JP5663491B2 - 標的核酸の検出方法 - Google Patents
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Description
本明細書に開示される検出方法は、それぞれ異なる固有の塩基配列を有する複数の検出用プローブを備える固相体を準備する工程と、前記標的核酸に予め関連付けられた前記検出用プローブの検出用配列に相補的なタグ配列と標識とを有するキメラDNAを取得するように前記試料に対してPCRを実施する工程と、前記キメラDNAと前記検出用プローブとを前記検出用配列と前記タグ配列とを用いてハイブリダイズさせる工程と、前記担体上の前記標識に基づくシグナル強度情報を取得する工程と、前記シグナル強度情報に基づいて前記標的核酸を検出する工程と、を備えている。本明細書に開示の検出方法は、1種又は2種以上の標的核酸を適用対象とし、より詳細には、これらの標的核酸中の特徴的な配列に関する標的配列を検出対象とする。以下、主として一種の標的核酸についての一連の工程を説明するが、以下の工程は、複数又は多数の標的核酸を同時に検出する場合にも適用される。
本明細書に開示される検出方法(以下、単に本検出方法という。)は、図1に示すように、固相体100を準備する工程を備えることができる。こうした固相体100は、検出方法の実施に先立って予め準備していてもよいし、商業的に入手してもよいし、検出方法の実施毎に調製してもよい。
図1に示すように、PCR工程は、標識42と、標的核酸10に予め関連付けられた特定の検出用プローブ104の検出用配列106とハイブリダイズ可能なタグ配列66とを有するキメラDNA60を取得するように試料に対してPCRを実施する工程とすることができる。このようなキメラDNA60を取得することで、標的核酸10の標的配列12の塩基配列にかかわらず、予め標的配列12に関係なく決定された固有の検出用配列106を有する検出用プローブ104を利用することができるようになる。タグ配列66は、検出用プローブ104の固有の検出用配列106と特異的にハイブリダイズ可能な程度に相補的であることが好ましく、より好ましくは検出用配列106に完全に相補的である。標識については後述する。
図1に示すように、第1のプライマー30は、識別用配列32とタグ付加用配列36とを有している。第1のプライマー30は、標的核酸10の種類に基づき、その数だけ準備される。ある種の生物のゲノムDNAの所定部分において二通りの変異が想定される場合、例えば、一塩基置換変異であって、天然型がAであり変異型がTの場合、当該部分について標的核酸10は二種類存在することになる。したがって、当該部分について、一つの標的核酸10が天然型塩基を含む標的配列12を有し、他の一つの標的核酸10が変異型塩基を含む標的配列12を有することになる。したがって、遺伝子のある部位に関し2種類の標的核酸10が存在するときには、それぞれの標的核酸10が有する標的配列12に相補的な識別用配列32をそれぞれ備える2種類の第1のプライマー30が準備される。
識別用配列32は、標的核酸10中の特徴的配列である標的配列12と特異的にハイブリダイズして試料中の標的核酸10を識別することができる。識別用配列32は、標的核酸10の標的配列12と高い選択性でハイブリダイズ可能な程度に相補的に設定される。好ましくは完全に相補的(特異的)に設定される。なお、識別用配列32として好ましい長さは変異の態様にもよるため、特に限定されないが、たとえば15塩基以上であることが望ましい。識別用配列32の長さ15塩基以上であることによって、高い選択性で標的配列12とハイブリダイズが可能である。また、識別用配列32が60塩基以下であれば、非特異なハイブリダイズが低減するため好ましい。
第1のプライマー30は、増幅産物であるキメラDNA60を検出用プローブ104の検出用配列106とハイブリダイズ可能にするためのタグ配列66をキメラDNA60に付与するためのタグ付加用配列36を備えることができる。キメラDNA60におけるタグ配列66は、標的核酸10を検出するものであるため、標的核酸10毎に検出用プローブ104の検出用配列106にハイブリダイズ可能に設定される。したがって、一つの標的核酸10に対応する一つのキメラDNA60は一つの検出用プローブ104に対応付けられることになる。また、タグ配列66は、検出用プローブ104の固有の検出用配列106と完全に相補的であることが好ましい。したがって、タグ付加用配列36は、検出用プローブ104における検出のための固有の検出用配列106と同一の塩基配列であることが好ましい。
図1に示すように、第2のプライマー40は、標識42と、標的核酸10の標的配列12に隣接する塩基配列と同一の部分配列44とを有することができる。標識42をその5’側に備えることができる。
標識42は、PCR増幅産物であるキメラDNA60を検出するためのものである。標識42としては従来公知のものを適宜選択して用いることができる。それ自体励起されると蛍光シグナルを発する蛍光物質などの各種色素であってもよいし、さらに酵素反応や抗原抗体反応により第2成分と組み合わせて各種シグナルを発する物質であってもよい。典型的には、Cy3、Alexa555、Cy5、Alexa647等の蛍光標識物質を用いることができる。また、ビオチンとストレプトアビイジンHPRとを組み合わせて基質による処理等による発色による検出を用いてもよい。
部分配列44は、標的核酸10の標的配列12に隣接する部分配列14と同一の塩基配列をからなる。ここで、標的配列12に隣接する部分配列14は、標的配列12に対して一個の塩基(ヌクレオチド)を置かずにすぐ5‘側にあることを意味するものでなく、適当な個数の塩基(ヌクレオチド)を置いて存在するものであってもよい。第2のプライマー40における部分配列44は、第2のプライマー40を標的核酸10の相補鎖20にアニーリングさせるための配列である。
ハイブリダイズ工程は、キメラDNA60中のタグ配列66に相補的な検出用配列106を有する検出用プローブ104を担体102に固定化した固相体100上でこれらの検出用プローブ104とキメラDNA60とをハイブリダイズ可能に接触させる工程である。図1及び図2(c)に示すように、この工程によれば、キメラDNA60が検出用プローブ104中の検出用配列106と一定条件下において特異的にハイブリダイズ部可能な程度に相補的であるとき、これらはハイブリダイズし担体102上の所定の検出用プローブ104において二重鎖を形成する。ハイブリダイズ工程後において、適宜洗浄工程をさらに含んでいてもよい。
シグナル強度情報取得工程は、ハイブリダイズ後の担体102上の標識42に基づく標的核酸10についてのシグナル強度情報を取得する工程である。本件シグナル強度情報取得工程によれば、キメラDNA60が検出用プローブ104とハイブリダイズすることで、標識42に基づきシグナル強度情報を得ることができる。
検出工程は、検出用プローブ104について得られた標識42のシグナル強度情報に基づいて、試料中の標的核酸10の有無や比率等を検出する工程である。本方法によれば、複数の標的核酸10を同時に検出する場合であっても、確実に検出対象たる標的配列を検出することができる。本方法では、ハイブリダイズ工程において検出用プローブ104に対する非特異的な結合が高度に抑制されているため、精度よくかつ高い検出感度で標的核酸10を検出し、その有無や比率等を取得することができる。
本発明のプライマーセットは、既に説明した第1のプライマーと第2のプライマーとを備えている。このプライマーセットは、検出用プローブ104が固定化された固相体と組み合わされて使用されるものであり、既に説明したキメラDNAを取得するのに好適なプライマーセットである。第1のプライマーは、たとえば、同一の遺伝子等に関して個体内に存在する変異や種や属において存在する相違を検出特定の標的核酸に特異的である識別用配列32と予め検出用配列106に関連付けられたタグ付加用配列36とを有し、第2のプライマーは、標識を備えている。プライマーセットは、2種類以上の標的核酸を検出するためのものであってもよい。この場合、各標的核酸に対して特異的な第1のプライマーと2種類以上の標的核酸に共通化された単一の第2のプライマーとを含んでいてもよい。本発明のプライマーセットは、既に説明した検出用プローブが固定化されたアレイなどの担体とキット化されていてもよい。
(1)DNAマイクロアレイの作製
(2)標的核酸とプライマーの調製と増幅
(3)ハイブリダイズ
(4)スキャナーを用いた検出
(5)データ解析
プラスチック板に、3’末端をアミノ基で修飾した合成オリゴDNA(株式会社日本遺伝子研究所製)を溶かした水溶液を検出用プローブとして、日本ガイシ株式会社にてGENESHOT(登録商標である)スポッターを用いてスポットした。表1に示すように、使用した合成オリゴDNA配列は、文献(Analytical Biochemistry 364(2007)78-85)のSupplementary Table1記載のD1_001からD1_100の100種とした(図5参照)。スポットの後、80℃、1時間のベークを行った。なお、これらのプローブは、そのTmが、VisualOMPによって算出される融解温度(0.1Mプローブ濃度、50mMNa+イオン及び1.5mM Mg+イオン)の高い順に配列されている。
検出対象とするサンプル遺伝子は、口腔内の微生物種のうち、Enterococcus faecalis(サンプル1)とPseudorambibacter alactolyticus(サンプル2)の2種を用いた。それぞれのサンプルの長さは、微生物に特徴的な配列の周辺配列である150bp程度とし、これらの塩基配列からなる人工遺伝子を標的核酸とした。この標的核酸を増幅するためのプライマーを以下のとおりに人工的に合成した。第2のプライマー、すなわち正方向プライマー(Fプライマー)は5´−AGGTTAAAACTCAAAGGAATTGACG−3´(配列番号101)とし、5´側をCy3で標識した。第1のプライマー、すなわち逆方向プライマー(Rプライマー)はサンプルの標的配列に応じて作成した。サンプル1の逆方向プライマーは、5´−GCAGATTCATTGGTCAGAGAACATATCTCTAGAGTGGT−3´(配列番号102)とした。サンプル2の逆方向プライマーは、5´−CATCTAAAGCGTTCCCAGTTCCATATCTCTATTGCGCT−3´(配列番号103)とした。
(試薬調製)
dH2O 15.0μl
multiple PCR kit 25.0μl
Fプライマー 3.75μl
Rプライマー 3.75μl
試料 2.5μl
合計 50.0μl
(2)得た増幅サンプルをマイクロアレイ上に固定した検出用プローブとハイブリダイズするために、以下のHybri controlとHybri solutionを調製し、これからハイブリダイズ用の試薬を調製した。なお、Hybri controlに使用したAlexa555標識オリゴDNA配列は、図5に記載のプローブのうち、D1_100の配列に相補な配列の5´末端をAlexa555で標識したAlexa555−rD1_100を用いた。
Alexa555−rD1_100 10μl
TE(pH8.0) 390μl
合計 400μl
20×SSC 2.0ml
10%SDS 0.8ml
100% Formamide 12.0ml
100mM EDTA 0.8ml
milliQ 24.4ml
合計 40.0ml
Hybri control 1.5μl
Hybri solution 9.0μl
小計 10.5μl
標識サンプル 7.5μl
合計 18.0μl
ハイブリダイズ後、以下の組成の洗浄液を満たしたガラス染色バットに、ハイブリダイズ反応終了後のマイクロアレイ基板を浸漬し、5分間上下振とうし、滅菌水を入れたガラス染色バットにガラス基板を移し、1分間上下振とうし、2000rpmで1分間遠心乾燥し、マイクロアレイ基板表面に残った水分を除去した。
(洗浄液の組成)
milliQ 188.0ml
20×SSC 10.0ml
10%SDS 2.0ml
合計 200.0ml
Appleied Precision社ArrayWoRxを使用して適宜、露光時間を調節し、蛍光画像を取得した。さらにGenePix Proを使用し、得られた画像の蛍光シグナルの数値化を行った。
画像の数値化ソフトウエアとしてGenePix Proを使用し、得られた画像の蛍光シグナルの数値化を行った。図6にサンプル1とサンプル2のそれぞれが、検出用プローブと非特異的結合を起こしているか検証を行った結果を示す。
Claims (3)
- 試料中の標的核酸を検出する方法であって、
前記標的核酸は発症診断、疾患診断、予後診断、薬剤若しくは治療選択に関するヒト及び非ヒト動物におけるSNP以外の遺伝子上の指標となる標的配列又は微生物由来の当該微生物に特徴的な標的配列を含む核酸であり、
それぞれ異なる所定の塩基配列を有する検出用プローブを備える固相体を準備する工程と、
前記試料に対してPCRを実施するPCR工程と、
前記標的核酸に予め関連付けられた前記検出用プローブに相補的なタグ配列と標識とを有するキメラDNAを取得する工程と、
前記キメラDNAと前記検出用プローブとを前記タグ配列によりハイブリダイズ可能に接触させる工程と、
前記固相体上の前記標識に基づくシグナル強度情報を取得する工程と、
前記シグナル強度情報に基づいて前記標的核酸を検出する工程と、
を備え、
前記PCR工程は、前記標的核酸中の標的配列と相補的な識別用配列と前記タグ配列と相補的なタグ付加用配列とを有する第1のプライマーと、前記標的配列でない部分配列に一致する部分配列と標識とを有する第2のプライマーとを準備し、
前記試料に対して前記第1のプライマーと前記第2のプライマーとを用いてPCRを行い、前記標的配列と前記タグ配列と前記標識とを有する前記キメラDNAを取得することを含み、
前記検出用プローブは、配列番号1〜100で表される塩基配列及びその相補配列から選択される塩基配列を有する、方法。 - 前記PCR工程は、2以上の前記標的核酸につき、2以上の前記第1のプライマーと共有する前記第2のプライマーとを用いて、同時にPCRを実施する工程である、請求項1に記載の方法。
- 前記PCR工程は、2以上の前記標的核酸につき、2以上の前記第1のプライマーと2以上の前記第2のプライマーとを用いて、同時にPCRを実施する工程である、請求項1に記載の方法。
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