KR100459394B1 - 인터컬레이터를 이용한 핵산의 전기화학발광 검출방법 - Google Patents

인터컬레이터를 이용한 핵산의 전기화학발광 검출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 핵산(nucleic acid) 혼성화 (hybridization) 결합을 검출하는 방법에 관한 것으로, 혼성화된 핵산에 결합하는 인터컬레이터(intercalator)를 이용하여 전이금속착물의 산화-환원반응을 유도하여 전기화학발광을 유발시킴으로써 특별한 표지방법이 필요 없는 핵산의 혼성화 검출방법을 제공한다.

Description

인터컬레이터를 이용한 핵산의 전기화학발광 검출방법{ELECTROCHEMILUMINESCENCE DETECTION METHOD FOR A NUCLEIC ACID USING AN INTERCALATOR}
본 발명은 핵산(nucleic acid)의 이중나선(double-stranded) 상태에만 특이적으로 결합하는 인터컬레이터(intercalator)를 사용하여 이에 의하여 전기화학발광 반응이 촉진되는 성질을 이용하여 핵산 혼성화(nucleic acid hybridization) 반응을 검출하는 방법에 관한 것이다.
핵산 혼성화 반응 결과를 알아보기 위한 일반적인 방법으로 방사능 사진법, 레이저 유발 형광법 및 전기화학적 방법에 의한 핵산 혼성화 측정법 등이 있다.
방사능 사진법은 타겟핵산을 방사성 동위원소로 표지하여 핵산의 혼성화를 검출하는 방법으로 분자생물학에서 가장 널리 사용되고 있다. 방사성 동위원소로는32P 등이 이용되며 표지된 타겟 올리고뉴클레오티드와 탐침 올리고뉴클레오티드의 결합 상태는 사진 건판 (photographic films)을 이용하여 검출한다. 상기 방사능 사진법은 많은 기초 지식이 필요하지 않으므로 쉽게 적용할 수 있지만, 분석시간이 몇 시간 또는 하루가 소요되어 신속하게 결과를 알 수 없으며, 0.1 ~ 10 ㎛ 의 오더 정도로 분해능이 낮다는 점 및 여기에 사용되는 방사성 동위원소의 안정성에 대한 문제가 단점으로 지적되고 있다.
최근에는 레이저 유발 형광법(Laser-Induced Fluorescence : LIF)이 DNA 혼성화 검출에 많이 사용되고 있는데, 이는 여러 가지 종류의 형광 물질을 사용할 수 있고, 분해능이 우수하며, 즉시 결과를 알 수 있다는 장점이 있다. 최근 형광분석법과 영상기술의 결합으로 CCD(Charge Coupled Device) 카메라를 도입하면 형광물질로 표지 된 분자들을 실시간으로 영상화할 수 있게 되었다. 그러나, 이러한 방법은 가장 많이 사용되는 방법임에도 불구하고, 시료의 DNA를 측정하기 전에 형광물질로 표지하여야 하고, 이를 분리 ·정제하는 공정이 복잡하며, 실험 도중 안정성 및 레이저 ·광학측정용 부속장치 등 고가의 장비가 필요하다는 점이 문제점으로 지적되고 있다. 또한, 이차원 기판 위를 스캔하기 위해 고가의 이미지 스캐너가 필요하다는 문제도 있다.
전기화학적(electrochemical) 방법에 의한 DNA 혼성화 측정법은 전기화학적으로 활성을 가진 금속착물과 이중나선 DNA의 결합을 이용하여 DNA 혼성화를 측정하는 법이다. 이는 매우 간단한 시스템으로 저가형 측정장치가 가능하나 감도가 좋지 않은 단점이 있다.
상기한 바와 같이 기존의 핵산 혼성화 검출법은 모두 여러 가지의 단점을 가지고 있어 고감도의 새로운 측정방법의 개발이 필요하다. 특히, 시료를 표지물질과 결합시키는 과정을 거치지 않고, 핵산을 신속하게 검출할 수 있는 검출법과 휴대용 진단장치로의 개발을 위한 소형 저가의 시스템의 개발이 요구되고 있다.
본 발명은 인터컬레이터와 전이금속착물 간의 산화-환원반응을 유도하여 전기화학발광을 유발시킴을 이용하여, 특별한 표지방법이 필요 없고 간편하며 측정 감도가 우수한 새로운 방식의 효과적인 핵산 혼성화 검출방법을 제공함으로써 상기한 바와 같은 문제점을 해결하고자 한다.
도 1은 인터컬레이터에 의한 전기화학발광의 원리를 나타낸 것으로, (1)은 지시전극 (working electrode)을 나타낸다.
도 2는 금판 위에 고정화된 탐침핵산과 타겟핵산이 혼성화 되는 과정과 인터컬레이터에 의한 전기화학발광의 원리를 나타낸 것으로, (1)은 지시전극 (working electrode)을, (2)는 금판 (gold plate)을, (3)은 이중나선 핵산 (double-stranded nucleic acid)을 나타낸다.
도 3은 전이금속착물인 트리스(2,2'-바이피리딜)루테늄 이가이온 [Ru(bpy)3 2+], 트리스(1,10-페난스롤라인)루테늄 이가이온[Ru(phen)3 2+]의 화학적 구조를 나타낸 것이다.
도 4는 인터컬레이터인 독소루비신, 다우노루비신의 화학식을 나타낸 것이다.
도 5는 독소루비신과 Ru(bpy)3 2+용액을 이용한 핵산의 혼성화 검출결과를 나타낸 것으로, a는 금판인 상태에서 측정한 발광량, b는 금판 위에 탐침핵산을 고정화하고 측정한 발광량, c는 탐침핵산과 타겟핵산을 혼성화시킨 후 측정한 발광량, d는 혼성화 후에 독소루비신을 처리한 후 측정한 발광량을 나타낸다.
도 6은 독소루비신과 Ru(phen)3 2+용액을 이용한 핵산의 혼성화 검출결과를 나타낸 것으로, e는 탐침핵산에 독소루비신을 반응시키고 세척 후 측정한 발광량, f는 혼성화 후 독소루비신을 처리하고 세척 후 측정한 발광량을 나타낸다.
도 7은 다우노루비신과 Ru(bpy)3 2+용액을 이용한 핵산의 혼성화 검출결과를 나타낸 것으로, g는 탐침핵산에 다우노루비신을 반응시키고 세척 후 측정한 발광량, h는 혼성화 후에 다우노루비신을 처리하고 세척 후 측정한 발광량을 나타낸다.
본 발명은 핵산의 혼성화를 검출하는 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 금속 표면 상에 고정화된 탐침핵산과 용액 상의 타겟핵산 간의 혼성화 반응으로 형성된 이중나선 핵산에 특이적으로 결합하며, 전이금속착물의 산화-환원 반응을 유도하여 전기화학발광이 나타나도록 하는 핵산의 인터컬레이터를 사용하여, 전압을 인가하고 전이금속착물의 전기화학발광을 유도시켜, 이 때 발생하는 발광량을 측정하는 단계를 포함하는 핵산 혼성화 측정방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 핵산 혼성화 측정방법은 핵산 어레이(nucleic acid array),핵산 센서(nucleic acid sensor), 핵산 칩(nucleic acid chip) 등의 핵산검출기 상에서의 핵산 혼성화 검출방법에 응용할 수 있다.
본 발명에서 검출하고자 하는 핵산은 올리고뉴클레오타이드(oligo- nucleotide), DNA, RNA, PNA, cDNA 등을 총칭한다. 상기한 핵산검출기는 좁은 기판 위에 매우 다양한 염기서열을 가지는 핵산 조각을 고밀도로 배열시킨 것으로, 여기에 고정화된 핵산(탐침핵산)에 대하여 상보적인 염기서열을 갖는 미지의 시료에 있는 타겟핵산과 혼성화시킴으로써, 미지의 시료 내의 핵산에 대한 정보를 알아내는 데 사용되는 것을 의미한다. 혼성화라 함은 핵산 염기를 구성하는 아데닌(adenine)-티민(thymine) 및 구아닌(guanine)-시토신(cytisine) 간의 수소결합에 의하여 상보적인 염기서열을 갖는 유전자 부위(subsequence)가 서로 결합하여 이중나선 핵산을 형성하는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 검출방법에 사용되는 인터컬레이터는 상기 핵산 어레이 등의 표면에 고정화된 탐침핵산과 용액 상의 타겟핵산 간의 혼성화 반응으로 형성되는 이중나선 핵산(double-stranded nucleic acid)에 특이적으로 결합하며, 전이금속착물의 산화-환원 반응을 유도하여 전기화학발광이 나타나도록 하는 것을 특징으로 한다. 본 발명은 상기 인터컬레이터에 의한 새로운 방식의 효과적인 핵산 센서 검출방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 특이적으로 핵산의 이중나선 상태에만 결합하는 인터컬레이터 중에서 전이금속착물의 산화-환원 반응을 유도하여 전기화학발광을 유발하는 인터컬레이터를 선택 ·사용하여 핵산 센서상에서의 핵산의 혼성화를 검출하는 방법에 관한 것으로, 특별한 표지 작업이 필요없고 신속하고 저렴하며 간단한 휴대용 핵산 센서에 대한 측정방법을 제공한다.
본 발명은 인터컬레이터를 사용하여 핵산의 혼성화를 검출하는 방법에 관한 것으로, 인터컬레이터를 사용하지 않은 전이금속착물에 의한 전기발광은 측정대상에서 제외된다.
본 발명에 따른 측정방법은,
(1) 반응용기에서 티올작용기를 5'-포스페이트 위치에 가지는 탐침핵산을 지시전극 표면에 고정화시키는 단계;
(2) 상기 탐침핵산이 고정된 지시 지시전극 표면을 인산 용액으로 세척한 후, 탐침핵산과 상보적인 염기서열을 가진 타겟핵산을 포함하는 버퍼용액에 담가 혼성화를 실시하는 단계;
(3) 상기 혼성화된 핵산에 인터컬레이터를 버퍼에 녹인 용액을 첨가하여 인터컬레이터를 혼성화된 이중나선 핵산에 결합시키는 단계;
(4) 버퍼용액으로 세척하여 결합하지 않은 인터컬레이터를 제거하는 단계;
(5) 상기 혼성화 및 인터컬레이터의 결합이 이루어진 지시전극을 측정 용기에 넣고, 버퍼용액에 용해시킨 전이금속착물 용액을 첨가하고, 기준전극과 대전극을 설치하는 단계; 및
(6) 기준전극 대비 지시전극 상에 인가전압을 걸어주어, 이중나선 핵산과 결합한 인터컬레이터가 전이금속착물의 산화-환원반응을 유도하게 하여 전기화학발광이 나타나게 하는 단계를 포함할 수 있다. 이 때, 전기화학적발광은 광검출기로 검출하고, 검출된 빛을 PC에 전달하여 시간에 대한 광량 변화로 자료를 분석한다.
상기 탐침핵산은 타겟핵산과 상보적인 단일 가닥 핵산이다.
탐침핵산은 상기한 바와 같이, 지시전극(working electrode)으로 사용하는 금 전극 또는 백금 전극 위에 고정화하여 사용할 수 있으며, 상기 지시전극과는 별도의 금판을 사용하여 금판 표면에 고정시킬 수 있다. 이 때 사용되는 금판은 1 ~ 5 mm2넓이가 바람직하다. 별도의 금판에 탐침핵산을 고정시키는 방법은 상기 지시전극에 탐침핵산을 고정시키는 단계에 지시전극과 함께 별도의 금판을 넣는 것을 제외하고는 상기 방법과 동일한 과정을 수행한다. 이와 같이, 지시 전극과 별도의 금판을 사용하는 경우에는 시료의 처리가 용이하고 측정과정에서 나타나는 노이즈가 감소하는 효과가 있다.
기준전극과 별도의 금판을 사용하는 방법은
(1) 반응용기에 별도의 금판을 넣고 티올작용기를 5'-포스페이트 위치에 갖는 탐침핵산을 금판 표면에 고정화시키는 단계;
(2) 상기 탐침핵산이 고정된 금판을 인산용액으로 세척한 후, 탐침핵산과 상보적인 염기서열을 갖는 타겟핵산을 포함하는 버퍼용액에 담가 혼성화를 실시하는 단계;
(3) 상기 혼성화된 핵산에 인터컬레이터를 버퍼에 녹인 용액을 첨가하여 반응시킴으로써 인터컬레이터를 혼성화된 이중나선 핵산에 결합시키는 단계;
(4) 버퍼용액으로 세척하여 결합하지 않은 인터컬레이터를 제거하는 단계;
(5) 상기 혼성화 및 인터컬레이터 결합이 이루어진 금판을 측정용기에 넣고, 버퍼용액에 용해시킨 전이금속착물 용액을 첨가하고, 지시전극, 기준전극 및 대전극을 설치하는 단계; 및
(6) 기준전극 대비 지시전극상에 인가전압을 걸어주어, 이중나선 핵산과 결합한 인터컬레이터가 전이금속착물의 산화-환원반응을 유도하게 하여 전기화학적발광이 나타나게 하는 단계를 포함할 수 있다.
분석 대상인 타겟핵산은 올리고머 형대로 사용하고, cDNA 형태인 경우에는 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction : PCR) 등의 방법으로 증폭시켜서 사용한다. 본 발명에 의한 측정방법에 있어서, 시료를 탐침핵산과 혼성화시키기 위하여 핵산에 미리 형광물질을 표지시키지 않고 사용한다.
상기 버퍼 용액으로 인산버퍼(phosphate buffer saline), 5X SSC 버퍼 또는 1X SSC 버퍼용액을 사용한다.
상기 탐침핵산의 고정화및 탐침핵산과 타겟핵산의 혼성화는 37 ℃에서 8 ~ 12 시간 동안 실시하고 인터컬레이터의 결합은 실온에서 약 30분 정도 반응시킨다.
상기 전기화학장치는 금 또는 백금을 지시전극으로, Ag/AgCl을 기준전극 (reference electrode)으로, 백금선을 대전극(counter electrode)으로 사용하여 삼전극계를 구성하여 사용한다. 여기에 기준전극과 지시전극 간의 전압을 인가해 주는 전원공급장치가 있다. 최대로 빛을 나타내는 전압을 측정하기 위하여 전압 +0.8 ~ +1.3 V 사이에서 싸이클릭 볼타메트리(Cyclic-voltammetry)를 측정한다. 루테늄 유도체와 인터컬레이터의 산화-환원반응이 나타나고, 빛이 최대로 나오는 전압 영역은 +1.12 ~ +1.20 V 사이에 있다.
삼전극계에서 기준전극과 지시전극 간에는 +1.12 ~ +1.20 V 사이에서 일정한 인가전압을 사용한다. 상기 범위의 전압을 인가하면, 용액속의 전이금속 이가이온이 산화되어 전이금속 삼가이온 유도체가 되고, 인터컬레이터에 의해 여기상태의 이가이온 유도체가 만들어지며, 이 유도체가 기저상태의 이가이온으로 되돌아 올 때, 약 610 nm 의 붉은색 빛이 발생한다. 이 때, 전이금속착물은 다시 +2 상태로 되돌아오며, 이는 다시 전극에 인가된 산화전압에 의해 +3가의 산화상태로 변하고 다시 인터컬레이터와 반응하여 빛을 발생시키는 사이클을 가지게 된다.
상기 광측정장치 부분은 암실상자(dark box) 안에서 포토카운터(Photo- counter) 검출기가 사용되어 전이금속이 나타내는 빛의 변화량을 디지털 신호로 변환시켜서 PC 에서 시간에 대한 발광량을 그래프로 표시하고 자료를 저장하는 역할을 한다.
본 발명에 따른 측정에 사용되는 장치는;
1) 탐침핵산을 고정화하기 위한 금속 표면으로서의 금 또는 백금 전극, 또는 금판,
2) 전이금속착물, 인산버퍼 용액, 타겟핵산, 인터컬레이터를 효율적으로 반응시킬 수 있는 샘플용기부분,
3) 기준전극 대비 일정한 전압을 인가하여 주는 전기공급장치부분,
4) 전기화학반응을 측정하는 전기화학측정장치 부분, 및
5) 인터컬레이터와 전이금속착물의 발광반응을 측정하는 광측정장치 부분 등을 포함하여 구성된다.
본 발명에 사용되는 핵산 인터컬레이터로 사용되는 물질은 핵산 이중나선 구조에 특이적으로 결합하며 전이금속착물의 산화-환원 반응을 유발시킬 수 있는 것으로, 독소루비신(doxorubicin) 또는 다우노루비신(daunorubicin) 등이 사용될 수 있다. 인터컬레이터는 종류에 따라 작은 홈, 큰 홈 또는 염기 쌍 사이 등에 결합하며, 인터컬레이터가 핵산 듀플렉스(nucleic acid duplex)와 인터컬레이션되는 양은 전극상의 혼성화되는 핵산 양과 비례한다. 본 발명에서 인터컬레이터로서 사용한 상기 독소루비신과 다우노루비신은 기존에 알려진 인터컬레이터 중에서 특히 우수한 전이금속착물의 전기화학발광 유발능력을 가진다. 또한, 본 발명에 사용되는 전이금속착물로는 루테늄 유도체를 사용하며, 트리스(2,2'-바이피리딜)루테늄 이가이온(Tris(2,2'-bipyridyl) ruthenium(Ⅱ)[Ru(bpy)3 2+]), 트리스(1,10-페난스롤라인)루테늄 이가이온 (tris(1,10- phenanthroline)ruthenium(Ⅱ)[Ru(phen)3 2+]) 등과 같은 루테늄 유도체가 특히 바람직하다.
본 발명의 기본 개념은 탐침핵산이 타겟핵산과 결합된 이중나선 구조에 인터컬레이터의 결합이 이루어지고, 결합된 인터컬레이터가 전이금속착물의 산화-환원 반응을 유도하여 빛을 발생하게 하여 전기화학발광 측정이 가능하다는 것이다. 인터컬레이터를 이용한 전기화학발광법은 루테늄만 사용하여 측정하던 기존의 방법과는 다른 새로운 핵산 혼성화 검출법을 제공한다. 본 발명의 타겟핵산을 검출하는측정 과정을 첨부된 도면을 참조하여 더욱 상세히 기술하면 다음과 같다.
도 1에서 알 수 있는 바와 같이, 인터컬레이터가 결합된 상태에서 지시전극(1) 상에 인가전압을 걸어주면 용액 속의 Ru(bpy)3 2+이 산화되어 Ru(bpy)3 3+유도체가 되고, 이는 인터컬레이터에 의해 여기상태의 Ru(bpy)3 2+*유도체가 되며, 이 유도체가 기저상태인 Ru(bpy)3 2+로 되돌아올 때 약 610 nm의 붉은색 빛을 발생하게 된다. 이 때 발생하는 빛은 포토멀티플라이어 튜브(Photomultiplier tube) 또는 아바란체 포토다이오드(avalanche photodiode)와 같은 광 검출기로 검출한다.
도 2는 금판 표면(2)에 탐침핵산을 자기조립법을 이용하여 단분자층으로 구성시킨 것을 보여준다. 지시전극(1)에 탐침핵산을 고정화하여 측정했을 경우 전압을 인가하여 측정하는 동안 전극 표면에 있는 핵산이 불안정화 되어 측정 노이즈가 많이 발생한다. 그러나, 지시전극과 별도의 금판(1 ~ 5mm2)을 사용하여 핵산을 고정화하면 시료의 처리가 용이하며, 측정과정에서 나타나는 노이즈가 감소되는 효과를 보인다. 여기에 타겟핵산을 투여하여 혼성화시켜 이중나선 핵산(3)를 형성시킨다. 혼성화된 이중나선 핵산에 인터컬레이터를 첨가하여 인터컬레이터를 핵산에 결합시킨다.
이하, 실시예를 들어 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 그러나 이들 실시예에 의하여 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 >
실시예 1
인터컬레이터로 독소루비신을 사용하고 루테늄 유도체로 Ru(bpy)3 2+을 사용하여 다음과 같은 실험조건으로 실시하였다.
우선, 티올 작용기를 5'-포스페이트 위치에 가지고 있는 핵산 (HS-C6-5'ACTCGCAAGCACCCTATCAGGC 3') 용액을 사용하여 금판 표면에 고정화하였다. 고정화를 위하여 튜브에 금판을 넣고 10 μM 올리고뉴클레오티드와 10 mM NaCl을 포함한 용액을 넣어 37 ℃ 에서 하룻밤 (약 10 시간) 동안 처리하였다. 올리고뉴클레오티드가 단층으로 올라간 금판을 인산 용액으로 세척한 후에 상보적인 염기서열을 가진 1 μM 올리고뉴클레오티드(5'-GCCTGATAGGGTGCTTGCGAGT-3')를 포함한 5X SSC 버퍼용액(750 mM 염화나트륨, 75 mM 시트르산 나트륨, pH7.0)에 담가 37 ℃ 에서 하룻밤 (약 10 시간) 동안 혼성화를 실시하였다. 그리고 나서, 혼성화된 핵산 위에 인산버퍼(pH7.4)에 녹인 1 mM 독소루비신 용액을 첨가한 후, 30 분 정도 실온에서 반응시켜 독소루비신을 올리고뉴클레오티드에 결합시켰다. 독소루비신을 올리고뉴클레오티드와 반응시킨 후, 1X SSC 버퍼 또는 인산버퍼용액(pH7.4)으로 세척하여 결합되지 않은 독소루비신을 제거하였다. 측정용기에 독소루비신이 결합된 샘플과 인산버퍼용액(pH7.4)에 용해시킨 Ru(bpy)3 2+용액 1 ㎖ 를 첨가하고, 독소루비신이 결합된 상태에서 전극(1) 상에 +1.19 V 의 인가전압을 걸어주어 광 검출기로 시간에 대한 광량 변화를 측정하였다.
도 5는 독소루비신과 Ru(bpy)3 2+과의 산화-환원반응을 광 측정장치로 측정한 결과를 보여준다. 금판에 핵산을 처리하지 않은 경우와 탐침 올리고뉴클레오티드를 처리한 경우, 올리고뉴클레오티드가 혼성화된 경우, 독소루비신 처리한 경우 등의 각 단계별로 측정한 결과를 보여준다.
도 5에서 a는 올리고뉴클레오티드와 결합하지 않은 상태의 금판 표면을 Ru(bpy)3 2+용액 상에서 측정했을 때 발광량을 나타낸다. 이 때, 발광되는 빛의 양은 루테늄 용액에 전압을 걸어주었을 경우에 나타나는 루테늄 자체의 발광량을 나타내는 것이다. b는 탐침 올리고뉴클레오티드를 고정화 시킨 다음 Ru(bpy)3 2+용액으로 측정했을 때 발광량을 나타낸다. 이 때, 루테늄의 자체 발광되는 빛의 양보다 약간 높은 정도를 나타내는데, 이는 루테늄과 탐침 올리고뉴클레오티드와의 상호작용에 의한 것으로 볼 수 있다. c는 탐침 올리고뉴클레오티드와 타겟 올리고뉴클레오티드가 혼성화 되었을 때 Ru(bpy)3 2+용액으로 측정한 발광량을 나타낸 것이다. 혼성화된 상태에서도 a의 금판 표면에서 측정했던 정도의 발광량을 보여주고 있다. d는 혼성화된 올리고뉴클레오티드에 독소루비신을 처리하고 세척하여 Ru(bpy)3 2+용액으로 측정했을 때의 발광량을 나타낸 것이다. 독소루비신은 혼성화된 올리고뉴클레오티드에 결합하여 세척단계에서 제거되지 않고 전기화학발광이 나타남을 보여준다. 이 때, 나타나는 발광량은 a,b,c 단계에서 나타나는 빛의 정도보다 2 배 정도의 수치를 보여 인터컬레이터에 의한 전기화학 발광이 유도되는 것을 볼 수 있다. 이러한 결과는 인터컬레이터로 핵산 혼성화를 측정하는 것이 효과적인 방법이라는 것을 보여준다.
실시예 2
인터컬레이터로 독소루비신을 사용하고 루테늄 유도체로 Ru(phen)3 2+을 사용하여 다음과 같은 실험조건으로 실시하였다.
우선, 티올 작용기를 5'-포스페이트 위치에 가지고 있는 올리고뉴클레오티드 (HS-C6-5'ACTCGCAAGCACCCTATCAGGC 3') 용액을 사용하여 금판의 표면에 고정화시켰다. 고정화시키기 위하여, 튜브에 금판을 넣고 10 μM 올리고뉴클레오티드와 10 mM NaCl 을 포함한 용액을 넣어 37 ℃ 에서 하룻밤 (약 10 시간) 동안 처리하였다. 올리고뉴클레오티드가 단층으로 올라간 금판을 인산 용액으로 세척한 후에 상보적인 염기서열을 가진 1 μM 올리고뉴클레오티드(5'-GCCTGATAGGGTGCTTGCGAGT-3')를 포함한 5X SSC 버퍼용액(750 mM 염화나트륨, 75 mM 시트르산 나트륨, pH7.0)에 담가 37 ℃ 에서 하룻밤 (약 10 시간) 동안 혼성화를 실시하였다. 그리고 나서, 혼성화된 올리고뉴클레오티드 위에 인산버퍼(pH7.4)에 녹인 1 mM 독소루비신 용액을 첨가한 후, 30 분 정도 실온에서 반응시켜 독소루비신을 올리고뉴클레오티드에 결합시켰다. 독소루비신을 올리고뉴클레오티드와 반응시킨 후 1X SSC 버퍼 또는 인산버퍼용액(pH7.4)으로 세척하여 결합되지 않은 독소루비신을 제거하였다. 측정용기에 독소루비신이 결합된 샘플과 인산버퍼용액(pH7.4)에 용해시킨 Ru(phen)3 2+용액 1 ㎖ 를 첨가하고, 독소루비신이 결합된 상태에서 전극(1) 상에 +1.19 V 의 인가전압을 걸어주어 광 검출기로 시간에 대한 광량 변화를 측정하였다.
도 6은 독소루비신과 Ru(phen)3 2+과의 산화-환원반응을 광측정장치로 측정한 결과를 보여준다.
도 6에서 e는 올리고뉴클레오티드 상태에서 독소루비신을 반응시키고 세척단계를 거친 후 Ru(phen)3 2+용액 상태에서 나타난 발광량을 측정한 것이다. 여기서 발광량은 제 5 도의 a와 비교하여 약간 높은 정도로 나타나고 있고 루테늄과 탐침핵산 간의 상호작용으로 전기화학발광이 일어나는 것을 볼 수 있다. f는 핵산이 혼성화되고 독소루비신이 인터컬레이팅 되었을 때 Ru(phen)3 2+용액 상태에서 전기화학발광을 측정한 것이다. 이 경우 독소루비신은 혼성화된 올리고뉴클레오티드에 결합하고 세척 단계를 거치면서 올리고뉴클레오티드에서 제거되지 않았으며, 또한 루테늄의 전기화학발광을 유도하여 빛을 발생시키는 것을 볼 수 있다.
실시예 3
인터컬레이터로 다우노루비신을 사용하고 루테늄 유도체로서 Ru(bpy)3 2+을사용하여 다음과 같은 실험조건으로 실시하였다.
우선, 티올 작용기를 5'-포스페이트 위치에 가지고 있는 올리고뉴클레오티드 (HS-C6-5'ACTCGCAAGCACCCTATCAGGC 3') 용액을 사용하여 금판의 표면에 고정화시켰다. 고정화시키기 위하여, 튜브에 금판을 넣고 10 μM 올리고뉴클레오티드와 10 mM NaCl 을 포함한 용액을 넣어 37 ℃ 에서 하룻밤 (약 10 시간) 동안 처리하였다. 올리고뉴클레오티드가 단층으로 올라간 금판을 인산 용액으로 세척한 후, 상보적인 염기서열을 가진 1 μM 올리고뉴클레오티드(5'-GCCTGATAGGGTGCTTGCGAGT-3')를 포함하는 5X SSC 버퍼용액 (750 mM 염화나트륨, 75 mM 시트르산 나트륨, pH7.0)에 담가 37 ℃ 에서 하룻밤 (약 10 시간) 동안 혼성화를 실시하였다. 그리고 나서, 혼성화된 올리고뉴클레오티드 위에 인산버퍼(pH7.4)에 녹인 1 mM 다우노루비신 용액을 올린 후, 30 분 정도 실온에서 반응시켜 다우노루비신이 올리고뉴클레오티드에 결합시켰다. 다우노루비신을 올리고뉴클레오티드와 반응시킨 후 1X SSC 버퍼 또는 인산버퍼용액(pH7.4)으로 세척하여 결합되지 않은 다우노루비신을 제거하였한다. 측정용기에 다우노루비신이 결합된 샘플과 인산버퍼용액(pH7.4)에 용해시킨 Ru(bpy)3 2+용액 1㎖ 를 첨가하고, 다우노루비신이 결합된 상태에서 전극(1) 상에 +1.19 V 의 인가전압을 걸어주어 광 검출기로 시간에 대한 광량 변화를 측정한다.
도 7은 다우노루비신과 Ru(bpy)3 2+과의 산화-환원반응을 광측정장치로 측정한 결과를 보여준다. 도 7에서 g는 올리고뉴클레오티드 상태에서 1 ml 다우노루비신 용액을 30 분 동안 실내온도에서 반응시킨 후 인산버퍼로 세척 후 Ru(bpy)3 2+용액 상에서 측정한 발광량을 나타낸다. 여기서 발광량은 도 5의 a와 비교하여 약간 높은 정도로 나타나고 있고 루테늄과 탐침 올리고뉴클레오티드 간의 상호작용으로 전기화학발광이 일어나는 것을 볼 수 있다. h는 올리고뉴클레오티드가 혼성화되고, 독소루비신이 인터컬레이팅 되었을 때 Ru(bpy)3 2+용액 상에서 전기화학발광을 측정한 것이다. 도 7의 g와 비교했을 경우 두 배 정도 발광량을 보여주고 있어 효과적인 검출이 이루어졌다고 볼 수 있다. 또한 g에 나타나는 탐침 올리고뉴클레오티드와 루테늄과의 상호작용이 약하게 일어나 발광량을 보여주고 있지만, 인터컬레이터에 의한 영향이 높아 탐침 올리고뉴클레오티드 상태와 혼성화된 올리고뉴클레오티드을 구별할 수 있는 방법으로 효과적으로 사용할 수 있다는 사실이 입증되었다.
기존의 전기화학발광에 있어서, 전이금속착물에 의한 타겟핵산 검출은 인터컬레이터를 사용하지 않은 방법으로써, 루테늄 또는 트리프로필아민 (Tripropylamine)을 탐침핵산에 결합시켜서 검출하는 방법은 시료처리 공정이 복잡하고 검출 감도가 좋지 않았다.
그러나, 본 발명에서는 인터컬레이터를 사용함으로써 상보적 결합이 되는 이중나선 핵산을 효과적으로 검출할 수 있다. 그리고, 핵산의 상보적 반응으로 생기는 핵산 이중나선에서 인터컬레이터가 인터컬레이션 되므로 정확하고 선택적인 검출이 가능하다. 또한, 기존의 핵산 어레이 등에 사용되는 Cy3, Cy5 등의 형광물질을 탐침핵산 또는 타겟핵산 등에 표지반응을 시킬 필요가 없어 검출과정이 신속하며, 별도의 복잡한 공정을 필요치 않으므로 간단한 작업으로 검출할 수 있다. 게다가, 전이금속착물을 전기화학발광으로 측정함으로써 레이저 또는 램프 등의 외부 광원이 필요하지 않으며, 기타 광학 부품인 필터나 편광기 등이 필요하지 않다. 그러므로, 저가의 측정시스템이 가능하며, 간단한 구성이 가능하다. 또한, 레이저 등의 광원을 사용하게 되면 노이즈 및 산란이 생기게 되는데, 이를 사용하지 않으므로 정확한 측정이 가능하다.

Claims (6)

  1. 삭제
  2. 반응용기에서 5'-포스페이트 위치에 티올작용기를 갖는 탐침핵산을 지시전극 표면에 고정화시키는 단계;
    상기 탐침핵산이 고정화된 지시 지시전극 표면을 세척한 후, 탐침핵산과 상보적인 염기서열을 갖는 타겟핵산을 포함하는 버퍼용액에 담가 혼성화를 실시하는 단계;
    상기 혼성화된 핵산에 인터컬레이터를 버퍼에 녹인 용액을 첨가하여 상기 인터컬레이터를 혼성화된 이중나선 핵산에 결합시키는 단계;
    버퍼용액으로 세척하여 결합하지 않은 인터컬레이터를 제거하는 단계;
    상기 혼성화 및 인터컬레이터의 결합이 이루어진 지시전극을 측정 용기에 넣고, 버퍼용액에 용해시킨 전이금속착물 용액을 첨가하고, 기준전극과 대전극을 설치하는 단계; 및
    기준전극 대비 지시전극 상에 인가전압을 걸어주어, 이중나선 핵산과 결합한 인터컬레이터가 전이금속착물의 산화-환원반응을 유도하게 하여 전기화학발광이 나타나게 하는 단계를 포함하고,
    상기 인터컬레이터가 금속 표면 상에 고정화된 탐침핵산과 용액 상의 타겟핵산 간의 혼성화 반응으로 형성된 이중나선 핵산에 특이적으로 결합하며, 전이금속착물의 산화-환원 반응을 유도하여 전기화학발광을 유발하는, 독소루비신 또는 다우노루비신이고,
    상기와 같이 인터컬레이터를 이용하여 전이금속착물의 전기화학발광을 유도시키고, 이때 발생하는 발광량을 측정함으로써 핵산의 혼성화를 측정하는 것을 특징으로 하는,
    핵산 혼성화 측정방법.
  3. 반응용기에 별도의 금판을 넣고 티올작용기를 5'-포스페이트 위치에 갖는 탐침핵산을 금판 표면에 고정화시키는 단계;
    상기 탐침핵산이 고정화된 금판을 인산용액으로 세척한 후, 탐침핵산과 상보적인 염기서열을 갖는 타겟핵산을 포함하는 버퍼용액에 담가 혼성화를 실시하는 단계;
    상기 혼성화된 핵산에 인터컬레이터로서 독소루비신 또는 다우노루비신을 버퍼에 녹인 용액을 첨가하여 반응시킴으로써 인터컬레이터를 혼성화된 이중나선 핵산에 결합시키는 단계;
    버퍼용액으로 세척하여 결합하지 않은 인터컬레이터를 제거하는 단계;
    상기 혼성화 및 인터컬레이터 결합이 이루어진 금판을 측정용기에 넣고, 버퍼용액에 용해시킨 전이금속착물 용액을 첨가하고, 지시전극, 기준전극 및 대전극을 설치하는 단계; 및
    기준전극 대비 지시전극상에 인가전압을 걸어주어, 이중나선 핵산과 결합한 인터컬레이터가 전이금속착물의 산화-환원반응을 유도하게 하여 전기화학발광이 나타나게 하는 단계를 포함하고,
    상기 인터컬레이터가 금속 표면 상에 고정화된 탐침핵산과 용액 상의 타겟핵산 간의 혼성화 반응으로 형성된 이중나선 핵산에 특이적으로 결합하며, 전이금속착물의 산화-환원 반응을 유도하여 전기화학발광을 유발하는, 독소루비신 또는 다우노루비신이고,
    상기와 같이 인터컬레이터를 이용하여 전이금속착물의 전기화학발광을 유도시키고, 이때 발생하는 발광량을 측정함으로써 핵산의 혼성화를 측정하는 것을 특징으로 하는,
    핵산 혼성화 측정방법.
  4. 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 상기 전이금속착물이 트리스(2,2'-바이피리딜)루테늄 이가이온[Ru(bpy)3 2+] 또는 트리스(1,10-페난스롤라인)루테늄 이가이온[Ru(phen)3 2+]인 핵산 혼성화 측정방법.
  5. 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 인가전압이 +1.12 ~ +1.20 V 인 핵산 혼성화 측정방법.
  6. 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 상기 핵산이 올리고뉴클레오티드, DNA, RNA, PNA 및 cDNA를 포함하는 군 중에서 선택되는 핵산 혼성화 측정방법.
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