de hidrólisis están disponibles
comercialmente como sondas TaqMan^{TM}. Éstas consisten en
oligonucleótidos de ADN que están marcados con moléculas donadoras y
aceptoras. Las sondas están diseñadas para unirse a una región
específica sobre una cadena de un producto de PCR. Después de la
hibridación del cebador de PCR con esta cadena, la enzima Taq
extiende el ADN con su actividad polimerasa 5' a 3'. La enzima
Taq muestra también actividad exonucleasa 5' a 3'. Las sondas
TaqMan^{TM} están protegidas en el extremo 3' mediante
fosforilación, para impedir que inicien la extensión de la
Taq. Si la sonda TaqMan^{TM} se hibrida con la cadena del
producto, una molécula Taq que está extendiendo puede
hidrolizar también la sonda, liberando el donador del aceptor como
la base de la detección. La señal, en este caso, es acumulativa,
aumentando la concentración de las moléculas donadoras y aceptoras
libres con cada ciclo de la reacción de amplificación.
El hecho de que la generación de la señal depende
de la aparición de reacciones de hidrólisis de la sonda significa
que hay una penalización de tiempo asociada con este método. Además,
la presencia de la sonda puede interrumpir el suave funcionamiento
del procedimiento de la PCR.
Además, se ha encontrado que la hidrólisis puede
volverse inespecífica, particularmente cuando se requiere un gran
número de ciclos de amplificación, por ejemplo, más de 50 ciclos. En
estos casos, la hidrólisis inespecífica de la sonda dará como
resultado una señal excesivamente elevada.
Esto significa que tales técnicas no son muy
compatibles con métodos de PCR rápida que se están haciendo más
importantes con el desarrollo de termocicladores rápidos de aire
caliente, tales como los RapidCycler^{TM} y LightCycler^{TM}, de
Idaho Technologies Inc. Otros dispositivos de PCR rápida están
descritos, por ejemplo, en las solicitudes de patente británica
co-pendientes N^{os} 9625442.0 y 9716052.7. Se ha
informado en otras partes de las ventajas de un ciclado rápido sobre
el termociclado convencional. Tales técnicas son particularmente
útiles, por ejemplo, en sistemas de detección para la guerra
biológica, en la que la velocidad de los resultados es importante si
ha de evitarse la pérdida de vidas o lesiones graves.
Además, las sondas de hidrólisis no proporcionan
una información significativa con respecto a la histéresis de la
desnaturalización, ya que la generación de las señales depende, por
lo general, de la hidrólisis de la sonda más que de la temperatura
de desnaturalización del amplicón.
La patente de EE.UU. Nº 5.491.063 describe un
método para la extinción en disolución de sondas marcadas con
fluorescencia, que depende de la modificación de la señal de un
oligonucleótido monocatenario marcado mediante un agente de unión a
ADN. Se sugiere que la diferencia en esta señal, que se produce como
resultado de una longitud de cadena reducida de la sonda después de
la escisión de la sonda (hidrólisis) durante una reacción en cadena
de la polimerasa, proporciona un medio para detectar la presencia de
un ácido nucleico diana.
Las sondas de hibridación están disponibles en
varias formas. Las balizas moleculares son oligonucleótidos que
tienen secuencias 5' y 3' complementarias, de tal manera que forman
bucles en forma de horquilla. Los fluoróforos terminales están muy
próximos para que se produzca la FRET cuando se forma la estructura
en forma de horquilla. Después de la hibridación de las balizas
moleculares con una secuencia complementaria, los fluoróforos se
separan, de tal manera que la FRET no se produce, y esto forma la
base de la detección.
Pueden usarse también pares de oligonucleótidos
marcados. Estos se hibridan estando muy próximos sobre una cadena de
producto de PCR, llevando moléculas donadoras y aceptoras juntas, de
modo que pueda producirse la FRET. La FRET intensificada es la base
de la detección. Variantes de este tipo incluyen usar un cebador de
amplificación marcado con una sonda adyacente sencilla.
El uso de dos sondas, o un tipo de baliza
molecular de sonda que incluye dos moléculas marcadas aumenta el
coste implicado en el procedimiento. Además, este método requiere la
presencia de una secuencia conocida razonablemente larga, para que
sean conocidas dos sondas que sean lo suficientemente largas para
unirse específicamente muy próximas la una de la otra. Esto puede
ser un problema en algunas aplicaciones diagnósticas, en las que la
longitud de secuencias conservadas en un organismo que puede usarse
para diseñar una sonda eficaz, tal como el virus VIH, puede ser
relativamente corta.
Además, el uso de pares de sondas implica un
diseño experimental más complejo. Por ejemplo, una señal
proporcionada cuando la desnaturalización de una sonda, es una
función de la desnaturalización de ambas sondas. El estudio de
pequeños desapareamientos o cuando se requiere que una de las sondas
se una a través de una región de corte y empalme (por ejemplo, para
detectar ARN cuando se compara con ADN en una muestra en la que la
secuencia a ambos lados de un intrón puede utilizarse como el sitio
de la sonda), puede proporcionar resultados incorrectos si la otra
sonda se desnaturaliza en primer lugar.
La patente de EE.UU. Nº 4.868.103 describe en
términos generales, un sistema de FRET para detectar la presencia de
un analito, que utiliza un colorante intercalante como molécula
donadora. El procedimiento no implica una etapa de
amplificación.
Los solicitantes han desarrollado un sistema
específico de cadena para detectar la presencia de secuencias
particulares de ácidos nucleicos.
La invención proporciona un método para detectar
la presencia de una secuencia de ácido nucleico diana en una
muestra, comprendiendo dicho método:
(a) añadir a una muestra sospechosa de contener
dicha secuencia de ácido nucleico diana, un agente de unión a ADN
bicatenario, y una sonda específica para dicha secuencia diana,
comprendiendo dicha sonda una molécula reactiva capaz de absorber
fluorescencia de, o donar energía de fluorescencia a, dicho agente
de unión a ADN bicatenario,
(b) someter la mezcla formada de este modo a una
reacción de amplificación, en la que el ácido nucleico diana es
amplificado,
(c) someter dicha muestra a unas condiciones bajo
las cuales dicha sonda se híbrida con la secuencia diana, y
(d) seguir la fluorescencia de dicha muestra, y
liberar intacta dicha sonda de la secuencia diana.
Como se usa en la presente invención, la
expresión "agente de unión a ADN bicatenario" se refiere a
cualquier entidad que se adhiera o asocie con ADN en forma
bicatenaria. Éstas incluyen colorantes intercalantes que son bien
conocidos en la técnica.
Cuando la sonda se híbrida con la secuencia diana
en la etapa (c), el agente de unión a ADN bicatenario, tal como un
colorante intercalante, es atrapado entre las cadenas. En general,
esto aumentará la fluorescencia en la longitud de onda asociada al
colorante. Sin embargo, cuando la molécula reactiva es capaz de
absorber fluorescencia del colorante (es decir, es una molécula
aceptora), acepta energía de emisión del colorante por medio de la
FET, especialmente FRET, y de este modo emite fluorescencia en su
longitud de onda característica. El aumento de fluorescencia de la
molécula aceptora, que es de una longitud de onda diferente a la del
colorante, indicará la unión de la sonda en forma bicatenaria. De
este modo, los cambios de fluorescencia que son indicativos de la
formación o desestabilización de cadenas dobles en las que la sonda
está implicada son seguidos preferiblemente en la etapa (d).
De manera similar, cuando la molécula reactiva es
capaz de donar fluorescencia al colorante (es decir, es una molécula
donadora), la emisión de la molécula donadora se reduce como
resultado de FRET, y esta reducción puede ser detectada. La
fluorescencia del colorante aumenta más de lo que se esperaría bajo
estas circunstancias.
Preferiblemente, la molécula reactiva es una
molécula aceptora ya que las señales son más fácilmente
determinables.
El uso de un agente de unión a ADN bicatenario
tal como un colorante intercalante, y una sonda que está marcada
individualmente es ventajoso por cuanto estos componentes son mucho
más económicos que otros análisis, en los que se requieren sondas
doblemente marcadas. Usando sólo una sonda, la longitud de la
secuencia conocida necesaria para formar la base de la sonda puede
ser relativamente corta, y por lo tanto el método puede usarse
incluso en situaciones diagnósticas difíciles.
Además, el método de la invención es
extremadamente versátil en sus aplicaciones. El método puede usarse
para generar datos tanto cuantitativos como cualitativos por lo que
se refiere a la secuencia de ácido nucleico diana en la muestra,
como se discute con más detalle más adelante. En particular, la
invención no sólo proporciona una amplificación cuantitativa, sino
que también puede usarse, adicional o alternativamente, para obtener
datos de caracterización, tales como temperaturas de
desestabilización de la doble cadena o temperaturas de
desnaturalización.
En el método de la invención, la muestra puede
someterse a condiciones bajo las cuales la sonda se híbrida con las
muestras durante o después de completarse la reacción de
amplificación. Por lo tanto, el procedimiento permite que la
detección se lleve a cabo de una manera homogénea, por cuanto la
amplificación y el seguimiento pueden llevarse a cabo en un único
recipiente, con todos los reactivos añadidos inicialmente. No se
requieren etapas posteriores de adición de reactivos. Tampoco hay
ninguna necesidad de efectuar el método en presencia de soportes
sólidos (aunque es una opción).
La sonda puede comprender una molécula de ácido
nucleico, tal como ADN o ARN, que se hibridará con la secuencia de
ácido nucleico diana cuando esta última esté en forma monocatenaria.
En este caso, la etapa (c) implicará el uso de condiciones que
volverán el ácido nucleico diana monocatenario.
La sonda puede estar libre en disolución o
inmovilizada sobre un soporte sólido, por ejemplo en la superficie
de una microesfera tal como una microesfera magnética, útil para la
separación de productos, o en la superficie de un dispositivo
detector, tal como la guía de ondas de un detector de resonancia de
plasmones superficiales. La selección dependerá de la naturaleza del
análisis particular que se está considerando, y de los medios de
detección particulares que se están empleando.
En particular, la reacción de amplificación usada
implicará una etapa de someter la muestra a condiciones bajo las
cuales cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos diana
presentes en la muestra se conviertan en monocatenarias. Tales
reacciones de amplificación incluyen la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) o la reacción en cadena de la ligasa (LCR), pero es
preferiblemente una reacción de PCR.
Es posible entonces que la sonda se hibride
durante el curso de la reacción de amplificación, con tal de que
encuentre condiciones apropiadas de hibridación.
En una realización preferida, la sonda puede
diseñarse de tal manera que se cumplan estas condiciones durante
cada ciclo de la reacción de amplificación. De este modo, en algún
punto durante cada ciclo de la reacción de amplificación, la sonda
se hibridará con la secuencia diana, y generará una señal como
resultado de la FET o FRET entre ella y el agente de unión a ADN
bicatenario, tal como el colorante intercalante atrapado entre la
sonda y la secuencia diana. Cuando la amplificación continúa, la
sonda se separará o desnaturalizará de la secuencia diana, y de este
modo la señal generada por ella se reducirá. Por lo tanto, en cada
ciclo de la amplificación, se genera un pico de fluorescencia de la
molécula reactiva. La intensidad del pico aumentará cuando la
amplificación continúa, debido a que más secuencias diana están
disponibles para unirse a la sonda.
Siguiendo la fluorescencia de la molécula
reactiva de la muestra durante cada ciclo, puede seguirse de varios
modos el progreso de la reacción de amplificación. Por ejemplo,
pueden analizarse los datos proporcionados por los picos de
desnaturalización, calculando por ejemplo el área bajo los puntos de
desnaturalización, y representando estos datos frente al número de
ciclos.
Por ejemplo, la fluorescencia se sigue
adecuadamente usando un fluorímetro conocido. Las señales de éstos,
por ejemplo en forma de voltajes de un fotomultiplicador, se envían
a un procesador de datos y se convierten en un espectro asociado con
cada tubo de muestra. Pueden evaluarse múltiples tubos, por ejemplo
96 tubos, al mismo tiempo. Los datos pueden recogerse de este modo a
intervalos frecuentes, por ejemplo, una vez cada 10 ms, durante toda
la reacción.
Los espectros generados de este modo pueden
resolverse, por ejemplo, usando "ajustes" de colorantes
preseleccionados, para formar picos representativos de cada resto
productor de señales (es decir, colorante y/o molécula reactiva).
Pueden determinarse las áreas bajo los picos, lo que representa el
valor de intensidad para cada señal, y si se requiere, expresadas
como cocientes unas de otras. El diferencial de las intensidades de
la señal y/o relaciones permitirá que se registren los cambios en la
FRET a través de la reacción o en diferentes condiciones de
reacción, tal como temperaturas. Los cambios, como se ha esbozado
anteriormente, están relacionados con el fenómeno de unión entre la
sonda y la secuencia diana. La integral del área bajo los picos
diferenciales permitirá que se calculen los valores de intensidad de
los efectos de la FRET.
Estos datos proporcionan la oportunidad de
cuantificar la cantidad de ácido nucleico diana presente en la
muestra.
Además, la cinética de la hibridación de la sonda
permitirá la determinación, en términos absolutos, de la
concentración de la secuencia diana. Los cambios de fluorescencia de
la muestra pueden permitir calcular la velocidad de hibridación de
la sonda con la muestra. Un aumento de la velocidad de hibridación
estará relacionado con la cantidad de secuencia diana presente en la
muestra. Como la concentración de la secuencia diana aumenta cuando
continúa la reacción de amplificación, la hibridación de la sonda se
producirá más rápidamente. De este modo, también puede usarse este
parámetro como base para la cuantificación. Este modo de
procesamiento de datos es útil por cuanto no depende de la
intensidad de la señal para proporcionar la información.
Preferiblemente, se siguen la fluorescencia de
tanto el colorante como de la molécula reactiva, y se calcula la
relación entre las emisiones. Esto proporciona una medición
específica de cadena para complementar la información genérica de
ADN proporcionada midiendo la fluorescencia del colorante. De este
modo, puede distinguirse la contribución a la señal de una
amplificación inespecífica, y de este modo el método proporciona una
comprobación interna.
Las moléculas reactivas adecuadas son colorantes
de rodamina u otros colorantes tales como Cy5 o fluoresceína. Éstos
pueden unirse a la sonda de una manera convencional. La posición de
la molécula reactiva a lo largo de la sonda es irrelevante, aunque
en general, estarán situadas en una región extrema de la sonda.
Los colorantes intercalantes son bien conocidos
en la técnica. Incluyen, por ejemplo, SYBRGreen tal como SYBRGreen
I, SYBRGold, bromuro de etidio y YOPRO-1.
Para que se produzca la FET, tal como FRET, entre
la molécula reactiva y el colorante, la emisión fluorescente del
donador (que puede ser el colorante intercalante o la molécula
reactiva sobre la sonda) debe ser de una longitud de onda más corta
que la del aceptor (es decir, el otro del colorante o la molécula
reactiva).
Las combinaciones adecuadas se exponen por lo
tanto en la siguiente tabla:
| Colorante | Aceptor/Donador | Molécula reactiva | Aceptor/Donador |
| SYBRGold | Donador | Rodamina | Aceptor |
| SYBRGreen I | Donador | Rodamina | Aceptor |
| SYBRGold | Donador | Cy5 | Aceptor |
| SYBRGreen I | Donador | Cy5 | Aceptor |
| Bromuro de etidio | Aceptor | Fluoresceína | Donador |
Preferiblemente, las moléculas usadas como
donador y/o aceptor producen picos marcados, y hay poco o ningún
solapamiento en las longitudes de onda de la emisión. Bajo estas
circunstancias, puede no ser necesario resolver el pico específico
de cadena de la señal del agente de unión a ADN bicatenario. Una
simple medición de la señal específica de cadena sola (es decir, la
proporcionada por la molécula reactiva), proporcionará información
con respecto a la extensión de FRET causada por la reacción diana.
La combinación de bromuro de etidio/fluoresceína puede satisfacer
este requisito. En ese caso, la reacción específica de cadena será
cuantificable por la reducción de fluorescencia a 520 nm, expresada
adecuadamente como 1/fluorescencia.
Sin embargo, cuando hay un solapamiento espectral
en las señales fluorescentes de las moléculas donadoras y aceptoras,
esto puede explicarse en los resultados, por ejemplo determinando
empíricamente la relación entre los espectros, y usando esta
relación para normalizar las señales a partir de las dos
señales.
Para lograr una señal completamente reversible,
que esté relacionada directamente con la cantidad de producto de
amplificación presente en cada etapa de la reacción, y/o cuando la
velocidad de la reacción sea de la mayor importancia, por ejemplo en
PCR rápida, la sonda se libera intacta de la secuencia diana. Esto
puede ser, por ejemplo, durante la fase de extensión de la reacción
de amplificación. Sin embargo, ya que la señal no depende de la
hidrólisis de la sonda, la sonda puede diseñarse para hibridarse y
desnaturalizarse de la secuencia diana en cualquier etapa durante el
ciclo de amplificación, incluyendo la fase de hibridación o
desnaturalización de la reacción. Tales sondas asegurarán que se
reduzcan al mínimo las interferencias con la reacción de
amplificación.
Cuando se usan sondas que se unen durante la fase
de extensión, puede lograrse que se liberen intactas de la secuencia
diana usando una enzima que carezca de actividad
5'-3' exonucleasa, tal como el fragmento de Stoffle
de Taq o Pwo.
Para asegurar que la sonda no se extienda durante
la fase de extensión de esta, o es más, de cualquiera de las
reacciones de amplificación, el extremo 3' de la sonda puede
bloquearse, adecuadamente mediante fosforilación.
La sonda puede tomar parte luego de nuevo en la
reacción, y de este modo representa una aplicación económica de la
sonda.
Los datos generados de este modo pueden
interpretarse de diferentes maneras. En su forma más simple, un
aumento de la fluorescencia de la molécula aceptora en el curso de,
o al final de la reacción de amplificación, es indicativo de un
aumento de la cantidad de la secuencia diana presente, que sugiere
el hecho de que la reacción de amplificación ha procedido, y por lo
tanto la secuencia diana estaba de hecho presente en la muestra. Sin
embargo, como se ha esbozado anteriormente, la cuantificación es
posible también siguiendo toda la reacción de amplificación. Además,
las emisiones del agente de unión a ADN bicatenario, en particular
el colorante intercalante, pueden usarse para seguir el aumento de
ácido nucleico en la muestra, y éste puede compararse con la
amplificación específica de cadena, como se mide mediante la
relación entre las señales de la molécula reactiva y del colorante.
Finalmente, es posible obtener datos de caracterización, y en
particular, análisis del punto de desnaturalización, o como una
medición del punto final o desde el principio hasta el fin, para
obtener información sobre la secuencia, como se discutirá con más
detalle más adelante.
De este modo, una realización preferida de la
invención comprende un método para detectar la amplificación de
ácidos nucleicos, como se ha descrito anteriormente, que
comprende:
realizar la amplificación de ácidos nucleicos
sobre un polinucleótido diana en presencia de (a) una polimerasa de
ácidos nucleicos (b) al menos un cebador capaz de hibridar con dicho
polinucleótido diana, (c) un agente de unión a ADN bicatenario
fluorescente y (d) una sonda de oligonucleótido que es capaz de
unirse a dicha secuencia de polinucleótido diana, y que contiene una
molécula aceptora que es capaz de absorber fluorescencia de dicho
colorante; y seguir los cambios de fluorescencia durante la reacción
de amplificación.
Como se ha indicado antes, el agente de unión a
ADN bicatenario es adecuadamente un colorante intercalante. La
amplificación se lleva a cabo adecuadamente usando un par de
cebadores, que están diseñados de tal manera que sólo es amplificada
la secuencia de nucleótidos diana que está en una cadena de ADN,
como se entiende bien en la técnica. La polimerasa de ácidos
nucleicos es adecuadamente una polimerasa termoestable tal como una
polimerasa Taq.
Las condiciones adecuadas bajo las que puede
llevarse a cabo la reacción de amplificación son bien conocidas en
la técnica. Las condiciones óptimas pueden variar en cada caso,
dependiendo del amplicón particular implicado, la naturaleza de los
cebadores usados y las enzimas empleadas. Las condiciones óptimas
pueden determinarse en cada caso por la persona experta. Las
temperaturas de desnaturalización típicas son del orden de 95ºC, las
temperaturas de hibridación típicas son del orden de 55ºC, y las
temperaturas de extensión son del orden de 72ºC.
El método puede usarse en combinación con
análisis de hibridación, para determinar características de
secuencias particulares.
De este modo, en una realización preferida, el
método incluye una etapa adicional, en la que se sigue una condición
de hibridación que es característica de una secuencia. Esta etapa
adicional puede comprender, por ejemplo, someter la muestra
amplificada a condiciones bajo las cuales dicha sonda se hibride con
la secuencia diana,
seguir la fluorescencia de dicha muestra y
determinar una condición de reacción particular, característica de
dicha secuencia, con la cual la fluorescencia cambia como resultado
de la hibridación de la sonda con la muestra o la desestabilización
de la doble cadena formada entre la sonda y la secuencia de ácido
nucleico diana.
Las condiciones de reacción adecuadas incluyen
temperatura, propiedad electroquímica, o la respuesta a la presencia
de enzimas o productos químicos particulares. Siguiendo los cambios
de fluorescencia cuando estas propiedades varían, puede lograrse una
información característica de la naturaleza precisa de la secuencia.
Por ejemplo, en el caso de la temperatura, puede determinarse la
temperatura a la cual la sonda se separa o "desnaturaliza" de
la secuencia diana. Esto puede ser extremadamente útil en, por
ejemplo, la detección, o si se desea también la cuantificación, de
polimorfismos en secuencias que incluyen una variación alélica, en
una diagnosis genética. En "polimorfismo" están incluidas
transiciones, transversiones, inserciones, deleciones, o inversiones
que pueden producirse en secuencias, particularmente en la
naturaleza.
La histéresis de la desnaturalización de la sonda
será diferente si la secuencia diana varía sólo en un par de bases.
De este modo, cuando una muestra contiene sólo una única variante
alélica, la temperatura de desnaturalización de la sonda será de un
valor particular, que será diferente del encontrado en una muestra
que contenga sólo otra variante alélica. Una muestra que contenga
ambas variantes alélicas que mostrarán dos puntos de
desnaturalización que corresponden a cada una de las variantes
alélicas.
Se aplican consideraciones similares con respecto
a propiedades electroquímicas, o en presencia de ciertas enzimas o
productos químicos. La sonda puede ser inmovilizada sobre una
superficie sólida a través de la cual puede aplicarse un potencial
electroquímico. La secuencia diana se unirá a, o será rechazada de,
la sonda a valores electroquímicos particulares, dependiendo de la
naturaleza precisa de la secuencia.
Pueden prepararse equipos para usar con el método
de la invención. Estos equipos contendrán una sonda específica para
una secuencia de nucleótidos diana, que contiene una molécula
reactiva. Adicionalmente, pueden contener un agente de unión a ADN
bicatenario, tal como un colorante intercalante que sea compatible
en cuanto a ser capaz de experimentar FET o FRET con dicha molécula
reactiva. Otros componentes potenciales del equipo incluyen
reactivos usados en reacciones de amplificación, tales como ADN
polimerasa.
La invención se describirá ahora particularmente
a modo de ejemplo, con referencia a los diagramas adjuntos, en los
que:
La figura 1 muestra en forma de diagrama las
interacciones que se utilizan en el procedimiento de la
invención;
La figura 2 ilustra las etapas durante una
reacción de amplificación de acuerdo con la invención;
La figura 3 muestra los resultados de una
reacción de amplificación de acuerdo con la invención, y
La figura 4 muestra los resultados de un
experimento para detectar desapareamientos en secuencias.
La figura 1A ilustra la acción de un colorante
intercalante (1) que está en presencia de ADN monocatenario (2),
como se encontraría durante la fase de desnaturalización de una
reacción de PCR. El colorante se une a las cadenas de ADN y emite
fluorescencia a un cierto nivel. Sin embargo, cuando el ADN se
convierte en bicatenario (3), el colorante está concentrado y la
fluorescencia aumenta significativamente. Este aumento de
fluorescencia puede usarse para detectar la formación de ADN
bicatenario. La fluorescencia del colorante se producirá a una
longitud de onda particular, por ejemplo, en la región verde del
espectro.
El efecto del colorante intercalante (1) sobre
una sonda (4), de acuerdo con la invención, se ilustra en la figura
1C. Algo de colorante se unirá a los nucleótidos de la sonda, y
emitirá fluorescencia a nivel de fondo. Sin embargo, como resultado
de la FRET, algo de energía pasará a la molécula aceptora (5) como
se indica mediante la flecha, y de este modo esta molécula emitirá
fluorescencia también, pero a una longitud de onda diferente a la
del colorante, por ejemplo, en la región roja del espectro.
Cuando la sonda se hibrida con una secuencia
diana monocatenaria, como se ilustra en la figura 1D, cualquier
aumento de la energía de fluorescencia del colorante pasa a la
molécula aceptora (5), que de este modo emite fluorescencia a un
nivel superior. El aumento de la fluorescencia de la molécula
aceptora será indicativo de este modo de la hibridación de la sonda
con la secuencia diana. De este modo, midiendo el aumento de
fluorescencia de la molécula aceptora, por ejemplo, cuando la
temperatura disminuye, puede detectarse el punto en el que ocurre la
hibridación. De manera similar, se producirá una disminución en la
fluorescencia del aceptor, cuando la temperatura aumenta, a la
temperatura a la cual la sonda se desnaturaliza de la secuencia
diana. Esto variará dependiendo de las características de
hibridación de la sonda y de la secuencia diana. Por ejemplo, una
sonda que sea completamente complementaria con una secuencia diana
se desnaturalizará a una temperatura diferente a la de una sonda que
se hibride con la secuencia diana pero que contenga uno o más
desapareamientos.
La figura 2 ilustra cómo puede emplearse el
método de la invención en reacciones de amplificación, tales como la
reacción de PCR. La sonda (4) se hibridará con ADN monocatenario
conjuntamente con el colorante intercalante (1), y de este modo
generará una señal del aceptor aumentada (figura 2A). Esto se
producirá durante la fase de hibridación del ciclo. Como la cantidad
de secuencia diana aumenta como resultado de la amplificación, la
señal generada por la molécula aceptora durante la fase de
hibridación también aumentará.
Durante la fase de extensión, la sonda se retira
de la secuencia diana, o mediante hidrólisis o, como se ilustra,
porque es desplazada por la ADN polimerasa. En este punto, la señal
del aceptor disminuye aunque la señal del colorante (1) se
intensificará, indicativo de nuevo del aumento de la cantidad de la
secuencia diana.
Siguiendo el progreso de la reacción de
amplificación de esta manera, la cantidad de secuencia diana
presente en la muestra original puede cuantificarse.
Las mezclas para la reacción de PCR contenían los
siguientes reactivos, se prepararon concentraciones de trabajo:
1x tampón de PCR nativo (Mg^{++} 3 mM,
Bio/Gene, Bio/Gene House, 6 The Business Centre, Harvard Way,
Kimbolton, Cambridge, PE18 0NJ, UK). 0,025 unidades/\mul de ADN
polimerasa Taq, y 200 \muM de nucleótidos dNTP para PCR
(Boehringer Mannheim UK (Diagnostics & Biochemical) Limited,
Bell Lane, Lewes, East Sussex, BN7 1LG, UK). Cebadores
oligonucleótidos a medida, 1 \muM cada uno (Cruachem Ltd, Todd
Campus, West of Scotland Science Park, Acre Road, Glasgow G20 0UA,
UK). Se añadió plásmido de ADN hasta una concentración final de 10
fg/\mul (\sim3000 copias). En un experimento testigo negativo,
se llevó a cabo una PCR similar en ausencia de plásmido de ADN.
Los cebadores directos YPPA155
(dATGACGCAGAAACAGGAAGAAAGATCAGCC) e inversos YPP229R
(dGGTCAGAAATGAGTATGGATCCCAGGATAT) seleccionan un amplicón de 104 pares de bases del gen de la anticoagulasa de Yersinia pestis. Éste ha sido clonado previamente en un vector pBluescript SK (Stratagene Europe, Hogehilweg 15, 1101 CB Amersterdam, Zuidoost, Holanda), para formar el constructo de fagómido pYP100ML.
(dGGTCAGAAATGAGTATGGATCCCAGGATAT) seleccionan un amplicón de 104 pares de bases del gen de la anticoagulasa de Yersinia pestis. Éste ha sido clonado previamente en un vector pBluescript SK (Stratagene Europe, Hogehilweg 15, 1101 CB Amersterdam, Zuidoost, Holanda), para formar el constructo de fagómido pYP100ML.
Se añadió la sonda fluorescente (5'
(Cy5)CGCTATCCTGAAAGGTGATATATCCTGG, Bio/Gene, Bio/Gene House,
6 The Business Centre, Harvard Way, Kimbolton, Cambridge, PE18 0NG,
UK) hasta una concentración final de 0,2 \muM. Se añadió SyberGold
DYE (Molecular Probes) hasta una concentración final de 1:400.000 de
la concentración de referencia.
La reacción fue ciclada térmicamente en capilares
de vidrio de material compuesto y en un Ligthcycler de Idaho
Technology (Bio/Gene, Bio/Gene House, 6 The Business Centre, Harvard
Way, Kimbolton, Cambridge, PE18 0NG, UK). El ciclo fue de 95ºC
durante 1 s, 55ºC durante 1 s, y 74ºC durante 1 s).
Después del ciclo térmico, se llevó a cabo un
experimento de desnaturalización desde 55ºC hasta 95ºC a 0,1ºC/s. Se
obtuvieron datos ópticos de la reacción usando el
LightCycler^{TM}, y se registró la emisión de fluorescencia a 520
y 670 nm.
Los resultados, expresados como una función del
diferencial de la fluorescencia (F) frente a la temperatura (T),
dF/dT, representado en el eje Y frente a la temperatura, se muestran
en la figura 3. A 520 nm, sólo se registra la fluorescencia del
SybrGold. Un claro pico asociado con la temperatura de
desnaturalización del producto específico, que ha sido amplificado
en la reacción de PCR. El testigo negativo sólo muestra
artefactos.
A 670 nm, se registran tanto la señal del aceptor
Cy5 como la señal del SybrGold. El pico indicativo del producto de
amplificación específico se observa en el experimento positivo, pero
está ausente en el testigo negativo, en el que sólo se muestran
artefactos. Sin embargo, adicionalmente en este caso, se observa en
el experimento positivo un claro pico que resulta de la
desnaturalización de la sonda.
Se usaron los siguientes materiales.
Sonda: 5'
(Cy5)CGCTATCCTGAAAGGTGATATATCCTGGGA 3'
Homólogo: 5' TCCCAGGATATATCACCTTTCAGGATAGCG
3'
Desapareamiento 1: 5'
TCCCAGGATATATCAGCTTTCAGGATAGCG 3'
Desapareamiento 2: 5'
TCCCAGGATATATCAGGTTTCAGGATAGCG 3'
Desapareamiento 3: 5' TCCCAGGATATATCTTTCAGGATAGCG
3'
(Bio/Gene Limited, Bio/Gene House, 6 The Business
Centre, Harvard Way, Kimbolton, Cambridgeshire, PE18 0NG).
SYBR Green I (Molecular Probes).
Tampón de hibridación:
PCRM0012 (Bio/Gene Limited, Bio/Gene House, 6 The
Business Centre, Harvard Way, Kimbolton, Cambridgeshire, PE18
0NG).
LC 32 de Idaho Technology (Bio/Gene Limited,
Bio/Gene House, 6 The Business Centre, Harvard Way, Kimbolton,
Cambridgeshire, PE18 0NG).
Se formaron mezclas de hibridación de 4 \mul
que consistieron en lo siguiente:
PCRM012: Concentración de trabajo como ha
definido el fabricante.
SYBR Green I: Concentración de 1/20.000 de la
disolución de referencia.
Oligonucleótido de la sonda: 100 \muM.
Oligonucleótido diana: 100 \muM.
Las mezclas de hibridación se sometieron al
siguiente régimen de temperaturas en el LightCycler. Calentamiento a
95ºC a 20ºC/s, enfriamiento a 50ºC a 20ºC/s, mantenimiento a 50ºC
durante 10 s, calentamiento a 80ºC a 0,1ºC/s. Se siguió la
fluorescencia en dos canales durante la etapa final de
calentamiento, F1 (520 nm-580 nm) con la ganancia
ajustada a 16, y F2 (650 nm-690 nm) con la ganancia
ajustada a 128.
El solapamiento espectral de SYBR Green I en F2
se retiró de la fluorescencia F2 usando la siguiente relación
determinada empíricamente: solapamiento F2 = 0,3232 x F1 + 4,2853.
El componente independiente de SYBR Green I de F2 se normalizó y
representó en el eje Y frente a la temperatura en el eje X, como se
muestra en la figura 4. Los resultados muestran la dependencia de la
temperatura de disociación de la sonda de la naturaleza de la
secuencia diana. Son claramente distinguibles diferencias de una
única base en la secuencia diana.
Claims (23)
1. Un método para detectar la presencia de una
secuencia de ácido nucleico diana en una muestra, comprendiendo
dicho método:
(a) añadir a una muestra sospechosa de contener
dicha secuencia de ácido nucleico diana, un agente de unión a ADN
bicatenario, y una sonda específica para dicha secuencia diana,
comprendiendo dicha sonda una molécula reactiva capaz de absorber
fluorescencia de, o donar energía de fluorescencia a, dicho agente
de unión a ADN bicatenario,
(b) someter la mezcla formada de este modo a una
reacción de amplificación, en la que el ácido nucleico diana es
amplificado,
(c) someter dicha muestra a unas condiciones bajo
las cuales dicha sonda se hibrida con la secuencia diana,
(d) seguir la fluorescencia de dicha muestra, y
en el que dicha sonda es liberada intacta de la secuencia diana.
2. Un método conforme a la reivindicación 1, en
el que se determina la fluorescencia asociada con la formación y
desestabilización de cadenas dobles en las que la sonda está
implicada.
3. Un método conforme a la reivindicación 1 ó
reivindicación 2, en el que la molécula reactiva es una molécula
aceptora capaz de absorber fluorescencia de dicho agente de unión a
ADN bicatenario.
4. Un método conforme a una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el agente de unión a ADN
bicatenario es un colorante intercalante.
5. Un método conforme a una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el ácido nucleico diana se
vuelve monocatenario antes de la hibridación con la sonda en la
etapa (c).
6. Un método conforme a una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la reacción de amplificación
es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
7. Un método conforme a una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la sonda se hibrida con el
ácido nucleico diana durante cada ciclo de la reacción de
amplificación.
8. Un método conforme a la reivindicación 7, en
el que la sonda se hibrida con el ácido nucleico diana durante una
fase distinta a la fase de extensión del ciclo de amplificación.
9. Un método conforme a la reivindicación 7 ó
reivindicación 8, en el que se sigue la fluorescencia de la muestra
desde el principio hasta el fin de la reacción de amplificación.
10. Un método conforme a la reivindicación 9, en
el que los datos de fluorescencia generados se usan para determinar
las cantidades relativas de fluorescencia de las moléculas donadoras
y aceptoras a través de la reacción, o las velocidades de
hibridación de la sonda.
11. Un método conforme a una cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 10, en el que los datos de fluorescencia se
usan para cuantificar la cantidad de ácido nucleico diana presente
en la muestra.
12. Un método conforme a la reivindicación 4, en
el que se sigue la fluorescencia de tanto el colorante como de la
molécula reactiva.
13. Un método conforme a una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la molécula reactiva es un
colorante de rodamina, Cy5 o fluoresceína.
14. Un método conforme a una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la molécula reactiva está
unida a una región extrema de la sonda.
15. Un método conforme a una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la reacción de amplificación
se lleva a cabo usando una enzima que carece de actividad
5'-3' exonucleasa.
16. Un método conforme a una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el extremo 3' de la sonda
está bloqueado para inhibir su extensión durante la fase de
extensión.
17. Un método conforme a la reivindicación 1, que
comprende realizar la amplificación de ácidos nucleicos sobre un
polinucleótido diana en presencia de (a) una polimerasa de ácidos
nucleicos (b) al menos un cebador capaz de hibridar con dicho
polinucleótido diana, (c) un agente de unión a ADN bicatenario
fluorescente y (d) una sonda de oligonucleótido que es capaz de
unirse a dicha secuencia de polinucleótido diana, y que contiene una
molécula aceptora que es capaz de absorber fluorescencia de dicho
agente de unión a ADN bicatenario; y seguir los cambios de
fluorescencia durante la reacción de amplificación.
18. Un método conforme a la reivindicación 17, en
el que la amplificación se lleva a cabo adecuadamente usando un par
de cebadores de amplificación.
19. Un método conforme a la reivindicación 17 ó
reivindicación 18, en el que la polimerasa de ácidos nucleicos es
adecuadamente una polimerasa termoestable.
20. Un método conforme a una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que en una etapa adicional, se
lleva a cabo un análisis de hibridación, y se sigue una condición de
hibridación que es característica de la secuencia.
21. Un método conforme a la reivindicación 20, en
el que la condición es la temperatura, potencial electroquímico, o
una reacción con una enzima o producto químico.
22. Un método conforme a la reivindicación 21, en
el que la condición es la temperatura.
23. Un método conforme a la reivindicación 22,
que se usa para detectar una variación alélica o un polimorfismo en
una secuencia diana.
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