KR20240049288A

KR20240049288A - 핵산 서열의 동시다중 검출을 위한 장치 및 방법

Info

Publication number: KR20240049288A
Application number: KR1020247006787A
Authority: KR
Inventors: 프란체스코 빌라; 크리스토프 판티에르; 마엘 르 베르
Original assignee: 비포퀴르
Priority date: 2021-07-30
Filing date: 2022-07-28
Publication date: 2024-04-16
Also published as: FR3125824A1; WO2023007097A1

Abstract

핵산 서열을 동시다중 검출하기 위한 장치는, 소광자 및 형광단을 합한 형광 프로브 적어도 2개를 함유하는 시험관내 핵산 증폭 시약을 사용하여 일련의 열 주기를 수행하도록 구성되되, 상기 형광 프로브는 각각 변별적 핵산 서열을 표적화하도록 구성되고, 상기 형광단은 중첩 형광 파장 범위를 가지는 열 순환기(4), 상기 형광 파장 범위에서 상기 형광단에 의해 발광되는 방사선을 측정하도록 구성되되, 각각의 프로브에 의해 발광되는 방사선은 프로브가 비변형 상태, 즉 소광자가 형광 발광을 이동시키거나, 실질적으로 이동시키지 않거나, 아니면 소광자가 형광 발광에 역효과를 나타내는 변형 상태인지 여부에 따라 가변적인 광 센서(6), 그리고 각각의 형광 프로브에 대해 측정된 형광으로부터 유래한 타임 시그니처로부터 변형된 상태일 때의 농도를 나타내는 값을, 1개 이상의 프로브를 포함하는 반응 혼합물의 소정 열 주기에 대한 시간의 함수로서 확정하도록 구성되되, 이 프로브는 각각 전체가 실질적으로 비변형 상태 또는 변형 상태일 수 있고, 측정 적어도 2회는 열 주기중 적어도 일부의 주기 동안 수행되며, 변형 상태일 때의 농도를 나타내는 상기 값은, 상호작용하는 동안 형광 프로브가 비변형 상태로부터 변형 상태로 변경되도록 유도하기 위해, 각각이 변별적 형광 프로브와 결합된 핵산 서열 1개 이상의 존재를 정성화할 수 있도록 만드는 분석기(8)를 포함한다.

Description

핵산 서열의 동시다중 검출을 위한 장치 및 방법

본 발명은 PCR 반응 또는 기타 임의의 시험관내 핵산 증폭 방법에 의해 핵산 서열을 검출하는 분야, 특히 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 핵산 서열을 동시다중 검출하는 분야에 관한 것이다.

분자생물학 분야의 수많은 시나리오에서, 샘플중 관심 DNA 또는 RNA 서열 1개 이상의 존재가 높은 수준의 신뢰도로 확인되고, 관심 서열 세트인 것을 특징으로 하는 서열 각각의 상대적 농도가 측정될 필요가 있다.

이러한 시나리오에 있어 단일 테스트에서 동일한 샘플중 서열 여러개의 존재를 동시에 테스트할 수 있는 것에 종종 관심이 쏠린다. 이러한 필요의 이유는 긴급성, 샘플의 작은 크기, 샘플중 관심 서열의 낮은 농도 또는 테스트 비용(시약, 소모품, 자동화 시스템 점유율 등)일 수 있다.

이것 또는 이 서열이 특성규명되기에 불충분한 양으로 존재하는 경우 종래에는, 예컨대 중합효소 연쇄반응(PCR)에 의해 이 서열의 시험관내 지수적 증폭을 구현하였다. 이 방법의 목적은, 이 관심 서열에 위치하는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍의 혼합물을 사용하여 충분한 양만큼의 대상 서열을 수득하는 것이다. PCR의 여러 변법(예컨대 LATE-PCR, ASPCR)이 개발되었다. NASBA(핵산 서열 기반 증폭) 방법, TMA(전사 매개 증폭) 방법, LAMP(루프 매개 등온 증폭), SDA(가닥 치환 증폭) 및 롤링 서클 증폭(rolling circle amplification)과 같은 기타 시험관내 핵산 증폭 방법도 또한 공지되어 있다.

적용 가능할 때 관심 서열 1개 이상이 확인된 후, 관심 서열 1개 이상의 존재를 확인하기 위한 방법 다수가 이미 공지되어 있다. 전제조건 또는 표적화 서열결정을 수행하지 않고 샘플중 존재하는 핵산의 서열결정을 수행하는 것이 가능하다. 이러한 방법은 일반적으로 오래 걸리고, 비용이 많이 들며, 임의의 용도로 제한된다. 가장 많이 사용되는 방법은, 올리고뉴클레오티드 프로브의 관심 서열내 특징적인 부분에 혼성화될 수 있는 프로브를 사용하는 단계로 이루어진다. 이러한 프로브는 몇 가지 방법 계열에 따라 사용될 수 있다:

- DNA 칩: 이는 다양한 프로브를 고체 기판, 예컨대 2차원 매트릭스에 고정하고, 이 매트릭스내 자체의 좌표에 위치시키는 것으로 이루어져 있다(원리는 "DNA 마이크로어레이(DNA microarray)"라고도 칭하여짐). 이 불균일한 위상 검출은 상당한 제조 비용이 들고, 혼성화 속도가 느린데, 이 점은 감도 측면에서 성능을 저해한다.

- 액체 칩: 이는 액체 칩상에 프로브를 배열하는 것으로 이루어진다(예컨대 주소 "https://www.luminexcorp.com/xmap-technology/"의 사이트에 게시된 Luminex xMap 방법을 참조한다). 이 방법은 유동 세포형광계가 필요하기 때문에 사용하기가 복잡하고, 비드가 순차적으로 분석되므로 구현에 대한 분석이 즉각적이지 않다.

- 균일 위상 포맷: 프로브는 용액중 자유로운 단일 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 2개의 조합으로 이루어질 수 있다. 프로브는, 통상적으로 형광단 및 소광자에 의해 표지화된다. 프로브가 자체의 표적 서열을 함유하지 않는 샘플과 혼합되어 발견되고, 온도가 프로브-표적 서열 혼성화와 양립할 수 있는 온도 범위에 있을 때, 이 프로브의 형광은 소광자와 형광단의 공간적 근접성으로 말미암아 형광이 감소 또는 억제된다. 한편, 프로브가 자체의 표적 서열과 상호작용할 때, 형광단과 소광자는 거리를 유지하고, 프로브는 형광을 띠게 된다.

균일 위상 포맷은 여러 변법에 따라 사용될 수 있으며, 이러한 변법들중 가장 많이 사용되는 것은 이하에 상세하게 기재되어 있다:

- 분자 비콘: 이 변법에서 프로브는, 프로브가 혼성화되지 않고 낮은 온도에서 발견될 때, 형광단과 소광자가 즉시 근접하도록 디자인된 단일 올리고뉴클레오티드로 이루어져 있다. 이러한 근접성은, 관심 서열의 특정 서열 말단에 몇 개의 염기로 된 상보적 서열의 존재로 인해 가장 빈번히 초래된다. 용액중 이 두 상보적 말단은 이중 나선을 형성함으로써 혼성화되는데, 이 경우 혼성화는 형광단과 소광자를 서로 더 가까워지도록 이동시키고, 이것들 사이를 짧은 거리로 유지시키는 효과를 가진다. 표적 서열이 용액에 존재하고, 온도가 프로브와 자체 표적 사이에 형성된 이중체의 용융점 이하 또는 이와 가까운 온도일 때, 이 프로브의 표적 서열에서 혼성화되는 프로브는 형광을 띠게 되고,

- 5' 뉴클레아제 활성 테스트: 이 변법에서 프로브가 자체의 표적 서열에서 혼성화될 때, 이 프로브와 5' 프라이머의 혼성화는 신규 DNA 가닥의 중합을 촉발한다. 중합효소가 프로브의 5' 말단과 조우할 때, 중합효소는 5' → 3' 엑소뉴클레아제 활성으로 말미암아 프로브를 절단하는데, 이러한 5' → 3' 엑소뉴클레아제 활성은 형광단을 소광자로부터 비가역적으로 분리시키는 효과를 발휘한다. 이로써 방사선이 소광자에 의해 더 이상 흡수되지 않으므로, 형광단은 자체의 형광을 더 효과적으로 발현할 수 있다. 5' → 3' 엑소뉴클레아제 활성을 이용하는 방법의 원리는 미국 특허 제5,210,015호 및 Holland PM외 다수에 의해 저술된 간행물("Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5'----3' exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase" Proceedings of the National Academy of Sciences Aug 1991, 88(16) 7276-7280; DOI: 10.1073/pnas.88.16.7276 PNAS 1991en 1991)에 기재되어 있다. 이 방법에서, 프로브는 방사성 마커를 사용하여 5'에 표지화되었다. 이후 방법은 3'에 소광자를 첨가함과 아울러 이 마커를 형광단으로 대체함으로써 향상되었는데, 이러한 소광자의 첨가는 프로브가 용액중 자유로운지, 혼성화되는지 아니면 분해되는지 여부에 따라 프로브가 형광을 변화시킬 수 있도록 해준다(미국 특허 제5,723,591호, Taq-Man^TM 방법으로 사용 가능한 프로브).

이러한 포맷은 그 자체로서 변법들, 예컨대(이러한 방법 몇 개에서 프라이머로서도 또한 작용할 수 있는) 프로브가 사용되는 방법, 예컨대 Scorpion(등록 상표), Amplifluor(등록 상표), MGB 이클립스(MGB Eclipse, 등록 상표), 연장시 발광(Light Upon extension; LUX, 등록 상표), 미통합 증폭 신호 리포터 소광(Quenching of Unincorporated Amplification Signal Reporters; QUASR) 또는 QZyme(등록 상표)에 따라 수행될 수 있다.

균일한 위상 포맷은 프로브와 자체의 표적 서열 각각의 월등한 상호작용 속도, 저렴한 비용, 그리고 감도의 측면에서 월등한 성능을 비롯한 다수의 이점을 가지고 있다.

그러나 몇몇 측정을 동시에 수행하는 것은 동일한 테스트에서 혼합된 상이한 프로브들로부터 신호를 분리하는 능력에 의해 제한되는데, 이 점은 주요 단점이 된다. 실제로 변별적 서열들을 표적화하는 프로브들은 동일한 측정 동안 발광 파장들에 이용될 수 있도록 서로 분리될 수 있는 발광 파장들을 가져야 한다.

실제로, 어떤 변법(분자 비콘 또는 5' 뉴클레아제 활성 테스트 등)이 선택되었는지에 관계없이, 형광 채널당 1개를 초과하는 프로브를 사용하는 것은 불가능하다. 시판중인 실시간 열 순환기는 각각의 증폭 반응 주기의 채널 각각에 대한 형광 수준을 한 번에 측정한다. 따라서, 만일 샘플 형광 채널에서 발광하는 프로브 2개가 혼합되면, 매 형광 신호의 발생에 대한 이 프로브 각각의 기여도를 구별하는 것은 불가능하게 된다.

따라서, 4개의 형광 채널을 측정할 수 있는 실시간 열 순환기는 오로지 최대 4개의 프로브에 의해 발광되는 형광만을 검출하고 식별할 수 있으며, 이 장치로 수행되는 증폭 반응은 반응당 4개를 초과하는 표적 서열을 검출할 수 없다.

이러한 한계점을 극복하기 위해 몇 가지 방법이 제안된 바 있다:

- 여기 및 발광을 분리함에 의한 구별: 이 방법에서 동일한 형광 채널에서 발광하는 프로브는, 이 프로브가 별도로 여기될 수 있다는 조건으로 혼합될 수 있다. 일부 형광단은 실제로 서로 멀리 떨어져 있는 파장에서 여기될 수 있지만, 동일한 파장 대역에서 발광할 수 있다. 구체적으로 이 경우는 스톡스 오프셋(Stokes offset)이 큰 발광 형광단의 경우이다. 그러므로 세페이드(Cepheid)사는 최근 형광단 검출수를 6회에서 10회로 증가시킴으로써 자사 GeneXpert(등록 상표) 장치를 향상시켰다(Chakravorty외 다수의 논문("Detection of Isoniazid-, Fluoroquinolone-, Amikacin-, and Kanamycin-Resistant Tuberculosis in an Automated, Multiplexed 10-Color Assay Suitable for Point-of-Care Use"2017, Journal of Clinical Microbiology, 55, 183, published at the address https://doi.org/10.1128/JCM.01771-16)) 참조). 따라서, 예컨대 오렌지색 발광 대역에서 3개의 형광단이 구별될 수 있다(CF9, 파란색 범위에서 여기 가능, CF8, 녹색 범위에서 여기 가능, CF4, 노란색 범위에서 여기 가능). 이 방법은, 발광된 신호의 스펙트럼 구성을 분석할 수 있도록 만드는 광학 모듈을 필요로 한다(녹색 범위에서의 여기는 노란색, 오렌지색 및 적외선 범위에서 형광단 CF3, C8 및 CF10에 의해 각각 발광되는 신호를 발생시킴). 또한 여러 형광 대역, 즉 하나의 대역 또는 채널의 인접한 대역에서의 광학적 오염을 이용하는 방법도 또한 단점을 가진다. 이러한 광학적 오염("크로스토크(crosstalk)"라고도 공지됨)은 인접한 대역에서의 결과 분석을 방해할 수 있으며, 예컨대 위양성(false positive)과 같은 잘못된 결과의 원인이 될 수 있다.

- 용융 곡선 방법에 의한 구별: 동일한 형광 발광 범위를 공유하는 프로브들을 자체의 용융점으로 구별함으로써 이러한 프로브들을 구별하는 방법이 공지되어 있다. 이를 위해, 형광 신호 F를 기록하며 용액의 온도 T를 점진적이고 단조롭게 증가시킴으로써 관심 서열과 올리고뉴클레오티드 프로브(들) 사이에 이중체 형성이 개시된 후 용융 곡선이 생성된다. 곡선 -dF/dT의 최대치는 이중체의 용융점 Tf를 나타낸다. 이 용융점은, 형성된 이중체가 동종이중체이거나, 또는 이 온도가 동종이중체의 공지된 용융점보다 낮으면 이종이중체임을 보장하고, 심지어 이 경우 생성가능한 돌연변이 서열이 제한적 목록에 나열될 때와, 이 돌연변이 서열과 프로브 각각의 용융점이 2방향으로 독특하다고 공지될 때, 이종이중체 소스에서의 돌연변이(들)를 확인할 수 있도록 만들어준다.

용융 곡선 방법과 관련하여, 전술된 관심 서열을 검출하기 위한 방법 몇 가지는 용융점을 측정하기 위한 필요 조건과 양립할 수 없다.

이는, 특히 하기 방법의 경우에 해당한다.

- 5' → 3' 엑소뉴클레아제 활성을 가지는 중합효소를 이용한 증폭: 이는, 일반적으로 5' 뉴클레아제 활성을 가지는 미돌연변이 중합효소가 사용되는 방법, 즉 5' 뉴클레아제 활성 테스트 방법과 같이 가장 빈번히 사용되는 방법이다. 이는, 프로브 5' 말단의 가수분해가 억제되지 않을 때 이 프로브 5' 말단의 가수 분해를 초래하고, 가수분해된 프로브 분자는 더 이상 용융 곡선을 생성하는데 사용되지 않는다는 결과를 초래한다.

- 비대칭 증폭: PCR과 같이 일반적인 프라이머 의존적 지수 증폭의 경우, 증폭은 대칭이라고 지칭되고, 이러한 프라이머는 화학양론적 농도로 존재하게 되며, 이러한 화학양론적 농도는 증폭이 DNA의 센스 가닥을 안티센스 가닥만큼 생성하는 효과를 발휘한다. 이들 가닥중 하나는 구성(construction)에 의해 프로브의 서열과 동일한 서열 또는 매우 유사한 서열을 공유하므로, 이 가닥은 표적 서열에 혼성화될 프로브와 경쟁할 수 있고, 이 프로브가 발광하는 신호를 억제할 수 있다. 이러한 문제발생을 피하기 위해 프로브의 상보적 DNA 가닥 형성을 촉진하도록 프라이머의 농도 비율을 수정함으로써 비대칭 증폭이 수행될 수 있지만, 소량의 프라이머가 단지 선형이 되도록 소모될 때 증폭은 지수적 진행을 빠르게 중단하는데, 이는 테스트 기간이 길어지게 만들고/길어지게 만들거나 감도를 떨어뜨린다.

- 범용 프라이머(즉 프라이머의 5' 영역에 보존된 단일 영역을 함유하는 프라이머)를 사용한 동시다중 증폭: 이는, 프라이머 이량체의 생성을 유리하고 효과적으로 감소시킬 수 있으며(Brownie외 다수, "The elimination of primer-dimer accumulation in PCR,"Nucleic acids Res. 1997 Nucleic Acids Res. 1997 Aug 15;25(16):3235-41. doi: 10.1093/nar/25.16.3235, 사이트 주소 https://doi.org/10.1093/nar/25.16.3235에 공개됨), 단일 프라이머 쌍으로 많은 수의 관심 서열을 지수적으로 증폭시킬 수 있다. 다른 한편, 사용된 프라이머는 관심 서열의 센스 및 안티센스 가닥 각각을 증폭시키기 때문에, 비대칭 증폭을 수행하는 것인 물론 불가능하다.

프로브가 가수분해되지 않는 경우, 프로브의 혼성화는 대칭 증폭 반응 동안 형성된 상보적 가닥의 존재에 의해 억제되거나 상당히 감소할 수 있다. 이러한 신호의 감소는 적어도 2개의 기작으로부터 기인할 수 있다:

- 혼성화가 진행되는 동안, 프로브의 농도보다 더 낮은 농도에서조차 처음에, 그리고 우선적으로 혼성화될 수 있는 상보적 가닥과의 경쟁,

- 프로브와 상보적 가닥의 혼성화 이후조차에도 관심 서열의 상동성 5' 또는 3' 영역에서 혼성화될 수 있는 상보적 가닥에 의한 프로브의 치환. 이후 이 상보적 가닥은, 특히 이러한 상동성 영역의 길이에 의존하는 역학에 따라서 토우홀드(toehold) 매개 가닥 치환에 의해 프로브를 치환함(Sriniivas외 다수의 논문 "On the biophysics and kinetics of toehold-mediated DNA strand displacement"Nucleic acids research 2013, published at the address https://doi.org/10.1093/nar/gkt801 참조),

- Seegene사의 TOCE 및 MuDT 방법에 의한 구별: 용융 곡선에 따른 상기 방법은 종점에서 수행되므로, 관심 서열이 동시에 존재한다면, 이 관심 서열의 상대적 농도는 정량이 불가능하다. Seegene사는 이러한 제한을 피하기 위한 두 가지 방법을 설명하였다. 첫 번째는 TOCE(Tagging Oligenucleotide Cleavage & Extension, 등록 상표)라 지칭되는 것으로서, 이는 자체의 용융점으로 구별 가능한 "캐처(catcher)" 형광 프로브를 사용하여 형광 발광 채널당 5개 이하의 프로브를 검출할 수 있게 만든다. 주요 단점은, 이 방법이 관심 서열을 증폭하는데 사용되는 것에 더하여 올리고뉴클레오티드를 여러 개 더 추가하는 것을 필요로 하므로 이 방법의 구현이 복잡하다는 점이다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 찾고자 하는 PCR 생성물의 생성을 방해하는 시약을 소비하는 인공적 생성물을 생성할 수 있다. 두 번째는 MuDT(Multi Ct value in a single channel, 등록 상표)로 지칭되는 것으로서, 이는 동일한 여기 및 발광 채널에서 3개 이하의 프로브를 결합하는 것을 가능하게 만든다. 프로브는 수 ℃만큼 떨어진 변별적 용융점을 가진다. PCR 증폭은, 온도 프로파일이 약 95℃의 용융점까지 온도가 상승하는 동안 1개 이상의 단계를 포함하는 주기로 수행된다. 온도의 단계는 프로브들의 용융점들 사이에서 선택되며, 형광 신호는 이들 단계 각각에서 기록된다. 전체 형광 신호에 대한 프로브 각각의 기여도는 연산에 의해 확정될 수 있다. 유의미한 단점은, 사용된 열 순환기가 이러한 특정 주기 프로파일 유형을 관리할 수 있어야 한다는 점인데, 이는 주기가 진행되는 동안 온도 변화 시간을 최소화하고자 하는 신속 PCR과 양립할 수 없다. 이 방법은 프로브가 가수분해되는 TaqMan 모드에서의 검출과 더욱 양립할 수 없다.

그러므로 현재 동시다중방식이라고 주장되는 방법들은 자체의 복잡성이나 자체의성능, 또는 TaqMan 프로브와 같은 일반적 균질 위상 포맷과 자체의 비양립성 등으로 인해 매우 불만족스러운 실정이다. 대부분의 경우 동시다중방식이 아닌 다형광(multi-fluorescent)으로 묘사될 수도 있는데, 그 이유는 이 방법들이, 특히 신호들이 함께 결합되어 "평행" 또는 동시에 진행되되 동시다중화되지는 않는 측정을 하는 것을 포함하기 때문이다.

본 발명은 상황을 개선한다. 이를 위해서 시험관내 핵산 증폭 시약이 소광자와 형광단을 결합한 형광 프로브 적어도 2개를 함유하고, 일련의 열 주기들을 수행하도록 배열된 열 순환기를 포함하는 핵산 서열의 동시다중 검출용 장치를 제안하는데, 여기서 상기 형광 프로브는 변별적 핵산 서열을 각각 표적화하도록 배열되고, 상기 형광단은 중첩 형광 파장에서 발광하며, 광 센서는 상기 형광 파장 범위에서 상기 형광단에 의해 발광되는 방사선을 측정하도록 배열되고, 각각의 형광 프로브에 의해 발광되는 방사선은 각각의 프로브가 비변형 상태(소광자가 형광 발광을 감소시키거나 실질적으로 감소시키지 않음)인지 또는 변형 상태(소광자가 형광 발광에 역효과를 발휘함)인지 여부에 따라 가변적이며, 분석기는 각각의 형광 프로브에 대해 변형 상태일 때의 농도를 나타내는 값을, 측정된 형광도로부터 유래하는 타임 시그니처(time signature)로부터 1개 이상의 프로브(각각은 전체가 실질적으로 비변형 상태 또는 변형 상태일 수 있음)를 포함하는 반응 혼합물의 소정 열 주기에 대한 시간의 함수로서 확정하도록 배열되고, 적어도 2회의 측정이 적어도 일부 열 주기가 진행되는 동안 수행되며, 변형 상태일 때의 농도를 나타내는 상기 값은 1개 이상의 핵산 서열(각각은 형광 프로브가 핵산 서열과 상호작용할 때 비변형 상태로부터 변형 상태의 변경을 유발하도록 변별적 형광 프로브와 결합함)의 존재를 정량할 수 있도록 만든다.

이 장치는, 타임 시그니처가 이전에 특성규명된, 특성규명 형광 프로브를 사용하여 관심 서열의 존재를 검출할 수 있도록 만들기 때문에 특히 유리하다. 그러므로 이 타임 시그니처의 확정은 동일한 형광 발광 대역내에서 발광하는 프로브를 동시에 사용하는 것을 가능하게 하지만, 프로브의 타임 시그니처들은, 프로브 각각의 기여도에 대해 충분히 상이함에도 불구하고, 분리될 수 있다. 유리하게, 이 타임 시그니처는 또한 형광 대역의 인접한 대역으로 인한 잠재적인 광학적 오염을 효과적으로 제거할 수 있게 만든다. 이 장치에서 잠재적인 광학적 오염은 심지어 관심 서열의 존재를 검출하기 위해 사용될 수도 있다.

다양한 구현예들에 따르면, 본 발명은 이하 특징들중 1개 이상을 가질 수 있다:

- 열 순환기는 PCR 열 순환기이고, 적어도 2개의 형광 프로브는 TaqMan 프로브, 분자 비콘, 이중 형광 전달 프로브, Scorpion 프로브, Amplifluor 프로브, MGB 이클립스 프로브, LUX 프로브, QuASR 프로브 및 QZyme 프로브를 포함하는 군으로부터 선택됨;

- 시험관내 핵산 증폭 시약은 소광자와 형광단을 결합한 3개의 형광 프로브를 포함하고, 상기 형광 프로브는 변별적 핵산 서열을 각각 표적화하도록 배열되며, 상기 형광단은 중첩 형광 파장에서 발광함;

- 시험관내 핵산 증폭 시약은 소광자와 형광단을 결합한 형광 프로브 군 적어도 2개를 포함하고, 상기 형광 프로브는 변별적 핵산 서열을 각각 표적화하도록 배열되며, 상기 형광단은 형광 프로브의 각각의 군 내에 중첩 형광 파장에서 발광함;

- 분석기는 형광 프로브 각각의 형광 측정, 타임 시그니처 및 각각의 농도의일정성을 기반으로 매트릭스 시스템을 풀어 변형 상태인 형광 프로브 각각의 농도를 나타내는 값을 확정하도록 배열됨;

- 분석기는 형광 프로브 군당 1개의 매트릭스 시스템을 풀도록 배열됨;

- 분석기는 최소화 알고리즘을 이용하도록 배열됨; 그리고

- 분석기는 경사 하강(gradient descent)을 적용하거나 신경망을 사용함으로써 변형 상태일 때의 형광 프로브 각각의 농도를 나타내는 값을 확정하도록 배열됨.

본 발명은 또한 하기 작업들을 포함하는, 핵산 서열을 동시다중 검출하기 위한 방법에 관한 것이다:

a) 분석될 샘플과, 소광자 및 형광단을 결합한 형광 프로브 적어도 2개를 함유하는 시험관내 핵산 증폭 시약을 포함하는 시약 혼합물에 대해 다수 회차의 열 주기를 수행하는 작업(상기 형광 프로브는 변별적 핵산 서열을 각각 표적화하도록 배열되고, 상기 형광단은 중첩 형광 파장에서 발광함);

b) 각각의 열 주기가 진행되는 동안, 상기 형광 파장 범위에서 적어도 2회의 형광 측정을 수행하는 작업(각각의 프로브에 의해 발광되는 방사선은, 각각의 프로브가 비변형 상태인지(이 경우 소광자는 형광 발광을 감소시키거나 감소시키지 않음) 또는 변형 상태인지(이 경우 소광자는 형광 발광에 역효과를 발휘함)에 따라 가변적임);

c) 작업 b)의 측정과, 측정된 형광으로부터 유도된 타임 시그니처로부터 변형 상태일 때의 각각의 형광 프로브 농도를 나타내는 값을, 1개 이상의 프로브(이 프로브 각각은 전체가 실질적으로 비변형 상태이거나 변형 상태일 수 있음)를 포함하는 반응 혼합물의 소정의 열 주기에 대한 시간의 함수로서 확정하는 작업[변형 상태일 때의 농도를 나타내는 상기 값은, 형광 프로브가 핵산 서열과 상호작용할 때 비변형 상태로부터 변형 상태로 변경되도록 이 형광 프로브를 유도하기 위해 변별적 형광 프로브와 결합하는 각각의 핵산 서열 1개 이상의 존재에 대해 정성화할 수 있도록 만듦].

다양한 구현예들에 따르면, 본 방법은 이하와 같은 특징들중 1개 이상을 가질 수 있다:

- 작업 b)는 PCR 주기를 수행하는 것을 포함하고, 적어도 2개의 형광 프로브는 TaqMan 프로브, 분자 비콘, 이중 형광 전달 프로브, Scorpion 프로브, Amplifluor 프로브, MGB 이클립스 프로브, LUX 프로브, QUASR 프로브 및 QZyme 프로브를 포함하는 군으로부터 선택됨;

- 작업 b)는 소광자 및 형광단을 결합한 형광 프로브 3개를 포함하는 시험관내 핵산 증폭 시약을 사용하는 것을 포함하며, 상기 형광 프로브는 변별적 핵산 서열을 각각 표적화하도록 배열되고, 상기 형광단은 중첩 형광 파장에서 발광함;

- 작업 b)는 소광자 및 형광단을 결합한 형광 프로브 군 적어도 2개를 포함하는 시험관내 핵산 증폭 시약을 사용하는 것을 포함하며, 상기 형광 프로브는 변별적 핵산 서열을 각각 표적화하도록 배열되고, 형광 프로브의 각각의 군중 상기 형광단은 중첩 형광 파장에서 발광됨;

- 작업 c)는 각각의 형광 프로브의 형광 측정, 타임 시그니처 및 각각의 농도에 관한 일정성을 기반으로 매트릭스 시스템을 푸는 것을 포함함;

- 작업 c)는 형광 프로브 군당 1개의 매트릭스 시스템을 푸는 것을 포함함; 그리고

- 작업 c)는 경사 하강을 적용하거나 신경망을 사용하는 것을 포함함.

본 발명의 추가적인 특징과 이점은 이하와 같은 도면을 기반으로 하여, 본 발명을 제한하는 것이 아닌 예시하는 것에 의해 주어진 예들을 바탕으로, 이하 설명을 읽을 때 더욱 명료해질 것이다:
- 도 1은 본 발명에 따른 장치의 일반적인 도해를 나타내고,
- 도 2는 형광단 ATTO 565와 형광단 Cy3로 각각 표지화된 TaqMan 프로브를 사용한 2회의 PCR 반응 동안 얻어진 형광 세기를 시간에 대한 함수로서 보여주고,
- 도 3은 프로브에 특이적인 표적 서열과 상호작용하지 않았을 때와 상호작용하였을 때 사용된, 각각의 프로브에 대한 온도 주기의 프로파일(즉 타임 시그니처의 각각의 구성요소)을 보이는 프로브들의 세트에 관한 이 시그니처를 나타내고,
- 도 4는 본원에 전술된 바와 같은 타임 시그니처들의 최적의 합을 분해하는 것을 포함하고, 동일한 형광 대역에서 발광하는 TaqMan 프로브 2개를 사용하여 수행된 PCR 반응에 관한 특정 구현예에서 장치를 사용한 방법의 구현을 도시하는 것이고,
- 도 5는 본원에 전술된 바와 같은 타임 시그니처들의 최적의 합을 분해하는 것을 포함하고, 관심 서열 2개의 동시다중 증폭 동안 동일한 형광 대역에서 발광하는 TaqMan 프로브 2개를 사용하여 수행된 PCR 반응에 관한 특정 구현예에서 장치를 사용한 방법의 구현을 도시하는 것이고,
- 도 6은 분자 비콘 및 QUASR 유형 프로브로 수행된 PCR 반응의 특정 구현예에서뿐만 아니라, 인접한 채널로 말미암는 1개 채널에서 광학적 오염 신호를 제거하기 위한 장치를 사용한 방법의 구현을 보여준다.
도면들 및 이하의 설명은 대부분 확실한 성질의 요소들을 포함한다. 따라서, 도면들 및 이하의 설명은 본 발명을 보다 명확하게 만드는 역할을 할 뿐만 아니라, 해당되는 경우 본 발명을 한정하는데 기여할 수 있다.

본 발명은 핵산 서열의 동시다중 검출을 수행할 수 있는 장치, 즉 상기 프로브(예컨대 TaqMan, 분자 비콘(Molecular Beacon), FRET 프로브 등)가 상기 서열과 상호작용하는 동안 발광되는 신호의 변경에 의해 유전자 서열의 확인을 가능하게 하는 형광단 1개 이상을 포함하는 프로브를 사용할 수 있는 장치로서, 상기 형광단은 잠재적으로 중첩되는 형광 파장 범위에서 발광하는 장치를 제안한다.

프로브에 특이적인 표적 서열과 이 프로브의 상호작용은 사용되는 검출 방법에 따라 여러 형태를 취할 수 있다. 이 목록이 제한적이지 않으면서 TaqMan 유형 프로브, 분자 비콘, MGB 이클립스 프로브, 형광 전달(FRET)을 이용한 이중 프로브를 사용하는 실시간 PCR 검출, 또는 Scorpion, Amplifluor, LUX, QUASR 또는 QZyme 유형의 프로브로서 사용되는 실시간 PCR 검출과 같이 실제로 공지된 방법이 여러 개 있다.

프로브의 화학적 성질은 또한 방법에 따라서도 달라질 수 있다. 프로브는 데옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA), 또는 펩티드핵산(PNA), 잠금 핵산(LNA)과 같은 합성핵산 유사체에서 만들어질 수 있다. 프로브는, 프로브에 특이적인 유전자 서열과 프로브의 상호작용을 변경시키는 화학기, 예컨대 이중 나선체의 마이너 홈(minor groove)에 결합하는 기(Minor Groove Binder, MGB)를 포함할 수 있다.

구현된 방법에 따르면, 프로브는, 프로브의 상태에 따라서 자체의 형광 세기를 조정하는 효과를 가지는 형광단 1개 이상 및 화학기(이하의 설명에서 이는 "소광자"라고 지칭하고자 함) 1개 이상을 포함하는 단일 올리고뉴클레오티드 분자로 구성될 수 있다. 프로브는 또한 2개 이상의 분자로 구성될 수 있으며, 이 분자중 일부는 1개 이상의 형광단을 포함하고, 나머지 모두는 프로브의 상태를 확정하는 것으로서, 발생할 수 있는 상호작용에 따라서 자체의 형광 세기를 조정하는 효과를 가지는 화학기 1개 이상을 포함한다. 이는, 예컨대 2개의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 QUASR 프로브 또는 2개의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 이중 FRET 유형 형광 전달 프로브가 사용된 경우인데, 올리고뉴클레오티드 하나는 자체의 3' 말단에 형광단, 즉 자체의 에너지를 제2 올리고뉴클레오티드의 5'에 운반된 소광자에 전달함으로써 탈여기(de-exciting)될 수 있는 형광단을 운반하고, 이 소광자 자체는 형광단 파장 대역과 상이한 파장 대역의 광 방사선을 발광함으로써 탈여기될 수 있다.

구현된 검출 방법에 따르면, 프로브의 상호작용은, 프로브에 특이적인 유전자 서열과 프로브의 단순 혼성화, 효소 활성에 의해 매개되는 가수분해가 후속되는 혼성화, 또는 리가아제 작용에 의해 매개되는 현존 DNA 가닥 또는 중합효소 작용에 의해 매개되는 합성 DNA 가닥으로의 혼입이 후속되는 혼성화로 이루어질 수 있다.

이하 본문에서 "상호작용한다"라는 용어는, 본원에 전술된 방법들중 하나에 따라 프로브에 특이적인 유전자 서열과 상호작용하는 프로브의 작용을 설명하기 위해 일반적으로 사용될 것이며, "상호작용에 의해 변형된"이란 용어는, 본원에 전술된 방법들중 하나에 따라 프로브에 특이적인 유전자 서열과 프로브의 상호작용에 의해 프로브의 형광 특성이 변경되는 과정을 설명하기 위해 일반적으로 사용될 것이다.

본 발명에 따른 동시다중 검출은, 사용되는 각각의 유형의 형광 프로브에 대한 형광 타임 시그니처의 확정, 증폭 반응 동안 적용되는 적어도 2회의 열 주기 동안 2개 이상의 형광 신호를 획득하고, 이러한 시그니처를 사용하여 이 프로브에 의해 방출되는 신호를 분리하기 위한 알고리즘의 구현으로 인해 가능하다.

따라서, 본 발명의 특정 구현예에서, 장치는 프로브를 광학적으로 여기시키고, 1개 이상의 파장 대역에서 방출되는 형광 신호를 연속적으로 또는 샘플링된 방식으로 기록함으로써 1회 이상의 열 주기를 이 프로브에 적용하여 동시다중 측정을 수행할 수 있도록 만든다. 증폭 방법이 PCR의 경우에서처럼 일련의 열 주기를 포함하는 경우, 형광 신호는 이러한 주기들중 적어도 2회차 동안, 바람직하게는 매 주기 동안 기록된다. 증폭 방법이 등온일 때, 적어도 2회의 열 주기가 샘플에 적용되는데, 이 열 주기중 1회는 반응 시작시, 다른 1회는 방출된 형광 신호가 기록되는 동안에 적용된다.

더욱 구체적으로, 도 1에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 장치(2)는 적어도 2개의 형광 프로브를 함유하는 증폭 반응 혼합물에 2회 이상의 온도 주기를 적용할 수 있는 열 순환기(4), 적어도 1개의 파장 대역에서 주기당 적어도 2회의 형광 세기 측정을 수행할 수 있는 역량을 가지는 광 센서(6), 그리고 상이한 상태(반응 동안 상이한 프로브가 발견됨)의 상대적 농도 측정을 수행하고, 이로부터 상기 프로브에 의해 표적화된 관심 뉴클레오티드 서열 1개 이상의 존재를 추론하도록 배열된 분석기(8)를 포함한다. 본원에 기술된 예에서, 광 센서(6)는 형광 프로브의 여기 소스 및 대응하는 광 검출기 둘 다를 포함한다. 대안적으로, 광 센서(6)는 소스 및 검출기로 분리될 수 있었다. 본원에 기술된 예에서, 분석기(8)는 1개 이상의 프로세서상에서 실행되는 적합한 컴퓨터 프로그램 또는 코드이다. 프로세서라는 용어는 도면 및 복셀(voxel) 관련 처리시 텍스처 투영을 연산하기 위해 적응된 임의의 프로세서를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 이러한 프로세서는 개인용 컴퓨터 마이크로프로세서, 전용 FPGA 또는 SoC(시스템 온 칩) 유형 칩, 그리드에서 또는 클라우드에서의 연산 자원, 마이크로컨트롤러 또는 후술된 구현예에 필요한 연산 전력을 공급할 수 있는 기타 임의의 형태로서 공지된 방식으로 구현될 수 있다. 이러한 요소들중 1개 이상은 또한 ASIC와 같은 특화 전자 회로의 형태로 구현될 수 있다. 프로세서 및 전자 회로의 조합도 또한 상정될 수 있다.

열 순환기(4)는 시헌관내 핵산 증폭 시약, 즉 변별적 타임 시그니처를 가지는 형광 프로브 적어도 2개를 함유하는 시약과 혼합된 샘플에 소정의 범위에 자리잡은 여러 온도를 적용할 수 있다. 열 순환기(4)는 소정의 온도 프로파일을 이 혼합물에 반복적으로 적용할 수 있다. 분석기(8)는 샘플에 적용되는 온도 값들을 수신하거나 확정한다. 본원에 기술된 예에서, 이러한 값들은 분석기(8)로 전송된다. 다양한 구현예에 따르면, 이 값들은 샘플중에서 또는 샘플과 접촉하여 측정될 수 있거나, 시간의 함수로서 외삽될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 열 순환기(4)는 신속 열 순환기(즉 초당 5℃를 초과하는 만큼의 온도 변화, 더욱 바람직하게는 초당 15℃를 초과하는 온도 변화를 나타내는 열 순환기)이다. 이는 본 발명에 따른 분석기(8) 덕분에 가능하다. 종래 신속 열 순환기는 이것이 공급하는 정보가 충분히 정밀하지 않기 때문에 동시다중 측정을 수행하고자 하는데 사용되지 않는다.

광 센서(6)는, 자외선 범위 및/또는 가시광선 범위 및/또는 적외선 범위의 파장 대역 1개 이상에서 반응 혼합물을 대상으로 광 여기를 수행하고, 이와 같이 여기로 말미암는 형광 발광 세기를 자외선 범위 및/또는 가시광선 범위 및/또는 적외선 범위의 파장 대역 1개 이상에서 한정된 지속 기간 동안 1회 이상의 점 측정, 또는 소정의 빈도(예컨대 200 ms마다 100 ms씩)로 일련의 점 측정을 수행함으로써 측정을 진행하도록 배열된다. 이러한 형광 측정은 접근 가능한 파장 대역(들)에서의 시간의 함수로서 분석기(8)로 전송된다. 바람직한 구현예에서, 획득 주기는 10 ms 내지 10 s이고, 더욱 바람직하게는 100 ms 내지 1 s이다. 그러므로 전체 종래 기술과 달리, 분석기(8)는 열 주기 전반에 걸쳐 형광 응답 변화를 준연속적으로 추적할 수 있다.

본 발명에 따른 방법의 구체적이고 바람직한 구현예에서, PCR 반응은 유전자 표적의 존재 또는 부재를 함께 검출하고 구별하기 위해 사용되는데, 여기서 PCR 시약은 소광자와 형광단을 결합한 프로브 세트(예컨대 TaqMan 프로브)를 함유하고, 상기 형광 프로브는 공통 파장 대역 또는 범위에서 발광할 수 있는 변별적 형광단을 사용한다.

프로브 각각의 타임 시그니처에 대한 사전 지식 덕분에 분석기(8)는 프로브와 프로브에 특이적인 유전자 서열로부터 얻어진 증폭 생성물(또는 앰플리콘) 사이의 상호작용으로부터 기인하는 형광 신호 변화를 시약에 존재하는 각각의 프로브에 대해 서로 독립적으로 명료하게 측정할 수 있으므로, n개의 파장 대역에서 형광 신호를 동시에 측정할 수 있는, 본 발명에 따른 장치와 함께 2n, 심지어 3n 또는 4n의 동시다중화 수준을 달성할 수 있다.

이 방법은 종래 실시간 시험관내 핵산 증폭 분석 동안 수행된 바와 같이 시간이 경과함에 따라 저온(예컨대 60℃에서 형광의 증가를 단순히 관찰함에 의해서가 아니라, 열 주기 동안 광 센서(6)에 의해 측정된 형광 프로파일의 변화를 관찰함에 의해서 샘플에 관심 서열이 존재함을 검출할 수 있게 만든다. 도 2는 동일한 형광 채널에서, 그러나 PCR 반응이 진행되는 동안 장치(2)로 기록된 형광 곡선 2개를 보여주는데, 이때 사용된 프로브는 2개의 상이한 형광단(ATTO 565 및 Cy3)으로 기능화된다. 이 곡선들은 형광 프로파일이 프로브 유형에 따라서, 그리고 주기가 증폭의 시작시에 진행되는지 또는 종결시에 진행되는지 여부에 따라서 한 주기 동안 시간의 함수로서 변화함을 보여준다.

본 발명에 따른 방법의 특정 구현예에서, 열 주기는 PCR 주기로서 저온에서 고온으로의 온도 상승(단 저온은 55℃ 내지 70℃, 바람직하게는 58℃ 내지 65℃이고, 고온은 80℃ 내지 100℃, 바람직하게는 90℃ 내지 98℃임) → 고온에서 저온으로의 온도 강하를 포함한다.

본 발명의 설명에서 열 주기는, 일반적으로 60℃로부터 95℃까지의 온도 증가 → 60℃로의 온도 감소를 포함하는 것으로 기재된다. 이들 값은, 특히 신속한 PCR 반응의 구현에 대해 적응된다. 이들 범위의 값(60℃ → 95℃ → 60℃은, 예컨대 2가지 대신 3가지의 온도를 적용함으로써 PCR 증폭 동안 적용되는 특정 열 주기, 또는 심지어 사용된 시약의 열 안정성과 양립할 수 있는 온도 프로파일에 따라 등온 증폭 동안 추가되는 열 주기에 대해 적응하도록 수정될 수 있었음은 물론이다.

본 발명에 따른 방법의 특정 구현예에서, 신호 변화는 엑소뉴클레아제 활성을 가지는 중합효소에 의해 절단된 TaqMan 프로브의 경우 프로브(들)의 가수분해로부터 기인한다.

뿐 아니라, 장치(2)는 반응 혼합물에 존재하는 프로브들 각각의 타임 시그니처를 확정하기 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 일반적 원리

본 발명에 의해 구현된 일반적 원리는 이 프로브에 특이적인 관심 뉴클레오티드 서열과 프로브가 상호작용하였는지, 아니면 상호작용하지 않았는지 여부에 따라 프로브에 의해 방출되는 형광 신호의 변화를 검출하는 것을 바탕으로 한다. 출원인의 작업은, 1) 이 형광 신호가, 일반적으로 수반되어 발생하는 물리적 현상으로서, 다소간 널리 알려진 물리적 현상(주요 현상은 이하 언급될 것임)을 통해 온도에 의존한다는 것; 2) 온도에 따른 이 프로브의 형광 신호 변화는 프로브(들)를 함유하는 샘플에 온도 주기를 적용함으로써 측정될 수 있다는 것; 3) 자체로부터 얻어진 형광 곡선은, 프로브가 이 프로브에 특이적인 뉴클레오티드 서열과 상호작용하였는지 아니면 상호작용하지 않았는지 여부에 따라 변한다는 것; 3) 한 주기가 진행되는 동안 신호 변화의 이러한 변화는 프로브에 특이적이고, 열 주기가 진행될 때 이 프로브에 특이적인 표적 서열과 상호작용하였던 것으로 확인된 이 프로브의 분획을 검출하는데 사용될 수 있는 시그니처를 생성한다는 것; 4) 이 분율의 증폭 반응의 선택된 횟수(적어도 2가지)만큼의 확정은 증폭 반응 혼합물중 프로브에 특이적인 관심 뉴클레오티드 서열의 역치 주기의 확정을 통해 이 뉴클레오티드 서열의 존재 또는 부재, 또는 초기 농도를 추론할 수 있도록 할 수 있음을 확인할 수 있도록 만들었다.

대부분의 경우 특정 뉴클레오티드 서열과 상호작용하는 프로브의 형광 수준은 형광단과 소광자 사이의 거리를 수정함으로써 다양해지고(TaqMan, 분자 비콘, FRET, MGB 이클립스 프로브 및 Scorpion, Amplifluor, LUX, QUASR 프로브로서 작용하는 프라이머의 경우), 이러한 형광 변화는 여러 방식으로 온도에 의존할 수 있음에 주목한다.

먼저, 사용된 형광단 형광의 양자 수율 변화는 온도가 증가함에 따라 감소한다. 예컨대 로다민 B의 수율은 온도가 0.8℃로부터 10℃까지, 0.3℃로부터 60℃까지 거쳐감에 따라 균일하게 감소한다(Kubin외 다수의 논문("Fluorescence quantum yields of some rhodamine dyes", Journal of Luminescence 1983, doi.org/10.1016/0022-2313(82)90045-X) 참조). 이와 같은 특정의 경우에, 이러한 감소는 본질적으로 온도에 따른 동적 소광현상의 증가에 기인한다(Amaoutakis 기술 노트(2016, "of fluorescence with temperature" 참조). 온도에 따른 양자 수율의 이러한 변화는 결국 형광단의 유형에 따라 달라진다. 따라서, 동일한 파장 범위에서 발광하는 2개의 형광단의 온도에 따른 양자 형광 수율의 변화는 형광단마다 서로 상이할 수 있다.

그 다음, 형광단과 소광자 사이의 거리, 또는 형광단 또는 소광자의 위치를 수정하는 프로브의 입체구조(configuration) 변화(예컨대 프로브의 형광단은 다른 프로브의 소광자 또는 여러 프로브들의 소광자들 근처에 있을 수 있음)는 형광단에 의해 방출되는 형광 신호에 영향을 미친다. 더욱 일반적으로, 형광 프로브 및 다른 시약을 포함하는 증폭 반응 혼합물은 상이한 화학 종들 사이의 분자내 및 분자간 상호작용에 의해 조절된다. 용액중 올리고뉴클레오티드는 증폭 반응 단계(증폭 반응 동안 생성된 것으로서, 프로브에 상보적인 서열이 고농도로 존재)의 온도에 관한 함수로서 상이한 입체구조를 채택할 수 있다. 제1 근사치로서, 증폭 반응의 각 시점에서 비변형 프로브에 대해 상이한 시나리오가 나올 수 있다:

1) 프로브는 증폭 반응 동안 생성된 상보적 서열과 상호작용한다,

2) 프로브는 임의의 상보적 서열과 상호작용하지 않는다

3) 프로브는 복잡한 구조에 결합되고, 용액중 1개 이상의 올리고뉴클레오티드는 서로 결합한다.

따라서 프로브는 이러한 시나리오들중 하나 또는 다른 하나에 해당하는지 여부에 따라 상이한 상태들, 예컨대 상이한 입체구조들을 채택할 수 있다.

형광단에 의해 발광되는 형광을 소광하는데 있어 소광자의 효능은 온도에 따른 프로브의 형광 세기에 영향을 미치는 제3의 요인이다.

마지막으로, 프로브의 상태도 또한 중요한 요소가 될 수 있다: TaqMan 방법에서, 프로브가 자체의 표적 서열상에 혼성화되고, 중합효소의 5' → 3' 엑소뉴클레아제 활성을 통해 검출 모드로 가수분해되었을 때, 형광단은 프로브로부터 비가역적으로 절단되고, 자체의 형광은 소광자의 근접에 의해 더 이상 나타나지 않는다. 따라서 프로브에 특이적인 뉴클레오티드 서열과 프로브의 상호작용은, 프로브의 형광단이 소광자에 더 이상 분자 수준으로 결합하지 않는, 상태의 변화를 초래한다.

본 출원인은 온도에 따른 이러한 현상들 각각의 변화 법칙들이 프로브의 구조, 특히 형광단의 성질, 프로브의 서열 및 소광자의 성질뿐 아니라 다른 프로브와의 근접성에 따라 현상이 실질적으로 달라질 수 있음을 실험을 통해 발견하였다. 매개변수에 따르면, 이처럼 상이한 법칙들의 조합은 하나의 프로브로부터 다른 프로브에 이르기까지 매우 가변적인 전체 법칙을 생성할 수 있다. 특히 형광단의 양자 수율에 대한 온도의 영향과 프로브의 입체구조에 대한 온도의 영향에 반대 부호 및 상이한 시간 상수가 기여한다.

본 출원인의 작업은 소정의 온도 프로파일에 대해 이 곡선이 타임 시그니처 첫 번째 구성 요소를 형성한다는 것을 확인할 수 있도록 만들었다.

프로브들 중 하나에 상보적인 뉴클레오티드 서열이 임의의 농도로 샘플중에 존재하고, 이러한 서열을 운반하는 분자들중 하나가 이 서열의 특이적 프로브 분자와 상호작용할 때, 프로브가 (분자 비콘 프로브의 경우와 마찬가지로) 자체의 혼성화 상태를 고려하여 다른 입체구조를 채택하거나, 프로브의 구성요소가 (FRET 유형 이중 프로브 또는 Scorpion 프라이머의 경우와 마찬가지로) 파괴 효과를 가지는 프로브의 다른 구성요소 근처에 있거나, 또는 5' → 3' 엑소뉴클레아제 활성을 가지는 중합효소가 샘플에 존재하기 때문과 같은 이유들중 어느 하나로 인하여, 이 프로브의 온도에 관한 함수인 형광단 세기 변화 법칙은 수정될 수 있고, 이와 같은 상보적 서열과 혼성화된 프로브의 형광단이 (TaqMan 프로브의 경우와 마찬가지로) 이 엑소뉴클레아제에 의해 절단될 때, 이 프로브의 온도에 관한 함수인 형광의 변화 법칙은 수정될 수 있다.

본 출원인의 작업은 소정의 온도 프로파일에 대해 이러한 변화가 타임 시그니처의 첫 번째 구성 요소를 대체하는 시그니처의 두 번째 구성 요소를 이룬다는 것을 확인할 수 있도록 해 주었다.

상호작용 이전과 이후에 소정의 온도 주기 동안 기록된 형광 신호로서, 증폭 생성물의 존재로 말미암는 형광 신호를 분석하고 비교함으로써, 각각의 프로브에 대해 그리고 열 주기가 적용되는 시점에 이 상호작용에 의해 수정된 프로브의 분율을 연산할 수 있게 되고, 이로부터 이 2개의 타임 시그니처 구성요소 덕분에 샘플에 존재하는 이 특이적 서열로부터 얻어진 증폭 생성물의 양을 추론하는 것이 가능해진다.

임의의 양만큼의 관심 서열이 발견되는 증폭 반응의 첫 주기 또는 첫 시간 동안, 이 관심 서열로부터 얻어진 증폭 생성물의 존재에 의해, 관심 서열에 특이적인 프로브 분자는 유의미하게 변형되지 않고(이 관심 서열의 초기 농도가 높은 특정의 경우를 제외함), 기록된 형광 신호는 오로지 프로브에 특이적인 서열과 프로브의 상호작용에 의해 변경되지 않는 프로브의 타임 시그니처 구성요소로부터 유래한다. 임의의 횟수의 주기가 진행된 후, 증가하는 프로브의 분율은 관심 서열로부터 얻어진 증폭 생성물과 프로브의 상호작용 이후 변화하고, 기록된 신호는 관심 서열로부터 얻어진 증폭 생성물과 프로브의 상호작용에 의해 변형되거나 변형되지 않는 프로브의 타임 시그니처 구성요소 각각의 선형 조합이다.

만일 동일한 형광 대역에서 발광하는 몇몇 형광 프로브가 혼합되고, 기록이 연속적으로 수행되고, 샘플링 빈도가 충분할 때, (증폭된 표적 서열(들)의 존재에 의한 이러한 프로브의 변형 이전과 이후) 1회차 이상의 주기가 진행되는 동안 이러한 프로브 혼합물에 의해 발광하는 형광 세기는, 프로브들 자체의 각각의 타임 시그니처 덕분에 매 주기마다 비변형 형태로 발견되는 프로브 각각의 분율과 프로브에 특이적인 뉴클레오티드 서열과의 상호작용에 의해 변형되어 발견되는 프로브 각각의 분율을 확정함으로써, 프로브 각각의 신호에 대한 기여도들을 분리하는 것을 가능하게 한다.

프로브가 다수의 유기 형광단의 경우에서와 같이, 일반적이지는 않지만 인접한 형광 대역에서 대부분 발광할 때, 본 방법은, 특히 하나의 대역에서 다른 대역으로의 광학적 오염("크로스토크") 또는 프로브에 특이적인 서열과의 상호작용에 의한 프로브의 변형으로부터 말미암지 않는 임의의 기타 형광도 변화를 제거하는 것을 가능하게 만든다. 종래 기술에서, 이러한 광학적 오염은 비-대각 항이 동시다중 키트에 사용된 형광단의 동일성에 의존하는 정방 매트릭스(square matrix)를 이용하여 선형 보정을 적용함으로써 통상 제거된다. 예컨대 사용자는 4개의 형광 검출 채널을 가지는 열 순환기로써 이 키트에 사용된 형광단의 동일성을 입력한다. 이 표시는 형광단의 이러한 조합에 대해 적응된 광학적 오염 보정 매트릭스를 선택하는 것을 가능하게 만든다.

본 발명에 따른 방법에서, 채널 A에서 주로 발광하는 몇몇 형광단이 변별적 속도로 인접 채널 B의 신호를 오염시킬 수 있기 때문에, 이처럼 매트릭스를 이용한 보정은 더 이상 불가능해진다. 그러므로 채널 B에서 이들 형광단 모두에 의해 발생하는 오염의 속도는 채널 A에서 검출된 관심 서열 각각의 증폭 여부에 의존할 것이다. 본 발명에 따른 방법에서, 인접한 채널(들)내 채널 A에서 주로 발광하는 프로브의 타임 시그니처는 확정되거나 공지된다. 더욱이, 이 시그니처는 이 채널 또는 이에 인접한 채널내 신호에 대한 자체의 기여도를 정밀하게 확정하는데 사용된다. 그러므로 광학적 오염을 효과적으로 제거하기 위해 신호에 대한 이 기여도를 공제하는 것이 가능하다.

따라서 비변형 형태 및 변형 형태일 때, 각각의 타임 시그니처를 확정함으로써 형광 프로브를 특성규명하는 것은, 반응 혼합물에 열 주기를 적용하는 시점에 프로브에 특이적인 서열과 프로브의 상호작용후 변형된 프로브의 분율을 연산하는 것을 가능하게 만든다. 만일 시험관내 핵산 증폭 반응이 진행되는 동안 이 열 주기가 반복적으로 적용되고, 프로브에 특이적인 뉴클레오티드 서열로부터 얻어진 증폭 생성물 양을 나타내는 분율을 연산함으로써 각 주기에서 변형 형태로 발견되는 분율이 추론되면, 이 분율의 변화 곡선은 시간의 함수, 또는 PCR 유형 반응의 경우 주기 회차 수, 그리고 이로부터 추론된 임계 주기(Ct), 즉 추후 이로부터 프로브에 특이적인 관심 서열의 양을 (예컨대 이 임계 주기의 값을 검량선 곡선으로 옮겨) 추론할 수 있도록 만드는 임계 주기(Ct)로서 확립될 수 있다.

증폭 반응이 PCR 반응이고, 프로브중 적어도 1개가 TaqMan 프로브인 특정 구현예에서, 이 프로브의 타임 시그니처의 첫 번째 구성요소는 이 프로브와 이 프로브에 상보적인 서열과의 혼성화가 일어나지 않는 열 주기 동안의 프로브 형광 세기 변화로 이루어진다. 이 프로브 시그니처의 두 번째 구성요소는 자체의 가수분해 이후 열 주기 동안, 즉 프로브의 나머지로부터 형광단(또는 소광자)가 절단된 이후의 형광 세기의 변화이다.

증폭 반응이 PCR이고, 사용된 프로브중 적어도 1개가 분자 비콘인 특정 구현예에서, 이 프로브의 타임 시그니처 첫 번째 구성요소는 이 프로브와 이 프로브에 상보적인 서열과의 혼성화가 일어나지 않는 열 주기 동안의 프로브 형광 세기의 변화로 이루어진다. 이 프로브 시그니처의 두 번째 구성요소는 프로브의 상보적 서열의 존재하에서 진행되는 열 주기 동안의 프로브 형광 세기의 변화이다. 유리하게 분자 비콘 프로브는 이 프로브의 상이한 폴딩 상태(folding state)들 사이에서 우수한 형광 콘트라스트를 제공하는 이점을 가진다.

증폭 반응이 PCR이고 프로브중 적어도 1개가 FRET 유형의 프로브인 특정 구현예에서, 이 프로브의 타임 시그니처의 첫 번째 구성요소는 이 올리고뉴클레오티드와 이의 상보적 서열의 혼성화가 일어나지 않는 열 주기가 진행되는 동안 수용체 형광단을 운반하는 올리고뉴클레오티드의 형광 세기 변화로 이루어진다. 이 프로브의 시그니처의 두 번째 구성요소는 프로브의 상보적 서열의 존재 하에 진행되는 열 주기 동안 형광 세기의 변화이며, 이 열 주기에서 FRET 신호는 프로브의 올리고뉴클레오티드 2개가 이것들의 공통 표적 서열상에 인접하여 혼성화될 때의 신호이다. 유리하게는 동일한 앰플리콘상의 여러 FRET 프로브를 사용함으로써 FRET 프로브는 PCR 증폭 시약중 올리고뉴클레오티드 서열의 수를 제한하거나 돌연변이의 특성규명하는 것에 대해 더욱 유연할 수 있기 때문에, FRET 프로브를 사용하는 것은 현존 올리고뉴클레오티드의 수를 제한하는 것을 가능하게 하고, 따라서 FRET 프로브와 현존 올리고뉴클레오티드의 상호작용은 동시다중화 증가를 가속화한다.

소정 프로브의 타임 시그니처 확정

각각의 관심 서열에 대한 형광 올리고뉴클레오티드 프로브는, 상기 관심 서열 일부의 특징을 이루는 공지의 상보적 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하도록 디자인되거나, 소정의 형광 채널에 대해 확정된 타임 시그니처(Snm(t), Sm(t)), 즉 고정된 열 주기에 대한 시간의 함수로서, 프로브가 자체의 관심 서열과 이 프로브의 상호작용에 의해 변형되지 않는 경우와, 모든 프로브 분자들이 자체의 관심 서열과의 상호작용에 의해 각각 변형된 경우의 형광 세기의 곡선으로 이루어진 2개의 구성요소를 포함하는 타임 시그니처에 영향을 미치지 않도록 디자인된다.

이 프로브는 Taqman, 분자 비콘, 이중 형광 전달 프로브, Scorpion, Amplifluor, MGB 이클립스, LUX, QASUR 또는 QZyme 유형의 것일 수 있되, 이 목록은 제한적인 것은 아니다.

상기에 보인 바와 같이, 소정의 형광 채널에 대한 타임 시그니처는 프로브의 비변형 형태에 대한 구성요소(이하 Snm(t)) 및 이러한 프로브의 관심 서열과 이 프로브의 상호작용에 따른 프로브의 변형 형태에 대한 구성요소(이하 Sm(t))를 포함한다.

타임 시그니처의 구성요소들(Snm(t), Sm(t))은 각각 반응에 사용된 완충액중 비변형 형태인 프로브, 또는 프로브의 관심 서열과 프로브의 상호작용에 의해 변형 형태인 프로브에 직접 열 주기를 적용하여 확정될 수 있다. 대안적으로, 타임 시그니처는 또한 온도의 함수로서 2가지 형태의 프로브의 형광 프로파일을 확정하고(SnmT(T), SmT(T)), 얻어진 함수를, 온도 프로파일 PT(t)를 기술하는 함수에 적용함으로써 얻어질 수 있다(수학적으로 Snm은 함수 SnmT 및 PT의 합성명제, 즉 SnmToPT이고; 마찬가지로 Sm은 함수 SmT와 PT의 합성명제, 즉 SmToPT임). 대안적으로, 비변형 형태 또는 변형 형태의 프로브의 타임 시그니처 구성요소는, 프로브 및 기타 프로브나 형광 소스의 조합의 형광 세기 프로파일과 시그니처가 확정될 프로브가 존재하지 않을 때의 동일 조합의 형광 세기 프로파일의 공제에 의해 간접적으로 확정될 수 있다. 유리하게 프로브 단독의 타임 시그니처보다는 오히려 타임 시그니처들의 조합이 사용되어 프로브의 존재가 직접적으로 또는 간접적으로 확정될 수 있다. 예컨대 여러 프로브들의 조합의 시그니처 및 프로브들중 하나가 부재할 때의 여러 프로브들의 조합의 시그니처는 해당 프로브의 부재를 확정하는데 사용될 수 있거나, 또는 여러 프로브들의 조합의 시그니처 및 프로브들중 하나가 부재할 때, 그리고 부재하던 프로브가 사라지는 일이 발생하였을 때(예컨대 TaqMan 프로브의 시그니처가 부재할 때, 그리고 가수분해된 프로브의 시그니처가 존재할 때) 해당 프로브들의 조합의 시그니처는 해당 프로브의 전환(예컨대 TaqMan 프로브 시그니처의 부재 및 가수분해된 프로브 시그니처의 존재)을 확정하는데 사용될 수 있다. 시그니처들을 조합 사용하는 것은, 각각의 프로브를 개별적으로 특성규명할 필요가 없게 만들고, 프로브들간 상호작용에 따라 형광 신호에 미치는 그 어떠한 영향도 피할 수 있도록 만든다. 일반적으로, 프로브들의 임의의 조합의 신호는 시약 조성 상태의 직접 또는 간접 마커로서 (여러 신호들을 조합함으로써) 본 발명에 따라 사용될 수 있다.

도 3은 다양한 형광단과 소광자를 이용한 TaqMan 유형 또는 QUASR 유형 프로브에 대한 타임 시그니처 예를 보여준다(비변형 타임 시그니처 구성요소와, 프로브에 특이적인 서열과 프로브의 상호작용에 따라 변형된 타임 시그니처 구성요소).

도 3에는 상기 표 1의 "ID"가 인용되어 있고, 각각의 프로브에 대해 이 프로브들에 특이적인 서열과 프로브의 상호작용에 따른 변형 타임 시그니처 구성요소("Aft.Int") 및 비변형 타임 시그니처 구성요소("Bef.Int")가 표시되어 있다.

바람직한 구현예에 따르면, 동일한 형광 파장 범위에서 발광하는 프로브는 (이것이 비변형 상태일 때 및 변형 상태일 때의) 프로브의 타임 시그니처가 구별될 수 있을 정도로 충분히 변별적인 것으로 선택된다.

프로브 농도의 확정 및 반응

일단 프로브 세트가 선택되면, 수와 농도가 공지되지 않은 관심 서열을 함유하는 샘플과 프로브를 포함하는 반응 혼합물이 만들어진다. 이 반응 혼합물은 관심 서열 이외에도 각각의 대상 관심 서열에 대해 선택된 형광 프로브로서, 타임 시그니처가 전술된 바와 같이 직접적으로나 간접적으로 특성규명된 형광 프로브, 자체의 프로브와 양립가능하고 관심 서열을 증폭시킬 수 있는 프라이머 세트, 증폭 반응을 수행하는데 필요한 시약과 효소를 포함한다. PCR 검출의 경우, 반응 혼합물은, 특히 dNTP 및 적어도 1개의 내열성 중합효소(프로브가 TaqMan 유형인 변법에서, 중합효소는 5' → 3' 엑소뉴클레아제 활성을 가짐)로 이루어진다. 반응 혼합물은 또한 만일 관심 서열들중 적어도 1개가 RNA에 있는 것이면, 역전사효소를 포함할 수 있다.

증폭 방법이 PCR이고, 프로브가 TaqMan 유형 또는 분자 비콘 유형인 변법에서, 프라이머는 형광을 띠지 않고, 프로브 양 측중 어느 한 측에 대한 관심 서열 상에 위치한다. 프로브가 TaqMan 유형인 하위 변법에서, 중합효소는 또한 5' → 3' 엑소뉴클레아제 활성을 가진다.

증폭 방법이 PCR이고, 프로브가 Scorpion, Amplifluor, LUX 또는 QZyme 유형의 것인 변법에서, 이 프로브는 또한 프라이머 2개중 하나로서도 작용한다.

그 다음, 열 순환기(4)는 반응 혼합물을, 온도 프로파일을 보이는 1회 이상의주기에 보내는데, 이 회차 수는 관심 RNA 서열의 역전사를 가능하게 하는 주기 및/또는 고온 중합효소 활성화("핫 스타트")를 가능하게 하는 주기가 수행된 후에 적용 가능한 경우, 통상적으로 1회 내지 40회까지 수정될 수 있다. 이러한 주기들이 진행되는 동안, 형광 프로브(들)는 여기되고, 광 센서(6)는 프로브 각각의 형광 파장 범위에 대응하는 형광 채널상에 연속적으로 발광되는 형광을 기록한다. 광 센서(6)의 샘플링 빈도는, 우수한 판별력이 발휘될 수 있도록 만드는 중간 온도가 커버되면서, 주기당 적어도 2회의 형광 측정이 이루어지고, 바람직하게는 변성 단계에서 적어도 1회, 그리고 혼성화 단계(PCR 반응의 경우 신장 단계일 수도 있음)에서는 적어도 1회, 바람직하게는 더 큰 빈도로 형광 측정이 이루어지도록 선택된다.

이후, 분석기(8)는 각각의 채널에 대하여, 그리고 신호가 이 채널의 프로브들에 관한 타임 시그니처 구성요소의 선형 조합의 형태로서, 또는 이의 조합들중 하나의 형태로서 획득되었던 각각의 주기에서 형광 신호를 분해함으로써 광 센서(6)에 의해 각각의 형광 채널에서 측정된 형광 신호를 처리하도록 호출된다. 이는 증폭 신호가 출현되기 이전과 이후에, 또는 각각의 주기에서 비변형 형태로 발견되는 각각의 프로브의 분율 및 변형 형태로 발견되는 각각의 프로브의 분율을 확정하는 것을 가능하게 한다. 이러한 확정은 타임 시그니처의 시각적 해석에 의해 정성적으로 수행될 수 있거나, 또는 적합한 알고리즘으로 수치 연산함으로써 정량적으로 수행될 수 있다.

측정된 시그니처를, 변형 형태 또는 비변형 형태의 프로브 존재의 특징을 나타내는 시그니처의 합, 또는 변형 또는 비변형 형태의 여러 프로브들의 존재 또는 부재의 특징을 나타내는 시그니처의 합을 분해하는 것이 허용된다면, 타임 시그니처를 추출하기 위해 여러 알고리즘이 사용될 수 있다. 사용된 알고리즘은, 예컨대 각각의 주기에 대해 측정된 시그니처 근사치를 최적으로 구하여주는 특징적 시그니처의 선형 조합 가중치를 검색하는 알고리즘일 수 있다. 이러한 가중치는, 이 서열의 증폭 반응에 의한 증폭으로 말미암는 것으로서, 프로브에 특이적인 서열과의 상호작용에 따른 프로브의 변형을 직접적으로, 또는 간접적으로 나타낼 수 있다. 이하 섹션에서는 이 알고리즘의 구현을 자세히 설명하고자 한다.

증폭 반응 동안 적용되는 k번째 열 주기에서, 그리고 소정의 형광 채널에서,광 센서(6)에 의해 측정된 형광 신호 Fk(t)는 이하와 같이 정의될 수 있다:

[식 1]

상기 식 중

- t는 온도 주기 동안의 시간이고,

- n은 반응 혼합물중 프로브의 총 수이고,

- c_i는 지수 i의 프로브 양(또는 농도)이고,

- 는 증폭 반응의 k번째 주기 개시시 변형 형태로 존재하는, 지수 i인 프로브의 양(또는 농도)이고,

- 는 변형되었을 때 지수 i인 프로브의 타임 시그니처를 나타내고,

- 는 변형되지 않았을 때 지수 i인 프로브의 타임 시그니처를 나타낸다.

[식 2]

상기 식 2의 변인에 변화를 가하였을 때 이하와 같은 식이 얻어진다:

[식 3]

양 은 k회차 주기에 대한 비변형 프로브의 시그니처 구성요소의 합이고, c_i는 공지되어 있고 k회차 주기에 독립적인 관계로 공지되어 있음에 따라, 식 3은 k회차 주기에 대해 지수 i인 프로브 각각의 농도에서 측정된 형광 신호를 통합하는 매트릭스 시스템을 정의한다.

이러한 계수들은 매트릭스 식을 상쇄하는 계수들이다:

[식 4]

상기 식 4에 있어 t_i 값은 열 순환기(4)에 의한 열 주기 진행 동안 광 센서(6)에 의한 샘플링 시간에 대응한다. 열 주기는 더 낮은 온도로부터 더 높은 온도에 이르기까지 가열하는 단계와, 더 높은 온도로부터 더 낮은 온도로 냉각하는 단계를 포함하는 것으로 기억된다.

측정값들은 완벽하지 않기 때문에, 차이를 최소화하도록 값들이 선택될 수 있다. 수 많은 알고리즘이 이러한 최적화, 예컨대 최소 제곱이 수행될 수 있도록 만든다.

그러므로 프로브 각각의 타임 시그니처를 명확하게 정의하는 것이 가능하다는 것이 고려될 때, 타임 시그니처 덕분에 정도 2, 3, 4, 5 또는 그 이상의 동시다중화/역동시다중화가 수행되는 것이 가능함은 분명하다. 이러한 동시다중화/역동시다중화는 광 센서(6)의 모든 형광 채널에서 수행되는데, 이 점은 프로브가 주로 발광하는 채널에서 뿐만 아니라, 해당되는 경우 인접 채널들에서도 프로브의 광학적 기여도를 확인하는 것을 가능하게 만든다.

전술된 알고리즘의 일반화된 구현은 프로브를 개별적으로 특성규명하는 것을 필요로 하는데, 이 특성규명은 벡터 c의 확정시 아티팩트(artifact)를 도입할 수 있는 간접 측정(프로브가 결합되지 않은 경우의 프로브 시그니처)을 이용하는 것을 필요로 한다.

유리하게, 선형 변환 U에 의해 공간 변화를 진행함으로써 더욱 직접적인 시그니처(예컨대 프로브의 변형이 이루어지거나 이루어지지 않고 결합된 프로브의 시그니처)를 사용하여 유사한 연산을 수행하는 것이 가능할 수 있다:

[식 5]

여기서 U는 더욱 직접적으로 측정 가능한 타임 시그니처를 사용하여 벡터 c를 확정함에 있어서의 문제와 동일한 문제를 해결할 수 있도록 만든다.

유리하게 분해의 정밀도를 높이기 위하여 타임 시그니처의 몇몇 부분만 사용될 수 있다. 실제로, 중합효소 활성에 기인하는 PCR 주기의 연장 단계 동안 변형된 프로브 양의 변화 또는 단시간 온도 변화 프로파일의 재현불가능성과 같은 몇몇 현상은 임의의 시점에서 시그니처의 형상을 변경할 수 있으며, 변형된 프로브 양의 결정을 위해 시그니처의 이러한 부분이 고려되지 않는 것이 바람직할 수 있다. 일부 구현 모드에서, 타임 시그니처중 각각의 시간의 유의미도는 연산 결과에 대한 영향력을 최적화하기 위해 연산에 대해 가중될 수 있다.

대안적으로, 분석기(8)는 측정된 시그니처의 잔여 근사 오차(residual approximation error)를, 특징적인 시그니처들의 선형 조합에 의해 최적화하기 위해, 예컨대 경사 하강 알고리즘을 사용하여 매트릭스로서가 아닌 순수하게 수치에 의해 작동할 수 있거나, 또는 룩업 테이블 유형의 표를 포함하거나, 입력 측정 신호의 함수로서 각각의 프로브 농도를 복구하도록 훈련된 신경망을 사용할 수 있다.

유리하게도 알고리즘은, 예컨대 증폭 곡선의 형상과 같이 가설에 의해 제약될 수 있는, 주기내 변형된 프로브 양 변화 또는 변형된 프로브 양의 주기에 따른 증량의 영향력을 고려하면서, 시그니처의 선형 조합보다 더 복잡한 모델을 사용할 수 있다. 그 다음 알고리즘은 에너지 함수의 최소화에 의해 제약되는 최적화 연산의 형태를 취할 수 있거나, 시그니처의 연속성을 기반으로 한 증폭의 특정 매개변수를 학습하도록 훈련된 중립 망의 형태를 취할 수 있다.

도 5는 2개의 TaqMan 프로브를 사용한 PCR 반응의 특정 구현예에서의 구현을 나타낸다. 이는, 가수분해된 각각의 프로브의 각각의 농도를 전술된 바와 같이 타임 시그니처의 최적의 합을 분해함으로써 추출한 결과를 보여준다. 상단 곡선은 순수하게 사용되거나(좌측 첫 번째 및 중앙 두 번째), 또는 상이한 양으로 혼합된(우측) 2개의 세균 게놈에 각각 특이적인 프로브로서, 동일한 대역에서 발광하는 2개의 TaqMan 프로브를 함유하는 동일한 혼합물이 사용되는 PCR이 진행되는 동안의 미가공 형광 신호를 나타낸다. 하단 곡선은 추출 동안 단지 제1 프로브만 가수분해되었을 때(좌측 그래프), 단지 제2 프로브만 절단되었을 때(중앙 그래프), 그리고 PCR 동안 상이한 속도로 2개의 프로브가 절단되었을 때(우측 그래프), 동일 매개변수에 따른 추출에 따라 각각의 주기에서 연산된 가수분해 프로브 2개의 각각의 농도를 보여준다. 하단 우측 그래프는, 동일한 형광 신호를 공유하는 프로브를 사용하여 초기의 상이한 농도에서의 변별적 표적(여기서 서열은 비. 서브틸리스(B.subtilis) 또는 이. 콜라이(E.coli) 게놈에 속함) 2개의 증폭 신호를 추출하는, 본 발명에 따른 장치의 역량을 보여준다.

구현예:

실시예 1: 주로 650 nm 이상의 대역에서 발광하는 형광단으로 기능화된 2개의 TaqMan 프로브를 사용한 동시다중 PCR 분석에서 관심 뉴클레오티드 서열의 존재 확인.

이하의 실시예는 본 발명에 따른 방법 및 장치가 650 nm 이상의 대역에서 발광하는 형광단으로 둘 다 기능화된 2개의 TaqMan 프로브를 사용한 동시다중 PCR 분석을 사용하여 2개의 표적 서열중에서 관심 표적 서열의 존재를 확인하는 것을 어떻게 가능하게 만드는지를 보여준다. 관심 서열들중 하나에 대해 각각 특이적인 이들 프로브는 장치의 동일한 채널에서 측정된 형광 신호를 방출하지만, 상이한 타임 시그니처를 가진다. 이러한 시그니처에 관한 지식과 결합된 역동시다중화 알고리즘의 사용은 하나의 표적 또는 다른 표적의 증폭을 확인하는 것을 가능하게 만든다.

프라이머는 [D-알라닌--D-알라닌 리가아제] 유전자의 서열 2개를 증폭하는 데 특이적이다. 이. 패시움(E. faecium)의 경우, 센스 및 안티센스 프라이머의 서열은 GCTTTAGCAACAGCCTATCAG 및 TCGTCCGAACRTCTTCATTT이고, 이. 패칼리스(E. faecalis)의 경우, 센스 및 안티센스 프라이머의 서열은 GTTCTAGTGTCGGAATTAGCA 및 GCTTCRATCCCTTGTTCAAC이다. 2개의 TaqMan 유형 형광 프로브는 이. 패칼리스의 경우 5' 말단이 형광단 ATTO647N으로 기능화되고(서열 TGCTCGGGCATCATAACGGAAAGC, 표 1의 라인 ID 7 참조), 이. 패시움의 경우 5' 말단에서 CY5로 기능화된다(서열 GAAGCGCGCGAAATCGAAGTTGCT, 표 1의 라인 ID 6 참조). 2개의 프로브는 3' 말단이 소광자 BHQ2로 기능화된다. 본 발명자들은 이 2개의 프로브를 각각 "프로브 a"와 "프로브 b"로 식별한다.

제1 단계에서는 2개의 프로브 각각의 시그니처를 별도로 특성규명하기 위해 프로브와 결합된 각각의 프라이머 쌍과 대응 박테리아 서열 DNA가 사용되어 2회의 PCR 반응이 수행된다:

- 첫 번째 PCR에서는 10⁵개의 이. 패칼리스 게놈(추출 및 정량된 DNA)이 증폭되고, 이. 패칼리스에 특이적인 프로브는 0.1 μM 농도로 PCR 혼합물에 첨가된다. 각각의 프라이머에 대해 2개의 프라이머 쌍이 0.5 μM 농도로 PCR 혼합물에 첨가된다. Chronos DX의 채널 4에서 측정된 신호는 "신호 1"이라 지칭된다.

- 두 번째 PCR에서는 10⁶개의 이. 패시움 게놈(추출 및 정량된 DNA)이 증폭되고, 단지 이. 패칼리스 프로브만이 0.2 μM의 농도로 PCR 혼합물에 첨가된다. 각각의 프라이머에 대해 2개의 프라이머 쌍이 0.5 μM의 농도로 PCR 혼합물에 첨가된다. Chronos DX의 채널 4에서 측정된 신호는 "신호 2"라 지칭된다.

이와 같은 2회의 PCR 반응에서, 반응 혼합물은 완충액(Tris-HCL, KCl 25mM, (NH₄)₂SO₄ 16 mM, MgCl₂ 4.5 mM)으로 구성되며, 증폭은 Taq DNA 중합효소 3 U와 dNTP 0.2 mM이 사용되어 수행된다. 적용된 PCR 프로토콜은 95℃에서 1분 동안 수행되는 변성/중합효소의 활성화와, 45회차 PCR 주기(95℃에서 3초 동안 수행되는 변성, 그리고 60℃에서 15초 동안의 혼성화/연장과 같이 두 단계로 구성됨)로 구성된다. 형광 세기 측정은 100 ms마다 수행된다.

도 4는 2회의 실험 동안 채널 4에서 측정된 신호를 보여준다(도 4의 a: 프로브 "a"의 경우 신호 "1", 도 4의 b: 프로브 "b"의 경우 신호 "2").

이들 신호로부터 프로브 각각의 타임 시그니처 구성요소 2개가 추출된다(도 3의 6행 및 7행에 보인 시그니처).

이 2개의 프로브 각각의 시그니처가 정의된 후, 본 발명에 따른 방법이 사용되어 시약의 혼합물로 2회의 동시다중 증폭 반응이 수행된다. 2개의 프로브는 각각 0.1 μM(프로브 a, 이. 패칼리스) 및 0.2 μM(프로브 b, 이. 패시움)의 농도로 PCR 혼합물에 첨가된다. 두 프라이머 쌍은 각각의 프라이머에 대해 0.5μM의 농도로 PCR 혼합물에 첨가된다:

- 첫 번째 PCR에서는 10³개의 이. 패칼리스 게놈(추출 및 정량된 DNA)이 증폭된다. Chronos DX의 채널 4에서 측정된 신호는 "신호 3"이라 지칭된다.

- 두 번째 PCR에서는 10⁵개의 이. 패시움 게놈(추출 및 정량된 DNA)이 증폭된다. Chronos DX의 채널 4에서 측정된 신호는 "신호 4"라 지칭된다.

도 4는 이 두 가지 동시다중 PCR 반응 동안 채널 4에서 측정된 신호를 보여주는것이다(도 4의 c: 신호 "3" 및 도 4의 d: 신호 "4").

그 다음, 신호 "3" 및 신호 "4"는, 본 발명에 따른 알고리즘과 각각의 프로브의 타임 시그니처를 이용하여, 각각의 동시다중 PCR 반응에 대해, 변형된 프로브 각각의 농도를 나타내는 값을 연산함으로써 역동시다중화된다. 이러한 역동시다중화의 결과는 동시다중 증폭 반응 각각에 대해 도 4에 보인다(도 4의 e: 신호 3 분석, 도 4의 b: 신호 4 분석). PCR 반응 주기의 함수로서, 각각의 변형된 프로브 농도를 나타내는 값의 곡선들을 관찰하면, 두 반응 각각에 실제로 존재했던 관심 서열의 성질을 명확하게 확인하는 것이 가능하다.

실시예 2: 대부분 575 nm ~ 615 nm 대역에서 발광하는 형광단으로 들 다 기능화된 2개의 TaqMan 프로브를 사용한 동시다중 PCR 분석에서 관심 뉴클레오티드 서열 2개의 혼합물의 존재 확인.

본 실시예에서는 주로 575 nm ~ 615 nm 형광 대역에서 발광하는 TaqMan 유형 프로브를 사용하여 2개의 세균, 즉 비. 서브틸리스 및 이. 콜라이 세균 게놈 DNA 서열 2개의 각각의 양을 확인하고자 한다. 이. 콜라이에 특이적인 프로브는 형광단 ATTO 565로 표지화되고, 비. 서브틸리스에 특이적인 프로브는 Cy3으로 표지화된다.

상기 실시예에서와 같이 이들 프로브 2개의 타임 시그니처가 확정된 후, 관심 뉴클레오티드 서열 2개를 증폭하는데 필요한 2개의 프라이머 쌍과 2개의 프로브를 포함하는 반응 혼합물이 사용되어 일련의 PCR 증폭이 3회 수행된다.

첫 번째 반응에서는 10⁴개의 비. 서브틸리스 게놈이 첨가되고; 두 번째 반응에서는 10²개의 이. 콜라이 게놈이 첨가되고; 세 번째 반응에서는 10⁴개의 비. 서브틸리스 게놈과 10²개의 이. 콜라이 게놈이 첨가된다. 본 반응들은 장치 2가 사용되어 수행된다. 각각의 PCR 반응의 매 주기 동안 채널 3에 기록된 형광 신호는 도 5의 상단 라인에 보인다.

그 다음, 이들 곡선을 역동시다중화하기 위하여 각각의 증폭 반응에 대해, 그리고 각각의 프로브에 대해 알고리즘(8)이 사용되고, 주기 번호에 따라, 변형된 프로브를 나타내는 값을 보여주는 곡선이 얻어진다. 이들 역동시다중화된 곡선으로부터 반응 혼합물에 존재하는 관심 뉴클레오티드 서열(들)의 성질을 검출하는 것이 가능함이 관찰된다. 이들 6개의 곡선 각각에 대해, 혼합물에 존재하는 관심 뉴클레오티드 서열 각각의 양을 정량화하기 위하여 주기 Ct와 각각의 관심 서열 분자의 초기 양에 관한 로그를 연계시키며 표준 곡선으로 옮겨질 수 있는 임계 사이클(Ct)이 측정될 수 있다.

실시예 3: 관심 인간 및 바이러스 서열의 존재를 검출하기 위한 TaqMan 프로브 "a"의 PCR중 가수분해 동안 생성된 형광 신호에 의해 유도된 광학적 오염의 보정.

PCR 실험은 SARS-CoV-2의 바이러스 게놈에 특이적인 프로브 및 프라이머, 그리고 인간 비인두 상피세포의 내인성 대조군 유전자에 특이적인 프로브 및 프라이머가 사용되어 수행된다. 키트는 장치 2의 광학 채널 3개(채널 1 및 3은 SARS-CoV-2 코로나바이러스 표적 2개용이고, 채널 4는 내인성 대조군 표적용임)내 표적 서열 3개의 검출을 위한 프로브를 함유한다. 이 실험에서, 시료에 함유된 인간 DNA는 한 쌍의 프라이머로 관심 대조군 서열을 PCR 증폭하여 검출된다. 형광 신호는 5' 말단이 형광단으로 기능화된 프로브와 3' 말단이 소광자로 기능화된 프로브에 의해 생성되고, 이 형광단은 장치 2의 4번 광학 채널에서 검출 가능한 파장 대역에서 형광 신호를 발광한다. 이 프로브는 도 6의 a에 보인 바와 같이 프로브 "a"라 지칭되고, 이의 신호는 "신호 1"이라 지칭된다.

프로브 a의 발광 스펙트럼 확산으로 말미암아, 프로브에 의해 생성된 신호는또한 장치(2)의 광학 채널 3번에서도 검출된다. 이 신호는 "신호 2"라 지칭된다. 이 오염은 3번 채널에 존재하는 SARS-CoV-2의 표적 서열 검출에 사용된 프로브로 말미암아 생성된 신호의 가시적인 증가를 초래하며, 이는 샘플에 이러한 표적 서열이 존재하는 것으로 잘못 해석될 수 있다. 이 프로브는 프로브 "b"라고 지칭된다. 신호 2는 도 6의 b에 도시되어 있다.

이 실험에 사용된 PCR 프로토콜은 50℃에서 30초 동안 수행되는 역전사, 95℃에서 1분 동안 수행되는 핵산의 변성 및 중합효소의 활성화, 이후 45회의 PCR 주기(95℃에서 3초간 수행되는 변성과, 60℃에서 15초간 수행되는 혼성화/연장과 같이 2개의 단계로 구성됨)로 구성된다. 형광 측정의 샘플링 주기는 PCR 전반에 걸쳐 100 ms이다.

광학적 오염 신호를 제거하기 위해 하기 단계들을 포함하는, 본 발명에 따른 방법이 적용된다:

- 장치(2)의 광학 채널(3) 및 광학 채널(4)에서 검출되고, 키트에 존재하는 프로브 2개의 타임 시그니처를 결정하는 단계. 이 시그니처는 키트와 함께 제공된 양성 증폭 대조군 1.2 μl의 검출이 동반되는 PCR로부터 얻어진다. 이 시그니처는 신호 3 및 신호 4로서 확인된다.

- 본 발명에 따른 분석기(8)의 알고리즘을 이용하여, 신호 2에 존재하는 신호를 역동시다중화하는 단계. 역동시다중화 결과는 도 6의 c에 보인다. 프로브 b의 신호에 대응하는 곡선은 완벽하게 평탄한 것으로 관찰되는데, 이는 SARS-CoV-2의 바이러스 게놈 관심 서열이 샘플중에 존재하지 않음을 나타낸다.

실시예 4: 동시다중 PCR 반응에 사용되는 "분자 비콘" 유형 형광 프로브의 타임 시그니처를 처리함에 의한 관심 서열의 검출.

이 실시예에서는, "분자 비콘"(MB, Molecular Beacon) 유형 프로브를 사용한 PCR 증폭 덕분에 샘플중 관심 뉴클레오티드 서열의 존재를 검출하기 위해 본 발명에 따른 방법 및 장치가 사용된다. 1개 이상의 분자 비콘을 사용하는 방법에서, 이러한 프로브는 TaqMan 유형의 프로브와 달리 반응 동안 절단되지 않는다. 이를 위하여, 선택된 중합효소는 5' → 3' 엑소뉴클레아제 활성이 없고, 그 대신 가닥 치환(Strand Displacement; SD) 활성을 가진다.

이 실시예에서 PCR은 92°C에서 30초 동안 초기 변성/중합효소의 활성화와, 및 40회의 PCR 주기(92°C에서 5초 동안의 변성 및 62°C에서 30초 동안의 혼성화/연장과 같이 두 단계로 구성됨)로 수행된다.

반응 혼합물은 MgCl₂를 최종 농도 3 mM로 첨가함으로써 완충액(SD 중합효소 반응 완충액)으로 구성되고, 증폭은 5 U의 SD 중합효소 HotStart와 0.2 mM의 dNTP를 사용함으로써 수행된다. 농도 0.2 μM(센스 프라이머, 서열 CCGCCAATGGTACCGCAATCCCT) 및 농도 2 μM(안티센스 프라이머, 서열 GCTACTGCCATTATATTTTACGGTC)의 프라이머가 사용되어, fimH 이. 콜라이(LB 배지에서 세균 배양 및 정량후 PCR에 직접 첨가된 10⁴개의 세균) 유전자의 표적 서열이 증폭된다. 분자 비콘 유형 형광 프로브(서열 FAM-CGGGCACGCCAATGTTTATGTAAACCTTGGCCCG-BHQ1)는 0.03 μM의 농도로 존재한다.

45회 주기의 PCR 반응 동안 장치(2)의 채널 1에서 측정된 신호는 도 6의 d에 제시된다. 이 곡선으로부터, 이 분자 비콘 유형 프로브의 양쪽 타임 시그니처 구성요소가 추출된다. 이 구성요소는 참조번호 ID 10으로서 도 3에 보인다.

그 다음, 이 시그니처는 동시다중 PCR 반응 동안 기록된 신호를 역동시다중화하는데 사용되는데, 이 과정에서는 이 프로브는 여러 서열들 가운데 대응 뉴클레오티드 서열의 존재를 검출하기 위해 사용된다.

실시예 5: PCR 반응에서 구현된 QUASR 방법에 따른, 프로브의 타임 시그니처 확정.

본 발명은 QUASR(미통합 증폭 신호 리포터의 소광: Quenching of Unintegrated Amplification Signal Reporters) 시스템을 사용하여 PCR 증폭 동안 형광 곡선을 분석하는 데 사용될 수 있다.

이 실시예에서 PCR은 95℃에서 1분 동안 초기 변성/중합효소의 활성화, 및 45회 PCR 주기(95℃에서 3초 동안 변성 및 60℃에서 15초 동안 혼성화/연장과 같이 2개의 단계로 구성됨)로 수행된다. 형광 측정의 샘플링 주기는 PCR 전반에 걸쳐 200 ms이다.

반응 혼합물은 완충액(Tris-HCl, KCl 25 mM, (NH₄)₂SO₄ 16 mM, MgCl₂ 4.5 mM)으로 구성되며, 증폭은 3 U의 SuperHotTaq DNA 중합효소와 0.2 mM의 dNTP를 사용하여 수행된다. 각각의 서열 FAM-ACGCCAATGTTTATGTAAACCTTGCGCC 및 ACATTTCACAACACGAGCTGACGA의 "센스" 및 "안티센스" 프라이머는 0.5 μM 농도로 사용되고, 10⁵개의 이. 콜라이 게놈(LB 배지에서 세균 배양후 추출 및 희석)이 증폭된다. "센스" 프라이머 GGCGCAAGGTTTACATAAACATTGGCGT-BHQ1의 상보적 올리고뉴클레오티드는 0.3 μM 농도로 반응 혼합물에 첨가된다.

시간의 함수인 형광 세기 곡선은 45회의 PCR 주기 동안 측정되고, 도 6의 e에 도시되어 있다. 이 곡선은, 사용된 QUASR 유형 프로브의 타임 시그니처 구성요소 둘 다를 추출하는 것을 가능하게 만든다. 이 시그니처는 ID 9로서 도 3에 보인다.

그 다음, 이 시그니처는 동시다중 PCR 반응 동안 기록된 신호를 역동시다중화하는데 사용되며, 이 과정에서 다른 서열들중 대응하는 뉴클레오티드 서열의 존재를 검출하기 위해 이 프로브가 사용된다.

실시예 6: 인플루엔자 호흡기 바이러스 A, B, 세포융합 호흡기 바이러스 A 및 B, SARS-CoV-2 증후군 키트에서 5중 PCR을 이용한 뉴클레오티드 서열 5개의 검출.

본 발명에 기재된 방법 및 장치는, 오로지 이 장치의 광학 채널 2개(채널 3, 채널 4)만을 이용하여 5개의 표적을 검출하기 위해 5개의 프라이머 쌍과 5개의 프로브를 사용하여 수행되는 5중 PCR을 실시하여 바이러스 5개의 존재를 검출할 수 있도록 만든다.

이때 사용된 프라이머와 프로브는 이하 표적들에 특이적인 것들이다:

채널 3:

표적 1 - 인플루엔자 A:

- 센스 프라이머 GGAATGGCTAAAGACAACAAT

- 안티센스 프라이머 CTGCAGTCCTCGCTCACT

- 프로브 ATTO565-TTCACGCTCACCGTGCCCAGTGA-BHQ2

표적 2 - 인플루엔자 B:

- 센스 프라이머 CTCA ACTCTCTTCGAGCGT

- 안티센스 프라이머 TCTGGTGATAATCGGTGCTCTT

- 프로브 CY3-TCTGGTGATAATCGGTGCTCTT-BHQ2

표적 3 - SARS-CoV-2:

- 센스 프라이머 GCTTCAGCGTTCTTCGGAAT

- 안티센스 프라이머 CAATTGATGGCACCTGTAG

- 프로브 Alexa Fluor 568-ATTGGCATGGAAGTCACACCTTCGG-BHQ2

채널 4:

표적 4 - RSVB:

- 센스 프라이머 TCCTACTCTCTCAAGTGTGGTC

- 안티센스 프라이머 CTTGGTTTCTTGTGTACCTCT

- 프로브 ATTO647N-AGGCAATGCAGCAGGTCTAGGCAT-BHQ2

표적 5 - A형 RSV:

- 센스 프라이머 GCAGGATTGTTTATGAATGCCT

- 안티센스 프라이머 CACACTTGTCCATTCTGCT

- 프로브 Cy5-GGTGCAGGGCAAGTGATGTTACGG-BHQ2

프라이머는 0.1 μM ~ 0.6 μM의 농도로 혼합물에 첨가되고; 프로브는 0.1 μM ~ 0.5 μM의 농도로 반응에 첨가된다. RT-PCR 혼합물은 완충액(Tris-HCl, KCl 25 mM, (NH₄)₂SO₄ 16 mM, MgCl₂ 4.5 mM)으로 구성되며, 증폭은 3 U ~ 10 U의 TAQ 중합효소(5' 엑소뉴클레아제 활성)와 3 U의 WarmStart 역전사효소를 사용하여 수행된다. 사용된 PCR 프로토콜은, 60°C에서 1분 동안 수행되는 역전사, 95°C에서 1분 동안 수행되는 변성/중합효소의 활성화, 그리고 45회의 PCR 주기(95°C에서 3초 동안 수행되는 변성과, 60°C에서 15초 동안 수행되는 혼성화/연장과 같이 2개의 단계로 구성됨)로 구성된다. 형광 세기 측정은 100 ms마다 수행된다.

프로브의 타임 시그니처를 확정하기 위해 5회차 1개를 제외한 모든 프로브가 포함되는 5회의 PCR 반응이 진행된다.

그 다음, 이러한 타임 시그니처는 5중 PCR 반응 동안 기록된 신호를 역동시다중화하여, 단일 반응에서 5개의 관심 뉴클레오티드 서열중 임의의 서열의 존재를 검출하는데 사용된다.

따라서, 타임 시그니처 덕분에 프로브 각각의 타임 시그티처를 명확하게 정의하는 것이 가능하다는 점이 고려되면서 2중, 3중, 4중, 5중 또는 그 이상의 동시다중화/역동시다중화가 수행될 수 있음이 명백하다.

핵산 서열의 이처럼 동시다중 검출 능력은, 예컨대 임상 샘플에서 SARS-CoV-2 코로나바이러스 게놈의 점 유전자 돌연변이 다수의 동시 검출을 수행할 수 있는 가능성과 같이 수많은 가능성을 열어주는데, 이 점은 이 샘플에 존재하는 변이체를 신속하게 확인할 수 있게 만들고, 이 샘플에 존재하는 바이러스 게놈의 서열결정보다 더 신속하고 비용이 적게 드는 대안이 된다.

Claims

핵산 서열을 동시다중 검출하기 위한 장치로서,
소광자 및 형광단을 합한 형광 프로브 적어도 2개를 함유하는 시험관내 핵산 증폭 시약을 사용하여 일련의 열 주기를 수행하도록 구성되되, 상기 형광 프로브는 변별적 핵산 서열을 각각 표적화하도록 구성되고, 상기 형광단은 중첩 형광 파장에서 발광하는 열 순환기(4), 상기 형광 파장 범위에서 상기 형광단에 의해 발광되는 방사선을 측정하도록 구성되되, 각각의 프로브에 의해 발광되는 방사선은 프로브가 비변형 상태, 즉 소광자가 형광 발광을 감소시키거나 또는 실질적으로 감소시키지 않는 상태인지, 아니면 소광자가 형광 발광에 역효과를 나타내는 변형 상태인지 여부에 따라 가변적인 광 센서(6), 그리고 각각의 형광 프로브에 대해 측정된 형광으로부터 유래한 타임 시그니처로부터 변형된 상태일 때의 농도를 나타내는 값을, 1개 이상의 프로브를 포함하는 반응 혼합물의 소정 열 주기에 대한 시간의 함수로서 확정하도록 구성되되, 이 프로브는 각각 전체가 실질적으로 비변형 상태 또는 변형 상태일 수 있고, 측정 적어도 2회는 열 주기중 적어도 일부의 주기 동안 수행되며, 변형 상태일 때의 농도를 나타내는 상기 값은, 핵산 서열 1개 이상과 상호작용함에 따라 형광 프로브가 비변형 상태로부터 변형 상태로 변경되도록 유도하기 위해, 각각이 변별적 형광 프로브와 결합된 핵산 서열 1개 이상의 존재를 정성화하여 할 수 있도록 만드는 분석기(8)를 포함하는, 핵산 서열 동시다중 검출용 장치.
제1항에 있어서, 상기 열 순환기(4)는 PCR 열 순환기이고, 상기 적어도 2개의 형광 프로브는 TaqMan 프로브, 분자 비콘, 이중 형광 전달 프로브, Scorpion 프로브, Amplifluor 프로브, MGB 이클립스 프로브, LUX 프로브, QuASR 프로브 및 QZyme 프로브를 포함하는 군으로부터 선택되는, 핵산 서열 동시다중 검출용 장치.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 시험관내 핵산 증폭 시약은 소광자와 형광단을 합한 형광 프로브 3개를 포함하고, 상기 형광 프로브는 중첩 형광 파장에서 발광하는 상기 형광단과 변별적 핵산 서열을 각각 표적화하도록 구성된, 핵산 서열 동시다중 검출용 장치.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시험관내 핵산 증폭 시약은 소광자와 형광단을 합한 형광 프로브 군 적어도 2개를 포함하고, 상기 형광 프로브는 변별적 핵산 서열을 각각 표적화하도록 구성되며, 상기 형광단은 형광 프로브의 각각의 군 내에 중첩 형광 파장에서 발광하는, 핵산 서열 동시다중 검출용 장치.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분석기(8)는 형광 프로브 각각의 형광 측정, 타임 시그니처 및 각각의 농도의 일정성을 기반으로 매트릭스 시스템을 풀어 변형 상태인 형광 각각의 농도를 나타내는 값을 확정하도록 구성되는, 핵산 서열 동시다중 검출용 장치.
제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 분석기(8)는 형광 프로브 군당 1개의 매트릭스 시스템을 풀도록 구성되는, 핵산 서열 동시다중 검출용 장치.
제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 분석기(8)는 최소화 알고리즘을 이용하도록 구성되는, 핵산 서열 동시다중 검출용 장치.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분석기(8)는 경사 하강을 적용하거나 신경망을 사용하여 변형 상태인 형광 프로브 각각의 농도를 나타내는 값을 확정하도록 구성된, 핵산 서열 동시다중 검출용 장치.
핵산 서열을 동시다중 검출하기 위한 방법으로서,
a) 분석될 샘플과, 소광자 및 형광단을 결합한 형광 프로브 적어도 2개를 함유하는 시험관내 핵산 증폭 시약을 포함하는 시약 혼합물에 대해 다수 회차의 열 주기를 수행하는 작업으로서, 상기 형광 프로브는 변별적 핵산 서열을 각각 표적화하도록 구성되고 상기 형광단은 중첩 형광 파장에서 발광함;
b) 각각의 열 주기가 진행되는 동안, 상기 형광 파장 범위에서 적어도 2회의 형광 측정을 수행하는 작업으로서, 각각의 프로브에 의해 발광되는 방사선은, 각각의 프로브가 비변형 상태, 즉 소광자가 형광 발광을 감소시키거나 감소시키지 않는 상태 또는 변형 상태, 즉 소광자가 형광 발광에 역효과를 발휘하는 상태에 따라 가변적임;
c) 작업 b)의 측정과, 측정된 형광으로부터 유도된 타임 시그니처로부터 변형 상태일 때의 각각의 형광 프로브 농도를 나타내는 값을, 각각 그 전체가 실질적으로 비변형 상태이거나 변형 상태일 수 있는 프로브 1개 이상을 포함하는 반응 혼합물의 소정의 열 주기에 대한 시간의 함수로서 확정하는 작업으로서, 변형 상태일 때의 농도를 나타내는 값은, 핵산 서열 1개 이상과 상호작용함에 따라 형광 프로브가 비변형 상태로부터 변형 상태로 변경되도록 유도하기 위해, 각각이 변별적 형광 프로브와 결합된 핵산 서열 1개 이상의 존재를 정성화할 수 있도록 함;
을 포함하는, 핵산 서열 동시다중 검출 방법.
제9항에 있어서, 상기 작업 b)는 PCR 주기를 수행하는 작업을 포함하고, 상기 적어도 2개의 형광 프로브는 TaqMan 프로브, 분자 비콘, 이중 형광 전달 프로브, Scorpion 프로브, Amplifluor 프로브, MGB 이클립스 프로브, LUX 프로브, QuASR 프로브 및 QZyme 프로브를 포함하는 군으로부터 선택되는, 핵산 서열 동시다중 검출 방법.
제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 작업 b)는 소광자와 형광단을 합한 형광 프로브 3개를 포함하는 시험관내 핵산 증폭 시약을 사용하는 것을 포함하고, 상기 형광 프로브는 중첩 형광 파장에서 발광하는 상기 형광단과 변별적 핵산 서열을 각각 표적화하도록 구성되는, 핵산 서열 동시다중 검출 방법.
제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작업 b)는 소광자와 형광단을 합한 형광 프로브 군 적어도 2개를 포함하는 시험관내 핵산 증폭 시약을 사용하는 것을 포함하고, 상기 형광 프로브는 형광 프로브 각각의 군내 중첩 형광 파장에서 발광하는 상기 형광단과 변별적 핵산 서열을 각각 표적화하도록 구성되는, 핵산 서열 동시다중 검출 방법.
제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작업 c)는 형광 프로브 각각의 형광 측정, 타임 시그니처 및 각각의 농도의 일정성을 기반으로 매트릭스 시스템을 푸는 것을 포함하는, 핵산 서열 동시다중 검출 방법.
제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 작업 c)는 형광 프로브 군당 1개의 매트릭스 시스템을 푸는 것을 포함하는, 핵산 서열 동시다중 검출 방법.
제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작업 c)는 경사 하강을 적용하거나 신경망을 사용하는 것을 포함하는, 핵산 서열 동시다중 검출 방법.