JP5165936B2 - 標的核酸中の変異の検出方法及びアレイ - Google Patents
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Nucleotide Polymorphisms)を含む遺伝子上の変異を検出する技術に関する。
Analytical Biochemistry364(2007)78-85
前記他の特定部分配列に隣接する他の部分配列に相補的な他の第2のクエリ配列と、前記第1のプローブが保持する前記他の識別情報に基づいて前記固相担体上で前記一つの変異構成要素を検出するためのキャプチャープローブ又は標識物質に関する他の検出情報を含む他の検出情報用タグ配列と、をそれぞれ有する1種類又は2種類以上の他の第2のプローブと、
を準備し、
これらの他のプローブと前記標的核酸とをハイブリダイズ可能に接触させる第1の接触工程と、前記標的核酸にハイブリダイズした前記第1のプローブと前記第2のプローブとを連結して他の連結分子を取得する連結工程と、前記他の連結分子が備える前記他の識別情報用タグ配列又は前記他の検出情報用タグ配列を用いて前記他の連結分子を所定の標識物質で標識して他の標識済み連結分子を取得する標識工程と、前記他の識別情報及び前記他の検出情報に基づいて前記固相担体上で前記他のキャプチャープローブと前記他の標識済み連結分子とをハイブリダイズ可能に接触させる第2の接触工程と、ハイブリダイズ後の前記固相担体上において検出される前記他の識別情報及び前記他の検出情報に基づく前記標識物質の他のシグナル強度情報を取得するシグナル強度情報取得工程と、前記他のシグナル強度情報に基づいて前記標的核酸中の前記他の変異を検出する工程と、を備え、前記他の第1のプローブ及び/又は前記他の第2のプローブは、前記変異を構成する変異構成要素との組み合わせに基づいて、前記他の第1のプローブにおける他の特定部分配列に相補的な他の第1のクエリ配列及び/又は前記他の第2のプローブにおける他の前記部分配列に相補的な他の第2のクエリ配を有していてもよい。
前記標的核酸中の前記特定部分配列に隣接する部分配列に相補的な第2にクエリ配列と、前記第1のプローブが保持する前記識別情報に基づいて前記固相担体上で前記一つの変異構成要素を検出するためのキャプチャープローブ又は標識物質に関する検出情報を含む検出情報用タグ配列と、
をそれぞれ有する1種類又は2種類以上の第2のプローブと、
を備え、
前記第1のプローブ及び/又は前記第2のプローブは、前記変異の変異構成要素と前記変異部位に近接又は隣り合って存在する未検出の他の変異を構成する変異構成要素との組み合わせに基づいて、前記第1のプローブにおける特定部分配列に相補的な第1のクエリ配列及び/又は前記第2のプローブにおける前記部分配列に相補的な第2のクエリ配を有する、プローブセットが提供される。
本発明の検出方法は、第1のプローブと、第2のプローブと、標的核酸とを接触させる第1の接触工程と、第1のクエリプローブと第2のクエリプローブとの連結工程と、標識工程と、標識済み連結分子とキャプチャープローブとを接触させる第2の接触工程と、シグナル強度情報取得工程と、検出工程と、を備えている。本発明の検出方法は、1種又2種以上の標的核酸を適用対象とし、これらの標的核酸中の多型又は変異に関する特定部分配列を検出対象とする。以下、一種の標的核酸についての一連の工程を説明するが、以下の工程は、複数又は多数の標的核酸を同時に検出する場合にも適用される。また、以下の工程は、一つの標的核酸の複数の変異を検出する場合において、個々の変異に適用される。
第1の接触工程は、第1のプローブと第2のクエリプローブと標的核酸とをハイブリダイズ可能に接触させる工程である。まず、本工程で用いる第1のプローブと第2のプローブについて説明する。第1のプローブは、図1及び図2に示すように、第1のクエリ配列と識別情報用タグ配列とを備えることができる。
第1のプローブは、2種類以上準備される。第1のプローブは、第1のクエリ配列をその3’側に有しており、識別情報用タグ配列をその5’側に有することができる。
第1のプローブは、検出しようとする変異構成要素の種類の数に応じて準備される。第1のプローブは、存在する可能性のある変異構成要素の種類に応じた第1のクエリ配列を備えることができる。第1のクエリ配列は、標的核酸中の検出対象たる変異を構成する変異構成要素のそれぞれに関連付けられ、これらの変異構成要素(塩基)の一つを含んだ特定部分配列に相補的なクエリ配列であって前記変異構成要素に相補的な塩基を3’末端に有することができる。
第1のクエリプローブは、検出しようとする変異の変異構成要素を識別するための標識物質又はキャプチャープローブに関する識別情報用タグ配列を有している。識別情報用タグ配列は、検出対象変異を構成する1つの変異構成要素に一つずつ設定される。
Protocols in Molecular Biologyに準拠した方法(秀潤社刊バイオ実験イラストレイテッド3本当に増えるPCRp25に記載)等により算出したものを採用できるが、本発明における融解温度の範囲および塩基配列濃度の影響を加味できるNearest−Neighbor法によって算出されることが好ましい。Nearest−Neighbor法による融解温度は、例えば、Visual OMP(トミーデジタルバイオロジー株式会社製)とのソフトウエアや日本遺伝子研究所(http://www.ngrl.co.jp/)が提供するソフトウエア(Oligo
Calculator;http://www.ngrl.co.jp/tool/ngrl_tool.html)により容易に取得できる。なお、配列番号:1〜配列番号:100は、Visual
OMPによって算出される融解温度(0.1Mプローブ濃度、50mM Na+イオン及び1.5mM
Mg+イオン)の高い順に配列されている。
and A.Suyama,“Solution to 3−SAT by breadth first search”,DIMACS Vol.54 9−20(2000)および特願2003−108126に詳細が記載されている。これらの文献に記載の方法を使用して正規直交化配列を設計することができる。
第2のプローブは、第2のクエリ配列と、検出情報用タグ配列と、をそれぞれ備えることができる。第2のプローブは、その第2のクエリ配列をその5’側に備えることがきる。また、検出情報用タグ配列をその3’側に備えることができる。
第2のクエリ配列は、標的核酸中の特定部分配列に隣接する部分配列に相補的な配列である。第2のクエリ配列は、第1のクエリプローブが有する第1のクエリ配列に対応する特定部分配列に隣接する部分配列と高い選択性でハイブリダイズ可能な程度に相補的な配列とすることができる。好ましくは完全に相補的とすることができる。第2のクエリ配列は、後述する連結工程において、第1のクエリ配列とリガーゼ反応により連結される。このため、クエリ配列の5’末端側はリガーゼ反応可能にリン酸エスエル化されていることが好ましい。
第2のクエリプローブは、第1のプローブが保持する識別情報に基づいて固相担体上で一つの変異構成要素を検出するためのキャプチャー又は標識物質に関する配列情報を含む検出情報用タグ配列を備えることができる。検出情報用タグ配列の形態は、第1のプローブが保持する識別情報に基づいて決定することができる。
連結工程は、標的核酸にハイブリダイズした第1のプローブと第2のプローブとを連結して連結分子を取得する工程である。第1の接触工程において説明したように標的核酸中に検出しようとする所定の変異構成要素を含む特定部分配列が存在するとき、その特定部分配列に対応する第1のクエリ配列を有する第1のプローブと第2のプローブとが標的核酸にハイブリダイズする。図1及び図2に示すように、この状態で第1のプローブの5’末端と第2のプローブの3’末端とを連結する。
aquaticus)のTaqDNAリガーゼが含まれるが、これに限定されず、標的核酸やプローブの種類に応じて任意のDNAリガーゼ又はRNAリガーゼを使用し得る。
標記工程は、連結分子が備える識別情報又は検出情報としての標識物質関連配列情報を利用して連結分子を単一の又は2種類以上の標識物質で標識して標識済み連結分子を取得する工程である。
第2の接触工程は、標識済み連結分子中の識別情報又は検出情報としてのキャプチャープローブ関連配列情報(−)に相補的なキャプチャー配列を有する2種類以上のキャプチャープローブを固定化した固相担体上でこれらのキャプチャープローブと標識済み連結分子とをハイブリダイズ可能に接触させる工程である。この工程によれば、標識済み連結分子中のキャプチャープローブ関連配列(−)がキャプチャープローブ中のキャプチャー配列と一定条件下において選択的にハイブリダイズ部可能な程度に相補的であるとき、これらはハイブリダイズし固相担体上の所定のキャプチャープローブにおいて二重鎖を形成する。第1の接触工程後において、適宜洗浄工程をさらに含んでいてもよい。
第2の接触工程では、2種類以上のキャプチャープローブを固定化した固相担体を用いることができる。こうした固相担体は、例えばビーズであってもよいし平板であってもよく、材質は特に限定されないが、ガラス製又はプラスチック製の固相担体を用いることができる。好ましくは、固相担体は平板状であり、2種類以上のキャプチャープローブが一定の配列で固定されたアレイである。アレイは、多数個のキャプチャープローブを固定でき、同時に網羅的に各種の多型や変異を検出するのに都合がよい。また、アレイは、一つの固相担体上に複数個の区画された個別のアレイ領域を備えていてもよい。これらの個別のアレイ領域は、それぞれ同一のセットのキャプチャープローブが固定化されていてもよいし、それぞれ別のセットのキャプチャープローブが固定化されていてもよい。
シグナル強度情報取得工程は、ハイブリダイズ後の固相担体上の標識物質に基づく標的核酸についてのシグナル強度情報を取得する工程である。本件シグナル強度情報取得工程によれば、標識済み連結分子の識別情報又は検出情報としてのキャプチャープローブ配列情報(−)がキャプチャープローブとハイブリダイズすることで当該キャプチャープローブに関連付けされた状態で所定の標識物質に基づきシグナル強度情報を得ることができる。
検出工程は、識別情報及び検出情報に基づいて所定の標識物質及び所定のキャプチャープローブに関連付けられた変異構成要素についてのシグナル強度情報に基づいて、変異構成要素の有無や比率等を検出する工程である。すなわち、変異の有無、多型のタイプ及び変異率を検出することができる。本発明方法によれば、検出対象変異の変異構成要素に近接して他の変異があっても、確実に検出対象変異を検出することができる。他の変異に基づくバリエーションを採用しつつも検出対象の変異構成要素固有の識別情報及び検出情報を維持することで、こうした確実な検出が可能となっている。
本発明の検出方法は、近接する他の変異に関わらず検出対象たる変異を検出できることから、標的核酸中の近接する1種類又は2種類以上の他の変異を検出するのに適している。変異が近接するというとき、既に説明したように、検出対象変異と他の変異(1塩基)との間の塩基数が30塩基以下であることが好ましい。
本発明のプローブセットは、固相担体上に固定化されたキャプチャープローブを用いて標的核酸中の少なくとも一つの変異を検出するのに用いるプローブセットである。本発明のプローブセットは、既に説明した2種類以上の第1のプローブと1種又は2種類以上の第2のプローブとを含んでいる。こうしたプローブを用いることで、検出対象変異に近接して未検出の他の変異(変異自体は既知)があるときであっても、これらの他の変異に関わらず検出対象変異を確実に検出することができる。このプローブセットは、標的核酸中の近接する他の変異を検出対象変異とする第1のプローブ及び第2のプローブを含めることもできる。こうしたプローブセットは、一つの標的核酸中の2種類以上の近接する変異を検出する(好ましくは同時に)のに用いることができる。2種類以上の変異を対象とするとき、異なる変異を対象とするプローブセットは、標的核酸の同一の鎖を異なる鎖をターゲットとしていてもよい。
(1)変異遺伝子検出用DNAマイクロアレイの作製
(2)サンプル遺伝子の増幅
(3)ハイブリダイズ及び連結(エンコード反応)
(4)ラベル化反応
(5)DNAマイクロアレイを用いた検出
(6)データ解析
東洋鋼鈑社製gene
slideガラス基板に、5’末端をアミノ基で修飾した合成オリゴDNA(株式会社日本遺伝子研究所製)を溶かした水溶液をキャプチャープローブとして、日本ガイシ株式会社にてGENESHOT(登録商標である)スポッターを用いてスポットした。表1に示すように、使用した合成オリゴDNA配列は、文献(Analytical Biochemistry 364(2007)78-85)のSupplementary
Table1記載のD1_1からD1_100のうちTmが高い順に、D1_52, D1_71, D1_93, D1_74, D1_41,の5種とした。スポットの後、80℃、1時間のベークを行った。なお、これらのTmは、Visual
OMPによって算出される融解温度(0.1Mプローブ濃度、50mM Na+イオン及び1.5mM
Mg+イオン)の高い順に配列されている。
検出対象とする遺伝子変異を含む塩基配列は、以下の表2に示す変異の周辺配列である150bp程度とし、これらの塩基配列からなる人工遺伝子を標的核酸とした。合計4組の標的核酸を合成した。
Bio社のTaKaRa Ex Taq(カタログ#RR001B)を使用した。サーマルサイクラーとして、Applied Biosystems社のGeneAmp PCR
System9700を使用した。なお、用いたPCRプライマーについてはTm=58.90±0.75℃の範囲となるよう設計を行った。各プライマー配列を表3に示す。なお、Tmは、日本遺伝子研究所(http://www.ngrl.co.jp/)が提供するソフトウエア(Oligo
Calculator;http://www.ngrl.co.jp/tool/ngrl_tool.html)を利用して以下の式に基づいて算出した。
Tm=((ΔH*1000/(ΔS+41.3))−273.15−21.5971)(ただし、塩濃度:0.05M、プライマー濃度:250pmolであり、ΔSはハイブリッドにおける所定の最近接エントロピー変化の合計(cal/mol・K)を表し、ΔHはハイブリッドにおける所定の最近接エントロピー変化の合計(kcal/mol)を表す。)
(試薬調製)
プライマーミックス:F,R混合(20 μM, each) 0.5μl
Ex Taq バッファ (10×) 1.0μl
Ex Taq ポリメラーゼ(5 Unit/μl) 0.1μl
dNTP mix (2.5 nM) 0.8μl
dH2O 7.1μl
小計 9.5μl
サンプルDNA(10ng/μl) 0.5μl
合計 10.0μl
実施例2で得たPCR産物についてのエンコード反応を以下のようにして行った。エンコード反応にはNew England Biolabs社のTaq DNA Ligase(Catalog
# M0208S)を使用した。加熱にはサーマルサイクラーとして、Applied Biosystems社のGeneAmp PCR System 9700を使用した。なお、サンプルDNAの5’側に相補的なクエリ配列(検出塩基を含む)と識別情報用タグ配列とを備える5’クエリプローブ(本発明方法における第1のプローブ)の配列を表4に示す。5’クエリプローブは、その5’側に標識物質を付加するための識別情報用タグ配列を備えており、その3’側にクエリ配列を備えている。また、サンプルDNAの3’側に相補的なクエリ配列(検出塩基を含まない)と検出情報用タグ配列とを備える3’クエリプローブ(本発明方法における第2のプローブ)の配列を表5に示す。3’クエリプローブは、その5'側に5’クエリプローブのクエリ配列に隣接するクエリ配列を有し、3’側に表1に示すキャプチャープローブ配列と相同である検出情報用タグ配列を有している。なお、3’クエリプローブの5’末端はリン酸化されている。
(試薬調製)
5’クエリプローブ2種/3’クエリプローブMix(2.5μM,each)
0.300μl
Taq DNA リガーゼバッファ (10×) 1.500μl
dH2O 1.075μl
Taq DNA リガーゼ(40 Units/μl) 0.125μl
小計 3.000μl
PCR産物(変異遺伝子割合ごとに調製) 12.000μl
合計 15.000μl
実施例3で得たライゲーション産物のラベル化反応を以下のとおり行った。ラベル化反応には、TaKaRa
Bio社のTaKaRa Ex Taq(Catalog# RR001B)を使用した。サーマルサイクラーとして、Applied Biosystems社のGeneAmp
PCR System 9700を使用した。ラベル化にはアシメトリーPCRを用い、表1に示す配列と同一配列の各種D1プライマーと、識別情報用タグ配列に相補的であり、5’側がAlexa555又はAlexa647で標識されたプライマーとを用いた(表6)。
D1_プライマーMix (50 μM, each) 0.12μl
Alexa555-ED-1(200M) 0.24μl
Alexa647-ED-2(200M) 0.24μl
Ex Taqバッファ (10×) 1.20μl
dNTP ix (2.5 nM) 0.96μl
Ex aq リメラーゼ(5 Unit/μl) 0.12μl
ミリQ水 8.12μl
小計 11.00μl
ライゲーション産物 1.00μl
合計 12.00μl
ラベル化済み産物を用いたDNAマイクロアレイへの反応及びその検出手順は以下の通りとした。
まず、ハイブリダイズ補正用液及びハイブリダイズ用液を以下の組成で調製した。
ハイブリダイズ補正用液 1.5μl
ハイブリダイズ用液 9.0μl
小計 10.5μl
ラベル化済み産物 7.5μl
合計 18.0μl
Alexa555-rD1_41(100nM) 10μl
Alexa647-rD1_71(100nM) 10μl
TE(pH8.0) 380μl
400μl
20×SSC 2.0ml
10%SDS 0.8ml
100% Formamide 12.0ml
100
mM EDTA 0.8ml
ミリQ水 24.4ml
合計 40.0ml
次いで、調製した標識サンプル溶液を、Applied Biosystems社のGeneAmp PCR System 9700を使用し、90℃で1分加熱した後、ヒートブロック(TAITEC社DTU-N)を使用し80℃で1分加熱した。上記サンプル溶液を各9μlずつ、DNAマイクロアレイのスポットエリアにかけ、乾燥防止のためコンフォート/プラス用サーモブロックスライド(エッペンドルフ社製)を使用し、37℃で60分間静置することによりハイブリダイズ反応を行った。
ハイブリダイズ後、以下の組成の洗浄液を満たしたガラス染色バットに、ハイブリダイズ反応終了後のガラス基板を浸漬し、5分間上下振とうし、滅菌水を入れたガラス染色バットにガラス基板を移し、1分間上下振とうし、2000rpmで1分間遠心乾燥し、ガラス基板表面に残った水分を除去した。
(洗浄液の組成)
ミリ Q水 188.0ml
20×SSC 10.0ml
10%SDS 2.0ml
合計 200.0ml
Appleied Precision社ArrayWoRxを使用して適宜、露光時間を調節し、蛍光画像を取得した。さらにGenePix Proを使用し、得られた画像の蛍光シグナルの数値化を行った。
各SNPについて数値化した結果のうちSNP3の結果を表7にSNP4の結果を表8に示す。また、表7及び表8の結果に基づいて横軸をAlexa555のシグナル強度とし、縦軸にAlexa647のシグナル強度をプロットした。これらの結果を、図5及び図6に示す。
Claims (7)
- 固相担体上に固定化されたキャプチャープローブを用いて標的核酸中の少なくとも一つの変異を検出する方法であって、
前記変異を構成する変異構成要素のそれぞれに関連付けられており、前記変異構成要素をそれぞれ含んだ特定部分配列に相補的な塩基配列を3’末端に有する第1のクエリ配列と、前記変異構成要素を識別するための標識物質又はキャプチャープローブに関する識別情報を含む識別情報用タグ配列とを有する2種類以上の第1のプローブと、前記特定部分配列に隣接する部分配列に相補的な塩基配列を5’末端に有する第2のクエリ配列と、前記第1のプローブが保持する前記識別情報に基づいて前記固相担体上で前記一つの変異構成要素を検出するためのキャプチャープローブ又は標識物質に関する検出情報を含む検出情報用タグ配列とを有する1種類又は2種類以上の第2のプローブとを準備し、これらのプローブと前記標的核酸とをハイブリダイズ可能に接触させる第1の接触工程と、
前記標的核酸にハイブリダイズした前記第1のプローブと前記第2のプローブとを連結して連結分子を取得する連結工程と、
前記連結分子が備える前記識別情報用タグ配列又は検出情報用タグ配列を用いて前記連結分子を所定の標識物質で標識して標識済み連結分子を取得する標識工程と、
前記識別情報及び前記検出情報に基づいて、前記固相担体上で前記キャプチャープローブと前記標識済み連結分子とをハイブリダイズ可能に接触させる第2の接触工程と、
ハイブリダイズ後の前記固相担体上において検出される前記識別情報及び前記検出情報に基づく前記所定の標識物質のシグナル強度情報を取得するシグナル強度情報取得工程と、
前記シグナル強度情報に基づいて前記標的核酸中の前記変異を検出する工程と、
を備え、
前記第1のプローブが、さらに前記変異に近接又は隣接して存在する可能性のある他の変異を構成する他の変異構成要素のそれぞれにも関連付けられており、前記変異構成要素と前記他の変異構成要素を組み合わせた前記特定部分配列に相補的である前記第1のクエリ配列の種類に応じて準備される、及び/又は、
前記第2のプローブが、前記変異に近接又は隣接して存在する可能性のある他の変異を構成する他の変異構成要素のそれぞれに関連付けられており、前記他の変異構成要素を組み合わせた前記部分配列に相補的である前記第2のクエリ配列の種類に応じて準備され、
前記識別情報は、前記変異構成要素を識別するために前記変異構成要素にそれぞれ関連付けられた所定の標識物質を前記連結分子に付加するための配列情報を含み、
前記検出情報は、前記標識済み連結分子を共通の前記キャプチャープローブのキャプチャー配列にハイブリダイズさせるための配列情報を含む、検出方法。 - 前記識別情報は、前記変異構成要素を識別するために前記変異構成要素に関連付けられた前記キャプチャープローブのキャプチャー配列に前記標識済み分子をハイブリダイズさせるための配列情報を含み、
前記検出情報は、前記連結分子に共通の所定の標識物質を付加するための配列情報を含む、請求項1に記載の方法。 - 前記変異及び前記他の変異のうちの少なくとも一つを含んだ複数の変異を検出対象とし、
前記他の変異を構成する他の変異構成要素のそれぞれに関連付けられており、これらの他の変異構成要素の一つを含んだ他の特定部分配列に相補的なクエリ配列であって前記他の変異構成要素に相補的な塩基配列を3’末端に有する他の第1のクエリ配列と、前記他の変異の一つの前記他の変異構成要素を識別するための標識物質又はキャプチャープローブに関する他の識別情報を含む他の識別情報用タグ配列と、をそれぞれ有する2種類以上の他の第1のプローブと、
前記他の特定部分配列に隣接する他の部分配列に相補的な塩基配列を5’末端に有する他の第2のクエリ配列と、前記他の第1のプローブが保持する前記他の識別情報に基づいて前記固相担体上で一つの前記他の変異構成要素を検出するためのキャプチャープローブ又は標識物質に関する他の検出情報を含む他の検出情報用タグ配列と、をそれぞれ有する1種類又は2種類以上の他の第2のプローブと、を準備し、
これらの他のプローブと前記標的核酸とをハイブリダイズ可能に接触させる第1の接触工程と、
前記標的核酸にハイブリダイズした前記他の第1のプローブと前記他の第2のプローブとを連結して他の連結分子を取得する連結工程と、
前記他の連結分子が備える前記他の識別情報用タグ配列又は前記他の検出情報用タグ配列を用いて前記他の連結分子を所定の標識物質で標識して他の標識済み連結分子を取得する標識工程と、
前記他の識別情報及び前記他の検出情報に基づいて前記固相担体上で前記他のキャプチャープローブと前記他の標識済み連結分子とをハイブリダイズ可能に接触させる第2の接触工程と、
ハイブリダイズ後の前記固相担体上において検出される前記他の識別情報及び前記他の検出情報に基づく前記標識物質の他のシグナル強度情報を取得するシグナル強度情報取得工程と、
前記他のシグナル強度情報に基づいて前記標的核酸中の前記他の変異を検出する工程と、
を備える、
前記他の第1のプローブが、さらに前記変異の変異構成要素のそれぞれにも関連付けられており、前記変異構成要素と前記他の変異構成要素を組み合わせた前記他の特定部分配列に相補的である前記他の第1のクエリ配列の種類に応じて準備される、及び/又は、
前記他の第2のプローブが、前記変異を構成する変異構成要素のそれぞれに関連付けられており、前記異構成要素を組み合わせた前記他の部分配列に相補的である前記他の第2のクエリ配列の種類に応じて準備され、
前記他の識別情報は、前記他の変異構成要素を識別するために前記他の変異構成要素にそれぞれ関連付けられた所定のほかの標識物質を前記他の連結分子に付加するための他の配列情報を含み、
前記他の検出情報は、前記他の標識済み連結分子を共通の前記他のキャプチャープローブのキャプチャー配列にハイブリダイズさせるための他の配列情報を含む、請求項1又は2に記載の方法。 - 前記第1のプローブ、前記第2のプローブ、前記他の第1のプローブ及び前記他の第2のプローブにつき、前記第1の接触工程、前記連結工程、前記標識工程、前記第2の接触工程、前記シグナル強度情報取得工程及び検出工程を前記固相担体上において同時に実施する、請求項3に記載の方法。
- 前記固相担体は、前記標的核酸について用いる複数の前記キャプチャープローブがその融解温度に基づく順序で配列された配列状態を備えるアレイである、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- 前記変異と前記他の変異との間の塩基数は30塩基以下である、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- 固相担体上に固定化されたキャプチャープローブを用いて標的核酸中の少なくとも一つの変異を検出するのに用いるプローブセットであって、
前記変異を構成する変異構成要素のそれぞれに関連付けられており、これらの変異構成要素の一つを含んだ特定部分配列に相補的なクエリ配列であって前記変異構成要素に相補的な塩基配列を3’末端に有する第1のクエリ配列と、前記変異の前記一つの変異構成要素の識別するための標識物質又はキャプチャープローブに関する識別情報を含む識別情報用タグ配列と、をそれぞれ有する2種類以上の第1のプローブと、
前記標的核酸中の前記特定部分配列に隣接する部分配列に相補的な塩基配列を5’末端に有する第2にクエリ配列と、前記第1のプローブが保持する前記識別情報に基づいて前記固相担体上で前記一つの変異構成要素を検出するためのキャプチャープローブ又は標識物質に関する検出情報を含む検出情報用タグ配列と、
をそれぞれ有する1種類又は2種類以上の第2のプローブと、
を備え、
前記第1のプローブが、さらに前記変異に近接又は隣接して存在する可能性のある他の変異を構成する他の変異構成要素のそれぞれにも関連付けられており、前記変異構成要素と前記他の変異構成要素を組み合わせた前記特定部分配列に相補的である前記第1のクエリ配列の種類に応じて準備される、及び/又は、
前記第2のプローブが、前記変異に近接又は隣接して存在する可能性のある他の変異を構成する他の変異構成要素のそれぞれに関連付けられており、前記他の変異構成要素を組み合わせた前記部分配列に相補的である前記第2のクエリ配列の種類に応じて準備され、
前記識別情報は、前記変異構成要素を識別するために前記変異構成要素にそれぞれ関連付けられた所定の標識物質を前記連結分子に付加するための配列情報を含み、
前記検出情報は、前記標識済み連結分子を共通の前記キャプチャープローブのキャプチャー配列にハイブリダイズさせるための配列情報を含む、プローブセット。
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