JP6577660B2 - 試料中の複数種類の短鎖核酸の検出方法、組み合わせ分析キットおよび分析キット供給管理方法 - Google Patents
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Description
1つの実施形態に従う短鎖核酸マルチプレックス検出法は、試料中の複数の短鎖核酸を複数の標的核酸からなる1つのシリーズとして同時期内に検出する。この方法においては、複数の反応がマルチプレックスに行われる。即ち、1つの反応場に2種類以上の反応対象、例えば、標的核酸、例えば遺伝子などが持ち込まれる。それらが共存している状態で、それらを共通する反応条件下に持ち込み、維持する。これにより、条件に適合する複数の核酸に対して共通する反応がもたらされる。これにより、1つのシリーズとして複数の標的核酸が検出される。「同時期内」とは、例えば、同時、順次または並行と解されてもよい。
(1)第1および第2の例
図1(S1)に示した長鎖化核酸セットのうちの第1のサブ長鎖化核酸41について図3を用いて更に説明する。図1(S1)および図3(a)に示す第1のサブ長鎖化核酸41は、例えば、図3(b)に示すような第1のサブ長鎖化核酸41Aまたは41Acの何れかであり得る。第1のサブ長鎖化核酸41Aと第1のサブ長鎖化核酸41Acとは互いに相補鎖である。標的配列10を含む標的核酸1を長鎖化するために、長鎖化核酸セット40は、第1のサブ長鎖化核酸41Aまたは41Acの何れかと、第2のサブ長鎖化核酸42とを含み得る。
第1のサブ長鎖化核酸41Aは、5’端に第1の標的結合領域51Aを含む。これは、第1のサブ標的配列11の相補配列である。第1のサブ長鎖化核酸41Aは、5’端から第1の標的結合領域51A、第1の検出用領域71A、第1の増幅用領域61Aをこの順番で含み、5’端がリン酸化されている。
第1のサブ長鎖化核酸41Acは、3’端に第1の標的結合領域51Acを含む。これは、第1のサブ標的配列11と同じ配列である。第1のサブ長鎖化核酸41Acは、3’端側から第1の標的結合領域51Ac、第1の検出用領域71Ac、第1の増幅用領域61Acをこの順番で含む。
第3および第4の例を図3(c)および(d)にそれぞれ示す。第3の例は、第2のサブ長鎖化核酸42が検出用領域72を含み、第1のサブ長鎖化核酸42が検出用領域71を含まない例である。第3の例において、第2のサブ長鎖化核酸42sは、3’端から第2の標的結合領域52、第2の検出用領域72、第2の増幅用領域62を含む(S1)。第4の例は、第1および第2のサブ長鎖化核酸がどもに検出用領域を含む例である。
LAMPなどの等温増幅法に好ましい長鎖化核酸セットの例を第5の例として図4Aおよび図4Cを参照しながら以下に説明する。図4Aは、第1のサブ長鎖化核酸141および第2のサブ長鎖化核酸142が含み得る増幅用領域と検出用領域とを含む態様の例を示している。しかしながら、これらのサブ長鎖化核酸141,142は、これらの増幅用領域および検出用領域を必ずしも全て含む必要はなく、所望に応じて選択され得る。以下に組み合わせの例について説明する。
上述のような長鎖化核酸セットを用いる標的核酸の長鎖化は、後述する2種類の方法の何れかを利用して行われ得る。
第1の方法を図6Aのスキーム3および図6Bスキーム4に示す。ここで使用される第1のサブ長鎖化核酸は、第1のサブ長鎖化核酸41A,141Aであり、これらはそれぞれ、5’端に第1の標的結合領域51A,151Aを含み、且つ5’端がリン酸化されている。長鎖化の反応は、例えば、(S31)〜(S33)を含むスキーム3または(S41)〜(S43)を含むスキーム4のように進行する。
上述のようなライゲーションによる長鎖化反応は、例えば、次にように行われ得る。標的核酸を含み得る試料と長鎖化核酸セットとを混合して長鎖化反応液を調製する。これを第1のサブ標的配列および第2のサブ標的配列のTm以下の温度で維持する。これにより長鎖化核酸セットを標的核酸に対してアニールさせる。次にリガーゼを添加し、その活性温度付近の温度に反応液を維持する。それによって2つのサブ標的配列を介して標的核酸に結合している第1のサブ長鎖化核酸と第2のサブ長鎖化核酸との間に存在するニック部分を連結する。これにより長鎖核酸が得られる。
第2の方法を図7Aおよび図7Bに示す。ここで使用される第1のサブ長鎖化核酸は、第1のサブ長鎖化核酸41Ac,141Acであり、3’端に第1の標的結合領域51Ac,151Acを含む。この長鎖化の反応は、(S51)〜(S55)を含むスキーム5または(S61)〜(S65)を含むスキーム6のように進行する。
上述のようなポリメラーゼによる長鎖化反応は、例えば、次のように行われ得る。標的核酸を含み得る試料と第2のサブ長鎖化核酸とDNAポリメラーゼとを混合して第1の長鎖化反応液を調製する。標的核酸がRNAである場合には、DNAポリメラーゼの代わりに逆転写酵素を長鎖化反応液に持ち込む。このような第1の長鎖化反応液を第2のサブ標的配列のTm以下の温度に維持する。それにより、第2のサブ標的配列と第2のサブ長鎖化核酸とがアニールする。次にDNAポリメラーゼ(または逆転写酵素)によって第1の伸長鎖を形成する。そこに第1の長鎖化核酸とDNAポリメラーゼ(または逆転写酵素)とを添加して第2の長鎖化反応液を調製する。これを第1のサブ標的配列のTm以下の温度に維持する。それによって第1の伸長鎖に対して第1のサブ長鎖化核酸をアニールさせ、第1の伸長鎖を鋳型として第1のサブ長鎖化核酸を伸長する。これにより第2の伸長鎖を形成する。
上述の通り、当該方法では、1つのシリーズに含まれる全ての長鎖核酸をユニバーサルプライマーセットを用いて1つの反応場において同時期内に増幅する。増幅反応条件は、選択される増幅反応に応じて決定され、一般的に用いられるそれ自身公知の酵素および反応条件から選択され得る。
増幅産物に含まれる検出用領域とプローブとのハイブリダイゼーションを検出することによって、増幅産物が検出される。増幅産物を検出することによって、試料中の標的核酸が検出される。
プローブは、基体表面に固定された状態で提供され得る。例えば、プローブは、基体と、前記基体によって提供される第1の反応場に接する面に固定されている複数のプローブとを含むプローブ固定基体として提供されてもよい。プローブ固定基体の例を図8に示す。
図9に更なるプローブ固定基体の例を示す。図9(a)はプローブ固定基体の平面図であり、図9(b)は線B−Bに沿った断面図である。このプローブ固定基体は、反応セルでの増幅反応とDNAチップ上でのハイブリダイズ反応とを連続して行うために、複数の構成要素を組み合わせて一体化してなるデバイス(以下、一体型デバイスと記す)の1例である。なお、一体型デバイス901は、検出用カセットまたは検出用カートリッジとも称され得る。
1つの実施形態に従うと、マルチシリーズについての短鎖核酸のマルチプレックス検出法が提供される。この方法によれば、上述した1つのシリーズのためのマルチプレックス検出法を利用して複数の種類のシリーズについて、試料中の複数種類の短鎖核酸を簡便に検出し得る。
(a)複数の標的配列のそれぞれについて、標的配列を含む長鎖核酸を得るための長鎖化核酸セット群を準備することと、
(b)第1の増幅用領域に結合する第1のプライマーと、第2の増幅用領域に結合する第2のプライマーとを含み、前記長鎖化核酸セット群から得られた複数の長鎖核酸を共通して増幅するユニバーサルプライマーセットを準備することと、
(c)基体と、基体によって提供される第1の反応場に接する面に固定されている複数種類のプローブ群とを含むプローブ固定基体を準備することと、
(d)試料と、(b)で準備された長鎖化核酸セット群とを第2の反応場に持ち込み、
複数種類の標的核酸のそれぞれと、対応する第1のサブ長鎖化核酸および対応する第2のサブ長鎖化核酸との間でのアニールおよびライゲーション、および/または核酸伸長によって、複数の標的核酸のそれぞれについて、第1のサブ長鎖化配列と第2のサブ長鎖化配列またはその相補配列とを含む長鎖核酸群を得ることと、
(e)第3の反応場において、長鎖核酸群と前記ユニバーサルプライマーセットとを増幅条件下に維持し、それにより増幅産物群を得ることと、
(f)第1の反応場において、(e)で生じた全ての増幅産物群と第1のプローブとの間でのハイブリダイゼーションの有無および/または量を検出することと、
(g)(f)の結果に基づいて、試料中に存在する前記複数の標的核酸を検出することと、
更に、
(h)前記(g)の結果に基づいて、前記第1〜第nのシリーズのそれぞれについての分析結果を得ること、
(i)所望に応じて、第n+(1〜s)の更なるシリーズについて追加して前記(a)〜前記(g)を行い、その結果に基づいて前記第n+(1〜s)の更なるシリーズについての分析結果をそれぞれ得ること、ここで、sは2以上の整数である
を含み得る。
実施形態によれば組み合わせ分析キットが提供される。これは、実施形態に従う検出方法を行うためのアッセイキットであり、以下キットとも称する。キットは、上述の何れかの2種類以上の長鎖化核酸セットを含む1シリーズ分の長鎖化核酸セット群、ユニバーサルプライマーセット、2種類以上のプローブを備えるプローブ固定基体を含み得る。アッセイキットは更に、任意に長鎖化試薬、増幅試薬、例えば酵素、基質、緩衝剤または緩衝液など、ハイブリダイズ試薬、例えば、塩など、洗浄剤、例えば洗浄液、標識物質、例えば電極活性物質、二本鎖認識物質など、取扱説明書並びにそれらの何れかの組み合わせなどを含み得る。
(1)互いに異なる配列をそれぞれ有する複数の標的配列をそれぞれに含む複数の標的核酸のそれぞれを長鎖化し、複数の長鎖核酸を形成し、長鎖核酸の増幅産物を得るための試薬と、
(2)試薬と組合されて提供される、増幅産物を検出するための少なくとも1つのプローブ固定基体とを備え得る。
(a)複数の標的核酸のそれぞれに対応する第1のサブ長鎖化核酸および第2のサブ長鎖化核酸を含む複数の長鎖化核酸群と、
(b)前記複数の標的核酸間で共通する配列を含む、前記第1の増幅用領域に結合する第1のプライマーと、前記複数の標的核酸間で共通する配列を含む、前記第2の増幅用領域に結合する第2のプライマーとを含むプライマーセットと、
を含み得る。
複数の標的核酸は第1〜第mの標的核酸であり、ここで、mは2以上の整数であり、
複数の標的配列は、標的核酸に対応して第1〜第mの標的配列であり、第1のサブ標的配列は、複数の標的配列に対応して第11〜第1mのサブ標的配列あり、第2のサブ標的配列は、複数の標的配列に対応して第21〜第2mのサブ標的配列であり、
第1の増幅用領域の配列は、第11〜第1mのサブ長鎖化核酸間で共通しており、第1の増幅用領域は、第1のプライマーの配列に結合する配列を含み、
第2の増幅用領域の配列は、第21〜第2mのサブ長鎖化核酸間で共通しており、第2の増幅用領域は、第2のプライマーの配列に結合する配列を含み得る。
複数の標的配列は、複数の標的核酸のそれぞれに対応している第1〜第mの標的配列であり、第1のサブ標的配列は、複数の標的配列のそれぞれに対応している第11〜第1mのサブ標的配列であり、第2のサブ標的配列は、標的配列のそれぞれに対応している第21〜第2mのサブ標的配列であり、第1の増幅用領域は、F2結合領域であり、更に前記第1のサブ長鎖化核酸はF1結合領域を含み、前記F1結合領域は、前記F2結合領域と第1のサブ標的結合領域との間に存在してよい。例えば、第1の検出用領域が第1のサブ長鎖化配列に含まれる場合には、第1の検出用領域は、第1のサブ長鎖化核酸上でF1結合領域とは重複しないようにその隣接する塩基からF2結合領域と重複する領域までの間に存在し、且つF2結合領域に重複しない領域を含み得る。第2の増幅用領域の配列は、B2結合領域であり、更に第2のサブ長鎖化核酸はB1結合領域を含み、B1結合領域は、B2結合領域と第2のサブ標的結合領域との間に存在し得る。第2の検出用領域が第2のサブ長鎖化配列に含まれる場合には、第2の検出用領域は、第2のサブ長鎖化核酸上でB1結合領域の5’端の5’側塩基からB2結合領域の5’端よりも3’側の範囲に存在し得る。第1のプライマーが、5’端にF1c配列を含み、3’端にF2配列を含むFIPプライマーであり、第2のプライマーが、5’端にB1c配列を含み、3’端にB2配列を含むBIPプライマーであり得る。第1の検出用領域が、標的配列のそれぞれに対応して第11〜第1mの検出用領域であり、第2の検出用領域が、標的配列のそれぞれに対応して第21〜第2mの検出用領域であり得る。プローブは、第1の検出用領域および/または第2の検出用領域に対応して第11〜第1mのプローブおよび/または第21〜第2mのプローブであり得る。
第1〜第nのシリーズ毎に予め定められたm1〜mn個の小項目をそれぞれに含む第1〜第nの小項目セットが設定されていてよい。第1〜第nの小項目セットがそれぞれに含む小項目数は、m1個〜mn個であり、m1〜mnは互いに同じであってもよく、異なっていてもよい。第1〜第nの小項目セットにおける最大値はmmaxであり、mおよびnは互いに独立して2以上の整数であり、第1〜第nのシリーズのそれぞれに含まれる小項目の種類は、前記シリーズ間で少なくとも一部分が互いに異なっていてもよい。第1〜第nのシリーズのうちの任意の第xのシリーズは、対応する第xの小項目セットを用いて分析され、第xの小項目セットは、第1x〜第mxの小項目を含み、1≦mx≦mmaxであり得る。
実施形態は、上述のマルチシリーズについて短鎖核酸のマルチプレックス検出法を行うために組み合わせ分析キットの提供を管理する方法である。
以下の例においては、サブ長鎖化核酸を長鎖化核酸と略す。また、例において参照される図面の符号については、上述にて引用された図面と符号とは別系統のものとして番号を割り振った。
(1)長鎖化核酸の準備
表2に示すmiRNA let−7−a(配列番号1)を検出するために実施形態に従って、図12(a)に示す長鎖化核酸2(それぞれ配列番号4および5)および長鎖化核酸3(配列番号10)を用意した。配列番号4は合成DNAオリゴ、配列番号5は3’端の2塩基がRNAであるキメラ合成オリゴである。
長鎖化核酸2と長鎖化核酸3のライゲーションを以下のように電気泳動で確認した。20μLの反応溶液にて、何れも終濃度で、50mMのTris−HCl(pH7.5)、5mMのMgCl2、1mMのDTT、20μMのATP、Ribonuclease Inhibitorを20UおよびmiRNA(配列番号1)、長鎖化核酸2(配列番号4,5)および長鎖化核酸3(配列番号10)をいずれについても33pmolずつ添加し、65℃5分、30℃10分でアニールした。その後、T4 RNA Ligase2を2Uで添加して39℃35分インキュベートしてライゲーションした。反応液の10μLをE−Gel Ex 2%(サーモフィッシャーサイエンティフィック製)にて電気泳動した。その結果を図12(b)に示す。そこに示される通り、標的短鎖核酸が存在し、長鎖化核酸2としてRNAキメラを用いた場合にライゲーション産物の生成を確認できた。
次に、低濃度のmiRNA let−7−a(配列番号1)をライゲーションし、得られた増幅用鋳型を用いてLAMP増幅を行った。miRNAを0.2fmolと、長鎖化核酸2(配列番号5)および長鎖化核酸3(配列番号10)をそれぞれ0.2fmolずつとを混合し、10μL反応液で、上記(2)記載の反応条件にてライゲーションを行った。続いて、15μLの反応液を以下の組成となるよう添加して63℃90分のLAMP増幅を行った。LAMP反応液組成は次の通りである:何れも終濃度で、20mMのTris−HCl(pH8.8)、30mMのKCl、8mMのMgCl2、10mMの(NH4)2SO4、0.1%のTween−20、0.8MのBetaine、1.4mMの各dNTP、1.6μMのFIP(配列番号20)、1.6μMのBIP(配列番号21)、0.8μMのLF(配列番号22)および8UのBst DNA polymerase。反応はいずれも2連で行った。結果、miRNAを添加してライゲーションしたものでは、平均33分で濁度が立ち上がったが、miRNAを添加せずにライゲーションしたものでは90分増幅後も濁度が立ち上らなかった。miRNA存在下でライゲーションしたもののみ、LAMP増幅されることが確認された。さらに、増幅産物の特異性を確認するため、ライゲーションPC(配列番号15)を同様にLAMP増幅した産物と共に、制限酵素Hinf Iで断片化して電気泳動した。その結果は図13に示す通りである。miRNAを介してライゲーションしたサンプルはポジティブコントロールと同じバンドパターンとなり、特異性が確認された。
配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26の核酸プローブを搭載したDNAチップを以下のように作成した。各配列の詳細を表5に示す。
次に、miRNA 3種let−7−a(配列番号1)、miR 21−5p(配列番号21)、miR 21−3p(配列番号3)のマルチプレックス検出を行った。3者に対し、サブ長鎖化核酸2としてそれぞれ配列番号5、配列番号16、配列番号18を、サブ長鎖化核酸3としてそれぞれ、配列番号10、配列番号17、配列番号19を用意した。miRNA、サブ長鎖化核酸2、サブ長鎖化核酸3をそれぞれ0.2fmolずつ混合した。これらを上記(3)に記載の条件にて、ライゲーションおよびLAMP増幅を行った。LAMP増幅用のプライマーは上記(3)と同じくFIP(配列番号20)、BIP(配列番号21)、LP(配列番号22)である。なお、増幅時間は60分に短縮した。増幅後のマルチ増幅産物をlet−7−aプローブ(配列番号23)、21−5pプローブ(破裂番号24)、21−3p(配列番号25)およびネガティブコントロール(配列番号26)を搭載した4枚のDNAチップ(DNAチップ1、DNAチップ2、DNAチップ3、DNAチップ4)それぞれについて上記(4)に記載の方法で同様に測定した。DNAチップ1、DNAチップ2、DNAチップ3、DNAチップ4に持ち込んだ試料は、サンプルA、サンプルB、サンプルC、サンプルDであり、これらの試料にはそれぞれ表6−1中で「+」で示されている標的核酸を含ませた。その結果を表6−2に示す。
長鎖化核酸を安定化するために、サブ長鎖化核酸を部分的に二本鎖化することにより、反応を効率化することができる。サブ長鎖化核酸2(配列番号5)に配列番号27を、長鎖化核酸3(配列番号10)に配列番号28の合成DNAをそれぞれアニールさせて一部を二本鎖化した。
以下に、本願出願の当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
[1]
試料中の複数種類の標的核酸の検出する方法であって、
前記複数の標的核酸は短鎖核酸であり、当該標的核酸間で互いに異なる標的配列をそれぞれ含み、当該標的配列は、5’端側に第1のサブ標的配列を含み、3’端側に第2のサブ標的配列を含み、
前記方法は、
(a)前記複数の標的配列のそれぞれについて、当該標的配列を含む長鎖核酸を得るための長鎖化核酸セット群を準備すること、
ここで、
各長鎖化核酸セットは、第1のサブ長鎖化核酸と第2のサブ長鎖化核酸を含み、
目的とする当該標的配列に対応して、
前記第1のサブ長鎖化核酸は、前記第1のサブ標的配列と同じ配列またはそれに相補的な第1の相補配列を含む第1の標的結合領域を一端に含み、他端側に第1の増幅用領域を含み、
前記第2のサブ長鎖化核酸は、前記第2のサブ標的配列に相補的な第2の相補配列を含む第2の標的結合領域を3’端に含み、および5’端側に第2の増幅用領域を含む、
ここで、前記第1のサブ長鎖化核酸および前記第2のサブ長鎖化核酸の少なくとも一方は、更に検出用領域を含み、前記第1のサブ長鎖化配列が当該検出用領域を含む場合には、当該検出用領域は、前記第1の標的結合領域と前記第1の増幅用領域との間に前記第1の標的結合領域とは重なり合わないように第1の検出用領域として存在し、前記第2のサブ長鎖化配列が当該検出用領域を含む場合には、当該検出用領域は、前記第2の標的結合領域と前記第2の増幅用領域との間に前記第2の標的結合領域とは重なり合わないように第2の検出用領域として存在し、
前記検出用領域は、目的とする当該標的配列に予め対応付けられており、前記複数の標的核酸間で互いに異なる配列を有し、前記長鎖化核酸セットは、第1のサブ長鎖化核酸および第2のサブ長鎖化核酸の少なくとも一方に検出用領域を含み、
(b)前記第1の増幅用領域に結合する第1のプライマーと、前記第2の増幅用領域に結合する第2のプライマーとを含み、前記長鎖化核酸セット群から得られた複数の当該長鎖核酸を共通して増幅するユニバーサルプライマーセットを準備することと、
(c)基体と、前記基体によって提供される第1の反応場に接する面に固定されている複数種類のプローブ群とを含むプローブ固定基体を準備すること、
ここで、前記複数種類のプローブは、
(1)前記複数種類の第1の検出用領域の配列のそれぞれと同じ配列をそれぞれ含む、
(2)前記複数の第1の検出用領域の配列のそれぞれに対する相補配列をそれぞれ含む、
(3)前記複数の第2の検出用領域の配列のそれぞれと同じ配列をそれぞれ含む、および/または
(4)前記複数の第2の検出用領域の配列のそれぞれに対する相補配列をそれぞれ含み
(d)当該試料と、前記(b)で準備された前記長鎖化核酸セット群とを第2の反応場に持ち込み、
前記複数種類の標的核酸のそれぞれと、対応する前記第1のサブ長鎖化核酸および対応する前記第2のサブ長鎖化核酸との間でのアニールおよびライゲーション、および/または核酸伸長によって、前記複数の標的核酸のそれぞれについて、前記第1のサブ長鎖化配列と前記第2のサブ長鎖化配列またはその相補配列とを含む長鎖核酸群を得ることと、
(e)第3の反応場において、前記長鎖核酸群と前記ユニバーサルプライマーセットとを増幅条件下に維持し、それにより増幅産物群を得ることと、
(f)前記第1の反応場において、前記(e)で生じた全ての増幅産物群と前記第1のプローブとの間でのハイブリダイゼーションの有無および/または量を検出することと、
(g)前記(f)の結果に基づいて、前記試料中に存在する前記複数の標的核酸を検出することと
を含む方法。
[2]
[1]に記載の方法であって、前記増幅がPCR法により行われ、
前記複数の標的核酸は第1〜第mの標的核酸であり、ここで、mは2以上の整数であり、
前記複数の標的配列は、前記標的核酸に対応している第1〜第mの標的配列であり、前記第1のサブ標的配列は、複数の前記標的配列に対応している第11〜第1mのサブ標的配列であり、前記第2のサブ標的配列は、複数の前記標的配列に対応している第21〜第2mのサブ標的配列であり、
前記第1の増幅用領域の配列は、前記第11〜第1mのサブ長鎖化核酸間で共通しており、前記第1の増幅用領域は、第1のプライマーの配列に結合する配列を含み、
前記第2の増幅用領域の配列は、前記第21〜第2mのサブ長鎖化核酸間で共通しており、前記第2の増幅用領域は、第2のプライマーの配列に結合する配列を含む
方法。
[3]
[2]に記載の方法であって、
前記長鎖核酸群を得ることが、当該核酸のアニールとライゲーション反応とを含み、
前記第1のサブ長鎖化核酸において、前記第1の標的結合領域が5’端に存在し、前記第1の増幅用領域が3’端側に存在し、リン酸化されている5’端を有し、
前記第1の標的結合領域の配列が、前記第1のサブ標的配列の相補配列である
方法。
[4]
[2]に記載の方法であって、
前記長鎖核酸群を得ることが、DNAポリメラーゼを用いる伸張反応を含み、
前記第1のサブ長鎖化核酸において、前記第1の標的結合領域が3’端に存在し、前記第1の増幅用領域が5’端側に存在し、
前記第1の標的結合領域の配列が、前記第1のサブ標的配列と同じ配列である
方法。
[5]
[1]に記載の方法であって、前記増幅がLAMPにより行われ、
前記標的核酸は第1〜第mの標的核酸であり、ここで、mは2以上の整数であり、
前記複数の標的配列は、前記標的核酸のそれぞれに対応している第1〜第mの標的配列であり、前記第1のサブ標的配列は、前記標的配列のそれぞれに対応している第11〜第1mのサブ標的配列であり、前記第2のサブ標的配列は、前記標的配列のそれぞれに対応している第21〜第2mのサブ標的配列であり、
前記第1の増幅用領域は、F2結合領域であり、更に前記第1のサブ長鎖化核酸はF1結合領域を含み、前記F1結合領域は、前記F2結合領域と第1のサブ標的結合領域との間に存在し、
前記第1の検出用領域が第1のサブ長鎖化配列に含まれる場合、前記第1の検出用領域は、前記第1のサブ長鎖化核酸上で前記F1結合領域とは重複しないようにその隣接する塩基からF2結合領域と重複する領域までの間に存在し、且つF2結合領域に重複しない領域を含み、
前記第2の増幅用領域の配列は、B2結合領域であり、更に前記第2のサブ長鎖化核酸はB1結合領域を含み、前記B1結合領域は、前記B2結合領域と第2のサブ標的結合領域との間に存在し、
前記第2の検出用領域が第2のサブ長鎖化配列に含まれる場合、前記第2の検出用領域は、前記第2のサブ長鎖化核酸上で前記B1結合領域の5’端の5’側塩基からB2結合領域の5’端よりも3’側の範囲に存在し、且つB2結合領域に重複しない領域を含み、
前記第1の検出用領域および第2の検出用領域のうちの少なくとも一方が前記長鎖化核酸セットに含まれており、
前記第1のプライマーが、5’端にF1c配列を含み、3’端にF2配列を含むFIPプライマーであり、
前記第2のプライマーが、5’端にB1c配列を含み、3’端にB2配列を含むBIPプライマーであり、
前記第1の検出用領域が、前記標的配列のそれぞれに対応して第11〜第1mの検出用領域であり、前記第2の検出用領域が、前記標的配列のそれぞれに対応して第21〜第2mの検出用領域であり、
前記プローブが、前記第1の検出用領域および前記第2の検出用領域の存在に依存して第11〜第1mのプローブおよび/または第21〜第2mのプローブである
方法。
[6]
[5]に記載の方法であって、
前記長鎖核酸群を得ることが、当該核酸のアニールとライゲーション反応とを含み、
それぞれの前記複数の標的核酸について、前記第1のサブ標的結合領域は、前記第1の相補配列であり、これは対応する前記第11〜第1mのサブ長鎖化核酸の5’端に存在し、これらはリン酸化されている5’端を有し、
前記第1のプライマー結合領域の配列は、F2c配列であり、前記F1結合領域が、F1c配列であり、前記第1のサブ長鎖化核酸において、前記第1のサブ標的結合領域が5’端に存在し、そこから3’側に向けて前記F1c配列、前記F2c配列がこの順番で存在する
方法。
[7]
[5]に記載の方法であって、
前記長鎖核酸群を得ることが、DNAポリメラーゼを用いる伸張反応を含み、
それぞれの前記複数の標的核酸について、前記第1のサブ標的結合領域は、前記第1のサブ標的結合配列と同じ配列であり、これは対応する前記第11〜第1mのサブ長鎖化核酸の3’端に存在し、
前記第1のプライマー結合領域の配列は、F2配列であり、前記F1結合領域が、F1配列であり、前記第1のサブ長鎖化核酸において、前記第1のサブ標的結合領域が3’端に存在し、そこから5’側に向けて前記F1配列、前記F2配列がこの順番で存在する
方法。
[8]
[4]、[5]または[7]に記載の方法であって、前記DNAポリメラーゼが逆転写酵素である方法。
[9]
[5]〜[8]の何れか1つに記載の方法であって、前記増幅がLAMPにより行われ、
前記第1のプライマーが、少なくともLFプライマーと組合されて第1のプライマーセットとして準備され、前記第1のサブ長鎖化核酸が、更にLF結合領域含み、前記LF結合領域は、前記F1結合領域を含まずにその隣接する塩基から前記F2結合領域と重複する領域の端までの間に存在し、且つF2結合領域に重複しない領域を有する、および/または
前記第2のプライマーが、LBプライマーと組合されて第2のプライマーセットとして準備され、前記第2のサブ長鎖化核酸が、更にLB配列を含み、前記LB配列は、前記B2配列の5’端よりも3’側であり、且つ前記B1配列の5’端よりも5’側に存在し、且つB2配列に重複しない領域を有する
方法。
[10]
[5]〜[9]の何れか1つに記載の方法であって、
前記第1のプライマーが、少なくともF3プライマーと組合されて第1のプライマーセットとして準備され、前記第1のサブ長鎖化核酸が、更にF3結合領域を含み、前記F3結合領域は、前記第1のサブ標的結合領域の存在していない末端に向けて前記F2結合領域よりも外側に存在し、および/または
前記第2のプライマーが、少なくともB3プライマーと組合されて第1のプライマーセットとして準備され、前記第2のサブ長鎖化核酸が、更にB3配列を含み、前記B3配列は、前記B2配列の5’側に存在する
方法。
[11]
[1]〜[10]の何れか1つに記載の方法を用いて、第1〜第nのシリーズを分析する方法であって、前記第1〜第nのシリーズ内のそれぞれについて予め定められた標的核酸群を小項目セットとして含み、前記小項目セットは複数種類の小項目を含んでおり、前記複数種類の小項目が前記複数の標的核酸群のそれぞれを検出することに対応し、
前記複数種類の小項目セットは、互いに独立した数で複数の当該標的核酸を含み、それらの数は互いに同じであるか、異なっており、
前記プローブ固定基体は、前記第1〜第nのシリーズで共通するユニバーサルプローブ固定基体であり、nは2以上の整数であり
前記シリーズのそれぞれについて、当該シリーズ毎に独立して当該小項目セットに対応する当該複数種類の標的核酸を検出するために、前記(a)〜前記(g)を行い、更に、
(h)前記(g)の結果に基づいて、前記第1〜第nのシリーズのそれぞれについての分析結果を得ること、
(i)所望に応じて、第n+(1〜s)の更なるシリーズについて追加して前記(a)〜前記(g)を行い、その結果に基づいて前記第n+(1〜s)の更なるシリーズについての分析結果をそれぞれ得ること、ここで、sは2以上の整数である
を含む方法。
[12]
[11]に記載の方法であって、
当該第1〜第nの小項目セットがそれぞれに含む当該小項目数は、m1個〜mn個であり、第1〜第nの小項目セット群における最大値はmmaxであり、mおよびnは互いに独立して2以上の整数であり、
前記第1〜第nのシリーズのうちの任意の第xのシリーズは、対応する当該第xの小項目セットを用いて分析され、当該第xの小項目セットは、第1x〜第mxの小項目を含み、1≦mx≦mmaxである
方法。
[13]
[1]〜[12]の何れか1つに記載の方法であって、
前記第1の反応場と前記第3の反応場が共通した1つの反応場であり、前記増幅反応と前記検出信号の検出および/または測定を同期間内に進行させ、そこにおいて前記検出信号を継続してモニタリングする、または経時的に複数の時点で検出若しくは測定する方法。
[14]
[1]〜[13]の何れか1つに記載の方法であって、
前記第1のサブ長鎖化核酸および第2のサブ長鎖化核酸が、その一部にLNAまたはPNAを含む方法。
[15]
[1]〜[14]の何れか1つに記載の方法であって、
前記第1のサブ長鎖化核酸および第2のサブ長鎖化核酸がそれぞれ第1の標的結合領域および第2の標的結合領域を除く少なくとも一部分が二本鎖である
方法。
[16]
短鎖の複数種類の標的核酸について同時期内に検出するための組み合わせ分析キットであって
当該キットは、
(1)互いに異なる配列をそれぞれ有する複数の標的配列をそれぞれに含む複数の標的核酸のそれぞれを長鎖化し、複数の長鎖核酸を形成し、前記長鎖核酸の増幅産物を得るための試薬と、
(2)前記試薬と組合されて提供される、前記増幅産物を検出するための少なくとも1つのプローブ固定基体と
を備え、ここで、
前記複数の標的核酸のそれぞれは、5’端に第1のサブ標的配列を有し、3’端に第2のサブ標的配列を有する短鎖核酸であり、
(1−1)前記試薬が、
(a)前記複数の標的核酸のそれぞれに対応する第1のサブ長鎖化核酸および第2のサブ長鎖化核酸を含む複数の長鎖化核酸群と、
ここで、
前記第1のサブ長鎖化核酸は、前記第1のサブ標的配列またはそれに相補的な第1の相補配列を含む第1の標的結合領域を一端に含み、他端に第1の増幅用領域を含み、
前記第2のサブ長鎖化核酸は、前記第2のサブ標的配列またはそれに相補的な第2の相補配列を含む第2の標的結合領域を3’端に含み、5’端側に第2の増幅用領域を含み、
ここで、前記第1のサブ長鎖化配列および前記第2のサブ長鎖化配列の少なくとも何れか一方は更に、予め前記複数の標的配列のそれぞれに対応付けられ、互いに異なる配列を有する複数の検出用領域のうちの対応する1種類の検出用領域を含み、
第1のサブ長鎖化配列が第1の当該検出用領域を含む場合には、それは前記第1の標的結合領域と第1の増幅用領域との間に前記第1の標的結合領域とは重なり合わないように存在し、第2のサブ長鎖化配列が第2の当該検出用領域を含む場合には、それは前記第2の標的結合領域と第2の増幅用領域との間に第2の標的結合領域とは重なり合わないように存在し、
(b)前記複数の標的核酸間で共通する配列を含む、前記第1の増幅用領域に結合する第1のプライマーと、前記複数の標的核酸間で共通する配列を含む、前記第2の増幅用領域に結合する第2のプライマーとを含むプライマーセットと、
を含み、
(2−1)前記プローブ固定基体は、
基体と、
前記基体によって提供される第1の反応場に接する面に固定されている複数のプローブとを含み、
ここで、前記複数のプローブは、
(1)前記複数の第1の検出用領域の配列のそれぞれと同じ配列をそれぞれ含む、
(2)前記複数の第1の検出用領域の配列のそれぞれに対する相補配列をそれぞれ含む、
(3)前記複数の第2の検出用領域の配列のそれぞれと同じ配列をそれぞれ含む、および/または
(4)前記複数の第2の検出用領域の配列のそれぞれに対する相補配列をそれぞれ含む
を備える
キット。
[17]
[16]に記載のキットであって、前記プライマーセットがPCRのためのものであり、
前記第1のプライマーと第1のプライマーとの組み合わせが、フォワードプライマーとリバースプライマーとの組み合わせであり、
前記複数の標的核酸は第1〜第mの標的核酸であり、ここで、mは2以上の整数であり、
前記複数の標的配列は、前記標的核酸に対応して第1〜第mの標的配列であり、前記第1のサブ標的配列は、前記複数の標的配列に対応して第11〜第1mのサブ標的配列あり、前記第2のサブ標的配列は、前記複数の標的配列に対応して第21〜第2mのサブ標的配列であり、
前記第1の増幅用領域の配列は、前記第11〜第1mのサブ長鎖化核酸間で共通しており、前記第1の増幅用領域は、第1のプライマーの配列に結合する配列を含み、
前記第2の増幅用領域の配列は、前記第21〜第2mのサブ長鎖化核酸間で共通しており、前記第2の増幅用領域は、第2のプライマーの配列に結合する配列を含む
キット。
[18]
[16]に記載のキットであって、前記増幅条件がLAMPの反応条件であり、
前記標的核酸は第1〜第mの標的核酸であり、ここで、mは2以上の整数であり、
前記複数の標的配列は、複数の前記標的核酸のそれぞれに対応している第1〜第mの標的配列であり、前記第1のサブ標的配列は、複数の前記標的配列のそれぞれに対応している第11〜第1mのサブ標的配列であり、前記第2のサブ標的配列は、前記標的配列のそれぞれに対応している第21〜第2mのサブ標的配列であり、
前記第1の増幅用領域は、F2結合領域であり、更に前記第1のサブ長鎖化核酸はF1結合領域を含み、前記F1結合領域は、前記F2結合領域と第1のサブ標的結合領域との間に存在し、
前記第1の検出用領域が第1のサブ長鎖化配列に含まれる場合、前記第1の検出用領域は、前記第1のサブ長鎖化核酸上で前記F1結合領域とは重複しないようにその隣接する塩基からF2結合領域と重複する領域までの間に存在し、且つF2結合領域に重複しない領域を含み、
前記第2の増幅用領域の配列は、B2結合領域であり、更に前記第2のサブ長鎖化核酸はB1結合領域を含み、前記B1結合領域は、前記B2結合領域と第2のサブ標的結合領域との間に存在し、
前記第2の検出用領域が第2のサブ長鎖化配列に含まれる場合、前記第2の検出用領域は、前記第2のサブ長鎖化核酸上で前記B1結合領域の5’端の5’側塩基からB2結合領域の5’端よりも3’側の範囲に存在し、
前記第1のプライマーが、5’端にF1c配列を含み、3’端にF2配列を含むFIPプライマーであり、
前記第2のプライマーが、5’端にB1c配列を含み、3’端にB2配列を含むBIPプライマーであり、
前記第1の検出用領域が、前記標的配列のそれぞれに対応して第11〜第1mの検出用領域であり、前記第2の検出用領域が、前記標的配列のそれぞれに対応して第21〜第2mの検出用領域であり、
前記プローブが、前記第1の検出用領域および/または前記第2の検出用領域に対応して第11〜第1mのプローブおよび/または第21〜第2mのプローブである
キット。
[19]
[16]〜[18]の何れか1つに記載の組み合わせ分析キットであって
上記(1)の前記試薬が、第1のシリーズに対応付けられた第1の試薬であり、前記第1の試薬のための前記複数の標的配列が、前記第1のシリーズに関連する標的核酸群であり、
当該組み合わせ分析キットは、更に、
(3)上記(1)の前記第1の試薬と組み合わせて提供される、第2〜第nのシリーズにそれぞれ対応付けられた第2〜第nの試薬のうちの少なくとも1つ、
ここで、
第2〜第nの試薬のそれぞれは、当該第2〜第nのシリーズ毎に対応付けられた[16]〜[18]の何れか1つに記載の当該試薬であり、前記シリーズ内で互いに異なる配列をそれぞれ有する複数の当該標的配列をそれぞれに含む複数の当該標的核酸のそれぞれを長鎖化し、複数の当該長鎖核酸を形成し、前記長鎖核酸の増幅産物を得るための試薬である;および/または
(4)上記(1)および/または上記(3)の当該第2〜第nの試薬のうちの少なくとも1つと組合されて提供される、[16]に記載の前記プローブ固定基体;
を備え、
ここで、
前記第1〜第nのシリーズ毎に予め定められたm1〜mn個の小項目をそれぞれに含む第1〜第nの小項目セットが設定されており、当該第1〜第nの小項目セットがそれぞれに含む当該小項目数は、m1個〜mn個であり、m1〜mnは互いに同じであるか、異なっており、第1〜第nの小項目セットにおける最大値はmmaxであり、mおよびnは互いに独立して2以上の整数であり、当該第1〜第nのシリーズのそれぞれに含まれる当該小項目の種類は、前記シリーズ間で少なくとも一部分が互いに異なっており、
前記第1〜第nのシリーズのうちの任意の第xのシリーズは、対応する当該第xの小項目セットを用いて分析され、当該第xの小項目セットは、第1x〜第mxの小項目を含み、1≦mx≦mmaxであり、
前記第1x〜第mxの小項目は、互いに異なる配列を有する第1〜第mxの当該標的配列をそれぞれに有する第1x〜第mxの当該標的核酸の存在または存在量に関する情報をそれぞれ得ることであり、前記第xの小項目セットに含まれる前記第1〜第mxの標的配列は、前記第xのシリーズ内で共通するのテーマに関連する標的核酸群であり、
前記第1x〜第mxの標的配列のそれぞれが、5’端に第11x〜第1mxの当該サブ標的配列をそれぞれ含み、3’端には第21x〜第2mxの当該サブ標的配列をそれぞれ含んでいる
キット。
[20]
[16]〜[19]に記載の組み合わせ分析キットの供給管理方法であって、
− それを有する場所とを紐付けられた、前記キットに含まれる当該長鎖化核酸セットおよび当該プローブ固定基体に関する在庫情報を互いに独立して記憶しているデータベースを構築することと、
− 当該キットを使用者からのオーダーを受けた管理システムが、前記オーダー内容に応じて前記データベース中の当該在庫情報を検索し、そこに含まれる当該情報の中から予め定められた条件に従って使用者に送られる当該キットまたは当該長鎖化核酸セット若しくは当該プローブ固定基体を在庫として有する場所を決定し、当該場所から前記使用者に対して、前記使用者に送る指示を出すことと、
を備える
方法。
Claims (20)
- 試料中の複数種類の標的核酸の検出する方法であって、
前記複数の標的核酸は短鎖核酸であり、当該標的核酸間で互いに異なる標的配列をそれぞれ含み、当該標的配列は、5’端側に第1のサブ標的配列を含み、3’端側に第2のサブ標的配列を含み、
前記方法は、
(a)前記複数の標的配列のそれぞれについて、当該標的配列を含む長鎖核酸を得るための長鎖化核酸セット群を準備すること、
ここで、
各長鎖化核酸セットは、第1のサブ長鎖化核酸と第2のサブ長鎖化核酸を含み、
目的とする当該標的配列に対応して、
前記第1のサブ長鎖化核酸は、前記第1のサブ標的配列と同じ配列またはそれに相補的な第1の相補配列を含む第1の標的結合領域を一端に含み、他端側に第1の増幅用領域を含み、
前記第2のサブ長鎖化核酸は、前記第2のサブ標的配列に相補的な第2の相補配列を含む第2の標的結合領域を3’端に含み、および5’端側に第2の増幅用領域を含む、
ここで、前記第1のサブ長鎖化核酸および前記第2のサブ長鎖化核酸の少なくとも一方は、更に検出用領域を含み、前記第1のサブ長鎖化配列が当該検出用領域を含む場合には、当該検出用領域は、前記第1の標的結合領域と前記第1の増幅用領域との間に前記第1の標的結合領域とは重なり合わないように第1の検出用領域として存在し、前記第2のサブ長鎖化配列が当該検出用領域を含む場合には、当該検出用領域は、前記第2の標的結合領域と前記第2の増幅用領域との間に前記第2の標的結合領域とは重なり合わないように第2の検出用領域として存在し、
前記検出用領域は、目的とする当該標的配列に予め対応付けられており、前記複数の標的核酸間で互いに異なる配列を有し、前記長鎖化核酸セットは、第1のサブ長鎖化核酸および第2のサブ長鎖化核酸の少なくとも一方に検出用領域を含み、
(b)前記第1の増幅用領域に結合する第1のプライマーと、前記第2の増幅用領域に結合する第2のプライマーとを少なくとも含み、前記長鎖化核酸セット群から得られた複数の当該長鎖核酸を共通して増幅するユニバーサルLAMPプライマーセットを準備することと、
(c)基体と、前記基体によって提供される第1の反応場に接する面に固定されている複数種類のプローブ群とを含むプローブ固定基体を準備すること、
ここで、前記複数種類のプローブは、
(1)前記複数種類の第1の検出用領域の配列のそれぞれと同じ配列、
(2)前記複数の第1の検出用領域の配列のそれぞれに対する相補配列、
(3)前記複数の第2の検出用領域の配列のそれぞれと同じ配列、
(4)前記複数の第2の検出用領域の配列のそれぞれに対する相補配列
のうち、(1)ないし(4)の配列の少なくとも1つをそれぞれ含み、
(d)当該試料と、前記(a)で準備された前記長鎖化核酸セット群とを第2の反応場に持ち込み、
前記複数種類の標的核酸のそれぞれと、対応する前記第1のサブ長鎖化核酸および対応する前記第2のサブ長鎖化核酸との間でのアニールおよびライゲーション、および/または核酸伸長によって、前記複数の標的核酸のそれぞれについて、前記第1のサブ長鎖化配列と前記第2のサブ長鎖化配列またはその相補配列とを含む長鎖核酸群を得ることと、
(e)前記第1の反応場において、前記長鎖核酸群と前記ユニバーサルLAMPプライマーセットとをLAMP条件下に維持し、それにより増幅産物群を得ることと、
(f)前記第1の反応場において、前記(e)で生じた全ての増幅産物群と前記複数種類のプローブとの間でのハイブリダイゼーションの有無および/または量を検出することと、
(g)前記(f)の結果に基づいて、前記試料中に存在する前記複数の標的核酸を検出することと
を含む方法。 - 試料中の複数種類の標的核酸の検出する方法であって、
前記複数の標的核酸は短鎖核酸であり、当該標的核酸間で互いに異なる標的配列をそれぞれ含み、当該標的配列は、5’端側に第1のサブ標的配列を含み、3’端側に第2のサブ標的配列を含み、
前記方法は、
(a)前記複数の標的配列のそれぞれについて、当該標的配列を含む長鎖核酸を得るための長鎖化核酸セット群を準備すること、
ここで、
各長鎖化核酸セットは、第1のサブ長鎖化核酸と第2のサブ長鎖化核酸を含み、
目的とする当該標的配列に対応して、
前記第1のサブ長鎖化核酸は、前記第1のサブ標的配列と同じ配列またはそれに相補的な第1の相補配列を含む第1の標的結合領域を一端に含み、他端側に第1の増幅用領域を含み、
前記第2のサブ長鎖化核酸は、前記第2のサブ標的配列に相補的な第2の相補配列を含む第2の標的結合領域を3’端に含み、および5’端側に第2の増幅用領域を含む、
ここで、前記第1のサブ長鎖化核酸および前記第2のサブ長鎖化核酸の少なくとも一方は、更に検出用領域を含み、前記第1のサブ長鎖化配列が当該検出用領域を含む場合には、当該検出用領域は、前記第1の標的結合領域と前記第1の増幅用領域との間に前記第1の標的結合領域とは重なり合わないように第1の検出用領域として存在し、前記第2のサブ長鎖化配列が当該検出用領域を含む場合には、当該検出用領域は、前記第2の標的結合領域と前記第2の増幅用領域との間に前記第2の標的結合領域とは重なり合わないように第2の検出用領域として存在し、
前記検出用領域は、目的とする当該標的配列に予め対応付けられており、前記複数の標的核酸間で互いに異なる配列を有し、前記長鎖化核酸セットは、第1のサブ長鎖化核酸および第2のサブ長鎖化核酸の少なくとも一方に検出用領域を含み、
(b)前記第1の増幅用領域に結合する第1のプライマーと、前記第2の増幅用領域に結合する第2のプライマーとを少なくとも含み、前記長鎖化核酸セット群から得られた複数の当該長鎖核酸を共通して増幅するユニバーサルLAMPプライマーセットを準備することと、
(c)基体と、前記基体によって提供される第1の反応場に接する面に固定されている複数種類のプローブ群とを含むプローブ固定基体を準備すること、
ここで、前記複数種類のプローブは、
(1)前記複数種類の第1の検出用領域の配列のそれぞれと同じ配列、
(2)前記複数の第1の検出用領域の配列のそれぞれに対する相補配列、
(3)前記複数の第2の検出用領域の配列のそれぞれと同じ配列、
(4)前記複数の第2の検出用領域の配列のそれぞれに対する相補配列
のうち、(1)ないし(4)の配列の少なくとも1つをそれぞれ含み、
(d)当該試料と、前記(a)で準備された前記長鎖化核酸セット群とを第2の反応場に持ち込み、
前記複数種類の標的核酸のそれぞれと、対応する前記第1のサブ長鎖化核酸および対応する前記第2のサブ長鎖化核酸との間でのアニールおよびライゲーション、および/または核酸伸長によって、前記複数の標的核酸のそれぞれについて、前記第1のサブ長鎖化配列と前記第2のサブ長鎖化配列またはその相補配列とを含む長鎖核酸群を得ることと、
(e)前記第1の反応場と連結される第3の反応場において、前記長鎖核酸群と前記ユニバーサルLAMPプライマーセットとをLAMP条件下に維持し、それにより増幅産物群を得ることと、
(f)前記第1の反応場において、前記(e)で生じた全ての増幅産物群と前記複数種類のプローブとの間でのハイブリダイゼーションの有無および/または量を検出することと、
(g)前記(f)の結果に基づいて、前記試料中に存在する前記複数の標的核酸を検出することと、
を含む方法。 - 請求項1に記載の方法であって、
前記標的核酸は第1〜第mの標的核酸であり、ここで、mは2以上の整数であり、
前記複数の標的配列は、前記標的核酸のそれぞれに対応している第1〜第mの標的配列であり、前記第1のサブ標的配列は、前記標的配列のそれぞれに対応している第11〜第1mのサブ標的配列であり、前記第2のサブ標的配列は、前記標的配列のそれぞれに対応している第21〜第2mのサブ標的配列であり、
前記第1の増幅用領域は、F2結合領域であり、更に前記第1のサブ長鎖化核酸はF1結合領域を含み、前記F1結合領域は、前記F2結合領域と第1のサブ標的結合領域との間に存在し、
前記第1の検出用領域が第1のサブ長鎖化配列に含まれる場合、前記第1の検出用領域は、前記第1のサブ長鎖化核酸上で前記F1結合領域とは重複しないようにその隣接する塩基からF2結合領域と重複する領域までの間に存在し、且つF2結合領域に重複しない領域を含み、
前記第2の増幅用領域の配列は、B2結合領域であり、更に前記第2のサブ長鎖化核酸はB1結合領域を含み、前記B1結合領域は、前記B2結合領域と第2のサブ標的結合領域との間に存在し、
前記第2の検出用領域が第2のサブ長鎖化配列に含まれる場合、前記第2の検出用領域は、前記第2のサブ長鎖化核酸上で前記B1結合領域の5’端の5’側塩基からB2結合領域の5’端よりも3’側の範囲に存在し、且つB2結合領域に重複しない領域を含み、
前記第1の検出用領域および第2の検出用領域のうちの少なくとも一方が前記長鎖化核酸セットに含まれており、
前記第1のプライマーが、5’端にF1c配列を含み、3’端にF2配列を含むFIPプライマーであり、
前記第2のプライマーが、5’端にB1c配列を含み、3’端にB2配列を含むBIPプライマーであり、
前記第1の検出用領域が、前記標的配列のそれぞれに対応して第11〜第1mの検出用領域であり、前記第2の検出用領域が、前記標的配列のそれぞれに対応して第21〜第2mの検出用領域であり、
前記プローブが、前記第1の検出用領域および前記第2の検出用領域の存在に依存して第11〜第1mのプローブおよび/または第21〜第2mのプローブである
方法。 - 請求項3に記載の方法であって、
前記長鎖核酸群を得ることが、当該核酸のアニールとライゲーション反応とを含み、
それぞれの前記複数の標的核酸について、前記第1のサブ標的結合領域は、前記第1の相補配列であり、これは対応する前記第11〜第1mのサブ長鎖化核酸の5’端に存在し、これらはリン酸化されている5’端を有し、
前記第1のプライマー結合領域の配列は、F2c配列であり、前記F1結合領域が、F1c配列であり、前記第1のサブ長鎖化核酸において、前記第1のサブ標的結合領域が5’端に存在し、そこから3’側に向けて前記F1c配列、前記F2c配列がこの順番で存在する
方法。 - 請求項3に記載の方法であって、
前記長鎖核酸群を得ることが、DNAポリメラーゼを用いる伸張反応を含み、
それぞれの前記複数の標的核酸について、前記第1のサブ標的結合領域は、前記第1のサブ標的結合配列と同じ配列であり、これは対応する前記第11〜第1mのサブ長鎖化核酸の3’端に存在し、
前記第1のプライマー結合領域の配列は、F2配列であり、前記F1結合領域が、F1配列であり、前記第1のサブ長鎖化核酸において、前記第1のサブ標的結合領域が3’端に存在し、そこから5’側に向けて前記F1配列、前記F2配列がこの順番で存在する
方法。 - 請求項5に記載の方法であって、前記DNAポリメラーゼが逆転写酵素である方法。
- 請求項1〜6の何れか1項に記載の方法であって、
前記第1のプライマーが、少なくともLFプライマーと組合されて第1のプライマーセットとして準備され、前記第1のサブ長鎖化核酸が、更にLF結合領域含み、前記LF結合領域は、前記F1結合領域を含まずにその隣接する塩基から前記F2結合領域と重複する領域の端までの間に存在し、且つF2結合領域に重複しない領域を有する、および/または
前記第2のプライマーが、LBプライマーと組合されて第2のプライマーセットとして準備され、前記第2のサブ長鎖化核酸が、更にLB配列を含み、前記LB配列は、前記B2配列の5’端よりも3’側であり、且つ前記B1配列の5’端よりも5’側に存在し、且つB2配列に重複しない領域を有する
方法。 - 前記請求項1〜7の何れか1項に記載の方法であって、
前記第1のプライマーが、少なくともF3プライマーと組合されて第1のプライマーセットとして準備され、前記第1のサブ長鎖化核酸が、更にF3結合領域を含み、前記F3結合領域は、前記第1のサブ標的結合領域の存在していない末端に向けて前記F2結合領域よりも外側に存在し、および/または
前記第2のプライマーが、少なくともB3プライマーと組合されて第1のプライマーセットとして準備され、前記第2のサブ長鎖化核酸が、更にB3配列を含み、前記B3配列は、前記B2配列の5’側に存在する
方法。 - 請求項1〜8の何れか1項に記載の方法を用いて、第1〜第nのシリーズを分析する方法であって、前記第1〜第nのシリーズ内のそれぞれについて予め定められた標的核酸群を小項目セットとして含み、前記小項目セットは複数種類の小項目を含んでおり、前記複数種類の小項目が前記複数の標的核酸群のそれぞれを検出することに対応し、
前記複数種類の小項目セットは、互いに独立した数で複数の当該標的核酸を含み、それらの数は互いに同じであるか、異なっており、
前記プローブ固定基体は、前記第1〜第nのシリーズで共通するユニバーサルプローブ固定基体であり、nは2以上の整数であり
前記シリーズのそれぞれについて、当該シリーズ毎に独立して当該小項目セットに対応する当該複数種類の標的核酸を検出するために、前記(a)〜前記(g)を行い、更に、
(h)前記(g)の結果に基づいて、前記第1〜第nのシリーズのそれぞれについての分析結果を得ること、
(i)所望に応じて、第n+(1〜s)の更なるシリーズについて追加して前記(a)〜前記(g)を行い、その結果に基づいて前記第n+(1〜s)の更なるシリーズについての分析結果をそれぞれ得ること、ここで、sは2以上の整数である
を含む方法。 - 請求項9に記載の方法であって、
当該第1〜第nの小項目セットがそれぞれに含む当該小項目数は、m1個〜mn個であり、第1〜第nの小項目セット群における最大値はmmaxであり、mおよびnは互いに独立して2以上の整数であり、
前記第1〜第nのシリーズのうちの任意の第xのシリーズは、対応する当該第xの小項目セットを用いて分析され、当該第xの小項目セットは、第1x〜第mxの小項目を含み、1≦mx≦mmaxである
方法。 - 請求項1〜10の何れか1項に記載の方法であって、
増幅産物群を得ること及びハイブリダイゼーションの有無および/または量を検出することを同期間内に進行させ、前記ハイブリダイゼーションの有無および/または量を継続してモニタリングする、または経時的に複数の時点で検出若しくは測定する方法。 - 請求項1〜11の何れか1項に記載の方法であって、
前記第1のサブ長鎖化核酸および第2のサブ長鎖化核酸が、その一部にLNAまたはPNAを含む方法。 - 請求項1〜12の何れか1項に記載の方法であって、
前記第1のサブ長鎖化核酸および第2のサブ長鎖化核酸がそれぞれ第1の標的結合領域および第2の標的結合領域を除く少なくとも一部分が二本鎖である
方法。 - 短鎖の複数種類の標的核酸について同時期内に検出するための組み合わせ分析キットであって
当該キットは、
(1)互いに異なる配列をそれぞれ有する複数の標的配列をそれぞれに含む複数の標的核酸のそれぞれを長鎖化し、複数の長鎖核酸を形成し、前記長鎖核酸の増幅産物を得るための試薬と、
(2)前記試薬と組合されて提供される、前記複数の長鎖核酸の増幅と前記増幅産物の検出とを同一反応場内で行うための少なくとも1つのプローブ固定基体と
を備え、ここで、
前記複数の標的核酸のそれぞれは、5’端に第1のサブ標的配列を有し、3’端に第2のサブ標的配列を有する短鎖核酸であり、
(1−1)前記試薬が、
(a)前記複数の標的核酸のそれぞれに対応する第1のサブ長鎖化核酸および第2のサブ長鎖化核酸を含む複数の長鎖化核酸群と、
ここで、
前記第1のサブ長鎖化核酸は、前記第1のサブ標的配列またはそれに相補的な第1の相補配列を含む第1の標的結合領域を一端に含み、他端に第1の増幅用領域を含み、
前記第2のサブ長鎖化核酸は、前記第2のサブ標的配列またはそれに相補的な第2の相補配列を含む第2の標的結合領域を3’端に含み、5’端側に第2の増幅用領域を含み、
ここで、前記第1のサブ長鎖化配列および前記第2のサブ長鎖化配列の少なくとも何れか一方は更に、予め前記複数の標的配列のそれぞれに対応付けられ、互いに異なる配列を有する複数の検出用領域のうちの対応する1種類の検出用領域を含み、
第1のサブ長鎖化配列が第1の当該検出用領域を含む場合には、それは前記第1の標的結合領域と第1の増幅用領域との間に前記第1の標的結合領域とは重なり合わないように存在し、第2のサブ長鎖化配列が第2の当該検出用領域を含む場合には、それは前記第2の標的結合領域と第2の増幅用領域との間に第2の標的結合領域とは重なり合わないように存在し、
(b)前記複数の標的核酸間で共通する配列を含む、前記第1の増幅用領域に結合する第1のプライマーと、前記複数の標的核酸間で共通する配列を含む、前記第2の増幅用領域に結合する第2のプライマーとを少なくとも含むユニバーサルLAMPプライマーセットと、
を含み、
(2−1)前記プローブ固定基体は、
基体と、
前記基体によって提供される第1の反応場に接する面に固定されている複数のプローブとを含み、
ここで、前記複数のプローブは、
(1)前記複数の第1の検出用領域の配列のそれぞれと同じ配列、
(2)前記複数の第1の検出用領域の配列のそれぞれに対する相補配列、
(3)前記複数の第2の検出用領域の配列のそれぞれと同じ配列、
(4)前記複数の第2の検出用領域の配列のそれぞれに対する相補配列
のうち、(1)ないし(4)の配列の少なくとも1つをそれぞれ備える
キット。 - 請求項14に記載のキットであって、
前記標的核酸は第1〜第mの標的核酸であり、ここで、mは2以上の整数であり、
前記複数の標的配列は、複数の前記標的核酸のそれぞれに対応している第1〜第mの標的配列であり、前記第1のサブ標的配列は、複数の前記標的配列のそれぞれに対応している第11〜第1mのサブ標的配列であり、前記第2のサブ標的配列は、前記標的配列のそれぞれに対応している第21〜第2mのサブ標的配列であり、
前記第1の増幅用領域は、F2結合領域であり、更に前記第1のサブ長鎖化核酸はF1結合領域を含み、前記F1結合領域は、前記F2結合領域と第1のサブ標的結合領域との間に存在し、
前記第1の検出用領域が第1のサブ長鎖化配列に含まれる場合、前記第1の検出用領域は、前記第1のサブ長鎖化核酸上で前記F1結合領域とは重複しないようにその隣接する塩基からF2結合領域と重複する領域までの間に存在し、且つF2結合領域に重複しない領域を含み、
前記第2の増幅用領域の配列は、B2結合領域であり、更に前記第2のサブ長鎖化核酸はB1結合領域を含み、前記B1結合領域は、前記B2結合領域と第2のサブ標的結合領域との間に存在し、
前記第2の検出用領域が第2のサブ長鎖化配列に含まれる場合、前記第2の検出用領域は、前記第2のサブ長鎖化核酸上で前記B1結合領域の5’端の5’側塩基からB2結合領域の5’端よりも3’側の範囲に存在し、
前記第1のプライマーが、5’端にF1c配列を含み、3’端にF2配列を含むFIPプライマーであり、
前記第2のプライマーが、5’端にB1c配列を含み、3’端にB2配列を含むBIPプライマーであり、
前記第1の検出用領域が、前記標的配列のそれぞれに対応して第11〜第1mの検出用領域であり、前記第2の検出用領域が、前記標的配列のそれぞれに対応して第21〜第2mの検出用領域であり、
前記プローブが、前記第1の検出用領域および/または前記第2の検出用領域に対応して第11〜第1mのプローブおよび/または第21〜第2mのプローブである
キット。 - 請求項14又は15に記載の組み合わせ分析キットであって
上記(1)の前記試薬が、第1のシリーズに対応付けられた第1の試薬であり、前記第1の試薬のための前記複数の標的配列が、前記第1のシリーズに関連する標的核酸群であり、
当該組み合わせ分析キットは、更に、
(3)上記(1)の前記第1の試薬と組み合わせて提供される、第2〜第nのシリーズにそれぞれ対応付けられた第2〜第nの試薬のうちの少なくとも1つ、
ここで、
第2〜第nの試薬のそれぞれは、当該第2〜第nのシリーズ毎に対応付けられた請求項16〜18の何れか1項に記載の当該試薬であり、前記シリーズ内で互いに異なる配列をそれぞれ有する複数の当該標的配列をそれぞれに含む複数の当該標的核酸のそれぞれを長鎖化し、複数の当該長鎖核酸を形成し、前記長鎖核酸の増幅産物を得るための試薬である;および/または
(4)上記(1)および/または上記(3)の当該第2〜第nの試薬のうちの少なくとも1つと組合されて提供される、請求項16に記載の前記プローブ固定基体;
を備え、
ここで、
前記第1〜第nのシリーズ毎に予め定められたm1〜mn個の小項目をそれぞれに含む第1〜第nの小項目セットが設定されており、当該第1〜第nの小項目セットがそれぞれに含む当該小項目数は、m1個〜mn個であり、m1〜mnは互いに同じであるか、異なっており、第1〜第nの小項目セットにおける最大値はmmaxであり、mおよびnは互いに独立して2以上の整数であり、当該第1〜第nのシリーズのそれぞれに含まれる当該小項目の種類は、前記シリーズ間で少なくとも一部分が互いに異なっており、
前記第1〜第nのシリーズのうちの任意の第xのシリーズは、対応する当該第xの小項目セットを用いて分析され、当該第xの小項目セットは、第1x〜第mxの小項目を含み、1≦mx≦mmaxであり、
前記第1x〜第mxの小項目は、互いに異なる配列を有する第1〜第mxの当該標的配列をそれぞれに有する第1x〜第mxの当該標的核酸の存在または存在量に関する情報をそれぞれ得ることであり、前記第xの小項目セットに含まれる前記第1〜第mxの標的配列は、前記第xのシリーズ内で共通するのテーマに関連する標的核酸群であり、
前記第1x〜第mxの標的配列のそれぞれが、5’端に第11x〜第1mxの当該サブ標的配列をそれぞれ含み、3’端には第21x〜第2mxの当該サブ標的配列をそれぞれ含んでいる
キット。 - 請求項14〜16の何れか1項に記載の組み合わせ分析キットであって、
前記複数の長鎖核酸の増幅と前記増幅産物の検出とを同一反応場内で同期間内に行うための少なくとも1つのプローブ固定基体と
を備えるキット。 - 請求項14〜16に記載の組み合わせ分析キットの供給管理方法であって、
− それを有する場所とを紐付けられた、前記キットに含まれる当該長鎖化核酸セットおよび当該プローブ固定基体に関する在庫情報を互いに独立して記憶しているデータベースを構築することと、
− 当該キットを使用者からのオーダーを受けた管理システムが、前記オーダー内容に応じて前記データベース中の当該在庫情報を検索し、そこに含まれる当該情報の中から予め定められた条件に従って使用者に送られる当該キットまたは当該長鎖化核酸セット若しくは当該プローブ固定基体を在庫として有する場所を決定し、当該場所から前記使用者に対して、前記使用者に送る指示を出すことと、
を備える
方法。 - 請求項1〜13の何れか1項に記載の方法に用いる、
試料中の、短鎖核酸である複数種類の標的核酸を、複数種類の長鎖化核酸セットを用いてそれぞれ長鎖化して得られる複数種類の長鎖核酸の増幅反応と、前記増幅反応によって得られる増幅産物の検出とを同一反応場内で行うためのプローブ固定基体であって、
基体と、
前記基体によって提供される第1の反応場に接する面に固定されている複数のプローブと、
前記第1の反応場に接する面に遊離可能に固定されている、前記複数の長鎖核酸を増幅するための一種類のユニバーサルLAMPプライマーセットと
を含み、
前記複数のプローブは、
(1)前記複数の長鎖化核酸セットにそれぞれ含まれる第1のサブ長鎖化核酸の第1の検出用領域の配列のそれぞれと同じ配列、
(2)前記第1の検出用領域の配列のそれぞれに対する相補配列、
(3)前記複数の長鎖化核酸セットにそれぞれ含まれる第2のサブ長鎖化核酸の第2の検出用領域の配列のそれぞれと同じ配列、
(4)前記複数の第2の検出用領域の配列のそれぞれに対する相補配列
のうち、(1)ないし(4)の配列の少なくとも1つをそれぞれ含むプローブ固定基体。 - 前記第1の反応場は流路であり、
前記一種類のユニバーサルLAMPプライマーセットは、前記流路の上流側の端に位置する、前記第1の反応場に接する面に遊離可能に固定されている、請求項19に記載のプローブ固定基体。
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