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Technisches
Gebiet
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Diese
Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung, ob sich ein spezielles
Nucleotid oder eine spezielle Base an einer bestimmten Position
in einer speziellen Polynucleotid-Sequenz befindet, ein Verfahren
zur Bestimmung, ob sich dieselben oder verschiedene spezielle Nucleotide
oder Basen an bestimmten Positionen in mindestens zwei verschiedenen
speziellen Polynucleotid-Sequenzen in einem Material mit einer Mehrzahl verschiedener
Polynucleotid-Sequenzen befinden, und Screening-Verfahren zur Bestimmung,
ob sich dieselben oder verschiedene spezielle Nucleotide oder Basen
an bestimmten Positionen in mindestens zwei verschiedenen speziellen
Polynucleotid-Sequenzen in einem Material mit einer Mehrzahl verschiedener
Polynucleotid-Sequenzen befinden.
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Stand der
Technik
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Gegenwärtig ist
die üblichste
Technik zur Bestimmung oder zum Nachweis von Polynucleotid-Sequenzen
die Hybridisierung unter Verwendung von Oligonucleotid- oder Polynucleotid-Sonden.
Für diese
Technik wird die Proben- oder Ziel-Nucleinsäure üblicherweise irreversibel an
einen festen Träger
wie Cellulose oder Nylon gebunden. Die markierte Probe wird dann
in Lösung
unter Hybridisierungs-Bedingungen zugegeben, und wenn es eine Sequenzhomologie
zwischen der Sonde und der Ziel-Nucleinsäure gibt, bildet die Sonde
ein Hybridmolekül
mit dem Ziel-Polynucleotid. Dieses Hybrid kann auf vielfältigen Wegen,
wie durch radioaktive Markierung oder Biotin-Markierung, nachgewiesen
werden. Die Nachteile dieser Technik sind: erstens, daß sie beträchtliche
Fachkunde beim Ausführenden
erfordert, zweitens, daß die
Technik langwierig und zeitraubend ist, und drittens, nicht leicht
automatisiert werden kann. Oft dauert das gesamte Verfahren mehr
als 48 Stunden.
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Die
Flüssig-Fest-Verfahren,
die zum Nachweis spezieller Nucleinsäuren in Proben üblicherweise
verwendet werden, sind beispielsweise Southern-Blot-, Northern-Blot-
und Dot-Blot-Hybridisierungen. Diese Verfahren sind langsam, nicht
effizient, technisch anspruchsvoll und können nicht leicht automatisiert
werden. Die Southern-Blot- und Northern-Blot-Protokolle haben den weiteren Nachteil
einer nicht effizienten Übertragung von
Nucleinsäure
vom Gel auf Papier. Andere Gruppen haben Flüssig-Fest-Hybridisierungen
verwendet, bei denen eine Fänger-Sonde
an einen festen Träger
gebunden ist und die DNA-Sequenz von Interesse in der Probe an die
Fänger-Sonde
gebunden wird. Ein Beispiel dafür
befindet sich in der Beschreibung des australischen Patents Nr.
AU-70152/87, das
die Verwendung von zwei Oligonucleotid-Sonden, die zu einander ausschließenden Regionen
derselben Ziel-Nucleinsäure
komplementär
sind, in einem flüssigen
Hybridisierungs-Format, um die Sonden an das Ziel, wenn es anwesend
ist, zu assoziieren, und das Nachweisen der Anwesenheit des Ziels
durch Immobilisierung des Zwei-Sonden-Ziel-Sandwichs
durch eine der Sonden und den nachfolgenden Nachweis der anderen
Sonde beschreibt. Dieses Verfahren erfordert jedoch eine zweite, eine
Nachweis-Sonde, um an die DNA-Sequenz von Interesse zu hybridisieren.
Dieser Schritt verringert die Spezifität des Tests und verstärkt danach
den Hintergrund. Die vorliegende Erfindung überwindet dieses Problem durch
Verwendung nur eines verlängerten
Primers, der sowohl Fänger-
als auch Nachweis-Elemente enthält.
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Im
Gegensatz zur Flüssig-Fest-Hybridisierung
besitzt die Flüssig-Flüssig-Hybridisierung eine
sehr schnelle Kinetik und eine verbesserte Empfindlichkeit wegen
des besseren Zutritts der Sonde zur Ziel-Sequenz. Gene-Probe Inc beispielsweise
verwendet ein Flüssig-Hybridisierungs-Hydroxylapatit-Verfahren
zum Nachweis oder zur Bestimmung von DNA-Sequenzen. Der Hauptnachteil dieses
Systems ist, daß es
auf adsorptiver Unterscheidung doppelsträngiger DNA-Sequenzen von einzelsträngigen DNA-Sequenzen
statt auf sequenzspezifischer Trennung von Hybriden von überschüssiger Sonde
beruht. Die vorliegende Erfindung überwindet diese Nachteile,
indem sie die Nucleinsäure-Hybridisierungen
in Lösung stattfinden
läßt, gefolgt von
der Entfernung der "Hybrid"-Moleküle auf eine
feste Träger-Matrix.
Ein weiterer potentieller Vorteil der Flüssig-Hybridisierung ist, daß ein generalisierter
fester Träger
für eine
Vielzahl von Zielen funktionieren kann, wenn die Träger-Bindungssonden
mit demselbem Einfang- oder Fänger-Molekül markiert
sind.
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Es
gibt mehrere Fälle
(australische Patentbeschreibungen Nr. AU-A-70152/87, Nr. AU-A-26755/88, Nr. AU-A-53105/86,
Nr. AU-B-89575/82
und Nr. AU-A-80097/87), die eine Kombination von zwei Oligonucleotid-Sonden
zum Nachweis spezieller Nucleinsäure-Sequenzen
in einer Probe verwenden. Sie alle erfordern die Verwendung von
zwei kurzen DNA-Sequenzen an dem Ziel. Diese Sequenzen müssen beide
bei allen möglichen
Zielen erhalten bleiben, müssen
einander ausschließen
und dürfen
einander nicht überlappen
und müssen
ein ähnliches
G+C-Verhältnis haben,
um zu ermöglichen,
daß beide
Sonden unter denselben Bedingungen an ihre komplementäre Sequenz
hybridisieren.
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Es
gibt dazu in Beziehung stehenden Stand der Technik, der die Verwendung
einer Fänger-Sonde
betrifft, um die Nucleinsäure-Sequenz
von Interesse zu bestimmen und sie aus der Lösung zu entfernen, indem das
Hybrid an eine feste Trägermatrix
gebunden wird (australische Patentbeschreibungen Nr. AU-A-70152/87, Nr.
AU-A-53105/86, Nr. AU-A-21781/88,
Nr. AU-A-69724/87, Nr. AU-A-14005/88). Diese Techniken verwenden jedoch
getrennte Fänger-
und Nachweis-Sonden, was zu einer Anzahl von Nachteilen führt, wie
sie vorstehend beschrieben sind. Die vorliegende Erfindung überwindet
diese Probleme durch Verwendung eines einzigen verlängerten
Primers, der sowohl Fänger-
als auch Nachweis-Elemente eingebaut besitzt.
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Es
gibt viele Beispiele, nichtradioaktive Reportermoleküle an DNA
zu binden, um den Nachweis spezieller Hybride zu ermöglichen.
Wenn jedoch Biotin zum Nachweis in das DNA-Molekül eingebaut wird, ist der Mechanismus
des Sichtbarmachens des eingebauten Biotins kompliziert und zeitraubend,
obwohl mehrere Biotin-Moleküle
pro Zielmo lekül
(wodurch die Nachweisempfindlichkeit erhöht wird) eingebaut werden können.
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Im
Gegensatz dazu erlaubt der Einbau oder die Inkorporierung anderer
nichtradioaktiver Reportermoleküle
(wie fluoreszierender, lumineszierender, chemilumineszierender Moleküle) einen
schnellen und einfachen Nachweis der Ziel-Sequenz. Der gegenwärtige Stand
der Technik erlaubt jedoch nur, daß ein einziges Reportermolekül an jede
Ziel-Sequenz gebunden wird. Diese Tatsache verringert die Gesamtempfindlichkeit des
endgültigen
Tests.
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Daher
gibt es einen Bedarf an einem einfachen Verfahren, das die schnelle
Kinetik von Flüssig-Hybridisierung
verwendet, das nur eine einzige Sonde zur Analyse benötigt und
das zu stabilen Hybriden führt,
wodurch es erlaubt, daß das
unhybridisierte Material leicht von den zu bestimmenden Sequenzen
entfernt werden kann. Dementsprechend liefert die vorliegende Erfindung
ein Flüssig-Hybridisierungs-System,
bei dem eine einzige Sonde an die Sequenz von Interesse hybridisiert
und dann zur Erzeugung eines stabilen Hybrids kovalent verlängert wird.
Dieses Hybrid wird dann auf einer Trägermatrix festgehalten und
nachfolgend zur Entfernung von unhybridisiertem Material gewaschen.
Das von der vorliegenden Erfindung beschriebene System ist einfach,
schnell, empfindlich, kann visuell oder auf einem einfachen Plattenleser
abgelesen werden und kann leicht automatisiert werden.
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Auf
diesem Gebiet der Nucleinsäure-Hybridisierung
gibt es die Notwendigkeit, zwei breitgefächerte Arten von Krankheiten
nachzuweisen: infektiöse
und genetische. Was infektiöse
Krankheiten betrifft, wurde eine Anzahl von Systemen auf DNA-Basis
zum Nachweis von Krankheiten, die verursacht werden von Bakterien, wie
Salmonella, Neisseria, parasitischen Organismen, wie Chlamydia und
Rickettsiae, von Viren, wie Hepatitis B und von Protozoen, wie Plasmodium,
beschrieben. All diese leiden jedoch unter einem oder mehreren der vorstehend
angegebenen Nachteile.
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Was
genetische Krankheiten betrifft, die durch eine Mutation (Deletion,
Insertion, Punktmutation oder Translokation) gekennzeichnet sind,
ist die Technologie weniger gut entwickelt. Diese Arten von Krankheiten werden
gegenwärtig
entweder durch Verwendung von Restriktionsfragment-Längen-Polymorphismus (RFLP)-Analyse
oder durch präzise
Hybridisierung kurzer Oligonucleotid-Sonden diagnostiziert. Der RFLP-Nachweis
erfordert, daß durch
die Mutation eine Restriftionsenzym-Stelle verändert ist, und das ist nicht immer
der Fall. Außerdem
erfordert die RFLP-Analyse die Verwendung der Southern-Blot-Hybridisierung
zum Nachweis. Die Verwendung kurzer Oligonucleotid-Sonden zum Nachweis
von Punktmutationen hat auch mehrere ernste Nachteile. Insbesondere
müssen
die Hybridisierungsbedingungen präzise sein, um sicherzustellen,
daß bei
der Hybridisierung nicht eine einzige Basenpaar-Fehlpaarung auftritt.
In der Praxis bestimmen die Salzkonzentration und die Temperatur
die Spezifität
der Hybridisierungsbedingungen, und diese sind nicht leicht mit
der erforderlichen Präzision
zu kontrollieren. Die vorliegende Erfindung überwindet die Notwendigkeit der
Southern-Hybridisierungs-Analyse und der präzisen Kontrolle der Hybridisierungsbedingungen.
Sie erzielt dies durch den speziellen Primer, der an einen konstanten
Abschnitt des Gens, der der Mutation benachbart ist, hybridisiert
und dem Enzym, einer DNA-Polymerase, erlaubt, die DNA-Kette bis zu und
einschließlich
der Nucleotid- oder Basen-Mutation zu verlängern. Durch Manipulierung
des bei der Polymerase-Reaktion zugegebenen Didesoxynucleotids können alle
der möglichen
Nucleotid-Veränderungen
nachgewiesen werden.
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Der
Nachweis sowohl infektiöser
als auch genetischer Krankheiten erfordert die Inkorporierung irgendeiner
Art von markiertem Molekül
in das System. Verschiedene radioaktive Isotope oder radioaktiv
markierte Verbindungen können
als Markierungen verwendet werden. Radioaktive Markierungen haben
jedoch mehrere Nachteile, wozu gehört: (i) gefährlich, (ii) teuer, (iii) begrenzte
Lagerbeständigkeit,
(iv) erfordern teure Ausrüstung
zur Messung des erzeugten Signals. In jüngerer Zeit wurde ein Bereich
nichtradioaktiver Substanzen zum Nachweis von DNA-Molekülen verwendet.
Beispiele für
nichtradioaktive Markierungen sind fluoreszierende, lumineszierende,
chemilumineszierende, enzymatische oder immunologische Verbindungen.
Es können
auch Markierungen, die auf der Affinität von Biotin und Avidin oder
Streptavidin basieren, Lanthaniden-Chelate, Lektine und Proteine
verwendet werden. Das bevorzugte Nachweismittel würde durch
Spektroskopie oder Photochemie oder durch die Bildung eines nachweisbaren
Komplexes zwischen dem Markierungsteil und dem Polypeptid, Lektin
oder einem Antikörper
sein, der an ein Gebilde gebunden ist, das in der Lage ist, eine
nachweisbare Veränderung
zu erzeugen, wozu Enzyme wie alkalische Phosphatase oder Meerrettich-Peroxidase
gehören.
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EP-A-0
297 379 beschreibt ein Verfahren zum Vervielfachen spezieller Ziel-Nucleinsäuren, das
den Gebrauch immobilisierter Primer beinhaltet. WO 89/10414 beschreibt
ein Verfahren zur Erzeugung neuer genetischer Macker und gleichzeitige
Bestimmung multipler genetischer Macker, das die Vervielfachung
einer genomischen DNA-Probe, die eine Sequenzveränderung umspannt, den Nachweis
der DNA-Sequenzveränderung
in dem vervielfachten Fragment und den Nachweis des vervielfachten
Fragments aufweist. Das US-Patent Nr. 4,851,331 beschreibt ein Sonden-Polynucleotid,
das an eine Ziel-Nucleotidsequenz in der Nucleinsäure einer
biologischen Probe bindet und dann mit einem Gemisch von Nucleosid-triphosphaten,
das mindestens ein Nucleosid-triphosphat, das nachweisbar markiert
wurde, enthält,
enzymatisch in der 3'-Richtung
verlängert wird.
WO 90/06042 beschreibt ein Verfahren zum Nachweis einer Ziel-RNA
oder -DNA in einer Analyt-Probe, das ein Inberührungbringen des Analyten mit
magnetischen Teilchen, die eine einzelsträngige 5'-gebundene DNA-Sonde, die in der Lage
ist, an die RNA oder DNA zu binden, tragen, beinhaltet.
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Was
jedoch in der gegenwärtigen
Technologie fehlt, ist ein einziges System, das umfaßt: (i)
ein schnelles Mittel zum Nachweis eines Nucleotids in einer Polynucleotid-Sequenz,
(ii) das genügend
empfindlich ist, um geringe Anzahlen des Ziel-Nucleotids in der
Probe nachzuweisen, und (iii) das nichtradioaktiv ist. Gegenwärtig werden
alle diese Erfordernisse nicht von einem einzigen System erfüllt.
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Als
ein abschließender
Aspekt erfordert die Notwendigkeit, spezielle Nucleotide in Sequenzen
in einer Probe nachzuweisen, die Organisation aller Schritte entweder:
(i) in ein einfaches Kit-Format oder (ii) in eine automatisierte
Vorrichtung. Während
sowohl Kits als auch automatisierte Maschinen zum Nachweis von Proteinen
mittels Antikörpern
verfügbar
sind, sind noch keine Systeme verfügbar, die spezielle Nucleotide
in Polynucleotid-Sequenzen in einer Probe einfach, schnell und preiswert
nachweisen.
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Aufgaben der
Erfindung
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Eine
Aufgabe ist es, Verfahren zur Bestimmung, ob sich ein spezielles
Nucleotid oder eine spezielle Base an einer bestimmten Position
in einer speziellen Polynucleotid-Sequenz befindet, bereitzustellen.
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Eine
andere Aufgabe ist es, Verfahren zur Bestimmung, ob sich dieselben
oder verschiedene spezielle Nucleotide oder Basen an bestimmten
Positionen in mindestens zwei verschiedenen speziellen Polynucleotid-Sequenzen in einem
Material mit einer Mehrzahl verschiedener Polynucleotid-Sequenzen
befinden, bereitzustellen.
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Eine
weitere Aufgabe ist es, Screening-Verfahren zur Bestimmung, ob sich
dieselben oder verschiedene spezielle Nucleotide oder Basen an bestimmten
Positionen in mindestens zwei verschiedenen speziellen Polynucleotid-Sequenzen
in einem Material mit einer Mehrzahl verschiedener Polynucleotid-Sequenzen
befinden, bereitzustellen.
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Offenbarung
der Erfindung
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Die
folgenden Abkürzungen
und Definitionen gelten in der gesamten Beschreibung und den Ansprüchen:
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- SP – spezifischer
Primer: eine Nucleotid-Sequenz, die zu einem Bereich oder Teil der
Ziel-Sequenz komplementär
ist
- Ziel – die
in der Probe nachzuweisende oder zu bestimmende Nucleotid-Sequenz;
kann beispielsweise aus irgendeinem infektiösem oder parasitären Organismus
einschließlich
irgendeines Virus-, Pilz-, Bakterien-, Mycoplasma-, Nematoden-,
Protozoen-Organismus stammen
- Polymeraseenzym – irgendeine
DNA-abhängige
DNA-Polymerase oder RNA-abhängige
DNA-Polymerase
- dNTP – alle
vier Desoxyribonucleotide, das heißt dATP, dCTP, dGTP und dTTP,
sowie dITP und dUTP
- ddNTP – alle
vier Didesoxyribonucleotide, das heißt ddATP, ddCTP, ddGTP und
ddTTP, sowie ddITP
- D – Nachweis-Molekül: ein Molekül, das kovalent
an ein Nucleotid oder eine Nucleotid-Sequenz gebunden werden kann,
und auf das nachfolgend entweder direkt oder indirekt getestet werden
kann. Beispielsweise Biotin; Radioisotope von Kohlenstoff, Wasserstoff,
Iod, Phosphor und Schwefel; irgendein Antigen; Haptene; flureszierende
Moleküle
einschließlich
Fluorescein, Rhodamin und Eosin; Enzyme einschließlich alkalische Phosphate,
Peroxidasen und Luciferase; irgendein monoklonaler Antikörper
- dNTP-D – ein
kovalent an eines der vier Desoxyribonucleotide gebundenes Nachweis-Molekül
- C – Einfang-
oder Halte-Molekül
oder Fänger-Molekül: ein Molekül, das kovalent
an ein Nucleotid oder eine Nucleotid-Sequenz gebunden werden kann
und das nachfolgend an ein Molekül
mit spezifischer Affinität
binden wird. Beispielsweise Biotin (bindet an Avidin oder Streptavidin);
Antikörper
(bindet an Antigen); Antigen (bindet an Antikörper)
- SAM – Molekül mit spezifischer
Affinität:
ein Molekül,
das spezifisch an ein bestimmtes Fänger-Molekül binden wird. Beispielsweise
Avidin oder Streptavidin; ein Antikörper, ein Antigen
- SS – fester
Träger:
irgendeine feste Matrix, an die SAM gebunden ist. Beispielsweise
Agarose; Polyacrylamid; magnetische Kügelchen; Polystyrol; Mikrotiterplatten;
Nylon, Nitrocellulose
- Waschen – Zugabe
und Entfernung einer Lösung
zum Zweck des Entfernens nicht reagierter Moleküle
- Stringenz – Salz-
und Temperatur-Bedingungen, die die Stabilität der Wasserstoffbindungen
zwischen zwei Nucleinsäure-Molekülen beeinflussen.
Beispielsweise sind die Wasserstoffbindungen am instabilsten bei
hoher Stringenz, die entweder eine hohe Temperatur oder wenig Salz
oder beides widerspiegelt.
- Test – irgendein
Verfahren, das für
den Nachweis des Nachweis-Moleküls
spezifisch ist und entweder qualitativ oder quantitativ gemessen
werden kann
- X – irgendeines
der vier Desoxyribonucleotide
- Y – irgendeines
der vier Ribonucleotide oder Desoxyribonucleotide; in dem Beispiel
wird Y Wasserstoffbindungen mit X ausbilden, d. h. eine Nucleotid-Sequenz
von neun Y's wird
zu einer Nucleotid-Sequenz von neun X's komplementär sein
- Z – irgendeines
der vier Nucleotide, das eine zu der Sequenz nicht komplementäre Sequenz
ausbildet
- ddT – Didesoxythymidin-5'-triphospat: ddT
wurde als Beispiel verwendet, da es mit A in der Ziel-Sequenz eine Basenpaarung
bildet. Wenn die nachzuweisende Base C wäre, würde ddG verwendet werden, G
mit ddC und T mit ddA.
- ddT-C – Didesoxythymidin-5'-triphosphat/Fängermolekül-Komplex:
ddT wurde als Beispiel verwendet, da es mit A in der Ziel-Sequenz
eine Basenpaarung bildet. Wenn die nachzuweisende Base C wäre, würde ddG
verwendet werden, G mit ddC und T mit ddA. Das Fänger-Molekül ist kovalent an ddT gebunden
und stellt irgendeines der vorstehend beschriebenen Fängermoleküle dar.
- direkt angrenzend – bedeutet,
daß zwischen
einem an einen Teil einer speziellen Polynucleotid-Sequenz gebundenen
Primer und einem speziellen nachzuweisenden Nucleotid oder einer
speziellen nachzuweisenden Base keine Nucleotide oder Basen sind
- Fraktion – bedeutet
mindestens einen Teil eines Gemisches, das sich aus der Reaktion
eines Oligonucleotid-Primers oder von Oligonucleotid-Primern, Extensionsreagenzien,
(einer) speziellen Polynucleotid-Sequenz(en), (einem) nachweisbaren
Elementen) und/oder Trenn-Elementen
ergibt.
- intervenierende Sequenz – bedeutet
mindestens ein Nucleotid oder eine Base zwischen einem an einen
Teil einer speziellen Polynucleotid-Sequenz gebundenen Primer und
einem speziellen Nucleotid oder einer speziellen Base, das oder
die zu bestimmen ist
- Oligonucleotid-Primer – ein
einzelsträngiges
Nucleinsäure-Molekül mit einer
typischen Länge
von 5 bis 60 Nucleotiden, das aber 200 oder mehr Nucleotide haben
kann, das eine zu einem Teil der nachzuweisenden oder zu bestimmenden
Polynucleotid-Sequenz komplementäre
Sequenz hat
- spezifische oder spezielle Polynucleotid-Sequenz – eine teilweise
oder vollständig
bekannte Sequenz von Nucleotiden
- Hybridisierung – die
physische Assoziierung oder Verknüpfung des Oligonucleotid-Primers
mit dem komplementären
Bereich der Ziel-Polynucleotid-Sequenz unter Ausbildung eines doppelsträngigen Hybrid-Nucleinsäure-Moleküls
-
Ein
störendes
nachweisbares Element und/oder Trenn-Element ist beispielsweise
eines, das dasselbe ist wie dasjenige, das an der Position inkorporiert
ist, die zu dem nachzuweisenden speziellen Nucleotid oder der nachzuweisenden
speziellen Base komplementär
ist, z. B.:
-
- (A) Man betrachte ein einzelnes Nucleotid oder
eine einzelne Base N1, das oder die in einer
speziellen Polynucleotid-Sequenz S1 nachzuweisen
ist. Man nehme an, es gibt einen gebundenen Oligonucleotid-Primer P1 mit einer zu einem Teil von S1 komplementären Sequenz,
und der an S1 gebunden ist. Man nehme an, daß es zwischen
P1 und N1 intervenierende
Nucleotide NA, NB und
NC gibt. Verlängere P1 bis
zu und einschließlich
von N, mit zu NA, NB,
NC und N1 komplementären Nucleotiden,
nämlich
ND, NE, NF beziehungsweise N2 – S1 (S1 entspricht
einem Trenn-Element); dann sind die folgenden Bedingungen erforderlich:
NA, NB oder NC können
nicht N1 sein.
- (B) Man betrachte zwei Nucleotide oder Basen N1 und
N2, die in zwei verschiedenen speziellen
Polynucleotid-Sequenzen S1 und S2 nachzuweisen sind. Man nehme an, daß es zwei
verschiedene Oligonucleotid-Primer P1 und
P2 (an S1 bzw. S2 gebunden) gibt, die eine zu einem Teil
von S1 und S2 komplementäre Sequenz
haben.
Man nehme an, daß es
intervenierende Nucleotide NA, NB und NC zwischen
P1 und N1, und intervenierende Nucleotide
NX, NY und NZ zwischen P2 und
N2 gibt. Man verlängere (a) P1 bis
zu und einschließlich
N1 mit zu NA, NB, NC und N1 komplementären Nucleotiden, nämlich ND, NE, NF beziehungsweise
N1 – D1 (D1 entspricht
einem nachweisbaren Element); und (b) P2 bis
zu und einschließlich
N2 mit zu NX, NY, NZ und N2 komplementären Nucleotiden, nämlich NO, NP, NQ und
N4 – D2 (D2 entspricht
einem anderen nachweisbaren Element); dann sind die folgenden Bedingungen
erforderlich:
-
Wenn
N1 = N2 und D1 = D2
-
-
Wenn
N1 ungleich N2 ist,
D1 = D2
-
-
Wenn
N1 nicht gleich N2 ist,
D1 nicht gleich D2 ist,
-
-
Erfindungsgemäß wird ein
Verfahren bereitgestellt zur Bestimmung, ob sich ein spezielles
Nucleotid oder eine spezielle Base an einer bestimmten Position
in einer speziellen Polynucleotid-Sequenz in einem Material befindet,
aufweisend:
- a) Aussetzen des Materials, unter
hybridisierenden Bedingungen, einem Oligonucleotid-Primer mit einer
zu einem Teil der speziellen Polynucleotid-Sequenz komplementären Sequenz,
wobei der Primer an seinem 5'-Ende
ein Trennelement oder ein nachweisbares Element beinhaltet, und
wobei der Primer an einen Teil der speziellen Polynucleotid-Sequenz
in dem Material (i) direkt angrenzend an die bestimmte Position
bindet oder (ii) nicht direkt angrenzend an die bestimmte Position
bindet, wodurch es eine intervenierende Sequenz zwischen der bestimmten
Position und an die spezielle Polynucleotid-Sequenz gebundenem Primer gibt;
- b) Verlängern
von an die spezielle Polynucleotid-Sequenz gebundenem Primer mit
der Maßgabe,
daß der gebundene
Primer nur bis zu und einschließlich
des speziellen Nucleotids oder der speziellen Base verlängert wird,
wenn sich das spezielle Nucleotid oder die spezielle Base an der
bestimmten Position in der speziellen Polynucleotid-Sequenz befindet,
wobei der verlängerte
Primer ein nachweisbares Element und/oder ein Trenn-Element an einer
zu dem speziellen Nucleotid- oder der speziellen Base komplementären Position
besitzt, mit der Maßgabe,
daß der
verlängerte
Primer mindestens ein Trenn-Element und mindestens ein nachweisbares
Element besitzt und, wenn es eine intervenierende Sequenz zwischen
der bestimmten Position und an die spezielle Polynucleotid-Sequenz
gebundenem Primer gibt, mit der weiteren Maßgabe, daß die intervenierende Sequenz
keine sein kann, bei der Basen oder Nucleotide, die zu der intervenierenden
Sequenz komplementär
sind und die in den verlängerten
Primer inkorporiert werden, ein Inkorporieren eines störenden nachweisbaren
und/oder Trenn-Elements verursachen;
- c) Abtrennen von irgendwelchem verlängerten Primer in eine Fraktion,
wobei die Fraktion kein nicht in dem verlängerten Primer enthaltenes
nachweisbares Element besitzt, mit der Maßgabe, daß das Abtrennen nicht den Schritt
des Verdaus der speziellen Polynucleotid-Sequenz mit dem daran gebundenen verlängerten
Primer beinhaltet; und
- d) Bestimmen, ob der verlängerte
Primer in der Fraktion anwesend ist, durch Untersuchen der Fraktion
auf den verlängerten
Primer, wobei die Anwesenheit des verlängerten Primers anzeigt, daß sich das
spezielle Nucleotid oder die spezielle Base an der bestimmten Position
in der speziellen Polynucleotid-Sequenz befindet, und das Fehlen
des verlängerten
Primers anzeigt, daß sich
das spezielle Nucleotid oder die spezielle Base nicht an der bestimmten
Position in der speziellen Polynucleotid-Sequenz befindet;
bei
dem das Verlängern
die Verwendung von mindestens einem Didesoxynucleotid umfaßt, wobei
das Didesoxynucleotid zu dem speziellen Nucleotid oder der speziellen
Base komplementär
ist.
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Die
Erfindung stellt auch ein Verfahren bereit zur Bestimmung, ob sich
an bestimmten Positionen in mindestens zwei verschiedenen speziellen
Polynucleotid-Sequenzen in einem Material mit einer Mehrzahl verschiedener
Polynucleotid-Sequenzen dieselben oder verschiedene spezielle Nucleotide
oder Basen befinden, aufweisend:
- a) Aussetzen,
unter hybridisierenden Bedingungen, des Materials mindestens zwei
verschiedenen Oligonucleotid-Primern, wobei jeder der verschiedenen
Oligonucleotid-Primer eine zu einem Teil einer der verschiedenen
Polynucleotid-Sequenzen komplementäre Sequenz hat, wobei:
jeder
der Primer an seine komplementäre
Polynucleotid-Sequenz
bindet, wenn sie in dem Material vorhanden ist, wobei jeder der
Oligonucleotid-Primer an einen Teil einer von derjenigen des (der)
anderen Primer(s) verschiedenen speziellen Polynucleotid-Sequenz
bindet,
jeder der Primer an seine komplementäre spezielle
Polynucleotid-Sequenz in dem Material (i) direkt angrenzend an die
bestimmte Position bindet oder (ii) nicht direkt angrenzend an die
bestimmte Position bindet, wodurch es eine intervenierende Sequenz
zwischen der bestimmten Position und an die spezielle Polynucleotid-Sequenz,
wenn sie in dem Material vorhanden ist, gebundenem Primer gibt,
und
jeder der Primer ein Trenn-Element oder ein nachweisbares
Element an seinem 5'-Ende
beinhaltet;
- b) Verlängern
der verschiedenen, an ihre komplementären Polynucleotid-Sequenzen
gebundenen Oligonucleotid-Primer mit der Maßgabe, daß jeder der gebundenen Primer
nur bis zu und einschließlich
der bestimmten Position verlängert
wird, wenn sich das spezielle Nucleotid oder die spezielle Base
an der bestimmten Position in der speziellen Nucleotid-Sequenz befindet,
wobei jeder der verlängerten
Primer ein nachweisbares Element und/oder ein Trennelement an einer
zu dem speziellen Nucleotid oder der speziellen Base komplementären Position
besitzt, mit der weiteren Maßgabe,
daß jeder
der verlängerten
Primer mindestens ein Trenn-Element und mindestens ein nachweisbares
Element besitzt und, wenn es intervenierende Sequenzen zwischen
den bestimmten Positionen und an die speziellen Polynucleotid-Sequenzen gebundenen
Primern gibt, mit der weiteren Maßgabe, daß die intervenierenden Sequenzen
keine sein können,
bei denen Basen oder Nucleotide, die zu den intervenierenden Sequenzen
komplementär
sind und die in den (die) verlängerten
Primer inkorporiert werden, ein Inkorporieren eines störenden nachweisbaren und/oder
Trenn-Elements oder von störenden
nachweisbaren und/oder Trenn-Elementen verursachen;
- c) Abtrennen von irgendwelchem (irgendwelchen) verlängerten
Primer(n), der (die) nur bis zu einem speziellen Nucleotid oder
einer speziellen Base in einer bestimmten Position verlängert wurde(n),
in mindestens eine Fraktion, wobei die Fraktion kein nicht in dem
verlängerten
Primer enthaltenes nachweisbares Element besitzt, mit der Maßgabe, daß das Abtrennen
nicht den Schritt des Verdaus der speziellen Polynucleotid-Sequenz
mit dem daran gebundenen Primer enthält; und
- d) Bestimmen, ob irgendwelche der verlängerten Primer in der (den)
Fraktionen) anwesend sind, durch Untersuchen der Fraktionen) auf
den (die) verlängerten
Primer, wobei die Anwesenheit eines verlängerten Primers anzeigt, daß sich ein
spezielles Nucleotid oder eine spezielle Base an einer bestimmten
Position in einer speziellen Polynucleotid-Sequenz befindet, und
das Fehlen des (der) verlängerten
Primer(s) in der (den) Fraktionen) anzeigt, daß sich mindestens ein spezielles
Nucleotid oder eine spezielle Base nicht an einer bestimmten Position
in mindestens einer der verschiedenen speziellen Polynucleotid-Sequenzen
befindet;
wobei das Verlängern die Verwendung von mindestens
einem Didesoxynucleotid umfaßt,
wobei das Didesoxynucleotid zu dem speziellen Nucleotid oder der
speziellen Base komplementär
ist.
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Die
Erfindung stellt auch ein dem vorstehenden Verfahren ähnliches
Screening-Verfahren bereit zur Bestimmung, ob sich dieselben oder
verschiedene spezielle Nucleotide oder Basen an bestimmten Positionen in
mindestens zwei verschiedenen speziellen Polynucleotid-Sequenzen
in einem Material mit einer Mehrzahl verschiedener Polynucleotid-Sequenzen
befinden.
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Im
wesentlichen verwendet das Verfahren:
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- einen Nucleinsäure-Primer,
der für
einen Teil einer teilweise oder vollständig bekannten Nucleotid-Sequenz, die
an das zu bestimmende Nucleotid oder die zu bestimmende Base direkt
angrenzt, spezifisch ist oder für einen
Teil einer teilweise oder vollständig
bekannten Nucleotid-Sequenz,
die an das zu bestimmende Nucleotid oder die zu bestimmende Base
nicht direkt angrenzend ist, sondern eine intervenierende Sequenz zwischen dem
gebundenen Primer und dem zu bestimmenden Nucleotid oder der zu
bestimmenden Base hat, spezifisch ist;
- Extension des Primers, katalysiert durch ein Nucleinsäure-Polymerase-Enzym;
- entweder (i) die Bindung eines Einfang-Moleküls am 5'-Ende des spezifischen Primers, Zugabe
der Ziel-Sequenz unter Hybridisierungs-Bedingungen und Einbau eines
Nachweis-Moleküls
oder von Nachweis-Molekülen
in den enzymkatalysierten verlängerten
Primer oder (ii) Bindung eines Nachweis-Moleküls an das 5'-Ende des spezifischen Primers, Zugabe
der Ziel-Sequenz unter Hybridisierungs-Bedingungen und Einbau eines
Einfang-Moleküls
oder von Einfang-Molekülen
in den enzymkatalysierten verlängerten
Primer;
- Einfangen oder Festhalten des verlängerten Primers unter Verwendung
eines an einem festen Träger
befestigten Moleküls
mit spezifischer Affinität;
und
- Test auf das Nachweis-Molekül.
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Vorteilhafterweise
umfaßt
das Verlängern
des Primers die Verwendung vier verschiedener Nucleotide, die ausgewählt sind
aus der Gruppe, die besteht aus dATP, dCTP, dGTP, dTTP, dUTP, dITP,
ddATP, ddCTP, ddGTP, ddITP und ddTTP, wobei mindestens eines der
Nucleotide ausgewählt
ist aus der Gruppe, die besteht aus ddATP, ddCTP, ddGTP, ddITP und
ddTTP, wobei die Nucleotide ein nachweisbares Element und/oder ein Trenn-Element
beinhalten.
-
Das
Verlängern
kann die Verwendung eines Nucleotids, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die
besteht aus ddITP, ddATP, ddCTP, ddGTP und ddTTP, aufweisen, wobei
das Nucleotid ein nachweisbares Element und/oder ein Trenn-Element
beinhaltet.
-
Zusätzlich zu
dem Nucleotid oder den Nucleotiden werden beim Verlängern des
Primers auch typischerweise mindestens ein geeignetes Polymerase-Enzym
und ein geeignetes Puffer-Mittel verwendet.
-
Beispiele
für Polymerase-Enzyme
sind E.coli DNA-Polymerase, E.coli DNA-Polymerase (Klenow-Fragment),
Bakteriophage T7- und DNA-Polymerase,
Bakteriophage T4 DNA-Polymerase, Taq DNA-Polymerase und AMV-reverse
Transkriptase.
-
Puffer-Mittel,
die wässrige
Lösungen
zwischen pH 6 bis 8,5 puffern, sind im allgemeinen geeignet zur Verwendung
mit einem Polymerase-Enzym
zur Verlängerung
des Primers. Im allgemeinen wird ein Magnesiumsalz (z. B. MgCl2 oder MgSO4 dem
Puffer-Mittel beigegeben. Eine Gesamtsalzkonzentration zwischen
50 und 300 mM ist im allgemeinen annehmbar.
-
Die
Temperatur der Extensions-Reaktion wird je nach verwendetem Polymerase-Enzym
gewählt
und liegt typischerweise in dem Bereich von 25 bis 80° C, besonders
typisch 30 bis 70° C.
-
Es
ist bevorzugt, daß mindestens
eines der Nucleotide das nachweisbare Element aufweist.
-
Alternativ
oder zusätzlich
ist das nachweisbare Element an den Oligonucleotid-Primer gebunden.
-
Typischerweise
ist das nachweisbare Element ein radioaktives Markierungselement,
das ausgewählt ist
aus der Gruppe, die besteht aus 3H, 125I, 131I, 14C, 35S und 32P.
-
Das
nachweisbare Element kann nicht radioaktiv sein und wird im allgemeinen
ausgewählt
aus der Gruppe, die besteht aus einer enzymatischen Gruppe, einer
immunologischen Gruppe und einer spektroskopisch nachweisbaren Gruppe.
Die spektroskopisch nachweisbare Gruppe kann eine lumineszierende
Gruppe, eine chemilumineszierende Gruppe, eine durch NMR nachweisbare
Gruppe, eine fluoreszierende Gruppe oder eine durch IR nachweisbare
Gruppe sein.
-
Im
allgemeinen ist die spezielle Polynucleotid-Sequenz eine DNA-Sequenz
oder eine RNA-Sequenz.
-
Die
spezielle Polynucleotid-Sequenz kann aus einem infektiösen oder
Krankheit verursachenden Organismus stammen, der ein lebender oder
nicht lebensfähiger
viraler, bakterieller, Pilz- oder Protozoen-Organismus sein kann.
-
Die
Extension kann umfassen:
-
- Zugabe einer Mehrzahl von Nucleotid-Arten zu dem an die
Polynucleotid-Sequenz gebundenen Primer, um den Primer zu verlängern; oder
- Zugabe einer einzigen Nucleotid-Art zu dem an die Polynucleotid-Sequenz gebundenen
Primer, um den Primer zu verlängern;
oder
- Zugabe mindestens einer einzigen Nucleotid-Art zu dem an die
Polynucleotid-Sequenz gebundenen Primer, um den Primer zu verlängern.
-
In
einer Ausführungsform
dieser Erfindung ist das Trenn-Element mit dem Oligonucleotid-Primer
verbunden. Alternativ beinhaltet der verlängerte Primer ein Trenn-Element,
das die Abtrennung des verlängerten Primers
aus dem Gemisch erleichtert und bei dem mindestens eines der Nucleotide
das Trenn-Element besitzt.
-
In
einer Ausführungsform
der Erfindung umfaßt
der Trennschritt:
Inberührungbringen
von irgendwelchem verlängerten
Primer mit einem Molekül,
das Affinität
zu dem Trenn-Element besitzt, wobei das Molekül mit einem Träger verbunden
ist, was die Abtrennung erleichtert; und Abtrennung des (der) in
Berührung
gebrachten verlängerten
Primer(s), um die Fraktion zu liefern.
-
Vorteilhafterweise
werden das Trenn-Element und das Molekül aus der direkt nachstehend
aufgelisteten Gruppe ausgewählt:
Trenn-Element | Molekül mit Affinität für das Trenn-Element |
a)
ein Ligand, für
den es einen Rezeptor gibt | einen
Rezeptor für
den Liganden; |
b)
ein Rezeptor | der
Ligand für
den Rezeptor |
c)
ein Antigen | ein
Antikörper
für das
Antigen |
d)
ein Antikörper
für ein
Antigen | das
Antigen; |
e)
ein anti-idiotyper Antikörper | ein
Antikörper
für den
anti-idiotypen Antikörper; |
f)
ein Antikörper
für einen
antiidiotypen Antikörper | ein
anti-idiotyper Antikörper
für den
Antikörper; |
g)
eine Hapten-Gruppe | ein
Antikörper
für die
Hapten-Gruppe; |
h)
ein Antikörper
für eine
HaptenGruppe | die
Hapten-Gruppe; |
i)
ein Enzym | ein
Bindungs-Hemmer für
das Enzym; und |
j)
ein Bindungs-Hemmer für
ein Enzym | das
Enzym. |
-
Typischerweise
werden das Trenn-Element und das Molekül aus der nachstehend aufgelisteten
Gruppe ausgewählt:
Trenn-Element | Molekül mit Affinität für das Trenn-Element |
a)
ein Ligand, für
den es einen spezifischen Rezeptor gibt | ein
spezifischer Rezeptor für
den Liganden; |
b)
ein spezifischer Rezeptor | der
Ligand für
den spezifischen Rezeptor; |
c)
ein Antigen | ein
spezifischer Antikörper
für das
Antigen; |
d)
ein spezifischer Antikörper
für ein
Antigen | das
Antigen; |
e)
ein anti-idiotyper Antikörper | ein
spezifischer Antikörper
für den
anti-idiotypen Antikörper; |
f)
ein Antikörper
für einen
antiidiotypen Antikörper | ein
für den
Antikörper
spezifischer anti-idiotyper Antikörper; |
g)
eine Hapten-Gruppe | ein
spezifischer Antikörper
für die
Hapten-Gruppe; |
h)
ein spezifischer Antikörper
für eine
Hapten-Gruppe | die
Hapten-Gruppe; |
i)
ein Enzym | ein
fest bindender Inhibitor für
das Enzym; und |
j)
ein fest bindender Inhibitor für
ein Enzym | das
Enzym. |
-
Typische
Beispiele für
Liganden, für
die Rezeptoren verfügbar
sind, sind:
ein Vitamin wie Biotin, ein Zucker-Molekül wie Glukose
oder Mannose, ein Hormon wie Adrenalin oder Cortison und ein Steroid
wie Progesteron oder Testosteron. Es gibt zahlreiche Arten von Liganden,
die verfügbare
Rezeptoren haben, und die vorstehende Liste ist nur zur Erläuterung
angegeben.
-
Die
Trennung beinhaltet typischerweise einen festen Träger, der
typischerweise ausgewählt
ist aus der Gruppe, die besteht aus Latex, Magnetkügelchen,
Nitrocellulose, Agarose, Cellulose, Polyacrylamid, Nylon, Glas und
Polystyrol.
-
Vorteile
-
1. Allgemeine Vorteile
-
Ein
besonderer Vorteil des Verfahrens der Erfindung ist, daß das System
Trenn- und Nachweis-Elemente auf dem einen Oligonucleotid nach Primer-Extension
vereinigt. Die meisten anderen Systeme erfordern die Verwendung
einer Einfang-Sonde und einer Nachweis-Sonde.
-
Ein
weiterer Vorteil ist, daß das
System zum Einbau eines Trenn- oder
Nachweis-Elements oder von Trenn-oder Nachweis-Elementen (abhängig von
der Konfiguration) von der Enzym-getriebenen Extension des Primers
abhängt,
und daher wird das Element oder werden die Elemente kovalent an
den speziellen Primer gebunden. Wegen dieser kovalenten Anbindung
können
die Wasch-Schritte bei sehr hoher Stringenz durchgeführt werden,
was zu verringertem Hintergrund und erhöhter Spezifizität führt.
-
Ein
weiterer Vorteil ist, daß das
Verfahren der Erfindung leicht automatisiert werden kann.
-
Bei
dem Verfahren der Erfindung können
die Schritte in ein einfaches Kit-Format inkorporiert werden.
-
Ein
weiterer Vorteil ist, daß ein
Oligonucleotid-Primer verwendet werden kann, der eine zu einem beibehaltenen
oder variablen Bereich des Genoms des Organismus von Interesse komplementäre Sequenz
hat, und daher für
hohe oder geringe Spezifizität
(d. h. gattungsspezifisch, artspezifisch oder stammspezifisch) ausgelegt
werden kann. Die Erfindung schafft ein schnelles und empfindliches
Verfahren zum Nachweis spezieller Nucleotid-Änderungen in speziellen Polynucleotid-Sequenzen
unter Verwendung einer einzigen Oligonucleotid-Sonde.
-
Allgemein
wird bei dem Verfahren der Erfindung das nachweisbare Hybrid von
einer festen Matrix festgehalten, um das Wegwaschen von nicht eingebautem
nachweisbarem Element zu erlauben. Dies ist zwar kein schwieriger
Schritt, aber er trägt
zur für
das Verfahren erforderlichen Zeit bei. Der Schritt kann umgangen werden
durch Wahl eines nachweisbaren Elements, wodurch irgendwelches nicht
eingebautes nachweisbares Element einfach inaktiviert und in dem Reaktionsgemisch
gelassen werden kann, statt daß es
phyisch entfernt werden muß.
-
Im
allgemeinen ist eine Nachweis-Empfindlichkeit in der Größenordnung
von 103 bis 104 Genom-Kopien
recht passend zum Nachweis eines breiten Bereichs von Virus-, Bakterien-
und parasitären
Organismen, die in ihren jeweiligen Krankheitsstadien üblicherweise
in mäßigen bis
hohen Anzahlen vorhanden sind. Für Defekt-Krankheiten,
bei denen das infektiöse
Mittel nur in sehr geringen Anzahlen anwesend ist (z. B. HIV), kann
das Verfahren der Erfindung von der Technik der Polymerase-Kettenreaktion
(PCA) Gebrauch machen, die effektiv ein Vervielfachungsschritt ist,
der zu einer Erhöhung
der Empfindlichkeit führt.
-
2. Vorteile
bei der Diagnose infektiöser
Krankheiten
-
Das
Verfahren der Erfindung erlaubt die schnelle, einfache und ungefährliche
Bestimmung spezieller Nucleotide in speziellen Polynucleotid-Sequenzen
in Proben von biologischem Material, insbesondere infektiösen Krankheitserregern.
Die Sequenz kann ein Teil eines infektiösen Organismus sein, wie einem
Virus-, Bakterien-, Protozoen- oder Pilz-Organismus, oder Teil eines
Gens sein, bei dem eine Abnormalität zu einer genetischen Störung führt: beispielsweise
Sichelzellen-Anämie,
zystische Fibrose,α-Thalassämie oder β-Thalassämie.
-
Nicht
lebensfähige
Organismen können
unter Verwendung des Verfahrens der Erfindung nachgewiesen werden.
-
Ein
weiterer Vorteil ist, daß das
Verfahren ein Gemisch von Oligonucleotid-Primern zur Bestimmung einer
Reihe von Erregern, die verdächtigt
werden, einen breitgefächerten
Bereich von Krankheitszuständen
zu verursachen (z. B. Pneumonia, Mykoplasma, Chlamydia, Streptokokkus,
Legionella, RSV), verwenden kann.
-
3. Vorteile
bei der Diagnose genetischer Krankheiten
-
Das
Verfahren kann verwendet werden zum schnellen Nachweis einer veränderten
Nucleotid-Base (Punktmutation) und zum Nachweis der Insertion oder
Deletion eines Nucleotids oder mehrerer Nucleotide in einer Polynucleotid-Sequenz.
In diesem Fall muß die
genetische Veränderung
auf der DNA-Sequenz-Stufe bekannt sein und charakterisiert werden.
-
Der
Nachweis einer einzigen Basenveränderung
oder mehrerer Basenveränderungen
kann automatisiert werden.
-
Das
Verfahren kann zum Screening oder Absuchen auf einzelne (oder mehrere)
Nucleotid-Veränderungen
im großen
Maßstab
angepaßt
werden. Dies ist insbesondere wichtig beim Absuchen auf genetische Krankheiten
wie zystische Fibrose, kann aber auch geeignet sein für die Unterscheidung
von Allelen, die nicht notwendigerweise bei der Gen-Expression beteiligt
sind, wie sie zur DNA-Profilierung
verwendet werden.
-
Dieses
besondere Verfahren beinhaltet keine Fest-Flüssig-Hybridisierung, keine
präzisen
Flüssig-Hybridisierungs-Bedingungen,
und ist nicht technisch anspruchsvoll. Andere Systeme, wie Southern-Blot-Hybridisierung,
erfordern, daß die
Ziel-Polynucleotid-Sequenz an einen festen Träger gebunden wird (technisch
anspruchsvoll) und/oder erfordern die Verwendung von Oligonucleotid-Sonden,
die präzise
Hybridisierungs-Bedingungen verlangen. Diese Systeme können nicht
automatisiert werden und können
nicht leicht für
Screening in großem
Maßstab
angepaßt
werden.
-
Kurze Beschreibung
der Zeichungen
-
Bevorzugte
Ausführungsformen
der Erfindung werden nun unter Bezugnahme auf die folgenden Zeichnungen
beschrieben, in denen:
-
1 eine schematische Zeichnung
eines Verfahrens zur Bestimmung einer speziellen Polynucleotid-Sequenz
ist;
-
2a eine schematische Zeichnung
eines Verfahrens zur Bestimmung einer speziellen Polynucleotid-Sequenz
unter Verwendung eines Trenn-Elements, das sich mit dem Oligonucleotid-Primer-Teil
eines verlängerten
Primers verbindet, ist;
-
2b eine schematische Zeichnung
eines Verfahrens zur Bestimmung einer speziellen Polynucleotid-Sequenz
unter Verwendung eines Trenn-Elements, das sich mit dem verlängerten
Teil eines verlängerten Primers
verbindet, ist;
-
3a eine schematische Zeichnung
eines erfindungsgemäßen Verfahrens
zur Bestimmung einer Nucleotid- oder Basen-Veränderung
unter Verwendung eines Trenn-Elements, das sich mit dem Oligonucleotid-Primer-Teil
eines verlängerten
Primers verbindet, ist;
-
3b eine schematische Zeichnung
eines erfindungsgemäßen Verfahrens
zur Bestimmung einer Nucleotid- oder Basen-Veränderung
unter Verwendung eines Trenn-Elements, das sich mit dem verlängertem Teil
eines verlängerten
Primers verbindet, ist;
-
3c eine schematische Zeichnung
eines Verfahrens zur Bestimmung einer Nucleotid- oder Basen-Veränderung
unter Verwendung eines nachweisbaren Elements, das mit dem verlängerten
Teil eines verlängerten
Primers verbunden ist, ist;
-
4 ein Autoradiogramm zeigt,
das zur Feststellung der Größe des in
dem dritten Beispiel hergestellten verlängerten Oligonucleotids verwendet
wurde; und
-
5 eine schematische Darstellung
einer Vorrichtung zur Durchführung
irgendeines der erfindungsgemäßen Verfahren
ist.
-
Beste Art und andere Arten
zur Durchführung
der Erfindung
-
Es
gibt zwei besonders bevorzugte Anwendungen der erfindungsgemäßen Verfahren,
das heißt
(i) der Nachweis oder die Bestimmung einer Nucleotid- oder Basen-Änderung
(Hauptanwendungen: genetische Krankheiten und DNA-Fingerprinting)
und (ii) Nachweis oder Bestimmung mehrfacher Nucleotid- oder Basen-Änderungen
in verschiedenen Polynucleotid-Sequenzen (Hauptanwendungen: genetische
Mehrfach-Erkrankungen und DNA-Fingerprinting). Eine einzige Vorrichtung
(mit geringen Veränderungen)
ist zur Verwendung bei beiden Anwendungen geeignet.
-
1. Bestimmung einer Nucleotid-
oder Basen-Veränderung
-
Dieses
Verfahren beinhaltet die folgenden Schritte:
-
- – die
Synthese eines spezifischen Primers, der zu einem Teil einer bekannten
oder teilweise bekannten Nucleinsäure-Sequenz, dem Ziel, komplementär ist. Die
spezifische Primer-Sequenz
ist komplementär
zu der Ziel-Sequenz, die entweder an das zu bestimmende einzelne
Nucleotid oder die zu bestimmende einzelne Base direkt angrenzt,
es oder sie aber nicht einschließt, oder an das zu bestimmende
einzelne Nucleotid oder die zu bestimmende einzelne Base nicht direkt
angrenzt, son dern zwischen dem gebundenen Primer und dem zu bestimmenden
Nucleotid oder der zu bestimmenden Base eine intervenierende Sequenz
besitzt.
- – die
Anbringung eines Halte- (Konfiguration A 3a) oder Nachweis- (Konfiguration B 3b) Moleküls an dem
5'-Ende des spezifischen
Primers.
- – die
Zugabe zu der Lösung
nur eines Typs Didesoxyribonucleotid (oder Desoxyribonucleotid),
das heißt desjenigen,
der mit der zu bestimmenden Base oder dem zu bestimmenden Nucleotid
in der Ziel-Sequenz ein Paar bilden oder eine Wasserstoffbindung
ausbilden kann, und entweder einer DNA-abhängigen DNA-Polymerase (wenn
das Ziel DNA ist) oder einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase
(wenn das Ziel RNA ist) unter Bedingungen, die für die enzymatische Extension
des spezifischen Primers geeignet sind. Das Didesoxyribonucleotid
(oder Desoxyribonucleotid) hat ein kovalent an es gebundenes Nachweis-Molekül (Konfiguration
A) oder Einfang- oder Halte-Molekül (Konfiguration
B).
- – Das
Polymerase-Enzym verlängert
den Primer unter Verwendung der Ziel-Nucleinsäure als eine Matrize, wobei
nur ein Molekül
des Didesoxyribonucleotids (oder Desoxyribonucleotids) angefügt wird,
wenn Basenpaarung möglich
ist. Der spezifische Primer wird nicht verlängert, wenn eine Basenpaarung
zwischen dem Didesoxyribonucleotid (oder Desoxyribonucleotid) und
der Ziel-Sequenz nicht möglich
ist.
- – Die
Reaktion kann hitzedenaturiert werden, und der Zyklus kann wiederholt
werden, um die Menge an verlängertem
spezifischen Primer zu vervielfachen.
- – Für Konfiguration
A wird das Molekül
mit spezifischer Affinität
(an einen festen Träger
gebunden) unter Bedingungen, die der Bindung des Halte-Moleküls an das
Molekül
mit spezifischer Affinität
förderlich
sind, zu der Lösung
zugegeben.
- – Für Konfiguration
B wird der verlängerte
spezifische Primer mit Ethanol gefällt, zur Entfernung von nicht inkorporiertem
Didesoxyribonucleotid-Haltemolekül-Komplex
(oder Desoxyribonucleotid-Haltemolekül-Komplex) gewaschen. Nach
dem Waschen wird der verlängerte
spezifische Primer in einer Lösung,
die der Bindung des Haltemoleküls
an das Molekül
mit spezifischer Affinität
förderlich
ist, erneut suspendiert. Dann wird das Molekül mit spezifischer Affinität (an einen
festen Träger
gebunden) zugegeben.
- – Für Konfigurationen
A und B wird, sobald der verlängerte
spezifische Primer über
das Haltemolekül
an den Komplex aus Molekül
mit spezifischer Affinität
und festem Träger
gebunden ist, das Gemisch extensiv unter Bedingungen hoher Stringenz
gewaschen.
- – Für Konfiguration
A und B wird am Schluß des
Wasch-Schritts das Gemisch unter Verwendung eines Verfahrens, das
zum Nachweis des Nachweis-Moleküls
geeignet ist, untersucht.
-
2. Bestimmung multipler
Nucleotid- oder Basen-Änderungen
in verschiedenen Polynucleotid-Sequenzen, d. h. multipler genetischer
Defekte oder Krankheiten oder genetisches Fingerprinting
-
Dieses
Verfahren beinhaltet die folgenden Schritte:
-
- – die
Synthese mehrerer verschiedener spezifischer Primer, von denen jeder
zu einer verschiedenen bekannten Nucleinsäure-Sequenz, den Zielen, komplementär ist. Die
verschiedenen spezifischen Primer-Sequenzen sind komplementär zu ihren
jeweiligen verschiedenen Ziel-Sequenzen, die an die nachzuweisende
einzelne Base direkt angrenzen.
- – die
Anbringung verschiedener Halte-Moleküle an dem 5'-Ende der verschiedenen spezifischen
Primer.
- – die
Hybridisierung, in Lösung,
dieser verschiedenen spezifischen Primer an ihre jeweiligen verschiedenen Ziel-Nucleinsäure-Sequenzen.
- – die
Zugabe der Lösung
aller vier Typen von Didesoxyribonucleotiden (z. B. ddATP, ddCTP,
ddGTP, ddTTP) und entweder einer DNA-abhängigen DNA-Polymerase (wenn
alle Ziele DNA sind) oder einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase (wenn
alle Ziele RNA sind) oder von beiden (wenn die Ziele ein Gemisch
aus sowohl DNA als auch RNA sind) unter Bedingungen, die für die enzymatische
Extension der verschiedenen spezifischen Primer geeignet sind. Jedes
Didesoxyribonucleotid hat ein kovalent an es gebundenes verschiedenes Nachweis-Molekül.
- – Das
Polymerase-Enzym verlängert
die verschiedenen spezifischen Primer unter Verwendung der verschiedenen
Ziel-Nucleinsäure-Sequenzen
als Matrizen, wobei nur ein Molekül eines der Didesoxyribonucleotide
angefügt
wird.
- – Die
Reaktion kann hitzedenaturiert werden, und der Zyklus kann wiederholt
werden, um die Mengen an verlängerten
verschiedenen spezifischen Primern zu vervielfachen.
- – Die
Moleküle
mit spezifischer Affinität
(mit spezifischer Affinität
für die
jeweils verschiedenen Halte-Moleküle, und die an festen Trägem wie "Teststreifen" befestigt sind)
werden zu der Lösung
unter Bedingungen, die der Bindung der verschiedenen Halte-Moleküle an die
verschiedenen Moleküle
mit spezifischer Affinität
förderlich sind,
zugegeben.
- – Wenn
die verschiedenen verlängerten
spezifischen Primer über
die verschiedenen Halte-Moleküle
an ihren Komplexen aus Molekül
mit spezifischer Affinität
und festem Träger
angebracht sind, wird jeder verschiedene Komplex individuell mit
dem geeigneten Teststreifen entfernt, der danach unter Bedingungen
hoher Stringenz gründlich
gewaschen wird.
- – Am
Ende des Wasch-Schritts wird einer der Teststreifen auf die Anwesenheit
eines Nachweis-Moleküls
getestet, wobei ein für
das bestimmte Nachweis-Molekül
geeignetes Verfahren verwendet wird. Wenn der Test anzeigt, daß das Nachweis-Molekül auf dem
Teststreifen anwesend ist, dann ist dies ein Anzeichen dafür, daß die spezifische
Nucleotid-Sequenz, die das Ziel des Primers mit dem bestimmten nachweisbaren
Molekül
ist, in der Testprobe vorliegt. Wenn der Test anzeigt, daß auf dem
Teststreifen kein Nachweis-Molekül
anwesend ist, dann ist dies ein Anzeichen dafür, daß die spezifische Nucleotid-Sequenz,
die das Ziel des Primers mit jenem bestimmten nachweisbaren Molekül ist, in
der Testprobe nicht anwesend ist.
- – Das
Verfahren des letzten Schrittes wird für jeden der Teststreifen wiederholt.
-
3. Vorrichtung zur Durchführung von
erfindungsgemäßen Verfahren
-
Es
wird auf 5 Bezug genommen.
Die Vorrichtung 100 ist zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren
nach nichtautomatischer oder automatischer Vorgehensweise allgemein
geeignet. Die Vorgänge
des Verlängerns
und Trennens finden in dem entfernbaren Reaktor 10 statt,
der in dem Haltegefäß 11 angeordnet
ist. Das Gefäß 11 wird
durch die thermisch geregelte Ummantelung 12 temperaturgeregelt.
Der Inhalt des Reaktors 10 wird durch Schütteln des
Gefäßes 11 unter
Verwendung einer Schüttelvorrichtung 13 gemischt.
Das Unterteil des Reaktors 10 besitzt eine Membran 14 mit
spezieller Porosität,
die durch die Membran-Haltevorrichtung 15 gestützt wird.
Der Reaktor 10 wird in dem Gefäß 11 durch die Halterung
für den
entfernbaren Reaktor 21 gehalten.
-
Probenmaterial,
Primer und Extensions-Reagenzien werden aus ihren jeweiligen Gefäßen 16, 17 und 18 an
den Reaktor 10 abgegeben. Man läßt für eine geeignete Dauer unter
schonendem Mischen und unter festgelegten Temperaturbedingungen
Primer-Annealing und -Extension stattfinden. Diese Reaktion erzeugt
einen verlängerten
Primer mit einem nachweisbaren Element und einem Trenn-Element, vorausgesetzt,
die Probe hat eine spezifische Polynucleotid-Sequenz, für die der
Primer eine Sequenz hat, die zu einem Teil der spezifischen Polynucleotid-Sequenz
komplementär
ist.
-
Nachfolgend
wird (werden) an einem inerten Träger angebrachtes) Moleküle) mit
spezifischer Affinität (SAM(S))
für das
Trenn-Element aus dem SAM-Vorratsgefäß 19 in den Reaktor 10 gegeben,
und für
eine geeignete Dauer mit verlängertem
Primer reagieren lassen. Nicht reagierte Reagenzien, Puffer und
nicht verlängerter)
Primer werden dann über
eine Vakuumleitung 25 mit zugeordneter Vakuumpumpe 24,
die am Unterteil des Haltegefäßes 11 angebracht
ist, zu dem Abfallbehälter 25 entfernt,
während
verlängerter)
Primer mit gebundenem (gebundenen) SAMS) durch die Membran 14 in
dem Reaktor 10 zurückgehalten
wird (werden). Die zurückgehaltenen
Primer-SAM-Komplexe werden mit aus dem Gefäß 22 zugeführtem Waschreagenreagens gewaschen,
um Hintergrund zu entfernen und dadurch die erste Fraktion in dem
Reaktor 10 zu erzeugen. Die erste Fraktion wird dann mit
dem Detektor 23 auf die Anwesenheit von nachweisbarem Element
untersucht. Typischer weise ist das nachweisbare Element ein radioaktives
Element, wie 32Pund der Detektor 23 ist
ein Szintillationszähler.
-
Wenn
der Test anzeigt, daß das
Nachweis-Molekül
anwesend ist, dann ist dies ein Anzeichen dafür, daß die spezifische Nucleotid-Sequenz in der Testprobe
anwesend ist. Wenn der Test anzeigt, daß kein Nachweis-Molekül anwesend
ist, dann ist dies ein Anzeichen dafür, daß die spezifische Nucleotid-Sequenz
in der Testprobe nicht anwesend ist.
-
Beispiel 1
-
In
diesem Beispiel zum Nachweis einer spezifischen Polynucleotid-Sequenz
wurde das in 1 dargestellte
Verfahren zur Bestimmung der eingsträngigen genomischen DNA des
Bakteriophagen M13 verwendet.
-
1. Synthese
des künstlichen
Primers
-
Eine
zu einzelsträngiger
(ss)M13-DNA komplementäre
17-Mer-DNA wurde
auf einer DNA-Synthesevorrichtung von Applied Biosystems synthetisiert.
-
Das
17-Mer hatte die Nucleotid-Sequenz:
-
-
Dieser
Primer ist nicht nur zu einzelsträngiger M13-DNA komplementär, sondern
auch zu dem bakteriellen doppelsträngigen DNA-Plasmid, pUC 12.
-
2. Anbringung des Primers
auf Cellulose
-
Zur
Anbringung des Primers auf ABM-Cellulose wurde das Verfahren von
Ashley und MacDonald (1984) verwendet.
-
Die
Amino-benzyloxymethyl (ABM)-Gruppen auf ABM-Cellulose wurden unter
Bildung von Diazobenzyloxymethyl-Cellulose (DBM-Cellulose) diazotiert. Der spezifische
Primer wurde an die DBM-Cellulose
gebunden. Es wurden etwa 40 μg
des spezifischen Primers an 20 mg Cellulose gebunden.
-
3. Hybridisierung von spezifischer
Primer-Cellulose (SP-Zellulose) mit Ziel-Nucleinsäure
-
SP-Cellulose
wurde in einer Lösung,
die die Ziel-Nucleinsäure,
entweder M 13 ssDNA oder pUC 12, und Wasser enthielt, erneut suspendiert.
Dies wurde gemischt, fünf
Minuten lang gekocht und auf Eis abgeschreckt. Das Gemisch wurde
dann zur Entfernung von Nucleinsäuren,
die nicht mit der SP-Cellulose hybridisiert hatten, durch Zentrifugieren
unter Verwendung eines Waschpuffers, der 140mM Natriumchlorid, 15mM Natriumcitrat
und 20mM Natriumphosphat, pH 7,0, enthielt, gewaschen.
-
4. Primer-Extension
-
Der
spezifische Primer wurde unter Verwendung von DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment)
zusammen mit markierten und nicht markierten Nucleotiden verlängert.
-
Die
Reaktionsbedingungen waren wie folgt: 20
: 1 Reaktionsgemisch
50mM | Tris-HCL,
pH 8,3 |
8mM | Magnesiumchlorid |
4mM | Dithiothreitol |
4mM | Natrium-pyrophosphat |
1mM | jeweils
dATP, dGTP und dTTP |
1Ci | 32P dCTP |
7 Einheiten | DNA-Polymerase
I, Klenow-Fragment. |
-
Es
wurde gefunden, daß die
Zugabe von Polyethylenglykol 6000 bis zu einer Endkonzentration
von 4 % die Inkorporierung von Radioaktivität bis zum Dreifachen erhöhte.
-
Das
Reaktionsgemisch wurde zwei Stunden lang bei 20°C inkubiert.
-
Am
Ende der Inkubation wurde nicht inkorporierte Nucleotide durch viermaliges
Waschen durch Zentrifugierung der SP-Cellulose entfernt. Der Waschpuffer
war 140mM Natriumchlorid, 15mM Natriumcitrat und 20mM Natriumphosphat,
pH 7,0. Die Probe wurde eine Minute lang bei Raumtemperatur gewirbelt,
dann fünf Minuten
lang bei 12.000g zentrifugiert. Dies wurde viermal wiederholt.
-
Schließlich wurde
die SP-Cellulose in eine Szintillations-Lösung enthaltende Ampulle gegeben,
und die Inkorporierung wurde unter Verwendung eines Flüssig-Szintillationszählers bestimmt.
-
Beispiel 2
-
In
diesem Beispiel zur Bestimmung einer spezifischen Polynucleotid-Sequenz wurde einzelsträngige genomische
DNA von dem Bakteriophagen M13 mp18 bestimmt unter Verwendung des
folgenden Oligonucleotid-Primers:
-
-
Die
in diesem Beispiel verwendete Konfiguration ist in 2b gezeigt; das Nachweis-Molekül in diesem
Beispiel ist 32P, und es ist an das 5'-Ende des spezifischen Primers gebunden;
das Halte-Molekül
ist Biotin, und es ist in den verlängerten Primer als Biotin-16-dUTP
(ein Analoges von dTTP) inkorporiert; das Molekül mit spezifischer Affinität ist Streptavidin,
und der feste Träger
ist Agarose.
-
Der
spezifische Primer wurde unter Verwendung einer Oligonucleotid-Synthesevorrichtung
synthetisiert und unter Verwendung von Polynucleotid-Kinase am 5'-Ende mit 32P wie folgt markiert:
-
Reaktionsgemisch:
Spezifischer
Primer (50 pMole 5' OH-Enden) | 1μl |
100
mM Dithiothreitol | 5μl |
10× TM Puffer
(600 mM Tris, pH 7,6, 90mM MgCl2 | 5μl |
γ-32P-dATP (3000 Ci/mMol) | 15μl |
T4 Polynucleotide-Kinase (8,6 Einheiten/ml) | 2μl |
ddH2O | 22μl |
-
Das
Reaktionsgemisch wurde 20 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Der markierte Primer
wurde unter Verwendung einer DEAE-Cellulose-Säule von nicht inkorporiertem 32P getrennt.
-
Die
Primer-Extensions-Reaktion wurde unter Verwendung des folgenden
Reaktionsgemisches entweder mit M13 mp18 oder Lambda-Bakteriophagem
(als nicht-homologe Kontrolle) durchgeführt:
-
-
-
Das
Reaktionsgemisch wurde 60 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Am Ende der Inkubation
wurde der verlängerte
Primer mit Ethanol gefällt,
um nicht inkorporiertes Biotin-16-dUTP zu entfernen. Zu dem Reaktionsgemisch
wurde ein Volumen (50μl)
5M Ammoniumacetat und 250μl
Ethanol zugegeben, gefolgt von kurzem Mischen und einstündiger Inkubation
bei –20°C. Die Fällung wurde
durch Zentrifugieren gesammelt, kurz getrocknet, in 50μl ddH2O erneut suspendiert und auf eine 200μl Streptavidin/Agarose-Säule (die
0,12mg Streptavidin enthielt), die vorher mit Bindungspuffer (10
mM Tris HCl, pH7,5; 200 mM NaCl; 1 mM EDTA) ins Gleichgewicht gebracht
worden war, aufgebracht. Die Säule
wurde fünfmal
mit jeweils 500μl
Bindungspuffer gewaschen. Die Streptavidin/Agarose wurde in 1 ml
Bindungspuffer, zu dem 6 ml Szintillationsflüssigkeit zugegeben worden waren,
suspendiert, und das Gemisch wurde in einem Flüssig-Szintillationszähler gezählt.
-
Die
Ergebnisse für
das M13- und das Lambda-System waren wie folgt:
Matrize | cpm |
M13 | 29.055 |
lambda | 1.043 |
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Die
Ergebnisse zeigen, daß der
Primer nur in Gegenwart der homologen Matrize M13 spezifisch verlängert wurde,
aber in Gegenwart der nicht homologen Matrize Lambda nicht verlängert wurde.
Außerdem
wurde Biotin in den verlängerten
Primer inkorporiert.
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Beispiel 3
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In
diesem Beispiel zur Bestimmung einer veränderten Nucleotid-Base wurde
die in 3c gezeigte Konfiguration
verwendet. Die bestimmte M13-Sequenz und die verwendete Oligonucleotid-Primer-Sequenz waren
wie folgt:
-
-
Der
spezifische Primer wurde unter Verwendung einer Oligonucleotid-Synthesevorrichtung
synthetisiert.
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Das
Reaktionsgemisch wurde wie folgt zusammengestellt:
500
ng M13mp18 ssDNA | 2,5μl |
0,8
pMole spezifischer Primer | 2,0μl |
10× Reaktionspuffer | 1,5μl |
ddH20 | 1,0μl |
-
Dieses
Reaktionsgemisch wurde bei 55°C
zehn Minuten lang inkubiert, zu welcher Zeit das Folgende zugegeben
wurde:
35P dATP (3000 Ci/mMol, 10 mCi/ml) | 0,5μl |
35P ddATP (3000 Ci/mMol, 10 mCi/ml) | 1,5μl |
DNA-Polymerase
(Klenow) (1 Einheit/μl) | 1,0μl |
-
Dieses
Reaktionsgemisch wurde weitere 15 Minuten lang bei 25°C inkubiert.
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Die
Reaktion wurde durch Zugabe von 4μl
Formamid-Farbstoff (95 % Formamid, 0,1 % Xylol-Cyanol, 0,1 % Bromphenolblau)
beendet. Das Reaktionsgemisch wurde drei Minuten lang bei 100°C erhitzt,
bevor es auf ein 20 %-iges Polyacrylamid-Gel geladen und 30 Minuten
lang bei 30 Milliampere elektrophoretisiert wurde. Das Gel wurde
dann in 10 %-iger
Essigsäure
fixiert, mit ddH2O gewaschen und zwölf Stunden
lang bei –80°C einem Röntgenfilm
ausgesetzt.
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Das
sich ergebende Autoradiogramm (4)
zeigte nur eine Bande mit einer Länge von 18 Nucleotiden. Daher
wurde der Primer durch die Inkorporierung eines markierten Adenin-Rests
nur um ein Nucleotid verlängert,
und so wurde ein spezielles einziges Nucleotid in einer Nucleinsäure-Sequenz
bestimmt.
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Beispiel 4
-
In
diesem Beispiel zur Bestimmung einer spezifischen Polynucleotid-Sequenz wurde das
Verfahren der 2a zur
Bestimmung der einzelsträngigen
genomischen DNA des Bakteriophagen M13 verwendet.
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1. Synthese
des künstlichen
Primers
-
Eine
zu MIS ssDNA komplementäre
25-Mer DNA wurde von Clontex (USA) synthetisiert.
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Das
25-Mer hatte die Nucleotid-Sequenz
in der X kovalent an ein
modifiziertes Nucleotid gebundenes Biotin ist.
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2. Hybridisierung
und Primer-Extension
-
Der
Primer wurde mit Puffer gemischt, der entweder M 13 DNA (Ziel) oder
Heringssperma-DNA (Kontrolle) enthielt, und unter Verwendung von
DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) verlängert.
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Die
Reaktionsbedingungen waren wie folgt:
-
- 50 mM Tris pH 7,5
- 10 mM MgCl2
- 4 mM DTT
- 100 mM NaCl
- 50 μg/ml
Rinderserumalbumin
- jeweils 0,02 mM dATP, dGTP, dTTP
- 1 Ci 32P dCTP
- 742,5 ng/50μl
M13- oder Heringssperma-DNA
- 25,8 ng/50μl
Biotin-Primer
- 0,5 Einheiten DNA-Polymerase I, Klenow-Fragment.
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Die
Reaktionsgemische wurden 60 Minuten lang bei 37°C inkubiert und durch Fällung und
Waschen beendet.
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Die
Fällung
wurde durchgeführt
durch Zugabe von 5M Ammoniumacetat, Kälberthymus-DNA als Träger und
Ethanol. Durch Zentrifugieren gesammelte Pellets wurden mit 70 %
Ethanol gewaschen, bis die Waschflüssigkeiten weniger als 500
cpm enthielten.
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Die
gewaschenen Pellets wurden dann in Bindungspuffer, der aus 200 mM
NaCl, 10 mM Tris pH 7,5, 1 mM EDTA bestand, gelöst und auf eine Streptavidin-Agarose-Säule aufgebracht.
Die Säulen
wurden mit mehreren Volumina Puffer gewaschen, und Streptavidin-Agarose
(SA)-gebundene Zählimpulse
wurden mit den folgenden Ergebnissen gemessen:
Ziel | SA-gebundene
cpm (Zählimpulse
pro Minute) |
M13 | 11.939 |
Heringssperma | 83 |
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Die
Ergebnisse zeigen, daß nur
in Anwesenheit von Ziel-M13-DNA verlängerte Primer dazu führen, daß signifikante
Radioaktivität
an die Säule
gebunden wird.
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Industrielle
Anwendbarkeit
-
Das
erfindungsgemäße Verfahren
kann leicht bei den folgenden Anwendungen verwendet werden:
-
- a) die einfache, schnelle, empfindliche und
automatisierbare Bestimmung infektiöser Krankheiten bei Menschen,
Tieren und Pflanzen;
- b) die spezifische, schnelle Bestimmung und die Bestimmung in
großem
Maßstab
von Basen-Änderungen in
Nucleinsäure-Sequenzen, insbesondere
bei der Bestimmung von Gen-Defekten und bei DNA-Fingerprinting;
- c) Kits für
den Gebrauch bei den vorstehenden Anwendungen; und
- d) automatisierte Geräte
zur Verwendung bei den vorstehenden Anwendungen.