KR20010035707A - 핵산검출방법, 및 핵산검출기와 이의 제조방법 - Google Patents

핵산검출방법, 및 핵산검출기와 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 탐침 DNA와 트리스(2,2'-비피리딜)금속착화합물 또는 그의 유도체가 금 표면에 고정되어 있는 전극; 상기 전극에 기준전극 대비 일정 전압을 인가하여 주는 전기화학장치; 및 상기 전극으로부터 발생되는 전기화학적 발광을 측정하는 광학측정장치를 포함하여 구성되는 타겟 DNA의 염기서열을 분석하는 핵산검출기 및 핵산검출용 키트를 제공하는 한편, 상기 핵산검출기의 제조방법과 이들을 이용한 핵산검출방법을 제공하여 고감도로 핵산을 검출할 수 있는 저가의 핵산검출시스템을 제공한다.

Description

핵산검출방법, 및 핵산검출기와 이의 제조방법{Method for detecting nucleic acids, detector for nucleic acids and method for producing the same}
본 발명은 전기화학발광을 이용한 핵산검출방법 및 핵산검출기, 그리고 핵산검출기의 제조방법에 관한 것으로서, 특히 미세 제작된 금 전극 위에 탐침 핵산과 Ru(bpy)3 2+유도체 등의 전기화학적 발광물질을 자기조립법(self-assembly)으로 고정화시킨 DNA칩을 포함하는 핵산검출기의 제조 방법과 상기 방법으로 제작된 칩을 이용하여 상보적 DNA 결합반응 후 형성된 DNA 듀플렉스를 전기화학발광을 이용하여 선택적으로 검출하는 핵산검출방법 및 상기 핵산검출기에 관한 것이다.
일반적으로 DNA 또는 RNA 등의 핵산검출법은 생물학 연구나 의료진단, 신약탐색, 법의학 등 많은 분야에 사용되고 있다.
서던 블롯팅(Southern blotting)법은 이 중 하나로서, 특정한 염기서열을 가진 DNA를 찾아내는 방법이다. 즉, 샘플인 DNA단편을 전기영동으로 분리하고, 분리된 DNA조각을 니트로셀룰로스(nitrocellulose)나 나일론 멤브레인(nylon membrane)과 같은 고체 기판상으로 이동시켜 DNA조각들의 상대적인 위치를 유지시킨다. 다음으로, 고체상에 고정된 DNA조각과 미리 준비해두었던 방사선 동위원소로 표지된 탐침(probe) DNA를 하이브리다이제이션시키게 되고, 이를 통해 찾고자 하는 염기서열을 가진 DNA조각의 위치를 알 수 있게 되는 것이다.
상기 방법을 응용하여 RNA를 검출하는 노던 블롯팅(Northern blotting)법이 개발되었으며, 작동하는 원리는 상기 서던 블롯팅법과 크게 다르지 않다.
그러나, 이러한 종래의 핵산검출법은 많은 노동력과 시간 그리고 막대한 자원을 필요로 하게 되는 단점이 있었으므로, 상기 단점을 해결하기 위해 다수의 핵산을 기판상의 기지(旣知)의 위치에 이차원으로 배열시키는 DNA칩(chip)이 개발되었다.
DNA칩은 좁은 기판 표면 위에 매우 다양한 염기 서열을 가지는 DNA조각을 고밀도로 배열시킨 것으로써, 고정된 DNA와 이에 상보적인 미지의 DNA시료와의 하이브리다이제이션(hybridization)을 통하여 미지 시료내의 DNA에 대한 정보를 알아내는 데 사용된다. 여기서 하이브리다이제이션이란 DNA 염기를 구성하는 아데닌(adenine)-티민(thymine)(A-T), 구아닌(guanine)-시토신(cytosine)(G-C)간의 수소결합에 의해 상보적인 염기서열을 갖는 유전자 부위(subsequence)가 서로 결합하여 이중 나선 DNA(double-stranded DNA)를 형성하는 것을 의미한다. 따라서, 미지의 DNA 시료의 단편들이 기판에 고정된 DNA 탐침과 상보적 결합을 하여 기판 표면에 놓이게 될 때 표지화된 DNA 탐침이나 DNA 시료 또는 하이브리다이제이션 반응 후의 이중 나선 DNA를 검출하여 시료내의 DNA 염기서열에 대한 정보를 알 수 있게 된다.
상기 표지 방법으로써 기존의 분자 생물학에서 가장 널리 사용되는 방법이 타겟(taget) DNA를 방사성 동위원소로 라벨링하는 방사능 사진법이다. 방사선 동위원소로는32P 또는35S 등이 사용되며, 라벨링된 타겟 DNA와 탐침 DNA의 결합 상태는 사진 건판(photographic films)을 이용하여 검출할 수 있다. 이 방법은 많은 기초 지식이 필요하지 않으므로 쉽게 적용할 수 있으나 검출시간이 몇 시간 혹은 하루 정도 걸리므로 곧바로 결과를 알 수 없고 분해능 또한 0.1 내지 10μm의 오더밖에 안되며, 나아가 표지에 사용되는 방사성 동위원소의 안정성에 문제가 있다.
따라서, 최근에는 레이저 유발 형광법(laser-induced fluorescence)이 많이 사용되고 있으며, 이 방법은 여러 가지 형광 물질이 사용 가능하다는 점과 분해능이 좋다는 장점과 동시에, 상기 방법에 CCD 카메라를 도입할 경우 형광물질로 표지된 분자들을 결합 즉시 영상화할 수 있게 되므로 결과 측정이 매우 빠르다는 장점도 있다. 그러나, 상기 방법은 가장 많이 사용되는 방법임에도 불구하고 미지의 DNA 시료를 측정하기 전에 이들을 형광물질과 공유결합시키는 과정이 필요하며, 레이저, 광학 측정용 부속장치 등 고가의 장비가 필요하다는 단점이 있다. 또한, 미국특허공보 제5,091,652호에 개시된 바와 같이 이차원 기판면을 스캔하기 위해서는 고가의 이미지 스캐너가 필요할 수밖에 없다.
핵산검출법으로 이용되는 또 다른 방법으로 웨이브가이드를 이용한 광학적검출법이 있다(P. A. Stimpson et al., Pro. Natl. Sci. USA, 91(1995) 6379-6383). 상기 방법은 2차원적인 광학적 웨이브 가이드와 빛의 산란 현상을 이용하여 근소한 파동(evanescent wave)을 만들고 상기 파동이 웨이브 가이드 표면의 DNA캡쳐(capture)지역에 흡착된 라벨에서 산란되도록 하는 것이다. 상기 라벨로 작용하는 입자는 탐침 올리고머와 DNA 단편이 결합된 지점에만 집중적으로 존재하며, 빛 산란의 원인이 된다. 이러한 광학적 검출법은 세척단계가 필요치 않아 매우 간편하며 칩의 결합 패턴을 CCD 카메라나 8mm 비디오로 즉시 눈으로 확인할 수 있으므로 검출단계에서 시간이 지체되지 않게 된다. 그러나, 이 방법 역시 고가의 장비를 필요로 하게 되는 단점이 있다.
또한, 표면 프라즈몬 공명(Surface Plasmon Resonance : SPR)법에 의해 라벨을 사용하지 않고 DNA결합을 검출하는 방법에 대한 연구가 최근 진행되고 있다. 상기 방법은 박막의 금속 표면과 용액간의 계면에 발생하는 굴절률의 변화나 두께의 변화를 감지하여 DNA결합을 검출하게 되므로, 라벨을 사용하지 않고도 DNA결합을 쉽게 검출할 수 있다는 장점이 있다. 그러나 상기 방법은 감도가 좋지 못하므로 1cm2의 표면에 약 1011정도의 탐침 DNA가 고정되어 있어야만 검출이 가능한 단점이 있다.
미국특허번호 제5,312,527호는 전기화학적으로 DNA 하이브리다이제이션을 측정하는 방법에 관한 것으로 전기화학적 활성을 갖는 금속착물과 이중 나선 DNA의 결합을 이용하여 DNA 하이브리다이제이션 결과를 측정하는 것이다. 이는 매우 간단한 시스템으로 제조 단가를 낮출 수 있으나, 감도가 좋지 않은 단점이 있다.
이상에서와 같이, 종래의 하이브리다이제이션을 이용한 핵산검출법은 모두 여러 가지의 단점을 가지고 있으며, 따라서 이를 해결하는 새로운 방법의 개발이 요구되었다. 특히 시료를 미리 표지 물질과 공유결합시키는 과정을 거치지 않고 DNA의 하이브리다이제이션을 감도가 좋으며 빠르게 검출할 수 있는 방법과, 나아가 휴대용 진단장치로의 개발을 위한 소형 저가의 검출 시스템을 개발하는 것이 요구되고 있다.
본 발명은 전기화학적 발광현상을 이용하여 핵산을 고감도로 검출할 수 있는 저가의 핵산검출기 및 이의 제조방법, 핵산검출용 키트 및 핵산검출방법을 제공한다.
도 1은 본 발명에 따른 DNA칩의 구조도이고,
도 2a는 본 발명에 따른 탐침 DNA를 내장한 DNA칩에 타겟 DNA가 주어졌을 때 하이브리다이제이션이 일어나 DNA 듀플렉스를 형성하는 과정의 모식도이고,
도 2b는 본 발명의 핵산검출기에서 항생물질이 DNA 듀플렉스의 마이너 그루브(minor groove)에 인터칼레이션(intercalation)되는 과정을 보여주는 모식도이고,
도 3은 본 발명에 이용되는 인터칼레이션 반응에 사용가능한 항생물질의 화학적 구조도이고,
도 4는 본 발명에 따른 여러 가지 다양한 탐침 DNA가 금 전극 표면의 각각의 미세위치에 고정되어 있는 DNA칩의 평면도이고,
도 5는 도 4에 도시된 DNA칩의 일부 단면도이고,
도 6은 본 발명의 핵산검출기의 전체 구조를 개략적으로 도시한 구조도이다.
도면의 주요부분에 대한 부호의 설명
11 : 금 전극
12 : 고정된 탐침 DNA
13 : 고정된 Ru(bpy)3 2+유도체
14 : 오메가 히드록시 운데케인티올(ω-undecanethiol)
51 : 기판
52 : 실리콘다이옥사이드(SiO2)층
53 : 금 전극
54 : 실리콘나이트라이드(Si3N4)층
55, 56, 57 : 각기 다른 DNA가 고정되어 있는 위치
58, 59, 510 : 각기 다른 탐침 DNA
61 : DNA칩
62 : 포텐시오스텟
63 : 대물렌즈
64 : 거울
65 : 렌즈
66 : 광검출부
67 : 광카운터
68 : A/D 변환기
69 : 컴퓨터
610 : X-Y 트랜스레이터
본 발명은 핵산검출기, 상기 핵산검출기의 제조방법 및 핵산을 검출하는 방법에 관한 것으로서, 특히 DNA칩이나 DNA센서에 있어서 칩이나 센서에 고정된 탐침 핵산과 생리학적 시료중 존재하는 타겟 핵산 사이의 하이브리다이제이션을 전이금속착물을 이용한 전기화학발광법을 이용하여 선택적으로 검출하는 핵산검출방법 및 핵산검출기에 관한 것이다.
본 발명은 탐침 DNA와, 트리스(2,2'-비피리딜) 금속착화합물 또는 그의 유도체인 전기화학적 발광물질이 금 표면에 고정되어 있는 전극; 상기 전극에 기준전극 대비 일정 전압을 인가하여 주는 전기화학장치; 및 상기 전극으로부터 발생되는 전기화학적 발광을 측정하는 광학측정장치를 포함하여 구성되는 타겟 DNA의 염기서열을 검출하는 핵산검출기를 제공한다.
본 발명에 따르는 상기 전기화학적 발광물질은, 바람직하게는, Ru(bpy)3 2+또는 Os(bpy)3 2+이다.
상기 탐침 DNA는 타겟 DNA와 상보적인 결합을 하는 단일 나선 DNA일 수 있다.
상기 전기화학장치는 삼전극계 또는 이전극계일 수 있다.
삼전극계를 채택하는 경우는 DNA칩이 작업 전극(working electrode)으로 기능하며, Ag/AgCl 전극 또는 은 전선(silver wire)이 기준 전극(reference electrode)으로, 그리고 백금선이 대전극(counter electrode)으로 사용될 수 있으며, 기준 전극과 작업 전극 간의 인가 전압을 조절하기 위하여 포텐시오스탯(potentiostat)이 사용될 수 있다. 반면에, 이전극계를 채택하는 경우에는 DNA칩이 작업 전극, 그리고 지면 또는 백금선이 대전극으로 사용될 수 있다. 이때, 건전지가 전압을 걸어주는 포텐시오스탯의 역할을 대신할 수도 있다.
상기 화학발광 측정을 위한 광학측정장치는, 바람직하게는, 광검출기, 광카운터, A/D 변환기 및 컴퓨터로 이루어진다.
한편, 화학발광을 검출하기 위한 상기 광검출기로는 APD(avalanche photodiode)나 PMT(photomultiplier tube) 등이 사용되거나, 여러 미세 위치를 검출하기 위하여 냉각 CCD 카메라 또는 펠티어(peltier)방식의 CCD 카메라도 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 핵산검출기는 표지물질을 라벨링하는 것에 의해 타겟 핵산을 검출하지 않으므로, 형광법 등에 사용되는 별도의 레이저나 LED와 같은 광원과 필터가 필요없다. 또한, 상기 발광은 전기화학적 반응에 의해 발생되는 빛이므로 형광물질을 여기시키기 위한 광원을 필요로 하지 않는다. 따라서, 본 발명에 따른 핵산검출기는 광원에 의한 노이즈와 산란을 최소화시킬 수 있어 고감도의 검출이 실현 가능하며, 상기와 같이 화학발광을 측정하기 위한 광학측정장치가 매우 간단하므로 전체 핵산검출기의 제조단가가 낮아지는 장점이 있다. 또한, 상기 광측정부에 APD(avalanche photodiode)를 사용하고 건전지를 전압 인가에 사용하면 후대용 스캐너를 제작하는 것이 가능하다.
본 발명은 또한, 상기 전극이 서로 다른 복수개의 탐침 DNA가 금 표면의 서로 다른 복수개의 미세 위치에 트리스(2,2'-비피리딜)금속착화합물 또는 그의 유도체와 함께 각각 고정되어 있는 전극인 것을 특징으로 하는 핵산검출기를 제공할 수 있다.
다른 한편으로, 상기 측정하고자 하는 생리학적 시료안의 타겟 DNA는 폴리머라제 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction : PCR)법 등으로 미리 증폭될 수 있다.
상기 생리학적 시료안의 타겟 DNA는 DNA칩상의 탐침 DNA와 하이브리다이제이션되어 DNA 듀플렉스(duplex)를 형성하게 되며, 그 후 항생물질을 포함한 용액을 가하면 항생물질이 DNA 듀플렉스에 인터칼레이션되어 결합된다. 다음으로, DNA칩상에서 인터칼레이션되지 않은 항생물질을 제거하게 되면 인터칼레이션된 항생물질을 전기화학발광법으로 모니터링할 수 있게 되고 결과적으로 DNA 듀플렉스를 모니터링할 수 있게 된다.
상기 DNA 듀플렉스(duplex)에 선택적으로 인터칼레이션(intercalation) 결합반응을 일으키는 항생물질로는 종래 전기화학적 검출법에 많이 사용되는 항생물질이라면 모두 가능하다. 바람직하게는, 상기 항생물질로서 분자구조상 3차 알킬아민기를 가지고 있는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 훽스트 33258(Hoechst 33258), 퀴나크린(Quinacrine) 또는 아크리딘 오렌지(Acridine Orange)가 사용될 수 있다.
한편, 전기화학적 발광물질로 Ru(bpy)3 2+의 유도체를 사용하는 경우에는 DNA칩 상의 전극에 약 1.2V의 산화전압을, Os(bpy)3 2+의 유도체가 사용되는 경우에는 약 0.6V의 산화전압을 전극에 인가하게 된다. 이때, 산화된 Ru(bpy)3 3+의 유도체 또는 Os(bpy)3 3+의 유도체가 전극 가까이에 위치하고 있는 알킬아민기를 포함한 항생물질과 산화환원 반응을 일으켜 여기상태(excited state)의 Ru(bpy)3 2+*의 유도체 또는 Os(bpy)3 2+*의 유도체를 만들게 되며, 여기된 상기 유도체가 기저 상태(ground state)로 되돌아올 때 약 610nm의 빛을 발생시킨다. 이때 금속착물은 다시 +2가 상태의 원래 산화상태로 되돌아오며, 이는 다시 전극에 인가된 산화 전압에 의해 +3가의 산화상태로 변하고 다시 항생물질과 반응하여 빛을 발생한다. 즉, 전압이 인가되는 동안 전이금속 착물은 항생물질이 모두 소모될 때까지 화학발광을 내게 되는 것이다.
본 발명에 따른 핵산검출기 및 핵산검출방법은 또한, 탐침 핵산 대신 효소를 Ru(bpy)3 2+유도체 착물과 함께 자기조립법으로 금 전극에 고정시킴으로써 화학발광을 유도하여 글루코스 등의 물질을 검출하는 방법에 응용될 수 있다. 예를 들어, 탈수소효소(dehydrogenase)에 의해 글루코스, 락테이트, 에탄올 등의 물질이 산화되면서 형성하는 NADH가 Ru(bpy)3 2+착물에 의해 화학발광을 일으키는 성질을 이용하여 상기 글루코스 등의 물질들을 동시에 분석 및 검출하는 다중바이오센서(multibiosensor)로서 활용이 가능하다. 상기 방법은 항체와 Ru(bpy)3 2+를 동일한 방식으로 고정시키고, 생리학적 시료에 포함된 항원을 글루코스 등으로 라벨링시킨 후 면역분석에 응용하면, 면역센서로도 사용이 가능하다.
본 발명의 다른 목적은 타겟 DNA를 포함하는 생리학적 시료; 상기 타겟 DNA와 상보적으로 결합할 수 있는 탐침 DNA와, 트리스(2,2'-비피리딜)금속착화합물 또는 그의 유도체가 금 표면에 고정되어 있는 전극; 상기 타겟 DNA와 탐침 DNA가 상보적으로 결합된 DNA 듀플렉스에 결합가능한 항생물질; 상기 전극에 기준전극 대비 일정 전압을 인가하여 주는 전기화학장치; 및 상기 트리스(2,2'-비피리딜)금속착화합물 또는 그의 유도체와, 항생물질과의 산화환원 반응을 통해 발생되는 전기화학적 발광을 측정하는 광학측정장치를 포함하여 구성되는 타겟 DNA의 염기서열 검출용 키트를 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 (1) 기판 위에 금 박막을 증착하여 전극을 형성하는 단계; (2) 상기 (1)단계의 전극을 세척하는 단계;(3) 탐침 DNA, 트리스(2,2'-비피리딜)금속착화합물 또는 그의 유도체, 및 오메가 히드록시 운데케인티올(ω-undecanethiol) 또는 3-머켑토프로피온산의 자기조립 물질들을 일정 용매에 녹인 혼합 용액에 상기 (2)단계 후의 전극을 담구어 상기 세가지 자기조립 물질들이 전극 위에 자기조립되는 단계; 및, (4) 상기 (3)단계 후의 전극을 세척하는 단계를 포함하는 타겟 DNA의 염기서열을 분석하는 핵산검출기의 제조방법을 제공하는 데에 있다.
이때 상기 기판으로서는 보로실리케이트 유리 또는 실리콘웨이퍼가 사용될 수 있다.
상기 핵산검출기의 제조방법은 상기 기판과 금 사이에 다수개의 박막을 형성하는 단계를 추가로 더욱 포함할 수 있다.
상기 (2)단계의 세척은 바람직하게는 기판을 피라나 용액 및 물로 순차적으로 세척하는 단계이다.
상기 (3)단계의 일정 용매는 에탄올/옥테인 혼합용매인 것이 바람직하다.
바람직하게는, 상기 자기조립 물질들로서 탐침 DNA, 트리스(2,2'-비피리딜)금속착화합물 또는 그의 유도체, 및 오메가 히드록시 운데케인티올이 사용되며, 이때 상기 (3)단계의 자기조립 반응시간은 상기 세가지 자기조립 물질들이 전극 표면의 약 50%를 커버하도록 조절되는 것이 전극과 금속착물사이의 전자전달 반응상 바람직하다.
상기 (3)단계의 혼합용액은 한쪽 피리딜 리간드에 알킬티올 작용기를 도입하여 합성한 Ru(bpy)3 2+또는 Os(bpy)3 2+전이금속착물 유도체, 5'-말단의 인산염 위치에 알킬티올 작용기를 가지고 있는 탐침 DNA, 및 오메가 히드록시 운데케인티올을 에탄올/옥테인 혼합용매에 녹인 용액인 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 상기 혼합용액의 몰비가 약 1 : 1 : 8이다.
상기 (4)단계의 세척은 기판을 에탄올과 물로 순차적으로 세척하는 과정일 수 있다.
본 발명은 다른 한편으로, 1) 제1항의 핵산검출기에 타겟 DNA를 포함하는 생리학적 시료를 넣고 배양하여, 탐침 DNA와 타겟 DNA가 상보적으로 결합된 DNA 듀플렉스를 형성하는 단계; 2) 상기 형성된 DNA 듀플렉스에 항생물질을 결합시키는 단계; 3) 상기 핵산검출기의 전극에 전압을 인가하여 트리스(2,2'-비피리딜)금속착화합물 또는 그의 유도체를 산화시키는 단계; 4) 상기 산화된 트리스(2,2'-비피리딜)금속착화합물 또는 그의 유도체가 항생물질과의 산화환원 반응을 통해 여기상태로 변환되는 단계; 및 5) 상기 여기상태의 트리스(2,2'-비피리딜)금속착화합물 또는 그의 유도체가 기저상태로 돌아오면서 방출하는 빛의 양을 측정하는 단계를 포함하여 이루어지는 타겟 DNA의 염기서열을 검출하는 핵산검출방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적, 특징 및 잇점들은 첨부한 도면을 참조한 실시예들의 상세한 설명을 통해 명백해질 것이다.
상기와 같은 특징을 갖는 본 발명의 바람직한 실시예를 첨부된 도면을 참조하여 설명하면 다음과 같다.
실시예
핵산검출기의 제조방법
도 1은 본 발명에 따른 DNA칩의 구조도이다.
우선, 기판 위에 형성된 금 전극(11) 표면에 자기조립법을 이용하여 탐침 DNA(12)와 전기화학발광물질인 트리스(2,2'-비피리딜)루테늄(II)(Ru(bpy)3 2+) 또는 트리스(2,2'-비피리딜)오스뮴(II)(Os(bpy)3 2+)의 유도체(13)가 고정된 단분자막층(monolayer)을 형성한다. 순서대로 설명하면 다음과 같다.
기판으로는 실리콘 웨이퍼 또는 보로실리케이트(borosilicate) 유리기판을 사용할 수 있다. 상기 기판 위에 먼저 프라즈마 증강 화학증착법(plasma enhanced chemical vapor deposition)으로 실리콘 다이옥사이드(SiO2)를 약 1000Å의 두께로 제작한다. 다음으로, 크롬(Cr)을 약 800Å의 두께로 진공증착시키고, 이어서 약 1000Å두께의 금을 진공증착시킨다. 상기 증착된 기판 위로 포지티브 포토레지스트를 도포한 후, 일정 패턴을 가진 마스크를 통해 빛을 조사한 후 현상하여 광분해된 포토레지스트를 제거한다. 다음으로 드러난 금부분을 에칭한 후, 그 위에 PECVD를 이용하여 시리콘 나이트라이드(Si3N4)를 약 3000 내지 5000Å의 두께로 증착시킨다.
다음으로, 금 전극의 표면은 DNA와 전이금속착물을 자기조립법으로 고정화하기 위한 세척과정을 필요로 한다. 세척액은 진한 황산과 30% H2O2의 3 : 1 혼합용액으로 100℃로 열처리를 한 피라나(Phiranha)용액을 사용한다. 상기 피라나 용액에 전극을 수초간 담가 세척한 후 물로 최종 세척한다.
그 후, 한쪽 피리딜 리간드에 알킬티올기를 도입하여 합성한 Ru(bpy)3 2+또는 Os(bpy)3 2+전이금속착물 유도체와, 역시 티올 작용기를 5'-말단 인산염 위치에 가지고 있는 탐침 DNA, 그리고 오메가 히드록시 운데케인티올(ω-undecanethiol)용액을 약 1:1:8의 몰비로 에탄올/옥테인 혼합용매에 녹인 혼합용액에 전극을 약 10분간 담근다. 그리고, 전극을 에탄올과 물로 순차적으로 세척하면 DNA칩의 제작은 완료된다. 이때, 사용한 오메가 히드록시 운데케인티올(ω-undecanethiol)(14)은 전극의 표면에로의 비특이적(non-specific) DNA 흡착을 막아주는 역할을 수행한다. 그러나 전극의 표면이 상기한 자기조립 물질들에 의해 100% 커버되는 경우 전극과 전이금속착물의 전자전달반응이 어려우므로 전극 표면의 약 50%를 커버하도록 자기조립반응의 시간을 조절하는 것이 바람직하다. 또는, 오메가 히드록시 운데케인티올(ω-undecanethiol)대신에 탄화수소의 길이가 짧은 3-머캡토프로피온산(3-mercaptopropionic acid)을 사용할 수도 있는 데, 이 경우는 표면 커버리지에 관계없이 전자전달을 용이하게 수행할 수 있다.
실시예에서 사용되는 전극은 삼전극계로 구성되어 있는 것으로서, DNA칩이 작업전극(working electrode)으로 작용하게 되며, 기준전극과 대전극(counter electrode)을 포함한다. 상기 기준전극과 대전극은 DNA칩에 내장하지 않고 별도의 전극을 사용하면 된다. 즉, 도 6에서 나타난 바와 같이, 기준전극과 대전극을 화학발광 측정부의 대물렌즈(63) 옆에 나란히 부착할 수 있다. 이때, Ag/AgCl(3M NaCl) 또는 단순히 은선(silver wire)을 준기준전극(quasi reference electrode)로써 사용할 수 있으며, 대전극으로는 백금(platinum)을 사용한다.
DNA칩에 소수의 DNA를 고정시킬 경우에는 상기 기준전극과 대전극을 DNA와 전이금속착물이 고정된 작업전극에 이웃한 위치에 함께 제작할 수 있다. 이때 대전극은 백금 전극으로 진공증착방법으로 약 1000Å의 두께로 제작할 수 있으며, 기준전극은 은을 약 1000Å의 두께로 진공증착하여 사용한다.
한편, 다양한 타겟 DNA를 검출할 수 있는 DNA칩도 제작이 가능하다.
도 4는 여러 가지 다양한 탐침 DNA가 36개의 각각의 미세위치에 고정되어 있는 DNA칩의 평면도로써, 이같은 다양한 탐침 DNA를 통해 여러 가지 다양한 타겟 DNA를 검출하는 것이 가능하다. 이를 보다 구체적으로 설명하기 위해, 상기 DNA칩의 일부 단면도를 도 5로 나타내었다.
도 5에 도시된 바와 같이, 서로 다른 탐침 DNA(58, 59 및 510)가 서로 다른 미세 위치(55, 56 및 57)에 Ru(bpy)3 2+의 유도체와 함께 고정되어 있다. 비교적 간단한 마스크의 사용, 광식각 기술 등 일반 반도체 공정을 이용하여 상기 DNA칩의 제작이 가능하다.
상기 제작된 DNA칩의 각각의 위치(55, 56 및 57)에 각각 다른 탐침 DNA와 Ru(bpy)3 2+착물, 및 오메가 히드록시 운데케인티올(ω-undecanethiol)이 약 1:1:8(몰비)로 혼합된 용액을 마이크로 스팟팅(spotting)방식으로 고정화시킨다. 이와 같이, 각각의 위치에 각각의 다른 탐침 DNA를 고정시킴에 의해 각각의 탐침 DNA와 대응하는 각각의 다른 타겟 DNA를 서로 다른 미세 위치에 고정화시킬 수 있다.
핵산검출방법
도 2a는 앞에서 제작한 탐침 DNA를 내장한 핵산검출기에 타겟 DNA가 주어졌을 때 하이브리다이제이션이 일어나 DNA 듀플렉스를 형성한 과정의 모식도이다.
상기 DNA 결합반응은 일반적인 결합반응 조건하에서 수행된다. 이때, 전극에 양극의 전압을 걸어주면 음전하를 띤 타겟 DNA가 전극으로 빠르게 이동되어 상보적인 탐침 DNA와의 결합반응이 용이해지게 된다. DNA와의 결합반응 후 전극에 음극의 전압을 걸어주면 탐침 DNA와 결합하지 않고 남아있는 비상보적(non-complementary)인 DNA들이 용이하게 제거된다.
도 2b는 결합반응 후 항생물질을 DNA칩에 가하여 항생물질이 DNA 듀플렉스의 마이너 그루브(minor groove)에 인터칼레이션(intercalation)되는 과정을 보여주는 모식도이다. 상기 인터칼레이션 반응은 전기화학측정법에 응용될 수 있다 (K.Hashimoto, K.Ito, Y.Ishimori, Anal. Chem., 66(1994)3830-3833).
도 3은 인터칼레이션 반응에 사용될 수 있는 항생물질의 화학적 구조도이다. 일반적으로 상기 항생물질에 붙어있는 3차 알킬아민기가 Ru(bpy)3 2+또는 Os(bpy)3 2+와 반응하여 화학발광을 일으킬 때 그 빛의 세기가 큰 것으로 알려져 있다(W.Y.Lee and T.A.Nieman, Anal. Chem. 67(1995) 1789-1796). 항생물질과 결합한 전극은 다시 세척과정을 거쳐 인터칼레이션되지 않은 항생제를 제거한다. 이때 항생물질이 DNA 듀플렉스에 인터칼레이션되는 양은 전극상의 DNA 듀플렉스의 양에 비례하고 이는 다시 생리학적 시료에 존재하는 타겟 DNA양에 비례한다.
본 발명의 전기화학적 발광물질로서 DNA칩 상의 전극에 Ru(bpy)3 2+의 유도체를 사용하는 경우는 약 +1.2V의 전압을 전극에 인가하며, Os(bpy)3 2+의 유도체를 사용하는 경우는 약 +0.6V의 전압을 전극에 인가하게 되며, 이를 통해 산화된 Ru(bpy)3 3+의 유도체 또는 Os(bpy)3 3+의 유도체가 전극에 가까이 위치한 알킬아민기를 포함하고 있는 항생제와의 산화환원 반응을 통해 여기상태(excited state)의 Ru(bpy)3 2+*의 유도체 또는 Os(bpy)3 2+*의 유도체를 만들게 된다. 이 유도체는 기저상태(ground state)로 되돌아올 때 약 610nm의 오렌지색 빛을 발생시킨다. 상기 발광을 통해 금속착물은 다시 +2가 상태의 원래 산화상태로 되돌아오며, 그후 다시 전극에 인가된 산화전압에 의해 +3가의 산화상태로 변하게 되어 다시 항생제와 반응하여 빛을 발생할 수 있게 되는 것이다. 즉, 전압이 인가되는 동안 전이금속착물은 전극에 위치한 항생물질이 모두 소모될 때까지 화학발광을 내게 된다. 상기한 과정을 연쇄 반응식으로 나타내면 아래와 같다.
(1) Ru(bpy)3 2+ +1.2VRu(bpy)3 3+
(2) 항생제 + Ru(bpy)3 3+Ru(bpy)3 2+*+ 항생제 산화물
(3) Ru(bpy)3 2+*Ru(bpy)3 2++ 빛(약 610nm)
이때 발생된 빛의 양은 항생물질의 양에 비례하며, 상기 항생제의 양은 생리학적 시료에 존재하는 타겟 DNA의 양에 비례하게 되므로 측정된 광량은 생리학적 시료에 포함된 타겟 DNA의 양과 정비례 관계를 갖게 된다.
상기 제작된 DNA칩의 탐침 DNA는 타겟 DNA와 하이브리다이제이션을 한 후, 항생물질을 포함한 용액을 가하여 상기 항생물질이 하이브리다이제이션된 DNA 듀플렉스에 인터칼레이션 되도록 하고, 인터칼레이션 되지 않은 항생물질을 제거하게 되면, 인터칼레이션된 항생물질을 전기화학발광법으로 모니터링할 수 있게 되고 결과적으로 하이브리다이제이션된 DNA 듀플렉스를 모니터링할 수 있게 된다.
상기 광측정을 위해 칩 리더(chip reader)가 사용될 수 있다. DNA칩의 여러 위치중 측정하고자 하는 위치에 있는 전극에 기준전극 대비 약 1.2 V의 전압을 가하면 전극 위에 고정화된 Ru(bpy)3 2+가 Ru(bpy)3 3+로 산화한다. 산화된 Ru(bpy)3 3+착물과 항생물질과의 산화환원 반응에 의해 약 610nm의 빛이 발생하며, 상기 빛은 칩 리더의 헤드부로 입사된다. 상기 헤드부는 대물렌즈와 거울 등의 광학 부품으로 구성되어 있다. 헤드로 입사된 화학발광은 렌즈를 거쳐 광증배관(PMT)이나 APD(avalanche photodiode) 등에서 광을 증배시키고 감도가 높은 광센서에 의해 전기신호로 바뀌게 된다.
한편, 다른 미세위치의 DNA 하이브리다이제이션 결과를 측정하고자 할 때에는 DNA칩이 올려져 있는 X-Y 트랜스레이터(610)를 이동함과 동시에 전압의 인가를 새로이 하여 다른 미세 위치로 이동시킨다. 이러한 과정을 연속하면 DNA칩상의 모든 미세위치에서 발생하는 하이브리다이제이션 결과를 순차적으로 검출할 수 있다.
다른 한편으로, 액체 질소를 사용하여 냉각하는 CCD 카메라나 펠티어(peltier) 방식의 CCD 카메라를 사용하고 DNA칩상의 모든 미세위치의 전극에 모두 동일한 산화전압을 인가하여 주면 DNA칩상의 모든 위치의 DNA의 하이브리다이제이션 결과를 동시에 검출할 수 있게 되어 신속한 검출이 가능하다.
이상 설명한 내용을 통해 당업자라면 본 발명의 기술사상을 일탈하지 아니하는 범위에서 다양한 변경 및 수정이 가능함을 알 수 있을 것이다.
따라서, 본 발명의 기술적 범위는 실시예에 기재된 내용으로 한정되는 것이 아니라 특허 청구의 범위에 의하여 정해져야 한다.
본 발명에 따른 핵산검출기 및 핵산검출방법은 고정화된 탐침 핵산과 타겟 핵산 사이의 선택적 결합반응 결과를 고감도로 검출할 수 있고, 검출 전 표지물질과 생리학적 시료를 공유결합시키는 복잡한 표지반응(labelling) 과정을 필요로 하지 않아 검출과정이 간단하며 신속하다.
또한, 본 발명에 따른 핵산검출기의 전극의 전압을 조절하여 핵산의 결합반응을 향상시킬 수 있다.
본 발명의 핵산검출방법은 전기화학적 발광을 측정하는 방법으로써, 외부의 광원을 필요로 하지 않게 되므로 레이저 등의 광원이나 필터가 필요하지 않아 저가의 측정시스템을 가능하게 하는 동시에 광원에 의한 노이즈와 산란을 최소화시킬 수 있어 고감도의 분석 및 검출이 가능하다.

Claims (11)

  1. 탐침 DNA와 트리스(2,2'-비피리딜)금속착화합물 또는 그의 유도체인 전기화학적 발광물질이 금 표면에 고정되어 있는 전극;
    상기 전극에 기준전극 대비 일정 전압을 인가하여 주는 전기화학장치; 및
    상기 전극로부터 발생되는 전기화학적 발광을 측정하는 광학측정장치를 포함하여 구성되는 타겟 DNA의 염기서열을 분석하는 핵산검출기.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 탐침 DNA는 타겟 DNA와 상보적인 결합을 하는 단일 나선 DNA인 것을 특징으로 하는 핵산검출기.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 전기화학적 발광물질이 Ru(bpy)3 2+또는 Os(bpy)3 2+인 것을 특징으로 하는 핵산검출기.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 전기화학장치는 삼전극계 또는 이전극계인 것을 특징으로 하는 핵산검출기.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 전극은 서로 다른 복수개의 탐침 DNA가 금 표면의 서로 다른 복수개의 미세 위치에 트리스(2,2'-비피리딜)금속착화합물 또는 그의 유도체와 함께 각각 고정되어 있는 전극인 것을 특징으로 하는 핵산검출기.
  6. 타겟 DNA를 포함하는 생리학적 시료;
    상기 타겟 DNA와 상보적으로 결합할 수 있는 탐침 DNA, 및 트리스(2,2'-비피리딜)금속착화합물 또는 그의 유도체가 금 표면에 고정되어 있는 전극;
    상기 타겟 DNA와 탐침 DNA가 상보적으로 결합된 DNA 듀플렉스에 결합가능한 항생물질;
    상기 전극에 기준전극 대비 일정 전압을 인가하여 주는 전기화학장치;및
    상기 트리스(2,2'-비피리딜)금속착화합물 또는 그의 유도체와, 항생물질과의 산화환원 반응을 통해 발생되는 전기화학적 발광을 측정하는 광학측정장치를 포함하여 구성되는 타겟 DNA의 염기서열 검출용 키트.
  7. (1) 기판 위에 금 박막을 증착하여 전극을 형성하는 단계;
    (2) 상기 (1)단계의 전극을 세척하는 단계;
    (3) 탐침 DNA, 트리스(2,2'-비피리딜)금속착화합물 또는 그의 유도체, 및 오메가 히드록시 운데케인티올 또는 3-머켑토프로피온산의 자기조립 물질들을 일정 용매에 녹인 혼합 용액에 상기 (2)단계 후의 전극을 담구어 상기 세가지 자기조립 물질들이 전극 위에 자기조립되는 단계;및
    (4) 상기 (3)단계 후의 전극을 세척하는 단계를 포함하는 타겟 DNA의 염기서열을 분석하는 핵산검출기의 제조방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 기판과 금 사이에 다수개의 박막을 형성하는 단계를 추가로 더욱 포함함을 특징으로 하는 핵산검출기의 제조방법.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 자기조립 물질들은 탐침 DNA, 트리스(2,2'-비피리딜)금속착화합물 또는 그의 유도체, 및 오메가 히드록시 운데케인티올이며, 이때 상기 (3)단계의 자기조립 반응시간은 상기 세가지 자기조립 물질들이 전극 표면의 약 50%를 커버하도록 조절되는 것을 특징으로 하는 핵산검출기의 제조방법.
  10. 제7항에 있어서,
    상기 (3)단계의 혼합용액은 한쪽 피리딜 리간드에 알킬티올 작용기를 도입하여 합성한 트리스(2,2'-비피리딜)금속착화합물 또는 그의 유도체, 5'-말단의 인산염 위치에 알킬티올 작용기를 가지고 있는 탐침 DNA, 및 오메가 히드록시 운데케인티올을 에탄올/옥테인 혼합용매에 녹인 용액인 것을 특징으로 하는 핵산검출기.
  11. 1) 제1항의 핵산검출기에 타겟 DNA를 포함하는 생리학적 시료를 넣고 배양하여, 탐침 DNA와 타겟 DNA가 상보적으로 결합된 DNA 듀플렉스를 형성하는 단계;
    2) 상기 형성된 DNA 듀플렉스에 항생물질을 결합시키는 단계;
    3) 상기 핵산검출기의 전극에 전압을 인가하여 트리스(2,2'-비피리딜)금속착화합물 또는 그의 유도체를 산화시키는 단계;
    4) 상기 산화된 트리스(2,2'-비피리딜)금속착화합물 또는 그의 유도체가 항생물질과의 산화환원 반응을 통해 여기상태로 변환되는 단계; 및
    5) 상기 여기상태의 트리스(2,2'-비피리딜)금속착화합물 또는 그의 유도체가 기저상태로 돌아오면서 방출하는 빛의 양을 측정하는 단계를 포함하여 이루어지는 타겟 DNA의 염기서열을 분석하는 핵산검출방법.
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