KR20020008195A - 폴리뉴클레오티드 서열 변형의 미세배열-기초 분석 - Google Patents

폴리뉴클레오티드 서열 변형의 미세배열-기초 분석 Download PDF

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KR20020008195A
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머르젠 리미티드
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Abstract

미세배열에 고정된 프라이머를 사용하는 고체상 폴리머라제-매개 증폭 접근법은 표적 폴리뉴클레오티드에서 서열 변형 검출을 위해 제공된다. 여기에 제공된 방법 및 조성물은 연구 및 임상 이용, 특히 관심있는 생물학적 샘플의 유전 정보의 대규모 분석에 유용하다.

Description

폴리뉴클레오티드 서열 변형의 미세배열-기초 분석{MICROARRAY-BASED ANALYSIS OF POLYNUCLEOTIDE SEQUENCE VARIATIONS}
휴먼 게놈 프로젝트가 사람 게놈의 기준 서열의 완성에 접근함으로서, 각 개인 군 뿐만 아니라 서로 다른 사람 개체군간에 밝혀진 DNA 서열 변형에 많은 관심이 기울여지고 있다. 이러한 변형을 확인하는 것은 질병에 대한 소인 및 내성에 대한 유전적 근거의 더이상의 탐구에 관한 중요한 부분이다. 이러한 서열 변형은 복잡한 유전 패턴 및 강력한 환경적 상호작용을 가지는 질병 및 특성 연구에서 유전적 마커로 작용할 것이다.
통상적으로, 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)과 같은 개체군-기초 유전적 변형에 대한 대규모 서열 분석은 혼성화-기초 올리고뉴클레오티드 배열(DNA 칩)상에서 행한다. 예를 들어, U.S. 특허 5,837,832(Chee et al.)은 각 프로브 셋트는 단일 뉴클레오티드에서 서로 다른 4 셋트의 프로브 배열을 함유하는 DNA 칩을 개시한다. 관심의 표적 폴리뉴클레오티드는 DNA 칩에 혼성화되고 특정 서열 변형은 표적폴리뉴클레오티드의 선호도 및 개별의 프로브에서의 혼성화 정도에 기초하여 검출된다. 유사한 기법이 다양한 HIV DNA 서열 분석을 위한 U.S. 특허 5,861,242 (Chee et al.)에 사용되었다.
통상의 혼성화-기초 서열 변형 분석법과 관련된 몇몇의 문제점이 상기 출원의 한계이다. Hacia(1999) Nature Genetics supp.21:42-47 에 의한 개관 참조. 예를 들어, 혼성화 분석법의 정확성이 좋지 않아서, 이형접합 돌연변이 스크린에 그것의 사용을 방해한다. 어떤 2 서열에 적용된 같은 실험적 접근법은 매우 다른 정확성을 가진 결과를 산출할 수 있다. 혼성화-기초 돌연변이 분석법의 부정확한 부정적 에러율이 개선될 필요가 있다. 혼성화-기초 방법학은 1 뉴클레오티드의 혼성화 차이에 기초하기 때문에, 혼성화-기초 서열 분석법의 특이성은 표적 폴리뉴클레오티드에서의 변형뿐만 아니라 혼성화 조건에 의해 크게 영향을 받을 수 있다. 혼성화-기초 돌연변이 검출은 표적 폴리뉴클레오티드가 샘플내에 미량인 경우에 특히 강력한 수단이 아니다.
유전물질의 소량 검출은 생물학적 연구 및 임상 진단에서 큰 도전을 나타낸다. 폴리머라제 사슬 반응(PCR)은 고감도 및 고특이성으로 게놈 DNA, 단일 가닥 cDNA 또는 mRNA 와 같은 특정 폴리뉴클레오티드 서열의 체외 증폭을 위한 강력한 수단을 제공한다. 한 출원은 샘플내에 존재하는 원인성, 병원성, 변질 또는 지표 유기물의 동정을 허용하도록 예를 들어, 환경, 식품 및 의학원등에서 기원한 생물학적 샘플에서 표적 유전자 서열을 증폭하는 것이다.
그러므로, 고정확성 및 개선된 감도로 서열 변형을 분석하는 방법을 개발할필요성이 있다.
(발명의 개요)
본 발명은 종래의 혼성화-기초 접근법과 비교하여, 더 높은 감도, 더 나은 정확성 및 덜 시간-소모적인 서열 변형 분석에 관한 신규한 방법을 제공한다.
한 양태에서, 본 발명은 단일 또는 다중 염기 치환, 결실 또는 삽입, 및 다른 더욱 복잡한 변형을 포함하는 표적 폴리뉴클레오티드 및 기준 서열간의 서열 변형을 검출하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 고체상 지지체에 고정된 다수의군의 올리고뉴클레오티드 프라이머 배열을 이용하고, 각 군의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 기준 서열의 특정 영역을 포함하도록 선택되고, 배열의 개별 영역을 차지하고, 적어도 4 셋트의 프라이머를 포함한다:1) 기준 서열에 정확하게 상보적인 제1셋트; 및 2) 각각 제1셋트의 프라이머에 동일하지만, 각 3셋트의 3' 최말단 뉴클레오티드가 상이한 3 개의 추가의 셋트의 프라이머. 본 발명의 배열은 표적 폴리뉴클레오티드가 표적 폴리뉴클레오티드에 정확하게 상보적인 적절한 셋트의 프라이머로부터 확장되는 검출가능한 신생 폴리뉴클레오티드의 합성을 위한 주형으로 작용하는 동안 폴리머라제-매개 증폭 반응에 사용될 수 있다. 고정된 프라이머는 고체상 지지체에서 표적 폴리뉴클레오티드의 특정 영역의 "제자리"혼성화 및 증폭을 가능케한다. 각 프라이머 부위에서 신생 가닥은 증폭동안 가닥에 통합된 표지로 정량적으로 검출될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 실행을 위한 증폭 수단은 PCR 이다. 고체상 지지체에서 미세배열은 약 100,000 개의 군 이하의 프라이머를 포함할 수 있다. 이와 같이, 본 발명의 방법은 표적 폴리뉴클레오티드의 약100,000 이하의 서로 다른 영역을 검출하는 데 유용하다. 대부분의 이용에서, 지지체에 존재할 수 있는 군의 수에 대한 더욱 낮은 제한이 없다는 것은 분명하지만, 더욱 많은 군이 바람직할 것이다.
본 발명의 구체예에 따라서, 고정된 프라이머는 단독으로 표적 폴리뉴클레오티드의 비대칭 PCR 에 사용되어 각각의 적당한 프라이머 부위에서 고체상에 부착되고, 가닥에 통합된 표지로 선택적으로 검출되는 단일의 상보적인 서열을 생성할 것이다. 본 발명의 다른 구체예에 따라서, 각 표적 폴리뉴클레오티드에 대한 다른 프라이머는 용액에 존재하여 표적 폴리뉴클레오티드의 양 가닥이 대칭적으로 합성될 수 있고, 개선된 검출을 위하여 각 프라이머 부위에 보유된다.
본 발명은 기준 서열과 비교될 때, 단일 표적 폴리뉴클레오티드에서의 서열 변형을 검출하는 데 사용될 수 있고, 이 경우에 본 발명의 DNA 배열은 상기에 개시된 대로, 기준 서열에 상응 및/또는 관련된 프라이머의 다중 군을 포함한다. 택일적으로, 본 발명은 하나 또는 많은 기준 서열과 비교될 때, 다중 표적 폴리뉴클레오티드에서 서열 변형을 검출하는 데 사용될 수 있다. 표적 폴리뉴클레오티드는 구조적으로 관련 또는 비관련될 수 있다. 서열 상동성이 없는 다중 표적 폴리뉴클레오티드가 본 발명에 따라서 검출되는 경우에, DNA 미세배열은 특정 표적 폴리뉴클레오티드에 특이적인 특정 기준 서열에 관한 각 영역을 가지는 다른 영역으로 나누어진다. 기준서열의 특정 영역을 포함하도록 선택되고, 각 군을 가지는 다수의 군의 프라이머는 영역내의 고체 지지체에 첨부된다. 단일 표적 폴리뉴클레오티드인 경우에, 각 군은 적어도 4 셋트의 프라이머를 포함한다:1) 기준 서열에 정확하게상보적인 제1의 셋트, 및 2) 각 프라이머의 제1셋트와 동일하지만, 각 3셋트의 3'-최말단 뉴클레오티드가 상이한 3개의 추가의 셋트의 프라이머.
본 발명은 더욱이 본원에 개시된 대로 대칭적 PCR 또는 비대칭적 PCR 접근법을 사용하여 표적 폴리뉴클레오티드에서 서열 변형을 검출하는 키트를 제공한다. 키트는 PCR 프라이머의 미세배열 및 PCR 반응 및 검출에 필요한 시약을 포함한다. 프라이머의 미세배열은 특정 기준 서열에 맞추어진 약 100,000 개의 군 이하의 프라이머를 포함할 수 있다. 본 발명의 구체예에서, 키트는 PCR 반응동안 합성된 가닥에 통합될 수 있는 표지된 뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명은 일반적으로 핵산 생물학 분야에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는, 본 발명은 연구, 진단 및 치료적 이용을 위한 생물학적 샘플에서 폴리뉴클레오티드 서열 변형의 고산출량 증폭, 검출 및 비교를 위한 방법 및 조성물을 제공한다.
도1 은 고정된 프라이머를 사용하여 표적 폴리뉴클레오티드에서 서열 변형을 증폭시키고 검출하는 고체상 증폭 방법을 체계적으로 도시한다.
도2 는 3'말단에서 1 뉴클레오티드가 다른 4 셋트의 프라이머를 사용하여 사람의 G3PDF 유전자 주형의 고체상 증폭 결과를 도시한다.
본 발명은 표적 폴리뉴클레오티드에서 서열 변형의 고산출량 형태, 감도 뿐만 아니라 단일 증폭 및 검출을 위한 신규한 방법 및 조성물을 제공한다. 본 발명은 생물학적 연구 및 의학 진단 및 요법 모두에서 유용성이 있는 게놈 분석의 다양한 양태에 사용될 수 있다.
본 발명은 신규한 PCR 및 폴리뉴클레오티드 배열 기법의 조합에 기초한다. 본 발명의 기본 원칙은 주형 및 신생 가닥의 연장을 방지하는 데 충분한 상보적인프라이머 3' 말단사이의 단일 뉴클레오티드 미스매치이다. 그러므로, 표적 폴리뉴클레오티드는 프라이머가 표적 서열과 완전한 매치를 하는 부위에서만 증폭될 것이다. 프라이머 제조 및 PCR 증폭 과정의 어떤 양태는 공유-출원중인 U.S. 가출원 60/173,618(1999.12.29 출원) 및 U.S. 특허 5,837,832(Chee et al.) 에 개시된 것에 유사하고, 이것의 개시는 본원에 참고문헌으로 수록된다.
A. 정의
"폴리뉴클레오티드"는 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드인 어떤 길이의 뉴클레오티드의 폴리머 형태이다. 이 용어는 단지 분자의 1 차적 구조에 관한 것이다. 그러므로, 용어는 이중 및 단일 가닥 DNA 및 RNA 를 포함한다. 또한 예를 들어, 당업계에 알려진 표지와 같은 공지된 형태의 변형, 하나 이상의 자연 발생 뉴클레오티드를 예를 들어, 비하전 연결(예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등), 예를 들어, 단백질(뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩티드, 폴리-L-리신 등을 포함)과 같은 돌출 부분을 포함하는 것, 삽입제(예를 들어, 아크리딘, 소라렌등), 킬레이터를 포함하는 것(예를 들어, 금속, 방사성 물질 등), 알킬화제를 포함하는 것, 변형된 연결(예를 들어, α 이상 핵산 등)뿐만 아니라 비변형 형태의 폴리뉴클레오티드와 같은 유사체, 뉴클레오티드간 변형으로 치환하는 메틸화, "캡" 을 포함한다.
본원에 사용될 때, 용어 "프라이머"는 폴리뉴클레오티드에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 촉매되는 조건하에 놓여질 때, 상보적인 가닥을 따라서 폴리뉴클레오티드 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 말한다.이러한 조건은 적당한 완충액("완충액"은 공동인자, 또는 pH, 이온강도등에 영향을 주는 치환을 포함한다), 및 적당한 온도에서 DNA 폴리머라제 및/또는 역전사효소와 같은 폴리머화를 위한 4 개의 서로 다른 뉴클레오티드 트리포스페이트 또는 뉴클레오사이드 유사체 및 하나 이상의 약제의 존재를 포함한다. 프라이머는 폴리머라제용 약제의 존재하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍할 만큼 충분히 길어야만 한다. 전형적인 프라이머는 표적 서열에 실질적으로 상보적인 서열 길이인 적어도 5 뉴클레오티드를 포함하지만, 다소 더 긴 프라이머가 바람직하다. 일반적으로 프라이머는 약 15-26 뉴클레오티드를 포함하지만, 35 뉴클레오티드 이하의 더 긴 프라이머가 사용될 수 있다.
프라이머는 항상 증폭되고, 그것이 어닐링 될 수 있는 특정 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함한다. 프라이머는 선택적으로 프로모터 서열을 또한 포함한다. 용어 "프로모터 서열"은 인지된 서열에 결합하고, 전사과정을 개시하여 RNA 전사체를 생산하는 RNA 폴리머라제에 의해서 특이적으로 인지되는 핵산 서열의 단일 가닥을 의미한다. 원칙적으로, 어떤 프로모터 서열은 개시 서열을 인식할 수 있는 공지되고 이용가능한 폴리머라제가 존재하는 경우에 사용될 수 있다. 공지되고 유용한 프로머터는 박테리오파지 T3, T7 또는 SP6 와 같은 어떤 박테리오파지 폴리머라제에 의해 인식된 것이다.
본원에 사용될 때, 용어 "태그", "서열 태그" 또는 "프라이머 태그 서열"은 폴리뉴클레오티드에 태그를 포함하는 비연속 폴리뉴클레오티드를 확인하는 데 사용될 수 있는 특정 핵산 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드를 말한다. 같은 생물학적출처로부터의 폴리뉴클레오티드는 특정 서열과 공유결합으로 태그되어서 연이은 분석에서 폴리뉴클레오티드는 같은 출처에 따라서 확인될 수 있다. 서열 태그는 또한 핵산 증폭 반응에 대한 프라이머로서 기능한다.
"미세배열"은 바람직하게는 개별 영역의 선형 또는 2차원 배열이고, 각각은 고체 지지체의 표면에 형성된 한정된 영역을 가진다. 미세배열상의 개별 영역의 밀도는 단일 고체상 지지체의 표면상, 바람직하게는 적어도 약 50 cm2, 더욱 바람직하게는 적어도 약 100/cm2, 더욱 더 바람직하게는 적어도 약 500/cm2, 더욱 더 바람직하게는 적어도 약 1,000/cm2에서 검출된 표적 폴리뉴클레오티드의 총 수로 결정된다. 본원에 사용될 때, DNA 미세배열은 표적 폴리뉴클레오티드를 증폭하거나 클로닝하기 위해 사용된 칩 또는 다른 표면상에 놓여진 올리고뉴클레오티드 프라이머의 배열이다. 배열내의 각 특정 군의 프라이머의 위치가 알려져 있기 때문에, 표적 폴리뉴클레오티드의 동일성은 미세배열내의 특정 위치에 대한 그들의 결합에 기초하여 결정될 수 있다.
"링커"는 제한 부위를 포함하는 합성 올리고데옥시리보뉴클레오티드이다. 링커는 단편을 벡터 분자로 연이어 클로닝하는 데 사용될 수 있는 제한 부위를 생산하는 DNA 단편의 말단상의 블런트 말단-연결일 수 있다.
용어 "라벨"은 분석 샘플내에서 표적 폴리뉴클레오티드의 존재를 나타내는 검출가능한 신호를 생산할 수 있는 조성물을 말한다. 적당한 표지는 방사성동위원소, 뉴클레오티드 색소포, 효소, 기질, 형광 분자, 화학발광부분, 자석 입자, 생물학적발광 부분등을 포함한다. 이와 같이, 표지는 분광기, 광화학, 생물화학, 면역화학, 전기, 광 또는 화학 수단에 의해 검출될 수 있는 어떤 조성물이다.
용어 "지지체"는 비드, 입자, 계량봉, 섬유, 필터, 막 및 식염수 또는 유리 슬라이드와 같은 실리케이트 지지체와 같은 종래의 지지체를 말한다.
용어 "증폭"은 예를 들어, 추가의 표적 분자, 또는 표적 유사 분자 또는 샘플내에 표적 분자의 존재 관점에서 생산되는 표적 분자에 상보적인 분자를 포함할 수 있는 증폭 산물의 생산을 의미하는 광범위한 의미로 사용된다. 표적이 핵산인 경우에, 증폭 산물은 DNA 또는 RNA 폴리머라제 또는 역전사효소와 함께 효소적으로 생산될 수 있다.
본원에 사용될 때, "생물학적 샘플"은 예를 들어, 혈액, 플라스마, 혈청, 척수액, 림프액, 피부의 외부 절개, 호흡, 장내, 및 요생식기 계통, 눈물, 타액, 우유, 세포(혈액 세포를 제한없이 포함), 종양, 기관, 및 체외 세포 배양물 성분의 샘플을 제한없이 포함하는 개체로부터 분리된 조직 또는 유체 샘플을 말한다.
본원에 사용될 때, 용어 "생물학적 출처"은 표적 폴리뉴클레오티드가 유래된 출처를 말한다. 출처는 세포, 조직 또는 유체를 제한없이 포함하는 상기에 개시된 어떤 형태의 "샘플"일 수 있다. "다른 생물학적 출처"는 같은 개체, 또는 같은 종의 각 개체로부터의 세포/조직/기관, 또는 서로 다른 종으로부터 세포/조직/기관을 말할 수 있다.
B. 기준 서열의 선택
본 발명은 특정 기준 서열을 가지는 표적 폴리뉴클레오티드와의 비교에 사용될 수 있다. 표적 폴리뉴클레오티드는 그 차제로 기준 서열 또는 그것의 변이체를 포함한다. 기준 서열로서 선택된 서열은 조직 또는 유체를 제한없이 포함하는 어떤 생물학적 출처로부터 기원할 수 있다. 기준 서열 및 표적 폴리뉴클레오티드는 상이한 출처의 것일 수 있다. 바람직하게는, 기준 서열 및 표적 폴리뉴클레오티드의 출처는 같은 종의 다른 개체, 또는 같은 종의 다른 개체군으로부터 기원한 것이다.
기준 서열은 특정 생물학적 출처로부터의 관심의 유전자의 적어도 한 부분을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 기준 서열은 유전자의 어떤 기능성과 관련된 것으로 알려진 적어도 하나의 특정 뉴클레오티드 위치 영역을 포함한다. 예를 들어, 위치는 효소를 코딩하는 유전자의 활성 부위일 수 있고, 위치에서 점 돌연변이는 효소 활성의 손실을 야기한다. 위치는 또한 박테리아 게놈에서 약제 내성 부위일 수 있고, 그 부위에서 야생형 유전자의 뉴클레오티드 치환은 어떤 항생제에 대한 박테리아 내성을 유발할 수 있다. 기준 서열은 또한 생물학적 출처의 전체 게놈을 포함할 수 있다. 예를 들어, HIV 균주의 전체 게놈은 다른 HIV 균주의 서열 변이체의 확인을 위한 기준 서열로서 사용될 수 있다.
기준 서열은 각각의 대표적인 특정의 사람 개체군으로부터 기원할 수 있고, 다른 개체군의 SNP 를 확인하기 위해서 사용될 수 있다. 다른 사람 개체군은 다른 성, 나이 또는 인종일 수 있고, 다른 지리적 영역으로부터 기원할 수 있고, 다른 과로부터 기원할 수 있다. 바람직하게는, 기준 서열은 개체군의 확인가능한 성질 또는 표현형을 나타내도록 선택된다. 확인된 서열 변이체 및 이들의 표현형 성질의 연관성에 대한 더이상의 연구는 어떤 질환의 개체군 또는 유전적 근거의 유전적 연결에 대한 통찰력을 제공해야 한다.
기준 서열을 일반적으로 약 5, 10, 20, 50, 100, 500, 1000, 5000 또는 10,000 염기사이의 어떤 길이일 수 있다. 기준 서열은 변형이 본 발명의 목적을 위한 관심의 영역 밖에 있는 한 야생형 유전자와 비교하여 그 자체로 어떤 서열 변형을 포함할 수 있다. 기준 서열은 공중에 접근가능하거나 상업적으로 이용가능한 서열 데이타베이스와 같은 어떤 서열 출처로부터 얻을 수 있다.
C. 올리고뉴클레오티드 프라이머의 배열 설계
1. 선택 프라이머
본 발명은 올리고뉴클레오티드 프라이머의 고정 및 개별 군을 포함하는 제조된 고체 지지체를 제공한다. 각 프라이머 군은 기준 서열내의 특정 영역에 해당하고, 기준 서열의 특정 영역에 정확하게 상보적인 제1셋트를 가지는 적어도 4셋트를 포함하고, 나머지 3셋트는 제1셋트에 동일하지만 3'최말단 뉴클레오티드만 다르다. 예를 들어, 기준서열의 A 뉴클레오티드의 경우에, 제1셋트의 상응하는 프라이머는 그것의 3'최말단에 T 를 가지는 반면에, 추가의 3 프라이머 셋트는 각 셋트의 3'최말단에 각 셋트에서 다른 뉴클레오티드인 A, C, 또는 G 를 가진다. 반드시 필요한 것은 아니지만, 4 개의 프라이머 셋트의 길이는 같은 것이 바람직하다. 프라이머는 예를 들어, Massachusetts Institute of Technology(MIT)로부터의 프라이머3 와 같은 표준 PCR 프라이머 선택 프로그램을 사용하여 선택 또는 설계될 수 있다.
고체상 지지체는 약 100,000 개 이하의 프라이머 군이 미리 결정된 패턴에따라서 개별 영역에 고정될 수 있는 약 5 내지 약 100 ㎛2의 영역을 제공할 수 있다. 준비된 고체 지지체는 지지체상의 어떤 위치에서 프라이머 또는 프라이머쌍 서열의 관련된 수기 또는 전자기록을 가져서 증폭된 표적의 지지체상의 위치 역시 확인될 수 있다.
기준 서열의 특정 영역에 상보적인 각 군내의 프라이머 수는 미세배열상의 연속적으로 설계된 증폭 반응의 필요에 의해서 결정 및 제한될 수 있다. 그러므로, 예를 들어, 미세배열상의 특정 부위에서 PCR 수행에 필요할 것으로 여겨지는 프라이머의 수, 특히 주어진 반응 부피 및, 표적 주형 폴리뉴클레오티드의 기대되는 수, 및 제안된 PCR 순환 횟수는 얼마나 많은 올리고뉴클레오티드 프라이머 카피를 성공적인 반응을 보장하기 위한 지지체상의 각 위치에서 군으로 적용할 것인지를 결정하는 데 도움이 될 것이다. 바람직하게는, 프라이머의 양(즉, 프라이머 분자 수 또는 프라이머 농도)은 허여된 고체 지지체상에 각 제공된 위치에서 같을 것이다(예를 들어, 표적 폴리뉴클레오티드의 약 100,000 이하의 영역을 증폭 또는 검출하기 위한 1000, 10,000, 100,000 이하의 프라이머 군을 가지는 DNA 미세배열 포맷에서).
고체 지지체는 검출될 수 있는 폴리뉴클레오티드상에 기초한 특정 이용의 프라이머 서열로 준비될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 프라이머는 특정 PCR 에 적합한 어떤 길이일 수 있고, 특히 증폭될 수 있는 표적 폴리뉴클레오티드의 서열 및 성질로 고려될 수 있다. 예로서, 프라이머는 길이면에서 약 4 내지 약 30 뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명의 핵산 프라이머는 이러한 변형이 상당한 정도로 얻어진 산출량 또는 산물에 네가티브한 영향을 주지않는 범위내에서 핵산 염기의 미미한 결실, 첨가 및/또는 치환을 포함할 수 있다.
올리고뉴클레오티드 프라이머는 핵산(우라실, 시토신, 티민, 아데닌 및 구아닌)뿐만 아니라 변형된 염기 및 염기 유사체에서 일반적으로 발견된 자연-발생 헤테로사이클 염기를 포함할 수 있다. 표적 서열의 프라이머에 혼성화 할 수 있는 어떤 변형 염기 또는 유사체는 본 발명의 실행에 유용하다.
프라이머의 당 또는 글리코사이드 부분은 데옥시리보스, 리보스, 및/또는 예를 들어, 2'-O-알킬 리보스와 같은 변형된 형태의 당을 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 당 부분은 2'데옥시리보스이지만; 표적 서열에 혼성화하는 프라이머의 능력과 양립가능한 어떤 당 부분이 사용될 수 있다.
한 구체예에서, 프라이머의 뉴클레오사드 단위는 당업자에게 공지된 대로, 포스포디에스테르 골격으로 연결된다. 추가의 구체예에서, 뉴클레오티드간 연결은 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트, 술파메이트(예를 들어, U.S. 특허번호 5,470,967)및 폴리아미드(즉, 펩티드 핵산)을 제한없이 포함하는 프라이머의 특정 혼성화와 양립가능한 당업자에게 공지된 어떤 연결을 포함할 수 있다. 펩티드 핵산은 Nielsen et al.(1991) Science 254:1497-1500, U.S. 특허번호 5,714,331, 및 Nielsen(1999)Curr.Opin.Biotechnol.10:71-75에 개시된다.
어떤 구체예에서, 프라이머는 즉, 한 형태 이상의 염기 또는 당 단위를 포함할 수 있는 키메라 분자일 수 있고/또는 연결은 같은 프라이머내의 하나 이상의 형태일 수 있다.
프라이머는 예를 들어, 삽입제 및/또는 마이너 그루브 결합제와 같은 당업계에 공지된 표적 서열에의 혼성화를 용이하게 할 수 있는 부분을 포함할 수 있다.
염기, 당, 및 뉴클레오사이드 골격의 변형뿐만 아니라 프라이머 상의 어떤 돌출기의 존재는 서열 특이적인 형태로 그것의 표적 서열과 결합하는 프라이머의 존재와 양립가능할 것이다. 공지되고 개발중인 많은 구조적 변형이 이러한 경계내에서 가능하다. 더욱이, 다양한 이종환상 염기, 당, 프라이머를 형성하는 뉴클레오사이드 및 뉴클레오티드를 제조하는 합성 방법, 및 특정의 미리예견된 서열의 올리고뉴클레오티드를 제조하는 합성 방법은 당업계에서 활발하게 개발중이고 알려져있다. 올리고뉴클레오티드 합성의 바람직한 방법은 U.S. 특허번호 5,419,966 의 교시를 통합한다.
올리고뉴클레오티드 프라이머는 특정 PCR 또는 증폭된 표적 폴리뉴클레오티드의 분리와 같은 연이은 조작을 돕고 용이하게 하는 어떤 특별한 추가 부분 또는 서열을 가지고 설계될 수 있다. 예를 들어, 프라이머는 서열 뿐만 아니라 표적 서열에 상보적인 서열을 포함할 수 있다. 이러한 서열은 일반적으로 프라이머의 표적-상보적인 서열의 업스트림(즉, 5' 쪽으로)이다. 예를 들어, 표적-상보적인 서열의 프라이머 업스트림에 존재하는 경우에, 하나 이상의 제한 효소 인식 부위를 포함하는 서열(소위 "링커" 또는 "어댑터")은 클로닝 및 증폭 산물의 연이은 유전자 조작을 용이하게 한다. 프라이머내에 포함된 다른 유용한 서열은 서열결정 프라이머에 상보적인 서열 및 예를 들어, T3RNA 폴리머라제, T7RNA 폴리머라제 및/또는 SP6 폴리머라제와 같은 박테리오파지 RNA 폴리머라제에 대한 프로모터를 특정하는 서열을 포함한다.
발명의 한 양태에서, 미세배열 프라이머는 표적 폴리뉴클레오티드에서 관심의 전 영역을 포함하는 타일링 방법으로 한정한다. 예를 들어, 프라이머의 제1의 군을 설계하여 그 안의 각 프라이머의 서열이 관심의 영역의 가장 5' 부분에 상응하게 하였다; 프라이머의 제2의 군은 3' 말단 영역을 향한 1 뉴클레오티드에 의해 제1의 군에서 "변형된" 서열을 가진다; 그리고 프라이머의 제3의 군은 3'말단 영역 등에 대한 1 뉴클레오티드에 의해서 제2의 군에서 "변형된" 서열을 가진다. 이론상, 프라이머군의 수는 관심의 영역에서 뉴클레오티드의 수와 같다. 물론, 영역의 특정 부분에 상응하는 각군의 프라이머내에, 상기에 개시된 바와 같이 4 개의 서로 다른 3' 말단을 가지는 적어도 4 셋트의 프라이머가 있다. 본 발명에 따라서 다중 표적 폴리뉴클레오티드가 검출된 경우에, 특정 표적 폴리뉴클레오티드에 상보적인 각 프라이머군은 미세배열의 개별 영역에 위치한다.
2.고체상 지지체
본 발명의 고체상 지지체는 뉴클레오티드 혼성화 및 합성의 지지에 적합한 어떤 고체 물질 및 구조일 수 있다. 바람직하게는, 고체상 지지체는 프라이머가 고정될 수 있고, PCR 반응을 수행할 수 있는 적어도 하나의 실질적으로 단단한 표면을 포함한다. 고체상 지지체는 예를 들어, 유리, 합성 폴리머, 플라스틱, 경 비망사 나일론 또는 세라믹으로 만들어질 수 있다. 다른 적당한 고체 지지체 물질이 공지되고 당업자에게 쉽게 이용가능하다. 고체 지지체의 크기는 DNA 미세배열 기법에 유용한 표준 미세배열 크기일 수 있고, 크기는 본 발명의 반응을 수행하기 위해 사용된 특정 기계에 적합하게 다듬어질 수 있다. 올리고뉴클레오티드를 고정하기 위한 목적으로 고체상 지지체의 유도를 위한 방법 및 물질은 당업자에게 공지되고, 예를 들어, U.S. 특허번호 5,919,523 에 개시되고, 그것의 개시는 본원에 참고문헌으로 수록된다.
고체상 지지체가 제공되거나 용기를 포함하는 액체의 일부일 수 있다. 예를 들어, 고체 지지체는 지지체상에서 폴리머라제 사슬 반응(PCR)을 포함하도록 고체 지지체의 말단을 따라서 봉인을 생성하는 면을 가지는 챔버에 놓일 수 있다. 구체예에서, 챔버는 지지체상에 PCR 혼합물이 남아있고, 또한 전체 표면을 프라이머 제공에 유용하도록 하는 직사각형 지지체의 각 면에 벽을 가질 수 있다.
3. 프라이머 고정
본 발명의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 고체상 지지체상의 특정 위치에 올리고뉴클레오티드를 첨부하고, 고정하고, 제공하고/또는 적용하는 어떤 이용가능한 수단을 사용하여 고체지지체의 표면에 첨부, 고정, 제공, 및/또는 적용된다. 예를 들어, 사진평판(Affymetrix, Santa Clara, CA)은 U.S. 특허번호 5,919,523, U.S. 특허번호 5,837,832, U.S. 특허번호 5,831,070, 및 U.S. 특허번호 5,770,722 에 개시되고, 본원에 참고문헌으로 수록된 것과 같은 칩 또는 고체 지지체상의 특정 위치에서 올리고뉴클레오티드 프라이머에 적용될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 프라이머는 Brown 및 Shalon, U.S. 특허번호 5,807,522(1998)에 개시된 것과 같은고형 지지체에 적용될 수 있다. 추가적으로, 프라이머는 Genetic MicorSystems(Woburn, MA), GeneMachines(San Carlos, CA)또는 Cartesia Technologies(Irvine, CA)에 의해 제조된 것과 같은 로봇 시스템을 사용하여 고체 지지체에 적용될 수 있다.
D. 표적 폴리뉴클레오티드에서 서열 변형의 검출
본 발명의 한 양태에서, 생물학적 샘플에서 표적 폴리뉴클레오티드의 고체상 증폭이 수행되고, 여기에서 올리고뉴클레오티드의 다중 군은 고체상 지지체에 고정된다. 바람직한 구체예에서, 군내의 프라이머는 적어도 서열상 동일하고 적당한 조건하에서 표적 폴리뉴클레오티드에 혼성화할 수 있고, 핵산 합성(즉, 사슬 연장 또는 확장)에 대한 개시 프라이머로 적합한 한정된 서열의 표적 폴리뉴클레오티드에 상보적인 제1셋트의 프라이머를 포함한다. 기준 서열의 특정 영역을 포함하는 선택된 프라이머는 별개 위치에서 고체상 지지체에 군으로 고정된다. 바람직하게는, 군내의 거리는 증폭된 산물의 검출에 사용될 수 있는 검출 수단의 분해능보다 크다. 바람직한 구체예에서, 프라이머는 자동화된 과정에 의해서 프로세싱되고 분석될 수 있는 미세배열 또는 칩을 형성하도록 고정된다. 고정된 프라이머는 핵산 증폭 수단에 적합한 조건하에서 표적 폴리뉴클레오티드의 고체상 증폭에 사용된다.
본 발명의 한 양태에 따라서, 초기 표적 폴리뉴클레오티드는 센스 가닥("양성 가닥") 및 상보적인 가닥("음성 가닥")을 가지는 이중 가닥 형태이다. 증폭을 수행하기 전에, 표적 폴리뉴클레오티드는 열 변성과 같은 변성을 겪음으로써 2 가닥이 반응용액에서 변성되고 분리된다. 바람직하게는, 본 발명에 사용된 프라이머는 2 개의 표적 폴리뉴클레오티드 가닥의 재생성을 방해하는 표적 폴리뉴클레오티드의 측정된 농도에 비하여 매우 과량 몰이다. 택일적으로, 최초 표적 폴리뉴클레오티드는 단일-가닥 DNA 또는 RNA 인 단일가닥이다.
본 발명의 한 바람직한 구체예에서, 핵산 증폭은 폴리머라제로 조절된다. 더욱 바람직하게는, 증폭은 PCR 반응에 적합한 조건에서 수행된다. 당업자에게 이해된 대로, PCR 반응은 신생 가닥의 다중 카피가 주형으로서 초기 표적 폴리뉴클레오티드에 기초하여 합성되는 동안 일반적으로 다양한 반응온도에서 어닐링-연장-변성 단계의 다중 순환을 포함한다. 결과적으로, 초기 표적 서열은 PCR 반응의 조건 및 제한에 기초하여 선형적으로 또는 지수적으로 "증폭"된다.
본 발명에 따른 PCR 반응동안, 고정된 프라이머의 배열은 반응 혼합물에서 표적 폴리뉴클레오티드와 접촉하고, 이어서 표적 폴리뉴클레오티드가 이중 가닥 형태인 경우에 변성된다. 어닐링에 적합한 조건하에서, 단일 가닥 표적 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥 표적 폴리뉴클레오티드내의 한정된 서열 영역에 상보적인 서열을 포함하는 고정된 단일 프라이머에 혼성화된다. 사슬 연장에 적합한 조건하에서(DNA 폴리머라제 및 해리 뉴클레오티드 dNTP 를 제한없이 포함), 각 표적 폴리뉴클레오티드 가닥은 신생 상보적인 가닥의 합성에 대한 최초 주형으로 기능하고, 어닐링된 프라이머의 3'-히드록실로부터 프라임되고, 표적 주형의 5'말단으로 연장된다. 사슬 연장의 완성에 이어서, 반응 조건은 변성을 허용하도록 변형되고, 그 동안 표적 가닥 및 신생 가닥은 분리되어서 표적 가닥이 샘플 용액에 해리되고, 신생 가닥은 고정된 프라이머에 의해서 고체 지지체에 남는다.
본 발명의 수행에서, 고정된 단일 프라이머는 단독으로, 또는 택일적으로 신생 고정된 가닥의 3'말단에서 서열에 상보적인 반응 용액의 프라이머와 조합하여 사용될 수 있다. 더욱이, 용액상 프라이머는 표적 폴리뉴클레오티드 모두 또는 특정 프라이머의 풀을 증폭할 수 있는 보편 프라이머일 수 있고, 각각은 특정 표적 서열에 특이적이다.
발명의 한 양태에서, 사용된 용액상 프라이머는 없다. 따라서, 상기에 개시된 대로 최초 증폭 반응은 연장 후에 변성 단계가 도입되는지에 관계없이 단일 가닥으로 또는 최초 표적 폴리뉴클레오티드 가닥으로 어닐링되어 각 프라이머 부위에서 고체상 지지체에 첨부된 신생 가닥을 생산한다. 그리고 신생 가닥의 존재는 하기에 개시된 대로 적절한 검출 수단으로 검출될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에서, 용액 상 프라이머는 다중 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭을 위한 고체상 고정된 프라이머와 조합하여 사용된다. 최초 증폭 반응에 이어서, 또 다른 증폭 반응의 순환이 수행되고, 그 동안 3' 말단에서 용액상 프라이머에 상보적인 이미 형성된 신생 가닥은 용액상 프라이머에 어닐링될 것이고, 표적 폴리뉴클레오티드에 실질적으로 동일한 제2의 신생 가닥의 연이은 합성에 대한 주형으로 기능한다. 결과적으로, 이중 가닥의 신생 폴리뉴클레오티드는 각 프라이머 부위에서 고체상 지지체에서 형성되고 첨부될 수 있다.
본 발명의 목적을 위해서, 표적 폴리뉴클레오티드는 이중 가닥 DNA, 단일가닥 DNA, 또는 RNA 일 수 있다. 표적 폴리뉴클레오티드의 예는 게놈 DNA, cDNA, mRNA, 미토콘드리아 DNA, 바이러스 DNA, 증폭된 DNA, 및 바이러스 RNA 를 제한없이포함한다. 이중 가닥 표적 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥 주형을 제공하기 위해서 증폭 반응의 개시시에 변성된다.
mRNA 표적 폴리뉴클레오티드는 역전사효소에 의해서 매개된 증폭의 주형으로 직접 사용될 수 있다. 각 고정된 프라이머 부위에서 기원한 사슬 연장의 완성 후에, 혼성화 RNA 주형 가닥은 예로서 RNAseH 에 의해서 고체상 지지체에 첨부된 신생 상보적인 DNA 가닥을 남겨놓은 채 분해될 수 있다. 제2프라이머(특정 또는 보편)가 용액상에 존재하는 경우에, 첫번째 신생 cDNA 가닥은 또 다른 신생 가닥을 합성하기 위한 주형으로 기능하여 각 고정된 프라이머 부위에서 이중가닥의 신생 DNA 분자를 형성하거나, 2 개의 고정된 프라이머에 결합한다.
택일적으로, 샘플에서 mRNA 표적 폴리뉴클레오티드는 우선 교대로 본 발명의 고체상 PCR 반응에 대한 최초 주형으로 기능하는 상보적인 DNA 로 역전사될 수 있다. 역전사는 예를 들어, 본 발명에 다른 PCR 증폭 반응용 용액상에서 보편 프라이머로서 사용될 수 있는 폴리-T 보편 프라이머로부터 개시될 수 있다. 폴리-T 개시 cDNA 산물은 3'말단에서 고체상 지지체에 고정된 특정 프라이머에 어닐링될 것이고, 그것의 3'말단에서 폴리A 서열을 가지는 신생 상보적인 가닥의 연속적인 합성에 대한 주형으로 기능한다. 변성 단계에 이어서, 고정된 신생 단일 가닥은 용액상에서 폴리-T 보편 프라이머에 혼성화할 수 있고, PCR 증폭의 연이은 순환에 대한 주형으로 기능할 수 있고, 고체상 지지체에 첨부된 이중 가닥의 신생 폴리뉴클레오티드를 형성할 수 있다.
본 발명의 다중 표적 폴리뉴클레오티드는 단독의 생물학적 출처 또는 택일적으로 서로 다른 종 또는 조직과 같은 다중 생물학적 출처로부터 기원할 수 있다. 예를 들어, 건강한 사람으로부터 분리된 표적 폴리뉴클레오티드의 군은 상기에 상세히 개시된 대로, 당업계에 공지된 검출방법에 의해서 2 원의 증폭 산물의 구별을 허용하는 조건하에서, 관심의 질환을 가지는 환자에서 분리된 표적 폴리뉴클레오티드의 다른 군과 PCR 반응에서 혼합될 수 있다. 그러므로, 본 발명은 표적 폴리뉴클레오티드의 교잡종 비교 분석에 사용될 수 있다.
5. PCR 반응
본 발명의 수행에서, 폴리머라제 사슬 반응(PCR)을 수행하기에 필요한 시약과 혼합된 적당한 표적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 반응 혼합물은 고체 지지체의 각 고정된 프라이머 쌍 또는 단일 프라이머 군과 접촉하여 놓여진다. 적당한 표적 폴리뉴클레오티드는 이중 가닥 DNA, RNA 주형의 역전사로 생성된 단일 가닥 cDNA, 또는 mRNA 군 일 수 있다. 반응 혼합물은 표적 가닥에 상보적인 폴리뉴클레오티드 가닥의 합성을 용이하게 하는 폴리머라제와 같은 효소를 포함한다. 적당한 폴리머라제는 Taq DNA 폴리머라제, Tth1 DNA 폴리머라제, Vent DNA 폴리머라제, 및 Pfu DNA 폴리머라제와 같은 열안정성 폴리머라제 효소를 포함한다. 반응 혼합물은 또한 폴리머라제 사슬 반응동안 신생 가닥에 통합될 수 있는 표지 분자를 포함할 수 있어서 증폭된 산물은 PCR 후에 고체 지지체에서 검출될 수 있다. 표지는 당업계에 알려진 방법에 따라서 직접 또는 간접적으로 검출될 수 있다. 직접 검출을 위한 적당한 표지는 플로오레세인 이소티오시아네이트, 텍사스 레드 또는 로드아민과 같은 어떤 형광 분자일 수 있다. 비오틴 또는 디곡시게닌과 같은 간접 검출을 용이하게하는 분자 역시 PCR 동안 신생 가닥에 통합될 수 있다. 비오틴은 표지된 스트렙타비딘 또는 표지된 항-비오틴 항체와의 결합에 의해서 연속적으로 검출될 수 있다. 이와 마찬가지로, 통합된 디곡시게닌은 표지 또는 비표지 항-디곡시게닌 항체로 검출될 수 있고, 비표지 항-디곡시게닌 항체는 표지된 항-항-디곡시게닌 항체로 검출될 수 있다.
PCR 을 수행하기 위한 시약을 미세배열상에 고정된 프라이머와 접촉시킨 후에, 예를 들어, 제자리 PCR 기계와 같은 자동화 시스템을 사용하여 미세배열을 PCR 을 용이하게 하는 조건하에 놓는다. PCR 과정을 위한 반응 조건은 제자리 PCR 기게 매뉴얼에 의해 추천될 수 있고, 사용된 주형의 적당한 주어진 성질 또는 프라이머 및 주형 혼성화에 예상되는 다른 어려움으로 다양화 될 수 있다. 온도 및 순환 횟수는 추천된 적당한 주어진 프라이머 선택 및 주형 서열, 및 어떤 다른 관련 인자로 선택될 수 있다. 미세배열상의 제자리-형태 PCR 반응은 예를 들어, Embretson et al., Nature 362:359-362(1993);Gosden et al, BioTechniques 15(1):78-80(1993);Heniford et al Nuc.Acid Res.21(14):3159-3166(1993);Long et al, Histochemistry 99:151-162(1993); Nuovo et al, PCR Methods and Applications 2(4):305-312(1993);Patterson et al Science 260:976-979(1993)에 개시된다.
6. 표지 및 검출
본 발명의 PCR 방법은 샘플에서 다중 표적 폴리뉴클레오티드의 검출을 제공한다. PCR 을 적당한 표지 시약에서 완결한 다음에, 증폭되고 표지된 표적 폴리뉴클레오티드는 미세배열상의 각각의 본래의 프라이머 위치에서 검출될 수 있다. 증폭되거나 표지된 표적 폴리뉴클레오티드의 검출은 예를 들어, 증폭되거나 새로 합성된 DNA 가닥에 통합된 표지를 검출하는 것을 포함하는 표지된 서열 검출에 사용된 표준 방법으로 수행될 수 있다. 그러므로, 예를 들어 형광 표지 또는 방사선표지는 직접 검출될 수 있다. 다른 표지 기법은 표지되거나 형광 분자(예를 들어, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 텍사스 레드 및 로드아민)에 결합되거나, 효소적으로 활성가능한 분자에 결합된 예를 들어, 항-스트렙타비딘 항체 또는 항-디곡시게닌 항체일 수 있는 표지된 분자 그 자체에 결합될 수 있는 항체 또는 다른 결합 분자(예를 들어, 스트렙타비딘)에 의해서 가닥 합성동안에 DNA 에 통합된 비오틴 또는 디곡시게닌과 같은 표지가 검출되는 것을 요구할 수 있다. 새로 합성된 분자에서 표지가 무엇이든지, 표지가 DNA 에 직접적으로 또는 DNA 에 결합하는 분자(또는 DNA 에 결합하는 분자에 결합)에 결합되는지 간에, 표지(예를 들어, 형광, 효소, 화학발광, 또는 비색)는 표지에 따라서 레이저 스캐너, CCD 카메라, X-레이 필름, 또는 특정 표지를 검출하기 위한 다른 적당한 수단으로 검출될 수 있다.
표적 폴리뉴클레오티드는 PCR 동안 증폭된 DNA 에 통합된 표지된 뉴클레오티드(예를 들어, 직접 표지화를 위한 dNTP-형광 표지; 간접 표지화를 위한 dNTP-비오틴 또는 dNTP-디곡시게닌)를 사용하여 검출될 수 있다. 간접 표지 DNA 의 경우에, 검출은 형광 또는 다른 효소 결합 스트렙타비딘 또는 항-디곡시게닌 항체에 의해 수행된다. PCR 방법은 폴리뉴클레오티드 표적에 대해 새로 합성된 보체에 통합된 표지를 검출함으로써 폴리뉴클레오티드의 검출을 사용한다. 본 목적을 위해서, 상기에 개시된 플로오로-dNTP, 비오틴-dNTP, 또는 디곡시게닌-dNTP 와 같은 합성된DNA 에 통합될 수 있는 어떤 표지는 당업계에 알려진다. 용액에서 하나 이상의 보편 프라이머를 사용하여 수행된 PCR 증폭은 보편 프라이머를 검출함으로써 고체 지지체상의 위치에서 증폭된 표적의 검출에 대한 대안을 제공한다. 그러므로, 하나 이상의 보편 프라이머가 사용되는 경우에, 서로 다른 출처로부터 표적 가닥은 고체 지지체상에서 서로 다르게 검출될 수 있다.
서로 다른 발현 시스템에서, 서로 다른 생물학적 출처로부터 유래된 증폭 산물은 "C.서로 다른 생물학적 출처에서 기원한 유전자의 차별적인 발현의 비교"라는 단락에 개시된 바와 같이 그들의 출처에 기초한 증폭된 가닥을 차별적으로 표지함으로써 검출될 수 있다. 한 양태에서, 본원에 사용된 검출 방법은 서로 다른 표지(예를 들어, 레드 염료 및 그린 염료)가 증폭동안 신생 가닥에 통합되기 보다는 용액에서 프라이머 태그상에 미리-통합된다는 점에서 단일-출처 표적에 대한 검출 방법과 다르다. 택일적으로, 제3의 표지 역시 구별된 표지뿐만 아니라 증폭동안 신생 가닥에 통합되어서, 차별적인 발현 비교에 대한 전체적인 감도가 향상될 수 있다.
7. 검출 키트
본 발명은 본 발명의 방법을 수행하는 키트를 제공한다. 키트는 예를 들어, 고체 지지체상에서 검출이 용이한 다수의 표적 폴리뉴클레오티드를 검출하기 위한 물질 및 시약을 포함한다. 키트는 예를 들어, 고체상 지지체, 특정 셋트의 표적 폴리뉴클레오티드용 올리고뉴클레오티드 프라이머, DNA 합성용 효소와 같은 폴리머라제 사슬 반응 시약 및 성분, 표지 물질, 및 세척용 다른 완충액 및 시약을 포함할 수 있다. 키트는 또한 고체 지지체에서 특정 표적을 증폭하기 위한 키트 사용의 지시를 포함할 수 있다. 키트가 예를 들어, 특정 셋트의 표적 폴리뉴클레오티드를 증폭하기 위하여 고체 지지체에 이미 고정된 프라이머 셋트를 가지는 제조된 고체 지지체를 포함하는 경우에, 이러한 제조된 고체 지지체의 설계 및 제조는 상기에 개시된다. 이러한 고체 지지체는 고객이 검출하고자 하는 표적 폴리뉴클레오티드에 따라서 각각의 키트에 대한 고개-맞춤형으로 제작된다. 키트는 또한 예를 들어, 지지체가 제자리-형태 PCR 기계를 사용하여 PCR 증폭을 할 수 있는 제자리-형태 또는 고체상 형태 PCR 과정을 사용하며, 고체 지지체에서 PCR 수행에 필요한 시약을 포함한다. 지지체는 PCR 용 시약과 접촉할 수 있다. 잠재적으로 다중 표적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 샘플은 반응전에 PCR 시약 혼합물에 첨가된다. PCR 시약은 일반적인 PCR 완충액, 열안정성 폴리머라제(예를 들어, Taq DNA 폴리머라제), 뉴클레오티드(예를 들어, dNTP), 및 다른 성분 및 표지 분자(예를 들어, 상기에 개시된 직접 또는 간접 표지용)를 포함한다. 고체 지지체는 고체 지지체상의 표시된 위치에서 부착된 프라이머를 제공한다. PCR 수행의 경우에, 고정된 프라이머를 가지는 지지체는 PCR 수행용 시약과 접촉되고, 반응 혼합물에서 표적 폴리뉴클레오티드는 주형으로 기능하여 PCR 조건에 놓인다(예를 들어, 제자리 형태 또는 고체상 형태 PCR). 키트의 사용을 위한 지시는 예를 들어, 상기에 개시된 방법에 나타난 바와 같은 과정의 상세한 설명을 포함할 수 있다. 키트는 고정된 프라이머 단독으로 또는 택일적으로 용액상 프라이머와 함께 사용되어 PCR 증폭 방법의 실행을 뒷받침하도록 조립될 수 있다.
D. 다중 표적 폴리뉴클레오티드의 고산출량 분석
상기에 개시된 증폭 방법은 고체상 지지체상의 다중 표적 폴리뉴클레오티드의 고산출량 분석법에 사용될 수 있다. 단일 형태 또는 쌍형성의 다중 군의 프라이머는 고체상 지지체에 고정되어서 미리예견된 형태로 미세배열을 형성한다. 각 군의 프라이머는 특정의 표적 폴리뉴클레오티드에 상보적인, 미세배열내의 개별 위치를 차지한다. 다중 표적 폴리뉴클레오티드를 포함하거나 포함할 것으로 여겨지는 샘플이 상기에 개시된 대로 PCR 반응에 적당한 반응 조건하에서 미세배열과 접촉하는 경우에, 각 표적 폴리뉴클레오티드는 그에 고정된 상보적인 프라이머를 가지는 미세배열과 함께 개별 위치에서 증폭되고 첨부될 것이다.
본 발명에 따라서, 잠재적인 표적 폴리뉴클레오티디의 수는 작은 밀도 미세배열을 생산하고 분석하는 이용가능한 기법에 의해서만 제한된다. 예를 들어, 공지된 기법을 사용하여 약 100,000 이하의 폴리뉴클레오티드가 고체 지지체상의 개별위치에서 약 1 00,000 개 이하의 상이한 프라이머쌍의 군을 제공하고, PCR 용액을 가지는 지지체를 프라이머가 검출되도록 설계된 표적 폴리뉴클레오티드의 적어도 1 카피를 포함하는 샘플과 접촉시킴으로써 단일 고체 지지체상에서 분석될 수 있다.
실시예 1. 미세배열에서 G3PDF 유전자의 PCR 검출
사람의 G3PDH 를 코딩하는 유전자가 양 요소의 프라이머 쌍이 지지체에 고정된 대칭적인 PCR, 또는 1 요소의 프라이머 쌍이 고정되고 나머지 1 요소는 용액내에 있는 비대칭적인 PCR 에 의해서 미세배열상의 증폭에 의한 검출을 위해 선택되었다.
공지된 사람의 G3PDH(hG3PDH)의 서열에 기초하여, 4 셋트의 프라이머를 유전적으로 설계했고, 분석에 사용했다. 4 셋트의 프라이머는 각 셋트가 서로 다른 뉴클레오티드, A, T, C, 또는 G 를 가지는 3'최말단의 마지막 염기를 제외하고는 hG3PDH 유전자 서열과 동일하였다. 프라이머를 고체 지지체에 프라이머를 첨부할 목적으로 아데닌의 5' 말단 변형으로 합성했다. 프라이머를 Sigma Chemicals (St.Louis, MO)에서 구입한 실란화 유리 슬라이드상에서 상이한 농도로 쌍 또는 단일 프라이머로 배치했다.
제공된 프라이머를 가지는 실란화 슬라이드를 실내온도에서 포화된 NaCl 챔버에서 하룻밤동안 수화시켰다. 수화된 슬라이드를 5 분동안 4×SSC 로 린스한 다음, 물로 세척했다. 슬라이드를 50 ℃ 에서 15 분동안 SurModics(Madison, WI) 차단 용액(0.1%SDS)으로 차단한 다음, 물 2X 로 린스했고, 대기중에서 건조시켰다. 그 다음, 슬라이드를 준비했다.
PCR 반응 용액을 최종 농도, 각 200μM dATP, dGTP, 및 dTTP; 100 μM dCTP 및 100 μM 비오틴-14-dCTP 가 되도록 제조했다. 반응 용액은 또한 1X Taq 반응 완충액(1.5mM MgCl2포함); DNA 주형으로서 사람의 G3PDH 유전자 플라스미드(100 ng 파지미드 DNA 또는 500 ng ss-cDNA 라이브러리) 및 2.5 단위의 Taq 폴리머라제 효소를 포함한다. 70 ㎕ 반응 용액을 하기와 같이 제조했다.
총부피 70 ㎕ 에 대해서
7 ㎕ 2mM d3TP(dATP, dGTP, 및 dTTP)
12.5 ㎕ 0.4 mm dCTP
12.5 ㎕ 0.4 mM 비오틴-14-dCTP
7 ㎕ 10X 반응 완충액(15mM MgCl2포함)
5 ㎕ DNA 주형
25.5 ㎕ 물
0.5 ㎕ Taq DNA 폴리머라제의 5 단위/㎕
HyBaid 챔버(HyBaid USA, Franklin, MA)를 센터내의 배열된 위치를 유지하도록 슬라이드상에 놓았고, 반응 용액을 챔버에 옮겼고, 플라스틱 커버로 봉했다. PCR 기계를 예비-가열했고, 하기의 순환 프로토콜을 적용했다:
개시 ----- 94 ℃ 5 분
주 순환: (단계 1-3) 반복 35 X
단계 1 ------ 94 ℃ 30 초
단계 2 ------ 55 ℃ 30 초
단계 3 ------ 72 ℃ 30 초
최종 연장 ------ 72 ℃ 7 분
종료 ------ 4 ℃ 정지
PCR 을 완성한 후에, 실내온도에서 30 분동안 슬라이드를 Boehringer Mannheim(Indianapolis, Indiana)에서 구입한 디곡시게닌-차단 용액으로 차단했다. 슬라이드를 부드럽게 진탕하면서 실내온도에서 30 분동안 스트렙타비딘(5㎍/㎕)(디곡시게닌-차단 용액으로 1:250 희석)으로 염색했다. 디곡시게닌-세척 완충액을 실내온도에서 15분동안 2 번 슬라이드를 세척하는 데 사용했다. 슬라이드를 실내온도에서 30 분동안 디곡시게닌-차단 용액으로 차단했다.
슬라이드를 실내온도에서 1 시간동안 디곡시게닌-차단 용액에서 1:100 희석된 제1항체(래빗 항-스트렙타비딘)와 함께 인큐베이션했다. 슬라이드를 실내온도에서 15 분동안 2 번 디곡시게닌-세척 완충액으로 세척했다. 슬라이드를 실내온도에서 30 분동안 디곡시게닌-차단 용액에서 1:100 희석된 제2항체(Cy3 결합 고우트 항-래빗 항체)와 함께 인큐베이션했다. 슬라이드를 실내온도에서 15 분동안 디곡시게닌-세척 완충액으로 세척했다. 슬라이드를 Genetic MicroSystems, GMS418 의 그린 빔으로 스캔했다.
대칭적 PCR 의 결과는 도 2 에 도시된다. 50 ng 의 G3PDH DNA 단편을 PCR 주형으로 사용했고, 컬럼 1 내지 6 의 프라이머 농도를 각각 250,125,62,31,15 및 7.8 p몰/㎕ 로 했다. PCR 을 비오틴화 dCTP 의 존재하에서 15 순환동안 표준 프로토콜하에서 수행했고, 신호를 스트렙파이딘 및 Cy3 결합 항체를 사용하여 검출했다. 발광 점은 3' 말단에서 C 잔기를 가지는 야생형 hG3PDH 프라이머가 고정된 위치에서 hC3PDH 주형의 성공적인 증폭을 나타낸다. 대조적으로, 표적 hG3PDH 주형의 검출은 상이한 3' 말단 뉴클레오티드를 가지는 hG3PDH 프라이머가 고정된 어떤 위치에서도 검출될 수 없었다.
본원에 언급된 모든 공개 및 특허출원은 각각의 공개 또는 특허출원이 구체적으로 그리고 각각 전체로서 참고문헌으로 지시되지 않는 한 참고문헌으로 본원에수록된다.
전술한 발명은 명료한 이해를 위해 예시의 방식으로 상세하게 개시되었지만, 수록된 청구항의 취지 또는 범위를 벗어나지 않고 어떤 변형이 만들어질 수 있다는 것은 본 발명의 교시 관점에서 당업자에게 자명할 것이다.

Claims (27)

  1. 기준 서열과 비교하여 샘플에서 표적 폴리뉴클레오티드의 서열 변형을 확인하는 방법으로서,
    a) 올리고뉴클레오티드의 5'말단에 의해서 고체상 지지체에 고정되어 있고, 더욱이 올리고뉴클레오티드 프라이머의 각 군이 기준 서열의 특정 영역을 포함하도록 선택되고, 배열상의 별개 영역을 차지하고, 적어도 2 셋트의 프라이머: 1)기준 서열에 정확하게 상보적인 제1셋트; 및 2) 각각 제1셋트의 프라이머와 동일하지만 각 추가의 셋트에서 3'말단에서 뉴클레오티드가 상이한 하나 이상의 추가의 셋트를 포함하는, 하나 이상의 군의 올리고뉴클레오티드 프라이머의 배열을 폴리머라제-매개 폴리뉴클레오티드 증폭을 위한 시약과 샘플을 함유하는 반응 혼합물과 접촉시키는 단계;
    b) 폴리머라제-매개 폴리뉴클레오티드 증폭을 수행함으로써 표적 폴리뉴클레오티드를 표적 폴리뉴클레오티드에 정확하게 상보적인 프라이머 셋트로부터 연장된 검출가능한 신생 폴리뉴클레오티드의 합성을 위한 주형으로 기능하도록 하는 단계;
    c) 상보적인 고정된 프라이머에 의해서 고체상 지지체의 개별 영역에서 포착된 합성된 폴리뉴클레오티드의 존재를 검출하는 단계; 및
    d) 고체상 지지체상에서 합성된 폴리뉴클레오티드의 검출된 패턴에 따라서 표적 폴리뉴클레오티드의 서열 변형을 확인하는 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 반응 혼합물은 용액상 프라이머의 군을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 용액상 프라이머의 군은 보편 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 보편 프라이머는 올리고-dT 프라이머인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 3 항에 있어서, 보편 프라이머는 T7 프로모터, T3 프로모터 또는 SP6 프로모터를 함유하는 프로모터인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 2 항에 있어서, 용액상 프라이머의 군은 각각 특정 서열을 가지는 다중 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 2 항에 있어서, 적어도 2 개의 상이한 표적 폴리뉴클레오티드는 상이한 생물학적 출처로부터 기원하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 반응 혼합물은 신생 폴리뉴클레오티드에 통합된 검출가능한 표지를 포함함으로써 신생 폴리뉴클레오티드를 검출가능하도록 하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 검출가능한 표지는 형광 분자인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 8 항에 있어서, 검출가능한 표지는 적어도 하나의 방사선표지-dNTP, 플루오로-dNTP, 비오틴화 dNTP 또는 디곡시게닌-dNTP 인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 8 항에 있어서, 검출가능한 표지는 신생 폴리뉴클레오티드에 결합하는 분자에 결합되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 검출가능한 표지는 신생 폴리뉴클레오티드에 통합된 제2 표지에 결합하는 분자에 결합되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1 항에 있어서, 배열은 적어도 약 100 내지 적어도 약 100,000 개의 군의 고정된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서, 배열은 적어도 약 1,000 개의 군의 고정된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 배열은 적어도 약 10,000 개의 군의 고정된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 1 항에 있어서, 고체상 지지체는 유리, 플라스틱, 합성 폴리머, 세라믹 및 나일론으로 구성되는 군으로부터 선택된 재료로 만들어진 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 1 항에 있어서, 폴리머라제는 Taq 폴리머라제, TthI 폴리머라제, Vent 폴리머라제, Pfu 폴리머라제 또는 어떤 다른 열안정성 폴리머라제인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. a) 올리고뉴클레오티드 프라이머의 각군이 기준 서열의 특정영역을 포함하도록 선택되고, 배열상의 별개 영역을 차지하고, 적어도 4 셋트의 프라이머: 1)기준 서열에 정확하게 상보적인 제1셋트; 및 2) 각 프라이머의 제1셋트와 동일하지만 각 3셋트의 3'말단에서의 뉴클레오티드가 상이한 3 개의 추가의 셋트의 프라이머를 포함하는, 고체상 지지체에 고정된 다수의 군의 올리고뉴클레오티드 프라이머의 배열;
    b) 배열상에서 폴리머라제-매개 폴리뉴클레오티드 증폭 반응에 적합한 시약; 및
    c) 배열상에서 증폭된 폴리뉴클레오티드를 검출하는 검출 수단을 포함하는 것을 특징으로 하는 기준 서열과 비교하여 표적 폴리뉴클레오티드의 서열 변형을 확인하는 키트.
  19. 제 18 항에 있어서, 검출 수단은 증폭 반응동안 증폭된 폴리뉴클레오티드에 통합된 검출가능한 표지를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  20. 제 19 항에 있어서, 검출가능한 표지는 형광 분자인 것을 특징으로 하는 키트.
  21. 제 19 항에 있어서, 검출가능한 표지는 비오틴화 11-dNTP 또는 디곡시게닌-dNTP 인 것을 특징으로 하는 키트.
  22. 고체상 지지체의 별개 영역들에 고정되어 있고, 올리고뉴클레오티드 프라이머의 군이 기준 서열의 특정 영역을 포함하도록 선택되고, 각 군은 적어도 2 셋트의 프라이머를 포함하며: 1) 제1셋트는 기준 서열에 정확하게 상보적이며; 및 2) 하나 이상의 추가의 셋트의 각각은 각 추가의 셋트의 3' 말단에서 뉴클레오티드가 상이하다는 것을 제외하고는 프라이머의 제1셋트와 동일하여, 표적 폴리뉴클레오티드가 표적 폴리뉴클레오티드에 정확하게 상보적인 프라이머 셋트로부터 연장된 검출가능한 신생 폴리뉴클레오티드의 합성의 주형으로 기능하도록 하는, 폴리머라제-매개 폴리뉴클레오티드 증폭에 의해서 기준 서열과 비교하여 샘플에서 표적 폴리뉴클레오티드의 서열 변형을 확인하기 위한 배열.
  23. 제 22 항에 있어서, 배열은 적어도 약 100 내지 적어도 약 100,000 개의 군의 고정된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 23 항에 있어서, 배열은 적어도 약 1,000 개의 군의 고정된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 24 항에 있어서, 배열은 적어도 약 10,000 개의 군의 고정된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 22 항에 있어서, 고체상 지지체는 유리, 플라스틱, 합성 폴리머, 세라믹 및 나일론으로 구성되는 군으로부터 선택된 재료로 만들어진 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 22 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 프라이머의 배열은 2 개 이상의 표적 폴리뉴클레오티드에서 서열 변형을 확인하기에 적합한 것을 특징으로 하는 방법.
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