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Die Erfindung betrifft ein Verfahren
zur qualitativen und quantitativen Bestimmung einer spezifischen Nucleinsäure, deren
Vorkommen in einem Gengemisch, das DNA oder RNA enthält, vermutet
wird, und das zur Gendiagnose auf dem Gebiet der klinischen Diagnose,
zur Klonierung nützlicher
Gene und zur Erforschung unbekannter Gene geeignet ist. Die vorliegende
Erfindung ist auch als Verfahren zur Optimierung der Reaktionsbedingungen
zur Amplifikation von Genen geeignet.
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Tests auf eine spezifische Nucleinsäure unter
Verwendung einer Sonde (Nucleinsäuresonde),
die in der Basensequenz zu der Nucleinsäure komplementär ist, machen
sich die Fähigkeit
der spezifischen Nucleinsäure
zur Hybridisierung mit der Sonde zu Nutze.
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Beispielsweise verwendet ein bekanntes,
Sandwich-Test genanntes Verfahren zwei Sonden, die mit verschiedenen
Teilen der spezifischen Nucleinsäure
hybridisieren. Bei diesem Verfahren wird eine der Sonden an einem
festen Träger
immobilisiert, während
die andere mit einem Farbstoff markiert wird, der durch seine Farbe
oder eine fluoreszierende Substanz oder ein Enzym, das die Produktion
eines solchen Farbstoffs oder einer solchen fluoreszierenden Substanz
katalysiert, sichtbar ist. Diese Sonden werden einer Probe zugesetzt und
mit der spezifischen Nucleinsäure
in der Probe hybridisieren gelassen, so dass ein Komplex der drei
auf dem festen Träger
gebildet wird. Anschließend
wird der feste Träger
von dem Überstand
der Probenlösung unter
Abtrennung der unhybridisierten zweiten Sonde (B/F-Trennschritt)
abgetrennt. Sodann wird die Markierung in dem Komplex an dem festen
Träger
zur qualitativen und quantitativen Bestimmung der spezifischen Nucleinsäu re in der
Probe gemessen. Wenn ein Enzym, das die Produktion eines Farbstoffs,
der aufgrund seiner Farbe sichtbar ist, oder einer fluoreszierenden
Substanz katalysiert, zur Markierung der zweiten Sonde verwendet
wird, wird die unhybridisierte zweite Sonde nach Bildung des Komplexes
entfernt, und der Probenlösung
wird ein Vorläufer
des Farbstoffs oder der fluoreszierenden Substanz, die ein Substrat
für das
Enzym ist, zugesetzt. Der Farbstoff oder die fluoreszierende Substanz,
die als Reaktionsprodukt produziert werden, wird zur qualitativen
und quantitativen Bestimmung der Nucleinsäure in der Probe gemessen.
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In den letzten Jahren wurde es aufgrund
der Entwicklung der Polymerasekettenreaktion möglich, zum Testen eine spezifische
Region einer spezifischen Nucleinsäure in einer Probe in einem
Teströhrchen
zu amplifizieren. Die qualitative und quantitative Bestimmung einer
spezifischen Nucleinsäure
in einer Probe wird durch Amplifizieren einer spezifischen Region
der spezifischen Nucleinsäure
durch PCR und anschließendes Messen
des Amplifikationsprodukts in dem PCR-Reaktionsgemisch durch den
Sandwich-Test, wie vorstehend erwähnt, durchgeführt. Es
wurde auch vorgeschlagen, eine spezifische Region einer spezifischen
Nucleinsäuresequenz
durch PCR, wie vorstehend beschrieben, zu amplifizieren, Sonden,
die zur spezifischen Region komplementär sind, der Reaktionslösung unter
Bedingungen zuzusetzen, die ein Hybridisieren der Sonden mit der
amplifizierten Nucleinsäure
ermöglichen,
den resultierenden Komplex von den unhybridisierten Sonden elektrophoretisch
abzutrennen und anschließend
das Amplifikationsprodukt zu messen.
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Da der Sandwich-Test einen festen
Träger
in dem Reaktionsgemisch verwendet, kann die zweite Sonde an dem
festen Träger
nicht spezifisch adsorbiert werden. Die Gegenwart der Markierung
der zweiten, an den festen Träger
nicht spezifisch adsorbierten Sonde ruft Fehler bei der Messung
des markierten Hybrids an dem festen Träger hervor, was Probleme bei
der qualitativen und quantitativen Bestimmung einer spezifischen Nucleinsäure verursacht.
Da die Diagnose von Virusinfektionen den empfindlichen und reproduzierbaren Nachweis
von Spurenmengen viraler Nucleinsäuren in klinischen Proben erfordert,
ist das oben erwähnte
Problem, das der nicht spezifischen Adsorption zuzuschreiben ist,
ein ernsthaftes zu lösendes
Problem.
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Im Hinblick darauf, dieses Problem
zu umgehen, wurde eine Behandlung der Oberfläche des festen Trägers, um
sie hydrophil zu machen, durch Blockieren der adsorptiven Stellen
an einem Träger
mit Protein und sorgfältiges
Waschen des festen Trägers
nach versuchter B/F-Trennung versucht.
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Je nach Material des Trägers gelingt
es allerdings durch die chemische Behandlung nicht, die Oberfläche eines
Trägers
hydrophil zu machen, und die Behandlung kann technisch schwierig
sein. Wenn die Oberfläche
eines Trägers
mit Protein bedeckt ist, um die adsorptiven Stellen auf der Oberfläche des
Trägers
zu blockieren, kann zudem die Wechselwirkung zwischen dem Protein
und dem Nucleinsäuresegment
oder der Markierung der zweiten Sonde zu einer weiteren An von nicht
spezifischer Adsorption führen.
Zusätzlich
ist die Anzahl des wiederholten Waschens des festen Trägers bei
der B/F-Trennung betriebsbedingt begrenzt, und eine Reinigungslösung, die
ein oberflächenaktives
Mittel enthält,
kann beispielsweise eine Zersetzung des an dem Träger gebildeten
Hybrids auslösen.
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Im Falle eines Sandwich-Tests nach
der Amplifikation einer spezifischen Region einer bestimmten Nucleinsäure durch
PCR ist das Produkt der Amplifikation durch PCR eine doppelsträngige DNA.
Darum ist zur Hybridisierung von Sonden und amplifizierter Nucleinsäure ein
Heizverfahren zum Schmelzen des doppelsträngigen DNA-Amplifikationsprodukts
in zwei Einzelsträngen
nach Zugabe der Sonden zu dem PCR-Reaktionsgemisch (Denaturierung) und
ein anschließendes
Kühlverfahren
zur Bildung einer doppelsträngigen
DNA aus Sonden- und Ziel-DNA (Reassoziierung) essentiell. Daher
sind für
praktische klinische Diagnosen, deren Ziel üblicherweise Effizienz und
Wirtschaftlichkeit ist, zusätzlicher
Aufwand und Analysezeit notwendig.
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Bei dem oben genannten Verfahren
unter Anwendung der Elektrophorese kann die Notwendigkeit der Probennahme
von Amplifikationsprodukten aus den Reaktionsgefäßen zur Analyse nach der PCR
das Problem der falsch-positiven Ergebnisse verursachen, das einem
Verschleppen der Amplifikationsprodukte zuschreibbar ist, was für die praktische
Anwendung der PCR ein Hindernis darstellt.
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Darum ist die Entwicklung eines Testverfahrens
erwünscht,
das keinen derartigen Träger
verwendet und während
des Messers der Markierung der Sonde kein Denaturierungs- und Reassoziierungsverfahren
umfasst und das Verschleppen der durch PCR amplifizierten Nucleinsäure minimiert.
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Ein trägerfreies Testverfahren, das
das Durchführen
der PCR in Gegenwart eines fluoreszierenden Interkalationsfarbstoffs
und das Messen der Fluoreszenzintensität der Reaktionslösung umfasst,
ist bekannt (japanische ungeprüfte
Patentveröffentlichung
JP-A-5-237000, Igaku-no Ayumi 173(12), 959–963(1995) und Analytical Biochemistry,
229, 207-213(1995)).
Da die PCR-Produkte doppelsträngige
DNA sind, wird ein fluoreszierender Interkalationsfarbstoff der
die Fluoreszenzeigenschaft bei Interkalation mit einer doppelsträngigen Nucleinsäure ändert (beispielsweise
die Fluoreszenzintensität
verstärkt),
vor Amplifikation durch PCR einer Probenlösung zugesetzt, und die Fluoreszenzintensität der Reaktionslösung wird
zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung der Ziel-Nucleinsäure vor
der Amplifikation registriert.
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Dieses Verfahren macht es möglich, das
Fortschreiten der PCR durch Messen der Fluoreszenzintensität der Reaktionslösungen in
verschlossenen Gefäßen zu verfolgen,
und es kann das Problem der falsch-positiven Ergebnisse umgehen,
die verschleppten Amplifikationsprodukten zuschreibbar sind, da
keine Probenentnahme von Reaktionslösungen aus den Reaktionsgefäßen erforderlich
ist.
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Somit ist der oben erwähnte Test
durch die in Gegenwart eines fluoreszierenden Interkalationsfarbstoffs
durchgeführte
PCR und die registrierte Fluoreszenzintensität einer PCR-Reaktionslösung als trägerfreier oder homogener Einstufentest
ausgezeichnet.
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Da die fluoreszierenden Interkalationsfarbstoffe
allerdings nicht spezifisch doppelsträngige Nucleinsäuren binden,
wenn die Proben, zusätzlich
zu der spezifischen Nucleinsäure,
größere Mengen
an Genom-DNA enthalten, ist das Testverfahren mit dem Problem behaftet,
dass die Interkalation eines fluoreszierenden Interkalationsfarbstoffs
mit der Genom-DNA hohe Hintergrund-Zählimpulse ergibt und es dadurch
erschwert, die Änderung
in der Fluoreszenzintensität,
die der Amplifikation der spezifischen Nucleinsäure zuschreibbar ist, exakt
zu messen. Außerdem
können
die beiden Nucleinsäuren,
die zu spezifischen Regionen einer spezifischen Nucleinsäure komplementär sind und
als Primer zur Verlängerung
bei der PCR verwendet werden, in Abhängigkeit von ihren Sequenzen
komplementär
binden, und in einem solchen Fall dienen sie unter Erzeugung eines
Primerdimers sich gegenseitig als Templat. Da ein fluoreszierender
Interkalationsfarbstoff auch mit dem Primerdimer nicht spezifisch
interkaliert, bedeutet der erhöhte
Hintergrund, der der nichtspezifischen Interkalation zuschreibbar
ist, ein Problem bei der Registrierung der Änderung der Fluoreszenzeigenschaft
auf der Basis der Amplifikation der spezifischen Nucleinsäure.
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Zur Lösung dieses Problems wurde
ein Verfahren zum Testen von Nucleinsäuren unter Verwendung einer
fluoreszierenden Interkalationsfarbstoff-markierten Sonde entwickelt,
die in der Lage ist, eine spezifische Nucleinsäuresequenz zu erkennen, die
ein einzelsträngiges
Oligonucleotid, das bezüglich
der Nucleinsäuresequenz
zu der spezifischen Nucleinsäuresequenz
der spezifischen Ziel-Nucleinsäure
komplementär
ist, und einen fluoreszierenden Interkalationsfarbstoff, der mit
dem einzelsträngigen
Oligonucleotid verknüpft
ist, als Markierung umfasst. Die Sonde ist so aufgebaut, dass der
Interkalationsfarbstoff bei Hybridisierung des einzelsträngigen Oligonucleotids
mit der spezifischen Nucleinsäure
mit dem resultierenden doppelsträngigen
Oligonucleotid unter Änderung
der Fluoreszenzeigenschaft interkaliert (japanische Patentanmeldung JP7-185599,
EP-A-714986, Nucleic Acids Research 24(24), 4992–4997(1996)). Da der fluoreszierende
Interkalationsfarbstoff als Markierung die Fluoreszenzeigenschaft
bei Hybridisierung der Sonde mit der spezifischen Nucleinsäure ändert, gestattet
das Verfahren die qualitative und quantitative Bestimmung des resultierenden
Hybrids ohne Abtrennung der unhybridisierten Sonde. Wenn zudem die
Sonde vor Amplifikation der spezifischen Nucleinsäure der
Probe zugefügt
wird, ist es möglich,
die Amplifikation der Nucleinsäure
auf der Basis der Sequenzspezifität durch Messen der Fluoreszenzintensität der Reaktionslösung während der
Amplifikation zu registrieren.
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Die Erfinder haben Studien zur Bereitstellung
eines Verfahrens zum trägerfreien
oder homogenen Testen einer spezifischen Nucleinsäure unter
Verwendung eines fluoreszierenden Interkalationsfarbstoffs durchgeführt, das
für die
spezifische Nucleinsäuresequenz
spezifisch genug ist, so dass ein exakter Test auch dann möglich ist,
wenn die Probe eine große
Menge Genom-DNA enthält
oder wenn während
der Amplifikation durch PCR vor dem Test ein Primerdimer erzeugt
wird, und das die spezifische Nucleinsäuresequenz bei konstanter Temperatur
ohne Abtrennung überschüssiger Sonde
und ohne Denaturierungs- und Reassoziierungsverfahren qualitativ
oder quantitativ bestimmen kann, und als Ergebnis haben sie die
Erfindung gemacht.
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Die vorliegende Erfindung stellt
nämlich
ein Verfahren zum Testen einer spezifischen Nucleinsäure, die
in einer Probe vermutet wird, bereit, das folgendes umfasst:
einen
DNA-Herstellungsschritt, der die Herstellung einer doppelsträngigen DNA
mit einer Promotor-Sequenz für
eine DNA-Polymerase und der nucleären Sequenz der spezifischen
Nucleinsäure
(spezifische Nucleinsäuresequenz)
stromabwärts
von der Promotor-Sequenz unter Verwendung der spezifischen Nucleinsäure in der Probe
als Templat umfasst, wobei der DNA-Herstellungsschritt die Amplifikation
von DNA durch Polymerasekettenreaktion (PCR), bei der die doppelsträngige DNA
mit der spezifischen Nucleinsäuresequenz
in Gegenwart einer DNA-Polymerase und eines zu der spezifischen
Nucleinsäuresequenz
komplementären
Paares von Primern synthetisiert wird, umfasst, wobei einer der
Primer ein Promotor-Primer mit einer Promotorsequenz für eine DNA-Polymerse
am 5'-Ende ist;
und
einen RNA-Herstellungs- und Messschritt, der die Herstellung
einer einzelsträngigen
RNA mit der spezifischen Nucleinsäuresequenz durch die RNA-Polymerase
und die Messung der einzelsträngigen
RNA umfasst,
wobei der RNA-Herstellungs- und Messschritt unmittelbar
auf den DNA-Herstellungsschritt folgt, und:
- a)
durch Zugabe von mindestens der RNA-Polymerase, Ribonucleosidtriphosphaten
und einer Sonde, die mit einem fluoreszierenden Interkaltionsfarbstoff
markiert ist und zu der einzelsträngigen RNA komplementär ist, zu
der im DNA-Herstellungsschritt erhaltenen Reaktionslösung gestartet
wird,
- b) die Messung der Fluoreszenzintensität der Reaktionslösung umfasst,
- c) bei konstanter Temperatur durchgeführt wird, und
- d) kein Denaturierungs- und Reassoziierungssverfahren zur Hybridisierung
oder Abtrennung der nicht mit der hergestellten einzelsträngigen RNA
hybridisierten Sonde umfasst.
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Bevorzugte Merkmale der Erfindung
sind in den Unteransprüchen
hier beschrieben.
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Die vorliegende Erfindung wird nachstehend
ausführlich
beschrieben. Es wird auf die beigefügten Zeichnungen Bezug genommen.
Es zeigen:
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1 eine
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung, wobei die Ziel-Nucleinsäure in der
Probe einzelsträngige
RNA ist.
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2 die
anfänglichen
Kopien-Anzahlen einer rekombinanten HCV-RNA und die durch ein erfindungsgemäßes Verfahren
gemessenen Fluoreszenzintensitäten.
Die Ordinate gibt die Zunahme in der Fluoreszenzintensität während 30
min der in vitro Transcription an.
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3 die
Mengen des PCR-Produkts aus der Ziel-Nucleinsäure und die Fluoreszenzintensitäten, die durch
Testen einer rekombinanten HCV-RNA durch ein erfindungsgemäßes Verfahren
gemessen wurden.
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4 die
anfänglichen
Kopien-Anzahlen einer rekombinanten HCV-RNA und die Fluoreszenzintensitäten, die
durch ein erfindungsgemäßes Verfahren
gemessen wurden.
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In dem DNA-Herstellungsschritt wird
doppelsträngige
DNA, bestehend aus einer Promotorsequenz für eine RNA-Polymerase und einer
spezifischen Nucleinsäuresequenz
im Anschluss an die Promotorsequenz, unter Verwendung der spezifischen
Nucleinsäure
hergestellt. In dem Schritt wird ein Paar von Primem, die in der
Sequenz zu der spezifischen Nucleinsäuresequenz komplementär sind,
verwendet, und einer von ihnen ist ein Promotor-Primer, der eine Promotorsequenz für eine RNA-Polymerase
am 5'-Ende aufweist.
In dem Schritt werden auch eine DNA-Polymerase und Deoxyribonucleosidtriphosphate
verwendet.
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Die oben erwähnte doppelsträngige DNA
wird nämlich
durch eine DNA-Verlängerungsreaktion
durch wiederholte Einwirkung von DNA-Polymerase unter Verwendung
der oben erwähnten
beiden Primer hergestellt.
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Die bei der vorliegenden Erfindung
verwendete DNA-Polymerase ist nicht besonders eingeschränkt, und
beispielsweise können
E. coli-DNA-Polymerase III, das Klenow-Fragment, T4-DNA-Polymerase, T7-DNA-Polymerase,
Thermus a quaticus-DNA-Polymerase, Thermus thermophilus-DNA-Polymerase
und dergleichen verwendet werden.
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Der bei der vorliegenden Erfindung
verwendete Promotor-Primer ist so aufgebaut, dass er mindestens die
Promotorsequenz für
eine RNA-Polymerase und eine Sequenz komplementär zu der spezifischen Nucleinsäuresequenz
in dieser Reihenfolge vom 5'-Ende
zum 3'-Ende, wie vorstehend
beschrieben, aufweist. Das zu der spezifischen Nucleinsäure komplementäre Segment
ist zu mindestens einem Teil der spezifischen Nucleinsäure, nicht
notwendigerweise zu der gesamten spezifischen Nucleinsäuresequenz
komplementär.
Das Segment kann 6 bis 100 Nucleotide, vorzugsweise 10 bis 30 Nucleotide
lang sein, um die Spezifität
einer Nucleinsäure
zu gewährleisten,
die zu der spezifischen Nucleinsäure
komplementär
ist. Die Promotorsequenz für eine
RNA-Polymerase und die zur spezifischen Nucleinsäuresequenz komplementäre Sequenz
können über einige
Basen (Linkerbasen), die zu keiner von ihnen in Beziehung stehen,
verknüpft
sein. Wenn die spezifische Nucleinsäure RNA ist, geht der oben
erwähnten
DNA-Verlängerungsreaktion
eine Synthese von cDNA unter Verwendung der spezifischen Nucleinsäure als
Templat bei dem DNA-Herstellungsschritt
voraus. Für
die Synthese von cDNA werden die oben erwähnten beiden Primer, die Sequenzen
enthalten, die zur spezifischen Nucleinsäuresequenz komplementär sind,
eine reverse Transcriptase und die Substrate für die reverse Transcriptase,
Deoxyribonucleosidtriphosphate, verwendet. Einer der in dem DNA-Herstellungsschritt
verwendeten Primer kann für
die Synthese von cDNA verwendet werden, und in diesem Fall muss
der andere Primer zur Synthese von doppelsträngiger DNA durch eine DNA-Polymerase
der Reaktionslösung
nach der Synthese von cDNA zugefügt
werden. Die reverse Transcriptase ist nicht besonders eingeschränkt, und
diejenigen, die im Handel erhältlich
sind, können
verwendet werden. Außerdem
ist es im Falle einer DNA-Polymerase mit einer reversen Transcriptionsaktivität möglich, die
Synthese von cDNA und die Synthese von doppelsträngiger DNA ohne Diskontinuität durch
Zugabe eines Reagens, das die oben erwähnten beiden Primer, die DNA-Polymere
und Deoxyribonucleosidtriphosphate enthält, zu einer Probe durchzuführen.
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In dem RNA-Herstellungs- und Messschritt
nach dem DNA-Herstellungsschritt wird eine einzelsträngige RNA
durch Einwirken einer RNA-Polymerse auf die synthetisierte doppelsträngige DNA
synthetisiert und gemessen.
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Dieser Schritt wird in Gegenwart
von mindestens einer RNA-Polymerse, Ribonucleosidtriphosphaten und
einer fluoreszierenden Interkalationsfarbstoff-markierten Sonde,
die zur resultierenden RNA komplementär ist, nach dem DNA-Herstellungsschritt
ausgelöst.
Darum kann der RNA-Herstellungs- und Messschritt nur durch Zugabe
dieser Reagentien nach dem DNA-Herstellungsschritt gestartet werden.
Die Sonde hybridisiert mit der resultierenden RNA unter Änderung
der Fluoreszenz des fluoreszierenden Interkalationsfarbstoffs. Darum
sind die qualitative Bestimmung der spezifischen Nucleinsäure in der
Probe und die quantitative Bestimmung ihrer Ausgangsmenge durch
Messen der Fluoreszenzintensität
des Reaktionsgemisches möglich.
Die im RNA-Herstellungs- und Messschritt verwendete RNA-Polymerse
ist nicht besonders eingeschränkt,
und beispielsweise können
diejenigen, die im Handel erhältlich
sind, wie T7-RNA-Polymerse, T3-Polymerse und SP6-RNA-Polymerase, verwendet
werden.
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Die bei der vorliegenden Erfindung
verwendete Sonde ist ein Oligonucleotid, das selektiv mit der RNA hybridisiert,
die durch die Wirkung der RNA-Polymerase synthetisiert wird und
mit einem fluoreszierenden Interkalationsfarbstoff markiert ist,
der die Fluoreszenz beim Binden an doppelsträngige DNA ändert (japanische Patentanmeldung
JP 7-185599, EP-A-714986, Nucleic Acid Research, 24(24), 4992–4997(1996)).
Der fluoreszierende Interkalationsfarbstoff ist nicht besonders
eingeschränkt,
solange er die Fluoreszenz beim Binden an doppelsträngige DNA ändert. Allerdings
sind diejenigen, die die Fluoreszenz bei Interkalation verstärken, im
Hinblick auf die leichte Aufzeichnung bevorzugt, und insbesondere
sind Thiazolorange, Oxazolgelb und ihre Derivate bevorzugt, da sie
radikale Veränderungen
in der Fluoreszenz zeigen.
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Der fluoreszierende Interkalationsfarbstoff
ist mit dem Oligonucleotid über
eine kovalente Bindung, falls notwendig über einen Linker einer entsprechenden
Länge verknüpft. Obwohl
beliebige Linker, die den fluoreszierenden Interkalationsfarbstoff
nicht am Binden an doppelsträngiger
DNA hindern, verwendet werden können,
sind die funktionellen Kohlenwasserstoffe mit funktionellen Gruppen
an beiden Enden bevorzugt, da sie leicht mit den Oligonucleotiden
zu verknüpfen
sind. Zudem kann beispielsweise ein handelsübliches Kit (C6-Thiolmodifier,
Clontech) verwendet werden. Der fluoreszierende Interkalationsfarbstoff
als Markierung kann mit jeder Stelle des Nucleotids verknüpft sein,
einschließlich
5'-Ende, 3'-Ende und Zentrum,
solange die Verknüpfung
weder den fluoreszierenden Interkatationsfarbstoff an der Interkalation
an doppelsträngiger
DNA, noch das Oligonucleotid an der Hybridisierung mit der RNA hindert.
Der zur RNA komplementäre
Bereich der Sonde ist vorzugsweise 6 bis 100 Nucleotide und mehr
bevorzugt 10 bis 30 Nucleotide lang, um die Spezifität für die RNA
zu gewährleisten.
Da, wie vorstehend beschrieben, die RNA-Polymerase in Gegenwart
einer fluoreszierenden Interkalationsfarbstoff-markierten Sonde
Wirkung entfaltet, so dass die Sonde mit der Transcriptionsprodukt-RNA
hybridisiert, macht es das erfindungsgemäße Verfahren möglich, eine
Ziel-Nucleinsäure
in Proben durch Registrierung der Fluoreszenzintensität des Reaktionsgemisches
ohne Denaturierungs- und Reassoziierungsverfahren zur Hybridisierung
exakt nachzuweisen und zu quantifizieren. Der fluoreszierende Interkalationsfarbstoff
als Markierung der Sonde ändert
nämlich
bei Hybridisierung der Sonde mit der erzeugten DNA die Fluoreszenz
in Abhängigkeit
von der ursprünglichen
Menge der spezifischen Ziel-DNA in der Probe, und die qualitative
und quantitative Bestimmung des Hybrids ist ohne Abtrennung der
unhybridisierten, überschüssigen Sonde
und unter Bereitstellen eines einfachen homogenen einstufigen Tests
einer Nucleinsäure
mit der spezifischen Sequenz möglich.
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Der erfindungsgemäße DNA-Herstellungsschritt
kann die PCR anwenden. In einem solchen Fall wird die doppelsträngige DNA-Sequenz
mit einer Promotorsequenz für
RNA-Polymerase stromaufwärts und
einer spezifischen Nucleinsäuresequenz
stromabwärts
im DNA-Herstellungsschritt ausgiebig amplifiziert, und anschließend wird
damit der RNA-Herstellungs-
und Messschrit durchgeführt.
Zur Amplifikation durch PCR wird das übliche PCR-Verfahren zur Denaturierung
und Reassoziierung, das Erhitzen und Abkühlen umfasst, unter Verwendung
der oben erwähnten
beiden Primer im DNA-Herstellungsschritt durchgeführt.
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Die vorliegende Erfindung wird unter
Bezugnahme auf die Beispiele ausführlicher beschrieben. Allerdings
soll die vorliegende Erfindung keinesfalls auf diese spezifischen
Beispiele beschränkt
sein.
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1 erläutert eine
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung, wobei die spezifische Nucleinsäure in der
Probe eine einzelsträngige
RNA ist. In dem DNA-Herstellungsschritt synthetisiert eine reverse
Transkriptase die cDNA der spezifischen Nucleinsäure in Gegenwart eines Primers
für die
reverse Transcription und von Deoxyribonucleosidtriphosphaten. Die
synthetisierte cDNA ist zu der spezifischen Nucleinsäuresequenz
komplementär.
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Anschließend wird eine PCR durch Zugabe
eines Promotor-Primers mit der gleichen Sequenz wie das 5'-Ende der spezifischen
Nucleinsäure
und einer hitzebeständigen
DNA-Polymerase unter
Erhalt einer doppelsträngigen
DNA mit einer Promotorregion für
eine RNA-Polymerase am 5'-Ende
durchgeführt.
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Anschließend folgt der RNA-Herstellungs-
und Messschritt. Ein Reagens, das eine fluoreszierende Interkalationsfarbstoff-markierte
Sonde, eine RNA-Polymerase und Ribonucleo sidtriphosphate enthält, wird
der Reaktionslösung
zugesetzt, und anschließend
wird die Reaktionslösung
bei der für
die RNA-Polymerase optimalen Temperatur inkubiert. Die RNA-Polymerase
transkribiert die doppelsträngige
DNA mit einer im DNA-Herstellungsschritt hergestellten Promotorregion
in eine RNA mit spezifischer Nucleinsäuresequenz. Die durch Transcription
erzeugte RNA hybridisiert mit der fluoreszierenden Interkalationsfarbstoff-markierten
Sonde, die in der Reaktionslösung
coexistiert, unter Verstärkung
der Fluoreszenzintensität
in Relation zu der Menge des Hybrids. Darum ist die qualitative
Bestimmung der spezifischen Nucleinsäure oder die quantitative Bestimmung
der Ausgangsmenge der spezifischen Nucleinsäure durch Messen der Fluoreszenzintensität der Reaktionslösung vor
und nach oder während
dieses Schrittes möglich.
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Wenn die spezifische Nucleinsäure in der
Probe doppelsträngige
DNA ist, folgt die PCR in Gegenwart eines Paares der Primer und
eines Promotorprimers, Deoxyribonucleosidtriphosphaten und hitzbeständiger DNA-Polymerase
unter Erzeugung einer doppelsträngigen
DNA mit einer Promotorregion für
eine RNA-Polymerase den oben erwähnten
Verfahrensweisen.
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BEISPIEL 1
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Das erfindungsgemäße Verfahren wurde auf den
Test einer rekombinanten HCV-RNA angewandt, und seine untere Nachweisgrenze
wurde bewertet.
- (1) Eine rekombinante HCV-RNA
(enthält
die Basen Nr. 1 bis 1863 von Kato et al.: Kato, N., Hijikata, M., Ootsuyama,
Y., et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 9524-9528) wurde auf 50,
10, 5, 0 Kopien/10 μl
mit einem RNA-Verdünnungsmittel
der folgenden Zusammensetzung zur Herstellung von Proben verdünnt.
Zusammensetzung
des RNA-Verdünnungsmittels
10
mM Tris-HCl (pH 8,0)
0,1 mM EDTA
100 μg/ml Hefe-RNA
- (2) Ein Volumen von 5 ml einer Reaktionslösung der folgenden Zusammensetzung
wurde in PCR-Röhrchen gegeben,
und 10 μl
der Proben wurden hinzugefügt.
Zusammensetzung
der Reaktionslösung
30
mM Tris-HCl (pH 8,3)
150 mM KCl
13,6 mM MgCl2
4,3
mM NTPs
3 mM DTT
3 U/μl
RNase-Inhibitor
6 u/μl
reverse MMLV-Transkriptase
3,6 μM Primer;
5'-ACTCGCAAGCACCCTATC-3'
- (3) Die reverse Transcription wurde in einem Thermocycler durchgeführt.
Bedingungen
für die
reverse Transcription
42°C
für 10
min
99°C
für 6 min
- (4) 60 μl
einer PCR-Lösung
der folgenden Zusammensetzung wurden zugesetzt.
Zusammensetzung
der PCR-Lösung
10
mM Tris-HCl (pH 8,3)
50 mM KCl
1,6 mM MgCl2
0,025%
Nonidet P-40
37,5 U/ml Taq-DNA-Polymerase für einen Heißstart
0,3 μM Promotor-Primer;
5'-ATTTAGGTGACACTATAGAATACAACACTCCA-CCATAGATCACTC-3'
- (5) Die PCR wurde in einem Thermocycler unter den folgenden
Bedingungen durchgeführt.
Bedingungen
für die
PCR
- (a) 95°C
für 9 min
nach (a) wurde ein Cyclus der folgenden (b) bis (d) 40 Mal wiederholt.
- (b) 95°C
für 30
s
- (c) 65°C
für 30
s
- (d) 72°C
für 1 min
- (6) 70 μl
der jeweiligen resultierenden PCR-Gemische wurden mit 65,3 μl einer Transcriptionslösung der folgenden
Zusammensetzung gemischt und anschließend in einer Quarzküvette übergeführt, die
bei 37°C in
einem Fluoreszenzspektralphotometer gehalten wurde.
Zusammensetzung
der Transcriptionslösung
75,3
mM Tris-HCl (pH 8,0)
15,1 mM MgCl2
10,7
mM DTT
0,86 mM NTPs
4,3 mM Spermidine
2,2 U/μl Rnase-Inhibitor
53,6
nM YO-271 (fluoreszierende Interkalationsfarbstoffmarkierte Sonde);
5'-CTCGC*GGGGGCTG-3'
(* bezeichnet
die mit dem fluoreszierenden Interkalationsfarbstoff markierte Stelle)
- (7) Anschließend
wurden den Reaktionsgemischen 4,7 μl SP6-RNA-Polymerase (30 U/μl) zugesetzt,
damit die Gesamtmenge 140 μl
betrug, und die Fluoreszenzintensität wurde bei 37°C 30 min
aufgezeichnet (Anregungswellenlänge
490 nm, Emissionswellenlänge
510 nm).
- (8) Durchschnitt und Standardabweichung der Zunahme in der Fluoreszenzintensität für 0-Kopien-Proben wurden
berechnet, und die Ausschlussgrenze für die Gegenwart der Ziel-DNA
wurde auf (Durchschnitt) + 3 × (Standardabweichung)
eingestellt.
-
2 zeigt
die Zunahmen in der Fluoreszenz während 30 min und das Nachweisverhältnis. Die
Zunahme in der Fluoreszenzintensität für 10 Kopien unterschied sich
wesentlich von derjenigen für
0 Kopien (t Test, Signifikanzniveau 1%), und 10 Kopien der rekombinanten
HCV-RNA waren nachweisbar.
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3 zeigt
die Korrelation zwischen den DNA-Mengen, die aus den Dichtender
Ethidiumbromid-angefärbten
Banden berechnet wurden, die durch Agarosegelelektrophorcse von
Teilen der Reaktionsgemische unmittelbar nach Zugabe der SP6-RNA-Polymerase
erhal- ten wurden, und die Zunahmen in der Fluoreszenzintensität. Es wurde
eine gute Korrelation zwischen den Mengen an PCR-Produkten und Zunahmen
in der Fluoreszenzintensität
gefunden. Diese Ergebnisse bestätigten,
dass die vorliegende Erfindung empfindliche sequenzspezifische Tests
auf spezifische Nucleinsäuren
in Proben ermöglichte.
-
BEISPIEL 2
-
Serumproben von 20 Patienten mit
chronischer Hepatitis C wurden durch das erfindungsgemäße Verfahren
getestet, und die Ergebnisse wurden mit denjenigen verglichen, die
unter Verwendung eines handelsüblichen
HCV-RNA Nachweiskits (Amplicore HCV, Japan Rosh) erhalten wurden.
- (1) Nucleinsäure wurde aus jeweils 120-ml-Serumproben
von 20 Patienten mit chronischer Hepatitis C unter Verwendung eines
organischen Lösungsmittels
und eines Proteinmodifizierers extrahiert.
- (2) Die Pellets des extrahierten Nucleotids wurden in 72 μl des Verdünnungsmittels
aus dem Kit gelöst,
und 50-μl-Portionen
der resultierenden Lösungen
wurden zum Test mit dem handelsüblichen
Kit verwendet. Der Test wurde nach den Anleitungen des Herstellers
durchgeführt.
- (3) Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren
wurden die Pellets der extrahierten Nucleinsäure in 14 μl eines Verdünnungsmittels der folgenden
Zusammensetzung gelöst,
und 10-μl-Portionen
der resultierenden Lösungen
wurden für
den Test verwendet. Der Test wurde auf die gleiche Weise wie in
Beispiel 1 durchgeführt.
Zusammensetzung
des Verdünnungsmittels
für die
Proben
10 mM Tris-HCl (pH 8,0)
0,1 mM EDTA
100 μg/ml Hefe-RNA
1
mM DTT
2 U/μl
RNase-Inhibitor
- (4) Für
die Proben, die durch das handelsübliche Kit negativ (–/–) getestet
wurden, wurden die Zunahme in der Fluoreszenzintensität während einer
Reaktionsdauer von 30 min und die Standardabweichung berechnet.
Die Ausschlussgrenze für
das erfindungsgemäße Verfahren
wurde auf (durchschnittliche Zunahme in der Fluoreszenzintensität) + 3 × (Standardabweichung)
eingestellt.
-
Die Korrelation zwischen den durch
das erfindungsgemäße Verfahren
und das handelsübliche
Kit erhaltenen Ergebnisse ist in der Tabelle nachstehend angegeben.
Für die
als negativ (–/–) und positiv
(+/+) nach dem handelsüblichen
Kit getesteten Proben wurden die unter Verwendung des handelsüblichen
Kits erhaltenen Ergebnisse mit denjenigen verglichen, die durch
das erfindungsgemäße Verfahren
erhalten wurden. Die durch diese beiden Verfahren erhaltenen Ergebnisse
stimmten mit einer Wahrscheinlichkeit von 81,3% ({(4 + 9}/(7 + 9)} × 100 =
13/16 × 100
= 81,3) überein.
-
-
Aus diesen Ergebnissen wurde bestätigt, dass
das erfindungsgemäße Verfahren
im Vergleich mit dem herkömmlichen
Verfahren den Nachweis spezifischer Nucleinsäuren in klinischen Proben erleichtert.
-
BEISPIEL 3
-
Das erfindungsgemäße Verfahren wurde auf den
Test einer rekombinanten HCV-RNA angewandt, und seine untere Nachweisgrenze
wurde bewertet.
- (1) Eine rekombinante HCV-RNA
(enthält
die Basen Nr. 1 bis 1863 von Kato et al.) wurde auf 50, 10, 5, 1, 0
Kopien/10 μl
mit dem gleichen RNA-Verdünnungsmittel
wie in Beispiel 1 verdünnt.
- (2) Ein Volumen von 5 μl
einer Reaktionslösung
der folgenden Zusammensetzung wurde in PCR-Röhrchen vorgelegt, und 10 μl der Proben
wurden zugefügt.
Zusammensetzung
der Reaktionslösung
30
mM Tris-HCl (pH 8,3)
150 mM KCl
13,6 mM MgCl2
4,3
mM dNTPs
3 mM DTT
3 U/μl
RNase-Inhibitor
6 U/μl
reverse MMLV-Transcriptase
3,6 μM Primer;
5'-GCACTCGCAAGCACCCTATCA-3'
- (3) Die reverse Transcription wurde in einem Thermocycler unter
den folgenden Bedingungen durchgeführt.
Bedingungen der reversen
Transcription
42°C
für 10
min
99°C
für 6 min
- (4) 60 μl
einer PCR-Lösung
der folgenden Zusammensetzung wurden zugesetzt.
Zusammensetzung
der PCR-Lösung
10
mM Tris-HCl (pH 8,3)
50 mM KCl
1,6 mM MgCl2
0,025%
Nonidet P-40
37,5 U/ml Taq-DNA-Polymerase für einen Heißstart
0,3 μl Promotor-Primer;
5'-ATTTAGGTGACACTATAGAATACAACA-CTCCACCATAGATCACTCCCCTG-3'
- (5) Die PCR wurde in einem Thermocycler unter den folgenden
Bedingungen durchgeführt.
Bedingungen
für die
PCR
- (a) 95°C
für 9 min
nach (a) wurde ein Zyklus der folgenden (b) bis (d) 40 Mal wiederholt.
- (b) 95°C
für 30
s
- (c) 67°C
für 30
s
- (d) 72°C
für 1 min
- (6) Jeweils 70 μl
der resultierenden PCR-Gemische wurden mit 65,3 μl der gleichen Transcriptionslösung wie
in Beispiel 1 vermischt und anschließend in eine Quarzküvette übergeführt, die
bei 37°C
in einem Fluoreszenz-Spektralphotometer gehalten wurde.
- (7) Anschließend
wurden den Reaktionsgemischen 4,7 μl SP6-RNA-Polymerase (30 U/μl) zugesetzt,
so dass die Gesamtmenge 140 μl
betrug, und die Fluoreszenzintensität wurde bei 37°C für 30 min
(Anregungswellenlänge
490 nm, Emissionswellenlänge
510 nm) registriert.
- (8) Durchschnitt und Standardabweichung der Zunahme in der Fluoreszenzintensität für 0-Kopien-Proben wurden
berechnet, und die Ausschlussgrenze für das Vorliegen der Ziel-DNA
wurde auf (Durchschnitt) + 3 × (Standardabweichung)
eingestellt.
-
4 zeigt
die Zunahmen in der Fluoreszenzintensität und die Nachweisverhältnisse.
Sämtliche
Proben, die mindestens 10 Kopien der rekombinanten HCV-RNA enthielten, wurden
positiv getestet. 87,5% der Proben, die 5 Kopien enthielten, wurden
positiv getestet. Diese Tatsachen bestätigten, dass die vorliegende Erfindung
eine empfindliche, sequenzspezifische qualitative Bestimmung der
spezifischen Nucleinsäuren
gestattet.
-
Wie aus der obigen Beschreibung offensichtlich
ist, gestattet die vorliegende Erfindung die qualitative und quantitative
Bestimmung spezifischer Nucleinsäuren,
deren Vorkommen in Proben vermutet wird, durch einen einfachen homogenen
Test ohne Verwendung von Trägem
und ohne Abtrennung der nicht hybridisierten überschüssigen Sonde in dem RNA-Herstellungs- und
Messschritt, der die Registrierung der Fluoreszenzintensität umfasst.
Da die vorliegende Erfindung zudem die Notwendigkeit der Denaturierung
und Reassoziierung in dem Schritt beseitigt und in dem Schritt nur
die Zugabe des notwendigen Reagens zu den Probelösungen und die Registrierung
der Fluoreszenzintensität
bei konstanter Temperatur erfordert, kann der Schritt nur durch
einen Vorgang, nämlich
das Inkontaktbringen mit dem Reagens, durchgeführt werden.
-
Da erfindungsgemäß der fluoreszierende Interkalationsfarbstoff
als Markierung der Sonde die Fluoreszenz (beispielsweise die Fluoreszenzintensität ändert) bei
Hybridisierung der Sonde mit der RNA (die die gleiche Basensequenz
wie die spezifische Nucleinsäuresequenz
enthält),
die im RNA-Herstellungs- und Messschritt hergestellt wurde, ändert, ist
es möglich,
das resultierende Hybrid qualitativ und quantitativ ohne Abtrennen
der unhybridisierten überschüssigen Sonde
nachzuweisen. Darum ist unter Verwendung von Gefäßen, die aus einem Material
hergestellt sind, das bei der Anregungs- und Emissionswellenlänge des
fluoreszierenden Interkalationsfarbstoffes optisch transparent ist,
der kontinuierlichen Test möglich,
während
das Problem möglicher
falsch-positiver Ergebnisse aufgrund von verschlepptem Amplifikationsprodukt
beseitigt wird, da kein Erfordernis zum Sammeln von Reaktionslösungen aus
den Gefäßen besteht.
-
Da zudem erfindungsgemäß die Sonde
spezifisch eine spezifische Nucleinsäuresequenz erkennt und sich
die Fluoreszenz bei Hybridisierung ändert, wenn die PCR in dem
DNAHerstellungsschritt durchgeführt wird,
hybridisiert die Sonde nicht mit einem als Nebenprodukt hergestellten
Primerdimer. Darum trägt
das Primerdimer nicht zur Veränderung
der Fluoreszenz der Reaktionslösung
bei. Demnach kann ein sequenzspezifischer Test einer spezifischen
Nucleinsäure
ohne Abtrennung des Primerdimers nach der PCR durch Registrierung
der Fluoreszenz der Reaktionslösung
erreicht werden. Da außerdem
der RNA-Herstellungs- und Messschritt durch Zugabe einer RNA-Polymerase,
von Ribonucleosidtriphosphaten und der in dem DNA-Herstellungsschritt
erhaltenen Sonden-DNA-Lösungen ausgelöst wird,
umgeht die vorliegende Erfindung aufwändige Arbeitsschritte, wie Überführen einer
Reaktionslösung
aus einem Gefäß in ein
anderes, und stellt einen recht einfaches Testverfahren bereit,
das zu klinischen Diagnosen brauchbar ist.
