FR3125824A1 - Dispositif et procédé de détection multiplexée de séquences d’acides nucléiques - Google Patents

Abstract

Dispositif et procédé de détection multiplexée de séquences d’acides nucléiques Un dispositif de détection multiplexée de séquences d’acides nucléiques comprend un thermocycleur (4) agencé pour réaliser une série de cycles thermiques avec un réactif d’amplification d’acides nucléiques in vitro contenant au moins deux sondes de fluorescence combinant un quencher et un fluorophore, lesdites sondes de fluorescence étant agencées pour chacune cibler une séquence d’acide nucléique distincte et lesdits fluorophores émettant dans des plages de longueurs d’onde de fluorescence se chevauchant, un capteur de lumière (6) agencé pour mesurer un rayonnement émis par lesdits fluorophores, et un analyseur (8) agencé pour déterminer, pour chaque sonde de fluorescence respective, une valeur représentative d’une concentration, à partir de signatures temporelles tirées de la fluorescence mesurée en fonction du temps pour un cycle thermique donné d’un mélange réactionnel comprenant une ou plusieurs sondes et d’au moins deux mesures réalisées au cours de certains au moins des cycles thermiques. Fig.1

Description

Dispositif et procédé de détection multiplexée de séquences d’acides nucléiques

L’invention concerne le domaine de la détection de séquences d’acides nucléiques par réaction PCR, ou tout autre procédé d’amplification d’acides nucléiques in vitro, et en particulier la détection multiplexée de séquences d’acides nucléiques par réaction en chaîne par polymérase (PCR).

Dans de nombreuses situations du domaine de la biologie moléculaire, il est nécessaire d’identifier avec un grand niveau de confiance la présence d’une ou de plusieurs séquences d’ADN ou d’ARN d’intérêt dans un échantillon, et de mesurer leur concentration relative respective, ces séquences figurant dans un ensemble de séquences d’intérêt.

Dans ces situations, il est souvent intéressant de pouvoir tester la présence de plusieurs séquences simultanément dans le même échantillon en un seul test. Les causes de ce besoin peuvent être l’urgence, la petite taille de l’échantillon, la faible concentration des séquences d’intérêt dans cet échantillon, ou encore le coût du test (réactifs, consommables, taux d’occupation de l’automate, etc.).

Lorsque cette ou ces séquences sont en quantités trop faibles pour être caractérisées, il est classique de mettre en œuvre une amplification exponentielle in vitro de ces séquences, par exemple par une réaction en chaîne par polymérase (PCR). Ce procédé vise à obtenir une quantité suffisante des séquences recherchées à l’aide d’un mélange de paires d’amorces oligonucléotidiques localisées dans ces séquences d’intérêt. Plusieurs variantes de la PCR ont été développées (par exemple LATE-PCR, ASPCR). D’autres procédés d’amplification d’acides nucléiques in vitro sont également connus, tels que le procédé NASBA (nucleic acid sequence–based amplification), le procédé TMA (transcription mediated amplification), la LAMP (loop-mediated isothermal amplification), la SDA (strand displacement amplification) et l’amplification en cercle roulant (Rolling Circle Amplification).

Différents procédés sont déjà connus pour identifier la présence d’une ou de plusieurs séquences nucléiques d’intérêt, après les avoir amplifiées le cas échéant. Il est possible de réaliser un séquençage sans a priori, ou ciblé, des acides nucléiques présents dans l’échantillon. De tels procédés sont en général longs et coûteux et restent limités à certaines applications. Les procédés les plus utilisés consistent à utiliser des sondes oligonucléotidiques qui peuvent s’hybrider sur une portion caractéristique de leur séquence d’intérêt. Ces sondes peuvent être mises en œuvre selon plusieurs familles de procédés :

- puce à ADN : il s’agit de fixer les diverses sondes sur un support solide, par exemple une matrice à 2 dimensions, et les repérer par leurs coordonnées dans cette matrice (principe également appelé «DNA microarray» en anglais). Cette détection en phase inhomogène présente un coût important de fabrication et une cinétique d’hybridation lente qui nuit aux performances en termes de sensibilité,

- puce liquide : il s’agit d’ordonner les sondes sur une puce liquide, voir par exemple le procédé xMap de Luminex publié à l’adresse https://www.luminexcorp.com/xmap-technology/. Ce procédé est complexe à utiliser car il nécessite un cytofluorimètre en flux, et l’analyse qu’il met en œuvre n’est pas instantanée car les billes sont analysées séquentiellement,

- format en phase homogène : les sondes peuvent être constituées d’un oligonucléotide unique ou de l’association de deux oligonucléotides, libres en solution. Les sondes sont classiquement marquées au moyen d’un fluorophore et d’un quencher. Lorsqu’une sonde se trouve mélangée à un échantillon qui ne contient pas sa séquence cible, et que la température est dans l’intervalle de température compatible avec son hybridation, la fluorescence de cette sonde est diminuée ou supprimée par la proximité spatiale du quencher et du fluorophore. En revanche, lorsqu’elle interagit avec sa séquence cible, le fluorophore et le quencher se retrouvent maintenus à distance et la sonde devient fluorescente.

Le format en phase homogène peut être utilisé selon plusieurs variantes, dont les plus utilisées sont détaillées ci-dessous :

- la balise moléculaire : dans cette variante, la sonde est constituée d’un seul oligonucléotide, conçu de telle façon que le fluorophore et le quencher sont à proximité immédiate lorsque la sonde n’est pas hybridée et se trouve à basse température. Cette proximité résulte le plus souvent de la présence de séquences complémentaires de quelques bases aux extrémités de la séquence spécifique de la séquence d’intérêt. En solution, ces deux extrémités complémentaires s’hybrident en formant une double hélice, ce qui a pour effet de rapprocher et de maintenir à courte distance le fluorophore et le quencher. Lorsque les séquences cibles sont présentes dans la solution et que la température est en-dessous ou au voisinage de la température de fusion du duplex formé entre la sonde et sa cible, les sondes qui s’hybrident à leurs séquences cibles deviennent fluorescentes, et

- l’essai par l’activité nucléase 5’ : dans cette variante, lorsque la sonde est hybridée à sa séquence cible, l’hybridation d’une amorce en 5’ de cette sonde déclenche la polymérisation d’un nouveau brin d’ADN. Lorsque la polymérase rencontre l’extrémité 5’ de la sonde, elle la clive grâce à son activité exonucléasique de 5’ vers 3’, ce qui a pour effet de séparer de façon irréversible le fluorophore du quencher. Le fluorophore peut alors exprimer sa fluorescence de manière plus efficace puisque le rayonnement n’est plus absorbé par le quencher. Le principe du procédé exploitant l’activité exonucléase de 5’ vers 3’ a été décrit dans le brevet US 5 210 015 et dans une publication de Holland PM et al. «Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5'----3' exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase», Proceedings of the National Academy of Sciences Aug 1991, 88 (16) 7276-7280; DOI: 10.1073/pnas.88.16.7276 PNAS 1991en 1991. Dans ce procédé, la sonde était marquée par en 5’ à l’aide d’un marqueur radioactif. Le procédé a ensuite été amélioré en remplaçant ce marqueur par un fluorophore avec l’ajout d’un quencher en 3’ qui permet à la sonde de subir un changement de fluorescence selon qu’elle est libre en solution, ou hybridée, ou digérée (brevet US 5723591, sondes utilisables avec le procédé Taq-Man™).

Ces formats peuvent eux-mêmes être mis en œuvre selon des variantes telles que les procédés utilisant des sondes (qui peuvent jouer également le rôle d’amorce dans certains de ces procédés) de type Scorpion (marque déposée), Amplifluor (marque déposée), MGB Eclipse (marque déposée), Light Upon eXtension (LUX, marque déposée), Quenching of Unincorporated Amplification Signal Reporters (QUASR) ou QZyme (marque déposée) par exemple.

Le format en phase homogène présente de nombreux avantages parmi lesquels : une excellente cinétique d’interactions des sondes avec leur séquences cibles respectives, un faible coût, et d’excellentes performances en termes de sensibilité.

Cependant, la réalisation de plusieurs mesures simultanément est limitée par la capacité de séparer les signaux issus des différentes sondes mélangées dans le même test, ce qui constitue un inconvénient majeur. En effet, il faut que des sondes ciblant des séquences distinctes présentent des longueurs d’onde d’émission pouvant être séparées les unes des autres pour pouvoir les utiliser lors d’une même mesure.

En effet, quelle que soit la variante retenue (balise moléculaire ou essai d’activité nucléase 5’ ou autre), il n’est pas possible d’utiliser plus d’une sonde par canal de fluorescence. Les thermocycleurs en temps réel disponibles sur le marché mesurent un niveau de fluorescence pour chaque canal à un moment unique de chaque cycle de la réaction d’amplification. Par conséquent, si deux sondes émettant dans le même canal de fluorescence sont mélangées, il n’est pas possible de distinguer leur contribution respective à la production du signal de fluorescence.

Ainsi, un thermocycleur en temps réel capable de mesurer 4 canaux de fluorescence ne peut détecter et discriminer la fluorescence émise que par 4 sondes maximum et les réactions d’amplification réalisées avec cet appareil ne peuvent pas détecter plus de 4 séquences cibles par réaction.

Plusieurs procédés ont été proposés pour contourner cette limitation :

- discrimination par le découplage de l’excitation et de l’émission : dans ce procédé, des sondes émettant dans le même canal de fluorescence peuvent être mélangées à condition qu’elles puissent être excitées de manière distincte. Certains fluorophores peuvent en effet être excités à des longueurs d’onde éloignées les unes des autres, mais émettre dans la même bande de longueur d’onde. C’est notamment le cas des fluorophores qui émettent avec un large décalage Stokes. Ainsi, la société Cepheid a récemment amélioré son appareil GeneXpert (marque déposée) en étendant le nombre de fluorophores détectés de 6 à 10 (voir l’article de Chakravorty et al. «Detection of Isoniazid-, Fluoroquinolone-, Amikacin-, and Kanamycin-Resistant Tuberculosis in an Automated, Multiplexed 10-Color Assay Suitable for Point-of-Care Use», 2017, Journal of Clinical Microbiology, 55, 183, publié à l’adresse https://doi.org/10.1128/JCM.01771-16). Dans la bande d’émission orange par exemple, 3 fluorophores peuvent ainsi être discriminés (CF9, excitable dans le bleu, CF8, excitable dans le vert, CF4, excitable dans le jaune). Ce procédé nécessite un module optique permettant d’analyser la composition spectrale du signal émis : l’excitation dans le vert produit des signaux émis par les fluorophores CF3, C8 et CF10 dans le jaune, l’orange et l’infrarouge respectivement. Il présente de plus l’inconvénient des procédés utilisant plusieurs bandes de fluorescence, à savoir la contamination optique d’une bande, ou canal, dans une bande adjacente. Ces contaminations optiques (également appelées “crosstalks”) peuvent perturber l’analyse des résultats dans les bandes adjacentes et être source de résultats erronés, du type faux positifs par exemple.

- discrimination par la méthode de la courbe de fusion : il est connu de distinguer des sondes partageant la même plage d’émission de fluorescence en distinguant les sondes par leur température de fusion. Pour cela, on réalise une courbe de fusion après avoir initié la formation du duplex entre la séquence d’intérêt et la (ou les) sonde(s) oligonucléotidique(s), en augmentant progressivement et de façon monotone la température T de la solution, tout en enregistrant le signal de fluorescence F. Le maximum de la courbe –dF/dT indique la température de fusion Tf du duplex. Cette température de fusion permet de s’assurer que le duplex formé est un homoduplex, voire un hétéroduplex si cette température est inférieure à la température connue de l’homoduplex, voire même d’identifier, dans ce cas, la ou les mutations à l’origine de l’hétéroduplex lorsque les séquences mutantes possibles sont répertoriées dans une liste limitative et que leurs températures de fusion respectives avec la sonde sont préalablement connues de façon biunivoque.

En ce qui concerne la méthode de la courbe de fusion, certains des procédés de détection de séquences d’intérêt décrits plus haut sont incompatibles avec les conditions nécessaires pour mesurer la température de fusion.

C’est en particulier le cas des procédés suivants :

- amplification avec une polymérase ayant une activité exonucléase 5’->3’ : c’est le cas le plus fréquent, comme avec le procédé de l’essai par l’activité nucléase 5’, les polymérases non mutées ayant en général une telle activité. Il en résulte une hydrolyse de l’extrémité 5’ des sondes lorsque celle-ci n’est pas bloquée, et les molécules de sonde hydrolysée ne sont plus utilisables pour réaliser la courbe de fusion.

- amplification asymétrique : dans le cas général des amplifications exponentielles dépendantes d’amorces comme la PCR, l’amplification est dite symétrique et ces amorces sont en concentration stœchiométrique, ce qui a pour conséquence que l’amplification engendre autant de brins d’ADN sens qu’anti-sens. Par construction, l’un de ces brins partage la même séquence, ou une séquence très proche, de celle de la sonde, de sorte que ce brin peut rentrer en compétition avec la sonde pour s’hybrider à la séquence cible, et supprimer le signal émis par cette sonde. Pour contourner cette difficulté, on peut réaliser une amplification asymétrique en modifiant le rapport des concentrations des amorces afin de favoriser la formation du brin d’ADN complémentaire de la sonde, mais l’amplification cesse alors rapidement d’être exponentielle lorsque l’amorce en faible quantité a été consommée pour devenir seulement linéaire, ce qui rallonge la durée du test et/ou diminue sa sensibilité,

- amplification multiplexe avec une amorce universelle : on utilise ici des amorces contenant une région conservée unique dans leur région 5’. Cela permet de diminuer avantageusement et efficacement l’occurrence des dimères d’amorces (Brownie et al «The elimination of primer-dimer accumulation in PCR», Nucleic acids Res. 1997 Nucleic Acids Res. 1997 Aug 15;25(16):3235-41. doi: 10.1093/nar/25.16.3235, publié à l’adresse https://doi.org/10.1093/nar/25.16.3235.) et d’amplifier exponentiellement un grand nombre de séquences d’intérêt avec un seul couple d’amorce. En revanche, il est évidemment impossible de réaliser une amplification asymétrique, puisque l’amorce utilisée amplifie chacun des brins sens et anti-sens de la séquence d’intérêt.

Dans le cas où la sonde n’est pas hydrolysée, son hybridation peut être supprimée ou considérablement diminuée par la présence du brin complémentaire formé pendant la réaction d’amplification symétrique. Cette diminution du signal peut résulter d’au moins deux mécanismes :

- la compétition lors de l’hybridation avec ce brin complémentaire, qui, même en concentration inférieure à celle de la sonde, peut s’hybrider en premier et de façon préférentielle,

- le déplacement de la sonde par le brin complémentaire, qui peut s’hybrider dans des régions homologues en 5’ ou 3’ de la séquence d’intérêt, même après l’hybridation de celle-ci. Ce brin complémentaire peut alors déplacer la sonde par migration de branche («toehold-mediated strand displacement» en anglais) selon une cinétique qui dépend notamment de la longueur de de ces régions homologues (voir l’article de Srinivas et al. «On the biophysics and kinetics of toehold-mediated DNA strand displacement», Nucleic acids research 2013, publié à l’adresse https://doi.org/10.1093/nar/gkt801),

- la discrimination par les méthodes TOCE et MuDT de la société Seegene : la méthode ci-dessus selon la courbe de fusion est réalisée en point final et ne permet donc pas de réaliser une quantification des concentrations relatives des séquences d’intérêt si elles sont simultanément présentes. La société Seegene a décrit deux procédés pour contourner cette limitation. Le premier, dénommé TOCE («Tagging Oligonucleotide Cleavage & Extension», marque déposée) permet de détecter jusqu’à 5 sondes par canal d’émission de fluorescence en utilisant des sondes fluorescentes “catcher” distinguables par leur température de fusion. L’inconvénient principal est la complexité de mise en œuvre de ce procédé, qui nécessite d’ajouter plusieurs oligonucléotides en plus de ceux utilisés pour amplifier les séquences d’intérêt. Ces oligonucléotides sont susceptibles de générer des produits artéfactuels qui consomment des réactifs au détriment de la production des produits de PCR désirés. Le deuxième, dénommé MuDT («Multi Ct values in a single channel», marqué déposée), permet de combiner jusqu’à 3 sondes dans les mêmes canaux d’excitation et d’émission. Les sondes présentent des températures de fusion distinctes, séparées de plusieurs degrés. L’amplification par PCR est réalisée avec des cycles dont le profil de température comprend un ou plusieurs paliers lors de la remontée de la température vers la température de fusion voisine de 95°C. Les paliers de température sont choisis entre les températures de fusion des sondes, et le signal de fluorescence est enregistré à chacun de ces paliers. Par calcul, on peut déterminer la contribution de chacune des sondes au signal de fluorescence total. Un inconvénient important est que le thermocycleur utilisé doit pouvoir gérer ce type de profil particulier de cycle, qui est incompatible avec une PCR rapide dans laquelle on cherche à minimiser les temps de changement de température au cours des cycles. Ce procédé est en outre incompatible avec la détection en mode TaqMan dans lequel la sonde est hydrolysée.

À ce jour, les procédés qui prétendent être multiplex sont donc extrêmement insatisfaisants, soit par leur complexité, soit par leur performance, soit par leur incompatibilité avec des formats en phase homogène répandus comme les sondes TaqMan. Pour la plupart, on pourrait même les qualifier de multi-fluorescence plutôt que multiplex, puisqu’il s’agit surtout de faire des mesures « parallèles » ou simultanées, mais pas multiplexées, c’est-à-dire dont les signaux sont combinés entre eux.

L’invention vient améliorer la situation. À cet effet, elle propose un dispositif de détection multiplexée de séquences d’acides nucléiques comprenant un thermocycleur agencé pour réaliser une série de cycles thermiques avec un réactif d’amplification d’acides nucléiques in vitro contenant au moins deux sondes de fluorescence combinant un quencher et un fluorophore, lesdites sondes de fluorescence étant agencées pour chacune cibler une séquence d’acide nucléique distincte et lesdits fluorophores émettant dans des plages de longueurs d’onde de fluorescence se chevauchant, un capteur de lumière agencé pour mesurer un rayonnement émis par lesdits fluorophores dans lesdites plages de longueurs d’onde de fluorescence, le rayonnement émis par chaque sonde variant selon que celle-ci est dans un état non modifié dans lequel le quencher atténue ou n’atténue pas sensiblement l’émission de fluorescence, ou dans un état modifié dans lequel le quencher a un effet opposé sur l’émission de fluorescence, et un analyseur agencé pour déterminer, pour chaque sonde de fluorescence respective, une valeur représentative d’une concentration dans un état modifié, à partir de signatures temporelles tirées de la fluorescence mesurée en fonction du temps pour un cycle thermique donné d’un mélange réactionnel comprenant une ou plusieurs sondes, lesquelles peuvent être chacune sensiblement entièrement dans un état non modifié ou modifié, et d’au moins deux mesures réalisées au cours de certains au moins des cycles thermiques, lesquelles valeurs représentatives d’une concentration dans un état modifié permettent de qualifier la présence d’une ou plusieurs séquences d’acide nucléique chacune associée à une sonde de fluorescence distincte de manière à provoquer un changement d’état de la sonde de fluorescence de l’état non modifié vers l’état modifié lorsqu’elles interagissent.

Ce dispositif est particulièrement avantageux car il permet de détecter la présence d’une séquence d’intérêt à l’aide d’une sonde fluorescente caractérisée dont on a au préalable caractérisé une signature temporelle. Ainsi, la détermination de cette signature temporelle permet d’utiliser simultanément des sondes émettant dans une même bande d’émission de fluorescence, mais dont les signatures temporelles sont suffisamment différentes pour que leurs contributions respectives puissent néanmoins être séparées. Avantageusement, cette signature temporelle permet également d’éliminer efficacement les contaminations optiques potentielles d’une bande de fluorescence à une bande adjacente. Avec ce dispositif, les contaminations optiques potentielles peuvent même être exploitées pour détecter la présence d’une séquence d’intérêt.

Selon divers modes de réalisation, l’invention peut présenter une ou plusieurs des caractéristiques suivantes :

- le thermocycleur est un thermocycleur PCR, et les au moins deux sondes de fluorescence sont choisies parmi le groupe comprenant les sondes TaqMan, les balises moléculaires, les sondes duales à transfert de fluorescence, les sondes Scorpion, les sondes Amplifluor, les sondes MGB Eclipse, les sondes LUX, les sondes QUASR et les sondes QZyme,

- le réactif d’amplification d’acides nucléiques in vitro comprend trois sondes de fluorescence combinant un quencher et un fluorophore, lesdites sondes de fluorescence étant agencées pour chacune cibler une séquence d’acide nucléique distincte et lesdits fluorophores présentant des plages de longueurs d’onde de fluorescence se chevauchant,

- le réactif d’amplification d’acides nucléiques in vitro comprend au moins deux groupes de sondes de fluorescence combinant un quencher et un fluorophore, lesdites sondes de fluorescence étant agencées pour chacune cibler une séquence d’acide nucléique distincte et lesdits fluorophores présentant des plages de longueurs d’onde de fluorescence se chevauchant au sein de chaque groupe de sondes de fluorescence

- l’analyseur est agencé pour déterminer la valeur représentative de la concentration de chaque sonde de fluorescence dans un état modifié en résolvant un système matriciel basé sur les mesures de fluorescence, les signatures temporelles et la constance de la concentration respective de chaque sonde de fluorescence,

- l’analyseur est agencé pour résoudre un système matriciel par groupe de sondes de fluorescence,

- l’analyseur est agencé pour utiliser un algorithme de minimisation, et

- l’analyseur est agencé pour déterminer la valeur représentative de la concentration de chaque sonde de fluorescence dans un état modifié en appliquant une descente du gradient ou en utilisant un réseau de neurones.

L’invention concerne également un procédé de détection multiplexée de séquences d’acides nucléiques comprenant les opérations suivantes :

a) réaliser une pluralité de cycles thermiques sur un mélange réactionnel comprenant un échantillon à analyser et un réactif d’amplification d’acides nucléiques in vitro contenant au moins deux sondes de fluorescence combinant un quencher et un fluorophore, lesdites sondes de fluorescence étant agencées pour chacune cibler une séquence d’acide nucléique distincte et lesdits fluorophores émettant dans des plages de longueurs d’onde de fluorescence se chevauchant,

b) lors de chaque cycle thermique, réaliser au moins deux mesures de fluorescence dans lesdites plages de longueurs d’onde de fluorescence, le rayonnement émis par chaque sonde variant selon que celle-ci est dans un état non modifié dans lequel le quencher atténue ou n’atténue pas sensiblement l’émission de fluorescence, ou dans un état modifié dans lequel le quencher a un effet opposé sur l’émission de fluorescence,

c) déterminer une valeur représentative de la concentration de chaque sonde de fluorescence dans un état modifié à partir des mesures de l’opération b) et de signatures temporelles tirées de la fluorescence mesurée en fonction du temps pour un cycle thermique donné d’un mélange réactionnel comprenant une ou plusieurs sondes, lesquelles peuvent être chacune sensiblement entièrement dans un état non modifié ou modifié,

lesquelles valeurs représentatives d’une concentration dans un état modifié permettent de qualifier la présence d’une ou plusieurs séquences d’acide nucléique chacune associée à une sonde de fluorescence distincte de manière à provoquer un changement d’état de la sonde de fluorescence de l’état non modifié vers l’état modifié lorsqu’elles interagissent.

Selon divers modes de réalisation, le procédé peut présenter une ou plusieurs des caractéristiques suivantes :

- l’opération b) comprend la réalisation de cycles PCR, et les au moins deux sondes de fluorescence sont choisies parmi le groupe comprenant les sondes TaqMan, les balises moléculaires, les sondes duales à transfert de fluorescence, les sondes Scorpion, les sondes Amplifluor, les sondes MGB Eclipse, les sondes LUX, les sondes QUASR et les sondes QZyme,

- l’opération b) comprend l’utilisation d’un réactif d’amplification d’acides nucléiques in vitro comprenant trois sondes de fluorescence combinant un quencher et un fluorophore, lesdites sondes de fluorescence étant agencées pour chacune cibler une séquence d’acide nucléique distincte et lesdits fluorophores présentant des plages de longueurs d’onde de fluorescence se chevauchant,

- l’opération b) comprend l’utilisation d’un réactif d’amplification d’acides nucléiques in vitro comprenant au moins deux groupes de sondes de fluorescence combinant un quencher et un fluorophore, lesdites sondes de fluorescence étant agencées pour chacune cibler une séquence d’acide nucléique distincte et lesdits fluorophores présentant des plages de longueurs d’onde de fluorescence se chevauchant au sein de chaque groupe de sondes de fluorescence,

- l’opération c) comprend la résolution d’un système matriciel basé sur les mesures de fluorescence, les signatures temporelles et la constance de la concentration respective de chaque sonde de fluorescence,

- l’opération c) comprend la résolution d’un système matriciel par groupe de sondes de fluorescence, et

- l’opération c) comprend l’application d’une descente de gradient ou l’utilisation d’un réseau de neurones.

D’autres caractéristiques et avantages de l’invention apparaîtront mieux à la lecture de la description qui suit, tirée d’exemples donnés à titre illustratif et non limitatif, tirés des dessins sur lesquels :

- représente un diagramme générique d’un dispositif selon l’invention,

- montre l’intensité de fluorescence obtenue en fonction du temps au cours de deux réactions de PCR à l’aide d’une sonde TaqMan marquée respectivement avec le fluorophore ATTO 565 et le fluorophore Cy3,

- représente la signature temporelle d’un ensemble de sondes, avec, pour chacune d’elles, le profil du cycle de température utilisé, les composantes respectives de cette signature lorsque la sonde n’a pas interagi, et a interagi, avec la séquence cible dont elle est spécifique,

- illustre la mise en œuvre du procédé avec le dispositif dans le mode particulier d’une réaction PCR réalisée avec deux sondes TaqMan émettant dans la même bande de fluorescence, comprenant la décomposition en une somme optimale des signatures temporelles comme décrit plus haut,

- illustre la mise en œuvre du procédé avec le dispositif dans le mode particulier d’une réaction PCR réalisée avec deux sondes TaqMan émettant dans une même bande de fluorescence, comprenant la décomposition en une somme optimale des signatures temporelles comme décrit plus haut, lors d’une amplification multiplexe de deux séquences d’intérêt,

- illustre la mise en œuvre du procédé avec le dispositif pour éliminer les signaux de contamination optique d’un canal à un canal adjacent, ainsi que dans le mode particulier d’une réaction PCR réalisée avec des sondes de type balises moléculaires et QUASR.

Les dessins et la description ci-après contiennent, pour l'essentiel, des éléments de caractère certain. Ils pourront donc non seulement servir à mieux faire comprendre la présente invention, mais aussi contribuer à sa définition, le cas échéant.

L’invention propose un dispositif capable de réaliser une détection multiplexée de séquences d’acides nucléiques, c’est-à-dire en utilisant des sondes comprenant un ou plusieurs fluorophores permettant l’identification de séquences génétiques par modification du signal émis lors de l’interaction desdites sondes avec lesdites séquences (par exemple sondes TaqMan, Molecular Beacon, FRET, etc.), lesdits fluorophores émettant dans des plages de longueurs d’onde de fluorescence pouvant éventuellement se chevaucher.

L’interaction de la sonde avec la séquence cible dont elle est spécifique peut prendre plusieurs formes selon le procédé de détection utilisé. Il existe en effet plusieurs procédés connus, tels que, sans que cette liste soit limitative, la détection par PCR en temps réel utilisant des sondes de type TaqMan, des balises moléculaires (molecular beacon), des sondes MGB Eclipse, des sondes duales utilisant un transfert de fluorescence (FRET), ou la détection par PCR en temps réel utilisant des amorces fluorescentes servant également de sondes de type Scorpion, Amplifluor, LUX , QUASR ou QZyme.

La nature chimique de la sonde peut également variée selon les procédés. Elle peut être rendue en acide désoxyribonucléique (ADN), en acide ribonucléique (ARN), ou en analogues d’acide nucléique de synthèse tels que les acides peptidonucléique (Peptide Nucleic Acids, PNA), les acides nucléiques « cadenassés » (Locked Nucleic Acids, LNA). La sonde peut inclure des groupements chimiques modifiant son interaction avec la séquence génétique dont elle est spécifique, tels qu’un groupement se fixant dans le petit sillon de la double hélice (Minor Groove Binder, MGB).

Selon le procédé mis en œuvre, la sonde peut consister en une molécule oligonucléotidique unique comprenant un ou plusieurs fluorophores et un ou plusieurs groupements chimiques ayant pour effet de moduler l’intensité de leur fluorescence selon l’état de la sonde, appelés «quenchers» dans la suite du texte. La sonde peut également consister en deux ou plus molécules, les unes comprenant un ou plusieurs fluorophores, les autres comprenant un ou plusieurs groupements chimiques ayant pour effet de moduler l’intensité de leur fluorescence en fonction des interactions possibles définissent l’état de la sonde. C’est par exemple le cas avec une sonde QUASR comprenant deux oligonucléotides, ou avec une sonde duale à transfert de fluorescence de type FRET constituée de deux oligonucléotides, l’un portant à son extrémité 3’ un fluorophore capable de se désexciter en transférant son énergie à un quencher porté en 5’ d’un deuxième oligonucléotide, ce quencher pouvant lui-même se désexciter en émettant un rayonnement lumineux dans une bande de longueur d’onde différente de celle du fluorophore.

Selon le procédé de détection mis en œuvre, l’interaction de la sonde peut consister en une simple hybridation avec la séquence génétique dont elle est spécifique, ou une hybridation suivie d’une hydrolyse médiée par une activité enzymatique, ou une hybridation suivie d’une incorporation dans un brin d’ADN existant médiée par l’action d’une ligase, ou dans un brin d’ADN synthétisé médiée par l’action d’une polymérase.

Dans la suite du texte, on utilisera de manière générique le terme «interagir» pour décrire l’action d’une sonde qui interagit avec la séquence génétique dont elle est spécifique selon l’un des procédés décrits ci-dessus, et le terme «modifié e par l’interaction» le processus selon lequel les caractéristiques de fluorescence d’une sonde sont modifiées par son interaction avec la séquence génétique dont elle est spécifique selon un des procédés décrits ci-dessus.

La détection multiplexée selon l’invention est rendue possible grâce à la détermination de signatures temporelles de fluorescence pour chaque type de sonde fluorescente utilisée, à l’acquisition de deux signaux de fluorescence ou plus au cours d’au moins deux cycles thermiques appliqués pendant la réaction d’amplification, et à la mise en œuvre d’un algorithme permettant de séparer les signaux émis par ces sondes en utilisant ces signatures.

Ainsi, dans un mode de réalisation particulier de l’invention, le dispositif applique à ces sondes un ou plusieurs cycles thermiques en les excitant optiquement et en enregistrant en continu ou de manière échantillonnée les signaux de fluorescence émis dans une ou plusieurs bandes de longueurs d’onde, ce qui permet de réaliser la mesure multiplex. Lorsque la méthode d’amplification comprend une suite de cycles thermiques comme dans le cas de la PCR, les signaux de fluorescence sont enregistrés au cours d’au moins deux de ces cycles, et de manière préférentielle, au cours de chaque cycle. Lorsque la méthode d’amplification est isotherme, au moins deux cycles thermiques sont appliqués à l’échantillon, l’un au début, l’autre à la fin de la réaction, pendant lesquels les signaux de fluorescence émis sont enregistrés.

Plus précisément, et comme représenté sur la , le dispositif 2 selon l’invention comprend un thermocycleur 4 capable d’appliquer deux cycles de température ou plus à un mélange réactionnel de l’amplification contenant au moins deux sondes fluorescentes, un capteur de lumière 6 ayant la capacité de réaliser au moins deux mesures d’intensité de fluorescence par cycle dans au moins une bande de longueur d’onde, et un analyseur 8 agencé pour réaliser la mesure de la concentration relative des différents états dans lesquels se trouvent les différentes sondes au cours de la réaction, et pour en déduire la présence d’une ou de plusieurs séquences nucléotidiques d’intérêt ciblées par lesdites sondes. Dans l’exemple décrit ici, le capteur de lumière 6 comprend à la fois la source d’excitation des sondes fluorescentes et le photodétecteur correspondant. En variante, le capteur de lumière 6 pourrait être séparé en source et détecteur. Dans l’exemple décrit ici, l’analyseur 8 est un programme ou code informatique approprié exécuté sur un ou plusieurs processeurs. Par processeurs, il doit être compris tout processeur adapté au calcul de projection de textures sur des plans et de traitements liés aux voxels. Un tel processeur peut être réalisé de toute manière connue, sous la forme d’un microprocesseur pour ordinateur personnel, d’une puce dédiée de type FPGA ou SoC (« system on chip » en anglais), d’une ressource de calcul sur une grille ou dans un cloud, d’un microcontrôleur, ou de toute autre forme propre à fournir la puissance de calcul nécessaire à la réalisation décrite plus bas. Un ou plusieurs de ces éléments peuvent également être réalisés sous la forme de circuits électroniques spécialisés tel un ASIC. Une combinaison de processeur et de circuits électroniques peut également être envisagée.

Le thermocycleur 4 est capable d’appliquer des températures variables situées dans une plage donnée à un échantillon mélangé avec un réactif d’amplification d’acides nucléiques in vitro, ce réactif contenant au moins deux sondes fluorescentes ayant des signatures temporelles distinctes. Le thermocycleur 4 peut appliquer de façon répétée un profil de température donné à ce mélange. L’analyseur 8 reçoit ou détermine les valeurs de température appliquées à l’échantillon. Dans l’exemple décrit ici, ces valeurs sont envoyées à l’analyseur 8. Selon divers modes de réalisation, elles peuvent être mesurées dans ou au contact de l’échantillon, ou extrapolées en fonction du temps. Dans un mode de réalisation préféré de l’invention, le thermocycleur 4 est un thermocycleur rapide (c’est-à-dire avec un changement de température de l’ordre de plus de 5°C par seconde, et de manière plus préférée de plus de 15°C par seconde). Cela est rendu possible grâce à l’analyseur 8 selon l’invention. Conventionnellement, les thermocycleurs rapides ne sont pas utilisés pour essayer de réaliser des mesures multiplex car les informations qu’ils fournissent ne sont pas suffisamment précises.

Le capteur de lumière 6 est agencé pour soumettre le mélange réactionnel à une excitation lumineuse dans une ou plusieurs bandes de longueur d’onde dans l’ultraviolet et/ou dans le visible et/ou dans l’infrarouge, et de mesurer l’intensité de l’émission de fluorescence résultant de cette excitation, dans une ou plusieurs bandes de longueurs d’onde dans l’ultraviolet et/ou dans le visible et/ou dans l’infrarouge, en réalisant une ou plusieurs mesures ponctuelles pendant une durée déterminée, ou une série de mesures ponctuelles à une fréquence donnée (par exemple, pendant 100ms toutes les 200ms). Ces mesures de fluorescence en fonction du temps dans la ou les bandes de longueurs d’onde accessibles sont envoyées à l’analyseur 8. Dans un mode de réalisation préféré, la périodicité d’acquisition est comprise entre 10ms et 10s, et de manière encore plus préférée entre 100ms et 1s. Ainsi, contrairement à tout l’état de l’art connu, l’analyseur 8 peut suivre de manière quasi-continue l’évolution de réponse en fluorescence au long des cycles thermiques.

Dans un mode particulier et préféré du procédé selon l’invention, on utilise la réaction de PCR pour détecter et discriminer la présence ou l’absence d’une cible génétique en combinaison, le réactif de PCR contenant un jeu de sondes combinant un quencher et un fluorophore (telles que des sondes TaqMan par exemple), lesquelles sondes fluorescentes utilisent des fluorophores distincts qui peuvent émettre dans une bande ou plage commune de longueurs d’onde.

Grâce à la connaissance préalable de la signature temporelle de chacune des sondes, l’analyseur 8 est capable de mesurer de manière non-ambiguë, pour chaque sonde présente dans le réactif, la modification de signal de fluorescence résultant de l’interaction entre la sonde et les produits d’amplification (ou amplicons) issus de la séquence génétique dont elle est spécifique, indépendamment les unes des autres, et d’atteindre ainsi un niveau de multiplexage de 2n, voire 3n ou 4n, avec un dispositif selon l’invention capable de mesurer le signal de fluorescence dans n bandes de longueurs d’onde simultanément.

Ce procédé permet de reconnaître qu'une séquence d’intérêt est présente dans un échantillon, non pas par la simple observation d’une augmentation de la fluorescence à basse température (60°C par exemple) avec le temps comme cela est fait classiquement au cours d’une analyse par amplification d’acides nucléiques in vitro en temps réel, mais par l’observation du changement du profil de fluorescence mesuré par le capteur de lumière 6 lors d'un cycle thermique. La montre deux courbes de fluorescence enregistrées avec le dispositif 2, dans un même canal de fluorescence, mais au cours de réactions de PCR, dans lesquelles les sondes utilisées sont fonctionnalisées avec deux fluorophores différents (ATTO 565 et Cy3). Ces courbes montrent que les profils de fluorescence en fonction du temps au cours d’un cycle varient, en fonction de la nature de la sonde, et selon que le cycle se situe au début ou à la fin de l’amplification.

Dans un mode particulier du procédé selon l’invention, le cycle thermique est un cycle de PCR et comprend l’augmentation de la température d’une température basse à une température haute, la température basse étant comprise entre 55 et 70°C, de préférence entre 58 et 65°C et la température haute étant comprise entre 80 à 100°C, de préférence entre 90 et 98°C, suivi de la décroissance de la température de la température haute à la température basse.

Dans la présente description, les cycles thermiques sont décrits de manière générique comme comprenant l’augmentation de la température de 60 à 95°C, suivi de la décroissance de la température à 60°C. Ces valeurs sont particulièrement adaptées à la mise en œuvre d’une réaction PCR rapide. Il va de soi que les valeurs de ces plages (60°C, 95°C et 60°C) pourraient être modifiées pour s’adapter à des cycles thermiques particuliers utilisés lors d’une amplification par PCR avec par exemple l’utilisation de 3 températures au lieu de 2, ou même de cycles thermiques ajoutés au cours d’une amplification isotherme selon un profil de température compatible avec la stabilité thermique des réactifs utilisés.

Dans un mode particulier du procédé selon l’invention, la modification de signal résulte de l’hydrolyse de la ou des sondes dans le cas de sondes TaqMan clivées par une polymérase possédant une activité exonucléase.

De plus, le dispositif 2 peut être utilisé pour déterminer la signature temporelle de chacune des sondes présentes dans le mélange réactionnel.

Principe général de l’invention

Le principe général mis en œuvre par l’invention repose sur la détection de la modification du signal de la fluorescence émise par une sonde selon qu’elle a interagi ou non avec la séquence nucléotidique d’intérêt dont elle est spécifique. Les travaux de la Demanderesse ont permis d’identifier 1) que ce signal de fluorescence dépend d’une manière générale de la température au travers de plusieurs phénomènes physiques plus ou moins bien connus qui se produisent de façon concomitante, dont les principaux vont être cités ci-après ; 2) que la variation du signal de la fluorescence de cette sonde avec la température peut être mesurée en appliquant un cycle de température à l’échantillon contenant la ou les sondes : 3) que la courbe de fluorescence obtenue varie elle-même selon que la sonde a interagi ou non avec la séquence nucléotidique dont elle est spécifique ; 3) que cette variation de la variation du signal au cours d’un cycle est propre à la sonde et constitue une signature qui peut être exploitée pour détecter, au moment de l’application d’un cycle thermique, la fraction de cette sonde qui se trouve avoir interagi avec la séquence cible dont elle est spécifique ; 4) que la détermination de cette fraction à au moins deux instants choisis de la réaction d’amplification peut permettre d’en déduire la présence ou l’absence, ou la concentration initiale à travers la détermination d’un cycle seuil, dans le mélange réactionnel d’amplification, de la séquence nucléotidique d’intérêt dont la sonde est spécifique.

Rappelant que dans la plupart des cas, le niveau de fluorescence d’une sonde interagissant avec une séquence nucléotidique spécifique varie grâce à la modification de la distance entre un fluorophore et un quencher (cas des sondes TaqMan, Molecular Beacon, FRET, MGB Eclipse, et des amorces faisant fonction de sondes Scorpion, Amplifluor, LUX, QUASR, etc), cette variation de fluorescence peut dépendre de la température de plusieurs manières.

Tout d’abord, la variation du rendement quantique de la fluorescence du fluorophore utilisé, qui diminue au fur et à mesure que la température augmente. Par exemple, le rendement de la rhodamine B décroît de façon monotone avec la température en passant de 0,8 à 10°C à 0,3 à 60°C (voir l’article de Kubin et al. «Fluorescence quantum yields of some rhodamine dyes», Journal of Luminescence 1983, doi.org/10.1016/0022-2313(82)90045-X). Dans ce cas précis, cette décroissance est due pour l’essentiel à l’augmentation du quenching dynamique avec la température (voir la note technique de Arnaoutakis 2016, «Quenching of fluoresence with temperature», Technical note from EDINBURGH INSTRUMENTS publié à l’adresse https://www.edinst.com/wp-content/uploads/2018/10/TN_27-Quenching-of-Fluorescence-with-Temperature.pdf). Cette variation du rendement quantique avec la température varie elle-même avec la nature du fluorophore. Ainsi, la variation du rendement quantique de fluorescence avec la température de deux fluorophores émettant dans une même plage de longueurs d’onde peut différer d’un fluorophore à l’autre,

Ensuite, le changement de la conformation de la sonde, qui vient modifier la distance entre le fluorophore et le quencher, ou l’emplacement du fluorophore ou du quencher (par exemple, le fluorophore d'une sonde peut être à proximité du quencher d'une autre sonde ou aux quenchers de plusieurs sondes) a une conséquence sur le signal de fluorescence émis par le fluorophore. Plus généralement, le mélange de la réaction d’amplification contenant les sondes fluorescentes et les autres réactifs est régulé par des interactions intramoléculaires et intermoléculaires entre les différentes espèces chimiques. Les oligonucléotides en solution peuvent adopter différentes conformations en fonction de la température et du stade de la réaction d’amplification (la présence en concentration croissante de séquences complémentaires aux sondes générées lors de la réaction d’amplification). En première approximation, pour une sonde intacte, différentes situations sont possibles à chaque instant de la réaction d’amplification :
1) la sonde interagit avec une séquence complémentaire générée pendant la réaction d’amplification,
2) la sonde n’interagit avec aucune séquence complémentaire, ou
3) la sonde est liée à des structures complexes, avec un ou plusieurs oligonucléotides en solution liés entre eux.

La sonde peut donc adopter différents états, par exemple différentes conformations, selon qu’elle se trouve dans l’une ou l’autre de ces situations.

L’efficacité du quencher à quencher la fluorescence émise par le fluorophore est un troisième facteur influençant la variation de l’intensité de la fluorescence de la sonde avec la température.

Enfin, l’état de la sonde peut être également un facteur important : Dans le procédé TaqMan, lorsque la sonde s’est hybridée sur sa séquence cible et a été hydrolysée dans le mode de révélation par l’activité exonucléase 5’ vers 3’ de la polymérase, le fluorophore est clivé de façon irréversible de la sonde et sa fluorescence n’est plus impactée par la proximité du quencher. L’interaction de la sonde avec la séquence nucléotidique dont elle est spécifique se traduit ainsi par un changement d’état dans lequel le fluorophore de la sonde n’est plus lié moléculairement au quencher.

La Demanderesse a découvert expérimentalement que les lois de variations de chacun de ces phénomènes avec la température peuvent varier elles-mêmes de façon importante en fonction de la structure de la sonde et en particulier de la nature du fluorophore, de la séquence de la sonde et de la nature du quencher, ainsi que de la proximité avec une autre sonde. En fonction des paramètres, la combinaison de ces différentes lois peut produire une loi globale très variable d’une sonde à l’autre. En particulier, l’effet de la température sur le rendement quantique du fluorophore et celui de la température sur la conformation de la sonde ont des contributions de signes opposés et de constantes de temps différentes.

Les travaux de la Demanderesse lui ont permis d’identifier que, pour un profil de température donné, cette courbe constitue la première composante d’une signature temporelle.

Lorsqu’une séquence nucléotidique complémentaire à l’une des sondes est présente dans un échantillon à une certaine concentration et que l’une des molécules portant cette séquence interagit avec une molécule de cette sonde spécifique de cette séquence, la loi de variation de l’intensité de la fluorescence en fonction de la température de cette sonde peut être modifiée, que ce soit parce que la sonde adopte une autre conformation due à son état d’hybridation (comme c’est le cas pour les sondes Molecular Beacon), parce qu’un composant de la sonde est à proximité d’un autre composant de la sonde ayant un effet perturbateur (comme c’est le cas pour les sondes duales de type FRET ou les amorces Scorpion) ou encore qu’une polymérase possédant une activité exonucléase 5’ vers 3’ est présente dans l’échantillon, et que le fluorophore des sondes qui se sont hybridées avec leur séquence complémentaire est clivé par cette exonucléase (comme c’est le cas pour les sondes TaqMan), la loi de variation de la fluorescence en fonction de la température de cette sonde se trouve modifiée.

Les travaux de la Demanderesse lui ont permis d’identifier que, pour un profil de température donné, cette variation constitue une deuxième composante de la signature temporelle qui vient se substituer à la première composante de la signature.

En analysant et comparant les signaux de fluorescence enregistrés pendant un cycle de température donné avant et après les interactions résultant de la présence du produit d’amplification, il devient donc possible de calculer, pour chaque sonde et à l’instant où est appliqué le cycle thermique, sa fraction qui a été modifiée par cette interaction, et d’en déduire ainsi la quantité du produit d’amplification issu de cette séquence spécifique présent dans l’échantillon grâce à ces deux composantes de signature temporelle.

Au cours des premiers cycles ou des premiers instants d’une réaction d’amplification dans laquelle se trouve une certaine quantité d’une séquence d’intérêt, les molécules de la sonde dont elle est spécifique ne sont pas modifiées significativement par la présence d’un produit d’amplification issu de cette séquence d’intérêt (sauf dans le cas particulier d’une concentration initiale élevée de cette séquence d’intérêt), et le signal de fluorescence enregistré provient uniquement de la composante de la signature temporelle de la sonde non-modifiée par l’interaction avec la séquence dont elle est spécifique. Après un certain nombre de cycles, une fraction croissante de la sonde est modifiée à la suite de l’interaction avec le produit d’amplification issu de la séquence d’intérêt, et le signal enregistré est une combinaison linéaire des contributions des composantes de la signature temporelle respectives de la sonde non-modifiée et modifiée par l’interaction avec les produits d’amplification issus de la séquence d’intérêt.

Si on mélange plusieurs sondes fluorescentes émettant dans une même bande de fluorescence et qu’on enregistre en continu, avec une fréquence d’échantillonnage suffisante, l’intensité de fluorescence émise par ce mélange de sondes au cours d’un ou plusieurs cycles (avant et après modification de ces sondes par la présence de la ou des séquences ciblées amplifiées), on peut, grâce à leurs signatures temporelles respectives, séparer à chaque cycle les contributions au signal de chacune des sondes en déterminant pour chaque sonde la fraction qui se trouve sous forme non-modifiée et la fraction qui se trouve sous forme modifiée par l’interaction avec la séquence nucléotidique dont elle est spécifique.

Lorsque des sondes émettent majoritairement dans des bandes de fluorescence non pas communes mais adjacentes comme c’est le cas avec de nombreux fluorophores organiques, le procédé permet notamment d’éliminer les contaminations optiques d’une bande à l’autre (“crosstalks” en anglais) ou toute autre variation de fluorescence ne provenant pas de la modification de la sonde par l’interaction avec la séquence dont elle est spécifique. Dans l’état de l’art, l’élimination de ces contaminations optiques est réalisée classiquement par l’application d’une correction linéaire à l’aide d’une matrice carrée dont les termes non-diagonaux dépendent de l’identité des fluorophores utilisés dans un kit multiplex. Par exemple, avec un thermocycleur disposant de 4 canaux de détection de la fluorescence, l’utilisateur renseigne l’identité des fluorophores utilisés dans son kit. Cette indication permet de sélectionner une matrice de correction des contaminations optiques adaptée à cette combinaison de fluorophores.

Dans le procédé selon l’invention, une telle correction avec une matrice n’est plus possible puisque plusieurs fluorophores émettant de façon prépondérante dans un canal A peuvent contaminer, à des taux distincts, le signal dans un canal adjacent B. Ainsi, le taux de contamination engendré par l’ensemble de ces fluorophores dans le canal B dépendra de l’amplification ou non de chacune des séquences d’intérêt détectée dans le canal A. Dans le procédé selon l’invention, on détermine ou on connait, pour une sonde émettant de façon prépondérante dans un canal A, les signatures temporelles de cette sonde dans le ou les canaux adjacents. Et on utilise ces signatures pour déterminer précisément leur contribution au signal dans ce ou ces canaux adjacents. On peut ainsi retrancher cette contribution au signal pour éliminer de façon efficace les contaminations optiques.

La caractérisation des sondes fluorescentes par la détermination de leurs signatures temporelles respectives, dans leur forme non-modifiée et leur forme modifiée permet donc de calculer, à l’instant où un cycle thermique est appliqué au mélange réactionnel, la fraction d’une sonde modifiée après interaction avec la séquence dont elle est spécifique. Si on applique ce cycle thermique de façon répétée au cours d’une réaction d’amplification d’acides nucléiques in vitro, et qu’on en déduit par calcul la fraction de la sonde qui se trouve sous la forme modifiée à chaque cycle, cette fraction étant indicative de la quantité des produits d’amplification issus de la séquence nucléotidique dont la sonde est spécifique, on peut établir la courbe de la variation de cette fraction en fonction du temps, ou du nombre de cycles dans le cas d’une réaction de type PCR, et en déduire un cycle seuil (Ct, «threshold cycle» en anglais) qui permet ensuite d’en déduire la quantité de la séquence d’intérêt dont la sonde est spécifique (par exemple en reportant la valeur de ce cycle seuil sur une courbe d’étalonnage).

Dans le mode particulier où la réaction d’amplification est la réaction de PCR et l’une au moins des sondes est une sonde TaqMan, la première composante de la signature temporelle de cette sonde est constituée de la variation de l’intensité de sa fluorescence au cours du cycle thermique en absence d’hybridation de cette sonde avec sa séquence complémentaire. La seconde composante de sa signature est la variation de l’intensité de sa fluorescence au cours du cycle thermique après son hydrolyse, c’est-à-dire après clivage du fluorophore (ou du quencher) du reste de la sonde.

Dans le mode particulier où la réaction d’amplification est la PCR et l’une au moins des sondes utilisées est une balise moléculaire (Molecular Beacon), la première composante de la signature temporelle de cette sonde est constituée de la variation de l’intensité de sa fluorescence au cours du cycle thermique en absence d’hybridation de cette sonde avec sa séquence complémentaire. La seconde composante de sa signature est la variation de l’intensité de sa fluorescence au cours du cycle thermique en présence de sa séquence complémentaire. Avantageusement, les sondes Molecular Beacon ont l’avantage de fournir un meilleur contraste de fluorescence entre leurs différents états de repliement.

Dans le mode particulier où la réaction d’amplification est la PCR et l’une au moins des sondes est de type FRET, la première composante de la signature temporelle de cette sonde est constituée de la variation de l’intensité de la fluorescence de l’oligonucléotide portant le fluorophore accepteur au cours du cycle thermique en absence d’hybridation de cet oligonucléotide avec sa séquence complémentaire. La seconde composante de sa signature est la variation de l’intensité de la fluorescence au cours du cycle thermique en présence de sa séquence complémentaire, dont le signal FRET lorsque les deux oligonucléotides de la sonde sont hybridés de façon adjacente sur leur séquence cible commune. Avantageusement, les sondes FRET pouvant être plus souples pour caractériser des mutations ou pour limiter le nombre de séquences d’oligonucléotides dans le réactif d’amplification par PCR par l’utilisation de plusieurs sondes FRET sur un même amplicon, leur utilisation permet de limiter le nombre d’oligonucléotide en présence, donc leur interaction, donc de faciliter l’augmentation du multiplexage.

Détermination de la signature temporelle d’une sonde donnée

Pour chaque séquence d’intérêt, on conçoit une sonde oligonucléotidique fluorescente comprenant une séquence oligonucléotidique complémentaire et caractéristique d’une portion de ladite séquence d’intérêt, et dont on connaît, ou à défaut dont on détermine, pour un canal de fluorescence donné, la signature temporelle (Snm(t), Sm(t)) comprenant deux composantes constituées de la courbe de l’intensité de fluorescence en fonction du temps pour un cycle thermique fixé, lorsque qu’aucune sonde n’est modifiée par l’interaction avec sa séquence d’intérêt, et lorsque la totalité des molécules de la sonde sont modifiées par l’interaction avec sa séquence d’intérêt respectivement.

Cette sonde peut être de type Taqman, Molecular Beacon, sonde duale à transfert de fluorescence, Scorpion, Amplifluor, MGB Eclipse, LUX, QUASR ou QZyme sans que cette liste soit limitative.

Comme on l’a vu plus haut, pour un canal de fluorescence donné, la signature temporelle comprend une composante pour la forme non modifiée de la sonde, ci-après Snm(t), et une composante pour la forme modifiée de la sonde à la suite de l’interaction avec sa séquence d’intérêt, ci-après Sm(t).

Les composantes de la signature temporelle (Snm(t), Sm(t)) peuvent être déterminées respectivement en appliquant directement le cycle thermique à la sonde dans le tampon utilisé pour la réaction, respectivement sous sa forme non modifiée et sous sa forme modifiée par l’interaction avec sa séquence d’intérêt. En variante, la signature temporelle peut également être obtenue en déterminant le profil de fluorescence de la sonde sous ses deux formes en fonction de la température (SnmT(T), SmT(T)), et en appliquant la fonction obtenue à la fonction décrivant le profil de température PT(t) (mathématiquement, Snm est la composée des fonctions SnmT et PT, soit SnmToPT ; de même Sm est la composée des fonctions SmT et PT, soit SmToPT). De manière alternative, les composantes de la signature temporelle de la sonde sous sa forme non modifiée ou sous sa forme modifiée peuvent être déterminées indirectement par soustraction entre le profil de l’intensité de fluorescence d’une combinaison de la sonde et d’autres sondes ou sources fluorescentes et le profil de l’intensité de fluorescence de cette même combinaison en l’absence de la sonde dont la signature est à déterminer. Avantageusement, une combinaison de signatures temporelles peut être utilisée plutôt que la signature temporelle d’une sonde seule pour déterminer la présence d’une sonde directement ou indirectement. Par exemple, on peut utiliser la signature de la combinaison de plusieurs sondes et la signature de la combinaison de ces mêmes sondes en l’absence de l’une des sondes pour déterminer l’absence de cette même sonde, ou encore la signature de la combinaison de plusieurs sondes et la signature de la combinaison de ces mêmes sondes en l’absence de l’une des sondes et en présence du produit de la disparition de la sonde absente pour déterminer la transformation de cette même sonde (par exemple l’absence de la signature d’une sonde TaqMan et la présence de la signature de la sonde hydrolysée). L’utilisation de combinaison de signatures évite d’avoir à caractériser chaque sonde individuellement et permet de s’affranchir d’éventuelles effets d’interaction entre les sondes dans le signal de fluorescence. De manière générale, le signal de toute combinaison de sondes peut être utilisé selon l’invention comme marqueur direct ou indirect (par combinaison de plusieurs signaux) de l’état de la composition du réactif.

La montre des exemples de signature temporelle pour des sondes de type TaqMan ou QUASR utilisant divers fluorophores et quenchers : la composante de la signature temporelle non modifiée et la composante de la signature temporelle modifiée à la suite de l’interaction avec la séquence dont elle est spécifique.

Id	Type	Fluorophore (5’)	Quencher (3’)	Séquence
1	TaqMan	FAM	BHQ1	FAM-GATACCGCTGGAAACGGCTTTGTCAA-BHQ1
2	TaqMan	ATTO488	BHQ1	ATTO488-CGGCACGGTCAGGTTCGTCCTT-BHQ1
3	TaqMan	ATTO565	BHQ2	ATTO565-ATTGGCATGGAAGTCACACCTTCGG-BHQ1
4	TaqMan	CY3	BHQ2	CY3-TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG-BHQ2
5	TaqMan	Texas RED	BHQ2	TexasRED-TGCTCGGGCATCATAACGGAAAGC-BHQ2
6	TaqMan	CY5	BHQ2	CY5-GAAGCGCGCGAAATCGAAGTTGCT-BHQ2
7	TaqMan	ATTO647N	BHQ2	ATTO647N-TGCTCGGGCATCATAACGGAAAGC-BHQ2
8	QASR	FAM	-	FAM-ACGCCAATGTTTATGTAAACCTTGCGCC
9	QASR	FAM (1)	BHQ1(2)	1: FAM-ACGCCAATGTTTATGTAAACCTTGCGCC 2: GGCGCAAGGTTTACATAAACATTGGCGT-BHQ1
10	Balise Mol.	FAM	BHQ1	FAM-CGGGCACGCCAATGTTTATGTAAACCTTGGCCCG-BHQ1

La référence les « ID » du tableau 1 ci-dessus et représente pour chaque sonde la composante de la signature temporelle non modifiée (« Av.Int. ») et la composante de la signature temporelle modifiée (« Ap.Int ») à la suite de l’interaction avec la séquence dont elle est spécifique.

Selon un mode préféré de réalisation, des sondes émettant dans la même plage de longueurs d’onde de fluorescence sont choisies de sorte que leurs signatures temporelles (dans leur état non modifié et dans leur état modifié) soient suffisamment distinctes pour pouvoir être discriminées.

Réaction et détermination de la concentration des sondes

Une fois un jeu de sondes choisi, un mix réactionnel comprenant l’échantillon contenant les séquences d’intérêt en nombre et concentration inconnus est fait avec celles-ci. Outre les séquences d’intérêt, ce mix réactionnel comprend, pour chaque séquence d’intérêt recherchée, la sonde fluorescente choisie et dont la signature temporelle a été caractérisée directement ou indirectement comme indiqué ci-dessus, un jeu d’amorces compatible avec cette sonde et capable d’amplifier la séquence d’intérêt, des réactifs et enzymes nécessaires à la réalisation de la réaction d’amplification. Dans le cas d’une détection par PCR, il s’agit notamment des dNTPs et d’au moins une polymérase thermorésistante (dans la variante dans laquelle les sondes sont de type TaqMan, la polymérase possède une activité exonucléase 5’ vers 3’). Le mix réactionnel peut également comprendre une transcriptase inverse si au moins l’une des séquences d’intérêt est en ARN.

Dans la variante dans laquelle le procédé d’amplification est la PCR et les sondes sont de type TaqMan ou Molecular Beacon, les amorces sont non fluorescentes et situées sur la séquence d’intérêt de part et d’autre de la sonde. Dans la sous-variante dans laquelle les sondes sont de type TaqMan, la polymérase possède en outre une activité exonucléase 5’ vers 3’.

Dans la variante dans laquelle le procédé d’amplification est la PCR et une sonde est de type Scorpion, Amplifluor, LUX ou QZyme, cette sonde joue également le rôle de l’une des deux amorces.

Ensuite, le thermocycleur 4 soumet le mix réactionnel à un ou plusieurs cycles du profil de température, ce nombre pouvant varier de 1 à 40 typiquement, le cas échéant après avoir effectué un cycle permettant la transcription inverse de séquences d’intérêt en ARN et/ou un cycle permettant l’activation de la polymérase à haute température (démarrage “hotstart”). Au cours de ces cycles la ou les sondes fluorescentes sont excitées et le capteur de lumière 6 enregistre la fluorescence résultante en continu sur le ou les canaux de fluorescence correspondant aux plages de longueurs d’onde de fluorescence de chaque sonde. La fréquence d’échantillonnage du capteur de lumière 6 est choisie de telle sorte qu’au moins deux mesures de fluorescence soient réalisées par cycle, de préférence au moins une dans l’étape de dénaturation et au moins une dans l’étape d’hybridation (qui peut également être l’étape d’élongation dans le cas d’une réaction de PCR) de préférence à une fréquence plus élevée permettant de couvrir des températures intermédiaires ce qui permet un meilleur pouvoir de discrimination.

L’analyseur 8 est alors appelé pour traiter les signaux de fluorescence mesurés dans chaque canal de fluorescence par le capteur de lumière 6, en les décomposant, pour chaque canal et à chaque cycle auquel les signaux ont été acquis, sous la forme d’une combinaison linéaire des composantes des signatures temporelles des sondes dans ce canal ou d’une de leur combinaison. Cela permet de déterminer, à chaque cycle ou avant et après l’apparition du signal d’amplification, la fraction de chaque sonde qui se trouve sous forme non modifiée, et celle qui se trouve sous forme modifiée. Cette détermination peut être réalisée de manière qualitative par interprétation visuelle des signatures temporelle ou de manière quantitative par un calcul numérique avec un algorithme adapté.

Plusieurs algorithmes peuvent être utilisés pour extraire la signature temporelle pourvu qu’ils permettent la décomposition des signatures mesurées en une somme de signatures caractéristiques de la présence d’une sonde sous sa forme modifiée ou non modifiée ou de toutes combinaisons de présence ou d’absence de plusieurs sondes sous leur forme modifiée ou non modifiée. L’algorithme utilisé peut par exemple être un algorithme cherchant pour chaque cycle, les poids de la combinaison linéaire des signatures caractéristiques s’approchant de manière optimale des signatures mesurées pour chaque cycle. Ces poids pouvant être représentatif directement ou indirectement de la modification d’une sonde à la suite de son interaction avec la séquence dont elle est spécifique, conséquence de l’amplification de cette séquence par la réaction d’amplification. Le paragraphe suivant détaille une implémentation de cet algorithme.

Au k-ième cycle thermique appliqué pendant la réaction d’amplification, et dans un canal de fluorescence donné, le signal de fluorescence F_k(t) mesuré par le capteur de lumière 6 peut être défini comme suit :

[Equation 1]

Où :

- t est le temps au cours du cycle de température,

- n est le nombre total de sondes dans le mélange réactionnel,

- c_iest la quantité (ou concentration) de sondes d’indice i (cette quantité est connue),

- est la quantité (ou concentration) de sonde d’indice i présente sous forme modifiée au début du k-ième cycle de la réaction d’amplification,

- représente la signature temporelle de la sonde d’indice i lorsqu’elle est modifiée, et

- représente la signature temporelle de la sonde d’indice i lorsqu’elle est non-modifiée.

En réalisant le changement de variable

[Equation 2]

On obtient l’équation

[Equation 3]

Comme la quantité est la somme des composantes des signatures des sondes non modifiées pour le cycle k, et est connue puisque c_iest connu et indépendant du cycle k, l’équation 3 définit un système matriciel qui associe le signal de fluorescence mesuré aux concentrations de chaque sonde d’indice i pour le cycle k.

Ces coefficients sont ceux qui annulent l’équation matricielle

[Equation 4] =0

Où les t_icorrespondent aux instants d’échantillonnage par le capteur de lumière 6 pendant l’application du cycle thermique par le thermocycleur 4. On rappelle que le cycle thermique comprend l’étape de chauffage de la température inférieure à la température supérieure et l’étape de refroidissement de la température supérieure à la température inférieure.

Comme les mesures ne sont pas parfaites, les pourront être choisis pour minimiser la différence. De nombreux algorithmes permettent de réaliser cette optimisation, par exemple les moindres carrés.

Ainsi, il apparaît que, grâce aux signatures temporelles, il est possible de réaliser un multiplexage / démultiplexage de degré 2, 3, 4, 5 ou plus, dès lors que l’on est capable de bien définir les signatures temporelles de chacune des sondes. Ce multiplexage / démultiplexage est réalisé dans tous les canaux de fluorescence du capteur de lumière 6, ce qui permet d’identifier les contributions optiques d’une sonde dans le canal dans lequel elle émet de façon prépondérante, mais aussi dans les canaux adjacents le cas échéant.

L’implémentation généralisée de l’algorithme présenté ci-dessus nécessite de caractériser individuellement les sondes, ce qui nécessite l’utilisation de mesures indirectes (la signature des sondes lorsqu’elles ne sont pas mélangées) pouvant introduire des artefacts dans la détermination du vecteur c.

Avantageusement, on pourra réaliser un calcul similaire en utilisant des signatures plus directes (par exemple les signatures des sondes mélangées avec ou sans la modification d’une sonde) en réalisant un changement d’espace par une transformation linéaire U :

[Equation 5] tel que

tel que U permette de résoudre ce même problème de détermination du vecteur c en utilisant des signatures temporelles mesurables plus directement.

Avantageusement, seules certaines parties de la signature temporelle peuvent être utilisées, pour augmenter la précision de la décomposition. En effet, certains phénomènes comme la variation de la quantité de sonde modifiée au cours de la phase d’élongation du cycle de PCR qui résulte de l’activité de la polymérase ou encore la non-reproductibilité du profil de changement de température aux temps courts peuvent altérer la forme de la signature à certains temps et il peut être préférable de ne pas prendre en compte ces parties de la signature pour la détermination des quantités de sonde modifiée. Dans certains modes de mise en œuvre, l’importance de chaque temps de la signature temporelle peut être pondérée pour le calcul afin d’en optimiser l’impact sur le résultat du calcul.

En variante, l’analyseur 8 pourrait fonctionner de manière purement numérique et non matricielle, en utilisant par exemple un algorithme de descente de gradient pour optimiser l’erreur résiduelle de l’approximation de la signature mesurée par la combinaison linéaire de signatures caractéristiques, ou encore contenir des tables de type lookup table, ou encore utiliser un réseau de neurones entraîné pour retourner les concentrations de chaque sonde en fonction du signal de mesure en entrée.

Avantageusement, l’algorithme peut utiliser un modèle plus complexe que la combinaison linéaire des signatures, prenant en compte par exemple l’influence de la variation de la quantité de sonde modifiée au sein d’un cycle ou l’évolution au cours des cycles de la quantité de sondes modifiées qui peut être contrainte par des hypothèses telles que la forme de la courbe d’amplification. L’algorithme peut alors prendre la forme d’un calcul d’optimisation sous contraintes par la minimisation d’une fonction d’énergie ou encore prendre la forme d’un réseau de neurones entrainé à apprendre des paramètres spécifiques d’une amplification sur la base de la suite des signatures.

La illustre la mise en œuvre dans le mode particulier d’une réaction PCR avec deux sondes TaqMan. Elle montre l’extraction des concentrations respectives de chaque sonde hydrolysée par décomposition en une somme optimale des signatures temporelles comme décrit plus haut. Les courbes du haut montrent le signal de fluorescence brut au cours de la PCR avec le même mix contenant 2 sondes TaqMan émettant dans la même bande, spécifiques respectivement de deux génomes bactériens qui sont utilisés purs (le premier à gauche et le second au centre), ou mélangés dans des quantités différentes (à droite). Les courbes du bas montrent les concentrations respectives des 2 sondes hydrolysées calculées à chaque cycle selon une extraction avec les mêmes paramètres lorsque seule la première sonde est hydrolysée lors de l’extraction (graphes de gauche), seule la seconde sonde est clivée (graphes du centre) et lorsque les 2 sondes sont clivées selon des cinétiques différentes au cours de la PCR (graphes de droite). Le graphe en bas à droite montre la capacité du dispositif de l’invention à extraire les signaux d’amplification de ces deux cibles distinctes (ici des séquences appartenant au génome de B. subtilis et E. coli) à des concentrations initiales différentes en utilisant des sondes partageant le même signal de fluorescence.

Exemples de réalisation :

Exemple 1 : Identification de la présence d’une séquence nucléotidique d’intérêt dans une analyse par PCR multiplex utilisant deux sondes TaqMan fonctionnalisées avec des fluorophores émettant tous deux majoritairement dans la bande supérieure à 650nm.

L'exemple ci-dessous montre comment le procédé et le dispositif de l’invention permettent d'identifier la présence d'une séquence cible d'intérêt parmi deux séquences cibles à l’aide d’une analyse par PCR multiplex utilisant deux sondes TaqMan fonctionnalisées avec des fluorophores émettant tous deux majoritairement dans la bande supérieure à 650nm. Ces sondes, chacune spécifique de l’une des séquences d’intérêt, émettent un signal de fluorescence mesuré dans le même canal du dispositif, mais possèdent une signature temporelle différente. L'utilisation de l’algorithme de démultiplexage combiné avec la connaissance de ces signatures permet d'identifier l'amplification d'une cible ou l'autre.

Les amorces sont spécifiques pour amplifier deux séquences du gène [D-alaline--D-alanine ligase]. PourE. faeciumles séquences de l’amorcesenseetantisensesont GCTTTAGCAACAGCCTATCAG et TCGTCCGAACRTCTTCATTT, pourE. faecalisles séquences de l’amorcesenseetantisensesont GTTCTAGTGTCGGAATTAGCA et GCTTCRATCCCTTGTTCAAC. Deux sondes fluorescentes de type TaqMan sont fonctionnalisées à l'extrémité 5' avec le fluorophore ATTO647N pour E. faecalis (séquence TGCTCGGGCATCATAACGGAAAGC, voir ligne d’identifiant ID 7 du tableau 1) et CY5 pour E. faecium (séquence GAAGCGCGCGAAATCGAAGTTGCT, voir ligne d’identifiant ID 6 du tableau 1). Les deux sondes sont fonctionnalisées à l'extrémité 3' avec le quencher BHQ2. Nous identifions les deux sondes comme "Sonde a" et "Sonde b" respectivement.

Dans une première étape, on réalise deux réactions de PCR avec chaque paire d’amorce combiné avec la sonde et l’ADN de la séquence de la bactérie correspondants, afin de caractériser la signature de chacune des deux sondes séparément :

- dans une première PCR, on amplifie 10⁵génomes deE. faecalis(ADN extrait et quantifié) et seule la sonde spécifique deE. faecalisest ajoutée au mélange PCR à la concentration de 0,1µM. Les deux paires d'amorces sont ajoutées au mélange PCR à la concentration de 0,5µM pour chaque amorce. Le signal mesuré dans le canal 4 de Chronos DX est référencé comme “Signal 1”.

- dans une deuxième PCR, on amplifie 10⁶génomes deE. faecium(ADN extrait et quantifié) et seule la sonde deE. faeciumest ajoutée au mélange PCR à la concentration de 0,2µM. Les deux paires d'amorces sont ajoutées au mélange PCR à la concentration de 0,5µM pour chaque amorce. Le signal mesuré dans le canal 4 de Chronos DX est référencé comme “Signal 2”.

Dans ces deux réactions de PCR, le mélange réactionnel se compose d'un tampon (Tris-HCL, KCl 25mM, (NH₄)₂SO₄16mM, MgCl₂4,5mM) et l’amplification est réalisée en utilisant 3U de Taq DNA Polymerase et 0,2 mM de dNTPs. Le protocole de PCR utilisé se compose de : dénaturation / activation de la polymérase réalisée pendant une minute à 95°C et 45 cycles PCR (composés de deux phases : dénaturation pendant 3 secondes à 95°C et hybridation/extension pendant 15 secondes à 60°C). Les mesures de l’intensité de fluorescence sont effectuées toutes les 100ms.

La montre le signal mesuré sur le canal 4 pendant les deux expériences ( a : signal “1” pour la sonde “a” et b : signal “2” pour la sonde “b”).

Les deux composantes de la signature temporelle de chacune des sondes est extraite à partir de ces signaux (signatures montrées dans les lignes 6 et 7 de la ).

Après avoir défini les signatures de chacune de ces deux sondes, on réalise deux réactions d’amplification multiplex avec un mélange des réactifs en utilisant le procédé de l’invention. Les deux sondes sont ajoutées au mélange PCR respectivement à la concentration de 0,1µM (sonde a,E. faecalis) et 0,2µM (sonde b,E. faecium). Les deux paires d'amorces sont ajoutées au mélange PCR à la concentration de 0,5µM pour chaque amorce :

- dans une première PCR, on amplifie 10³génomes deE. faecalis(ADN extrait et quantifié). Le signal mesuré dans le canal 4 de Chronos DX est référencé comme “Signal 3”.
- dans une deuxième PCR, on amplifie 10⁵génomes deE. faecium(ADN extrait et quantifié). Le signal mesuré dans le canal 4 de Chronos DX est référencé comme “Signal 4”.

Dans la , on montre le signal mesuré sur le canal 4 pendant ces deux réactions de PCR multiplex ( c : signal “3” et d : signal “4”).

On démultiplexe ensuite les signaux “3” et “4” en utilisant l’algorithme de l’invention et les signatures temporelles de chaque sonde, en calculant, pour chaque cycle de chaque réaction de PCR multiplex, la valeur représentative de la concentration de chacune des sondes modifiées. Le résultat de ce démultiplexage est montré dans la pour chacune des réactions d’amplification multiplex ( e : analyse signal 3, b : analyse signal 4). L’observation des courbes des valeurs représentatives de la concentration de chaque sonde modifiée, en fonction du cycle de la réaction de PCR, permet d’identifier sans ambiguïté la nature de la séquence d’intérêt qui était effectivement présente dans chacune des deux réactions.

Exemple 2 : Identification de la présence d’un mélange de deux séquences nucléotidiques d’intérêt dans une analyse par PCR multiplex utilisant deux sondes TaqMan fonctionnalisées avec des fluorophores émettant tous deux majoritairement dans la bande 575-615nm.

Dans cet exemple, on cherche à connaître les quantités respectives de deux séquences d’ADN génomique de deux bactériesB. subtilisetE. colien utilisant des sondes de type TaqMan émettant majoritairement dans la même bande de fluorescence 575-615nm. La sonde spécifique deE. coliest marquée avec le fluorophore ATTO 565 et la sonde spécifique deB. subtilisest marquée avec Cy3.

Après avoir déterminé les signatures temporelles de ces deux sondes comme dans l’exemple ci-dessus, on réalise une série de 3 amplifications par PCR à l’aide d’un mélange réactionnel comprenant les deux paires d’amorces et les deux sondes nécessaires pour amplifier les deux séquences nucléotidiques d’intérêt.

Dans la première réaction, on ajoute 10⁴génomes deB. subtilis; dans la deuxième réaction, on ajoute 10²génomes deE. coli; dans la troisième réaction, on ajoute 10⁴génomes deB. subtiliset 10²génomes deE. coli. On réalise les réactions à l’aide du dispositif 2. Les signaux de fluorescence enregistrés dans le canal 3 au cours de chaque cycle de chacune des réactions de PCR sont montrés dans la ligne supérieure de la .

On utilise ensuite l’algorithme 8 pour démultiplexer ces courbes et on obtient, pour chaque réaction d’amplification et pour chaque sonde, une courbe montrant la valeur représentative de la sonde modifiée en fonction du numéro du cycle. On observe qu’on peut retrouver à partir de ces courbes démultiplexées la nature de la ou des séquences nucléotidiques d’intérêt présentes dans les mélanges réactionnels. Pour chacune de ces 6 courbes, on peut mesurer un cycle seuil («Threshold Cycle», Ct), qu’on peut reporter dans une courbe étalon qui relie le cycle Ct et le logarithme de la quantité initiale de molécules de chacune des séquences d’intérêt afin de quantifier la quantité de chacune des séquences nucléotidiques d’intérêt présente dans le mélange.

Exemple 3 : Correction de la contamination optique engendrée par le signal de fluorescence produit au cours d’une PCR pendant l’hydrolyse d'une sonde TaqMan "a" pour la détection de la présence de séquences d’intérêt humaines et virales

L'expérience PCR est réalisée en utilisant des amorces et sondes spécifiques du génome viral du SARS-CoV-2 et d’un gène contrôle endogène présent dans les cellules épithéliales du nasopharynx chez l’Homme. Le kit contient des sondes pour la détection de 3 séquences cibles dans 3 canaux optiques du dispositif 2 : canaux 1 et 3 pour deux cibles du coronavirus SARS-CoV-2, canal 4 pour la cible contrôle endogène. Dans cette expérience, l'ADN humain contenu dans un échantillon est détecté par l’amplification PCR de la séquence d’intérêt contrôle avec une paire d'amorces. Le signal de fluorescence est généré par une sonde fonctionnalisée avec un fluorophore à l'extrémité 5' et un quencher à l'extrémité 3', ce fluorophore émet un signal de fluorescence dans une bande de longueurs d'onde détectable dans le canal optique numéro 4 du dispositif 2. Cette sonde est référencée comme la Sonde “a” et son signal comme le “Signal 1”, montré dans la a.

En raison de l’étalement du spectre d’émission de la sonde a, le signal généré par la sonde est également détecté dans le canal optique numéro 3 du dispositif 2. Ce signal est référencé comme le “Signal 2”. Cette contamination génère une augmentation apparente du signal généré par la sonde utilisée pour la détection d’une séquence cible du Sars-CoV-2 présente dans le canal numéro 3, ce qui pourrait être interprété à tort comme la présence de cette séquence cible dans l’échantillon. Cette sonde est référencée comme la sonde “b”. Le signal 2 est représenté dans la b.

Le protocole de PCR utilisé dans cette expérience se compose de : transcription inverse réalisée pendant 30 secondes à 50°C, dénaturation des acides nucléiques et activation de la polymérase réalisées pendant une minute à 95°C, suivie de 45 cycles PCR (composés de deux phases : dénaturation pendant 3 secondes à 95°C et hybridation/extension pendant 15 secondes à 60°C). La période d’échantillonnage de la mesure de la fluorescence est de 100ms pendant toute la durée de la PCR.

Pour éliminer le signal de contamination optique, on applique le procédé selon l’invention, comprenant les étapes suivantes :

- Détermination de la signature temporelle des 2 sondes présentes dans le kit détectées dans les canaux optiques 3 et 4 du dispositif 2. Ces signatures sont obtenues à partir d'une PCR avec détection de 1,2µl du contrôle d'amplification positif fourni avec le kit. Ces signatures sont identifiées en tant que signaux 3 et 4.

- Utilisation de l’algorithme de l’analyseur 8 selon l’invention pour démultiplexer les signaux présents dans le signal 2. Le résultat du démultiplexage est montré dans la c. On observe que la courbe correspondant au signal de la sonde b est parfaitement plate, ce qui indique que la séquence d’intérêt du génome viral du SARS-CoV-2 est absente de l’échantillon.

Exemple 4 : Détection d’une séquence d’intérêt par l’exploitation de la signature temporelle d’une sonde fluorescente de type “balise moléculaire” utilisée dans une réaction d’amplification par PCR multiplex.

Dans cet exemple, le procédé et le dispositif de l’invention sont utilisés pour détecter la présence d’une séquence nucléotidique d’intérêt dans un échantillon grâce à une amplification par PCR utilisant des sondes de type “Balise Moléculaire” (MB, Molecular Beacon). Dans le procédé utilisant une ou des balises moléculaires, ces sondes ne sont pas clivées pendant la réaction contrairement aux sondes de type TaqMan. Dans ce but, la polymérase choisie est dépourvue d’activité exonuclease 5’ vers 3’, et est remplacée par une activité de déplacement de brin (SD pour «Strand Displacement» en anglais).

Dans cet exemple, une PCR est réalisée avec le protocole suivant : dénaturation initiale / activation de la polymérase pendant 30 secondes à 92°C et 40 cycles de PCR (composés de deux phases : dénaturation pendant 5 secondes à 92°C et hybridation/extension pendant 30 secondes à 62°C).

Le mélange réactionnel est composé d’un tampon (SD polymerase reaction buffer) en ajoutant du MgCl2 à la concentration finale de 3mM et l’amplification est réalisée en utilisant 5U de SD Polymerase HotStart et 0,2mM de dNTPs. Des amorces à la concentration de 0,2µM (amorcesens,séquence CCGCCAATGGTACCGCAATCCCT) et 2µM (amorceantisens,séquence GCTACTGCCATTATATTTTACGGTC) sont utilisées pour amplifier une séquence cible du gène fimH d’E. coli(10⁴bactéries ajoutées directement dans la PCR après culture bactérienne en milieu LB et quantification). La sonde fluorescente de type balise moléculaire (séquence FAM- CGGGCACGCCAATGTTTATGTAAACCTTGGCCCG-BHQ1) est à la concentration de 0,03µM.

Le signal mesuré dans le canal 1 du dispositif 2 au cours de la réaction de PCR de 45 cycles est présenté dans la d. À partir de cette courbe, on extrait les deux composantes de la signature temporelle de cette sonde de type balise moléculaire. Ces composantes sont montrées sur la en référence à l’ID 10.

On utilise ensuite cette signature pour démultiplexer les signaux enregistrés au cours de réactions de PCR multiplex qui utilise cette sonde pour rechercher la présence de la séquence nucléotidique correspondante parmi d’autres séquences.

Exemple 5 : Détermination de la signature temporelle d’une sonde selon le procédé QUASR mis en œuvre dans une réaction de PCR.

L’invention peut être utilisée pour analyser les courbes de fluorescence pendant l'amplification par PCR utilisant le système QUASR (Quenching of Unincorporated Amplification Signal Reporters.

Dans cet exemple, une PCR est réalisée avec le protocole suivant : dénaturation initiale / activation de la polymérase pendant une minute à 95 °C et 45 cycles de PCR (composés de deux phases : dénaturation pendant 3 secondes à 95°C et hybridation/extension pendant 15 secondes à 60°C). La période d’échantillonnage de la mesure de la fluorescence est de 200 ms pendant toute la durée de la PCR.

Le mélange réactionnel est composé d’un tampon (Tris-HCL, KCl 25mM, (NH₄)₂SO₄16mM, MgCl₂4,5mM) et l’amplification est réalisée en utilisant 3U de SuperHotTaq DNA polymerase et 0,2mM de dNTPs. Des amorces “sens” et “antisens” de séquence respective FAM-ACGCCAATGTTTATGTAAACCTTGCGCC et ACATTTCACAACACGAGCTGACGA à la concentration de 0,5µM sont utilisées pour amplifier 10⁵génomes d'E. coli(extraits et dilués après culture bactérienne en milieu LB). Un oligonucléotide complémentaire de l'amorce “sens” GGCGCAAGGTTTACATAAACATTGGCGT-BHQ1 est ajouté au mélange réactionnel à la concentration de 0,3µM.

La courbe de l’intensité de la fluorescence en fonction du temps est mesurée lors des 45 cycles PCR et illustrée dans la e. Cette courbe permet d’extraire les deux composantes de la signature temporelle de la sonde de type QUASR utilisée. Cette signature est montrée à la avec l’ID 9.

On utilise ensuite cette signature pour démultiplexer les signaux enregistrés au cours de réactions de PCR multiplex qui utilise cette sonde pour rechercher la présence de la séquence nucléotidique correspondante parmi d’autres séquences.

Exemple 6 : Détection de 5 séquences nucléotidiques dans un kit syndromique des virus respiratoire Influenza A, B, virus respiratoires syncitiaux A et B, et SARS-CoV-2 à l’aide d’une PCR pentaplex.

Le procédé et le dispositif décrits dans la présente invention permettent la recherche de la présence de 5 virus à l’aide d’une PCR pentaplex réalisée en mélangeant cinq paires d'amorces et cinq sondes pour la détection de 5 cibles en utilisant seulement deux canaux optiques du dispositif (canaux 3 et 4).

Les amorces et les sondes utilisées sont spécifiques des cibles suivantes :

Canal 3 :

Cible 1 - Influenza A :

• amorce sens GGAATGGCTAAAGACAAGACCAAT
• amorce antisens CTGCAGTCCTCGCTCACT
• sonde ATTO565-TTCACGCTCACCGTGCCCAGTGA-BHQ2

Cible 2 - Influenza B :

• amorce sens CTCAACTCACTCTTCGAGCGT
• amorce antisens TCTGGTGATAATCGGTGCTCTT
• sonde CY3-TCTGGTGATAATCGGTGCTCTT-BHQ2

Cible 3 - SARS-CoV-2 :

• amorce sens GCTTCAGCGTTCTTCGGAAT
• amorce antisens CAATTTGATGGCACCTGTGTAG
• sonde Alexa Fluor 568-ATTGGCATGGAAGTCACACCTTCGG-BHQ2

Canal 4 :

Cible 4 - RSVB :

• amorce sens TCCTAACTTCTCAAGTGTGGTC
• amorce antisens CTTGGTTTCTTGGTGTACCTCT
• sonde ATTO647N-AGGCAATGCAGCAGGTCTAGGCAT-BHQ2

Cible 5 - RSV type A :

• amorce sens GCAGGATTGTTTATGAATGCCT
• amorce antisens CACAACTTGTTCCATTTCTGCT
• sonde Cy5-GGTGCAGGGCAAGTGATGTTACGG-BHQ2

Les amorces sont ajoutées au mélange à une concentration comprise entre 0,1 et 0,6µM ; les sondes sont ajoutées à la réaction à une concentration comprise entre 0,1 et 0,5µM. Le mélange de RT-PCR se compose d’un tampon (Tris-HCL, KCl 25mM, (NH4)2SO4 16mM, MgCl2 4,5mM) et l’amplification est réalisée en utilisant entre 3 et 10U de TAQ polymerase (avec activité exonucléase en 5') et 3U de WarmStart reverse transcriptase. Le protocole PCR utilisé se compose de : transcription inverse réalisée pendant une minute à 60°C, dénaturation / activation de la polymérase réalisée pendant une minute à 95°C et 45 cycles PCR (composés de deux phases : dénaturation pendant 3 secondes à 95°C et hybridation/extension pendant 15 secondes à 60°C). Les mesures de l’intensité de fluorescence sont effectuées toutes les 100ms.

On réalise 5 réactions de PCR comprenant l’ensemble des sondes sauf une pour déterminer les signatures temporelles des sondes.

On utilise ensuite ces signatures temporelles pour démultiplexer les signaux enregistrés au cours de réactions de PCR pentaplex pour rechercher, en une seule réaction, la présence de n’importe quelle séquence parmi les 5 séquences nucléotidiques d’intérêt.

Ainsi, il apparaît que, grâce aux signatures temporelles, il est possible de réaliser un multiplexage / démultiplexage de degré 2, 3, 4, 5 ou plus, dès lors que l’on est capable de bien définir les signatures temporelles de chacune des sondes.

Cette capacité de détection multiplexée de séquences d’acides nucléiques ouvre des possibilités conséquentes, comme par exemple la possibilité de réaliser la recherche simultanée de nombreuses mutations génétiques ponctuelles du génome du coronavirus SARS-CoV-2 dans un échantillon clinique, ce qui permet d’identifier rapidement le variant présent dans cet échantillon, alternative plus rapide et moins coûteuse que le séquençage du génome viral présent dans cet échantillon.

Claims (15)

1. Dispositif de détection multiplexée de séquences d’acides nucléiques comprenant un thermocycleur (4) agencé pour réaliser une série de cycles thermiques avec un réactif d’amplification d’acides nucléiques in vitro contenant au moins deux sondes de fluorescence combinant un quencher et un fluorophore, lesdites sondes de fluorescence étant agencées pour chacune cibler une séquence d’acide nucléique distincte et lesdits fluorophores émettant dans des plages de longueurs d’onde de fluorescence se chevauchant, un capteur de lumière (6) agencé pour mesurer un rayonnement émis par lesdits fluorophores dans lesdites plages de longueurs d’onde de fluorescence, le rayonnement émis par chaque sonde variant selon que celle-ci est dans un état non modifié dans lequel le quencher atténue ou n’atténue pas sensiblement l’émission de fluorescence, ou dans un état modifié dans lequel le quencher a un effet opposé sur l’émission de fluorescence, et un analyseur (8) agencé pour déterminer, pour chaque sonde de fluorescence respective, une valeur représentative d’une concentration dans un état modifié, à partir de signatures temporelles tirées de la fluorescence mesurée en fonction du temps pour un cycle thermique donné d’un mélange réactionnel comprenant une ou plusieurs sondes, lesquelles peuvent être chacune sensiblement entièrement dans un état non modifié ou modifié, et d’au moins deux mesures réalisées au cours de certains au moins des cycles thermiques, lesquelles valeurs représentatives d’une concentration dans un état modifié permettent de qualifier la présence d’une ou plusieurs séquences d’acide nucléique chacune associée à une sonde de fluorescence distincte de manière à provoquer un changement d’état de la sonde de fluorescence de l’état non modifié vers l’état modifié lorsqu’elles interagissent.
2. Dispositif selon la revendication 1, dans lequel le thermocycleur (4) est un thermocycleur PCR, et les au moins deux sondes de fluorescence sont choisies parmi le groupe comprenant les sondes TaqMan, les balises moléculaires, les sondes duales à transfert de fluorescence, les sondes Scorpion, les sondes Amplifluor, les sondes MGB Eclipse, les sondes LUX, les sondes QUASR et les sondes QZyme.
3. Dispositif selon la revendication 1 ou 2, dans lequel le réactif d’amplification d’acides nucléiques in vitro comprend trois sondes de fluorescence combinant un quencher et un fluorophore, lesdites sondes de fluorescence étant agencées pour chacune cibler une séquence d’acide nucléique distincte et lesdits fluorophores présentant des plages de longueurs d’onde de fluorescence se chevauchant.
4. Dispositif selon l’une des revendications précédentes, dans lequel le réactif d’amplification d’acides nucléiques in vitro comprend au moins deux groupes de sondes de fluorescence combinant un quencher et un fluorophore, lesdites sondes de fluorescence étant agencées pour chacune cibler une séquence d’acide nucléique distincte et lesdits fluorophores présentant des plages de longueurs d’onde de fluorescence se chevauchant au sein de chaque groupe de sondes de fluorescence.
5. Dispositif selon l’une des revendications précédentes, dans lequel l’analyseur (8) est agencé pour déterminer la valeur représentative de la concentration de chaque sonde de fluorescence dans un état modifié en résolvant un système matriciel basé sur les mesures de fluorescence, les signatures temporelles et la constance de la concentration respective de chaque sonde de fluorescence.
6. Dispositif selon les revendications 4 et 5, dans lequel l’analyseur (8) est agencé pour résoudre un système matriciel par groupe de sondes de fluorescence.
7. Dispositif selon la revendication 5 ou 6, dans lequel l’analyseur (8) est agencé pour utiliser un algorithme de minimisation.
8. Dispositif selon l’une des revendications 1 à 4, dans lequel l’analyseur (8) est agencé pour déterminer la valeur représentative de la concentration de chaque sonde de fluorescence dans un état modifié en appliquant une descente du gradient ou en utilisant un réseau de neurones.
9. Procédé de détection multiplexée de séquences d’acides nucléiques comprenant les opérations suivantes :
   a) réaliser une pluralité de cycles thermiques sur un mélange réactionnel comprenant un échantillon à analyser et un réactif d’amplification d’acides nucléiques in vitro contenant au moins deux sondes de fluorescence combinant un quencher et un fluorophore, lesdites sondes de fluorescence étant agencées pour chacune cibler une séquence d’acide nucléique distincte et lesdits fluorophores émettant dans des plages de longueurs d’onde de fluorescence se chevauchant,
   b) lors de chaque cycle thermique, réaliser au moins deux mesures de fluorescence dans lesdites plages de longueurs d’onde de fluorescence, le rayonnement émis par chaque sonde variant selon que celle-ci est dans un état non modifié dans lequel le quencher atténue ou n’atténue pas sensiblement l’émission de fluorescence, ou dans un état modifié dans lequel le quencher a un effet opposé sur l’émission de fluorescence,
   c) déterminer une valeur représentative de la concentration de chaque sonde de fluorescence dans un état modifié à partir des mesures de l’opération b) et de signatures temporelles tirées de la fluorescence mesurée en fonction du temps pour un cycle thermique donné d’un mélange réactionnel comprenant une ou plusieurs sondes, lesquelles peuvent être chacune sensiblement entièrement dans un état non modifié ou modifié, lesquelles valeurs représentatives d’une concentration dans un état modifié permettent de qualifier la présence d’une ou plusieurs séquences d’acide nucléique chacune associée à une sonde de fluorescence distincte de manière à provoquer un changement d’état de la sonde de fluorescence de l’état non modifié vers l’état modifié lorsqu’elles interagissent.
10. Procédé selon la revendication 9, dans lequel l’opération b) comprend la réalisation de cycles PCR, et les au moins deux sondes de fluorescence sont choisies parmi le groupe comprenant les sondes TaqMan, les balises moléculaires, les sondes duales à transfert de fluorescence, les sondes Scorpion, les sondes Amplifluor, les sondes MGB Eclipse, les sondes LUX, les sondes QUASR et les sondes QZyme.
11. Procédé selon la revendication 9 ou 10, dans lequel l’opération b) comprend l’utilisation d’un réactif d’amplification d’acides nucléiques in vitro comprenant trois sondes de fluorescence combinant un quencher et un fluorophore, lesdites sondes de fluorescence étant agencées pour chacune cibler une séquence d’acide nucléique distincte et lesdits fluorophores présentant des plages de longueurs d’onde de fluorescence se chevauchant.
12. Procédé selon l’une des revendications 9 à 11, dans lequel l’opération b) comprend l’utilisation d’un réactif d’amplification d’acides nucléiques in vitro comprenant au moins deux groupes de sondes de fluorescence combinant un quencher et un fluorophore, lesdites sondes de fluorescence étant agencées pour chacune cibler une séquence d’acide nucléique distincte et lesdits fluorophores présentant des plages de longueurs d’onde de fluorescence se chevauchant au sein de chaque groupe de sondes de fluorescence.
13. Procédé selon l’une des revendications 9 à 12, dans lequel l’opération c) comprend la résolution d’un système matriciel basé sur les mesures de fluorescence, les signatures temporelles et la constance de la concentration respective de chaque sonde de fluorescence.
14. Procédé selon les revendications 12 et 13, dans lequel l’opération c) comprend la résolution d’un système matriciel par groupe de sondes de fluorescence.
15. Procédé selon l’une des revendications 9 à 13, dans lequel l’opération c) comprend l’application d’une descente de gradient ou l’utilisation d’un réseau de neurones.