WO2005103695A1

WO2005103695A1 - 遺伝子検出方法及び遺伝子検出装置

Info

Publication number: WO2005103695A1
Application number: PCT/JP2005/008374
Authority: WO
Inventors: Mizuo Maeda; Katsumi Akimoto; Junichi Hori; Ryusuke Murayama; Jinpei Tabata; Katsuhiko Bando
Original assignee: Matsushita Electric Industrial Co., Ltd.; Microtec Co., Ltd.
Priority date: 2004-04-23
Filing date: 2005-04-25
Publication date: 2005-11-03
Also published as: EP1757935A4; JPWO2005103695A1; CN1947013A; EP1757935A1; US20080138802A1

Abstract

検体試料中の特定の配列を有する遺伝子を高感度に検出する遺伝子検出方法及びその装置を提供する。検体試料中の特定の配列を有する検出すべき遺伝子を一本鎖に変性して遺伝子サンプルを作製する遺伝子サンプル作製工程と、該遺伝子サンプルの配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の核酸プローブを電極に固定化する固定化工程と、前記核酸プローブを固定化してなる電極に、前記遺伝子サンプルを添加して、電極上に前記核酸プローブと前記遺伝子サンプルとがハイブリダイズした二本鎖核酸を形成する二本鎖核酸形成工程と、電気化学的に活性であり、かつ光照射により前記二本鎖核酸と共有結合する挿入剤を添加する挿入剤添加工程と、光照射を行うことで前記二本鎖核酸と前記挿入剤を共有結合させる光照射工程と、前記二本鎖核酸と未反応の挿入剤を洗浄する洗浄工程と、前記二本鎖核酸と共有結合した挿入剤を電気化学的な測定により検出する測定工程を含む。

Description

明細書遺伝子検出方法及び遺伝子検出装置技術分野

本発明は、試料中に存在する特定の遺伝子配列を有する目的遺伝子を、挿入剤の電気化学的な発光を読み取ることで検出する遺伝子検出方法及びその装置に関する。

背景技術

従来の、電気化学的に特定の遺伝子配列を検出する方法は、検出すべき目的遺伝子に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の核酸プローブを電極表面に固定化し、該核酸プローブと、一本鎖に変性された目的遺伝子サンプルとをハイプリダイズさせた後、該核酸プローブと目的遺伝子サンプルとの二本鎖核酸に特異的に結合し、且つ電気化学的に活性な揷入剤を、該核酸プローブと遺伝子サンプルとの反応系に添加する。そして、前記揷入剤が添加された反応系中に電圧を印加して電気化学的な測定を行い、前記二本鎖核酸に結合した挿入剤を検出することにより、前記目的遺伝子サンプルとハイブリダィズした前記核酸プローブを検出し、目的とする遺伝子の存在を確認する（例えば、特許文献 1及び特許文献 2参照)。

ここで、前記挿入剤とは、前記二本鎖の核酸を認識して、該ニ本鎖核酸と特異的に結合する物質を指す。前記挿入剤は、何れも分子中にフエニル基等の平板状挿入基を有し、該揷入基が二本鎖核酸の塩基対と塩基対との間に介入することによって、二本鎖核酸と結合する。この挿入剤と二本鎖核酸との結合は、静電気的相互作用あるいは疎水的相互作用での結合であって、前記挿入剤の前記二本鎖核酸の塩基対間への挿入、及びその塩基対間からの離脱が一定の速度で繰り返される平衡反応による結合である。

前記挿入剤の中には、電気的に可逆な酸化還元反応を起こす物質がある。このような電気化学的に可逆である酸化還元反応を起こす挿入剤を用いることにより、電気化学的変化の測定によって、前記二本鎖核酸に結合した挿入剤の存在を検出することができる。なお、この電気化学的変化は、酸化還元時に発生する電流や発光等で検出することができる。

つまり、従来の遺伝子検出方法においては、前記挿入剤が二本鎖核酸にのみ特異的に結合すること、また、前記二本鎖核酸に結合した揷入剤の量を正確に検出することが重要であった。

しかし、従来の遺伝子検出に用いられる挿入剤は、一本鎖の核酸プローブや、該核酸プローブが固定される電極表面にも、非特異的に吸着してしまう。そして、この非特異的に吸着した挿入剤は、前記二本鎖核酸に結合した挿入剤の量の検出時に、バックグランドノイズとなり、検出感度を低下させる原因となる。

これを解消するため、従来方法においては、前記核酸プローブと遺伝子サンプルとの反応系に前記挿入剤を添加した後に、前述したバックグラウンドノイズとなる、一本鎖の核酸プローブや電極表面に非特異的な吸着をしている挿入剤を除去する洗浄処理が必要となっている（例えば、特許文献 2参照）。

特許文献 1特許第 2 5 7 3 4 4 3号公報

特許文献 2特許第 3 2 3 3 8 5 1号公報

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

しかしながら、前述したように、挿入剤と二本鎖核酸とは、静電気的相互作用あるいは疎水的相互作用によって結合されているものであるため、その結合力は弱く、前述の洗浄処理の際に、二本鎖核酸に結合させた挿入剤も解離してしまい、逆に検出感度を低下させてしまう、という課題がある。

一方、前記洗浄処理において、前記二本鎖核酸に結合した挿入剤が解離しないように考慮した場合は、前記一本鎖の核酸プローブや電極表面に非特異的な吸着をしている挿入剤の除去が不十分となるため、バックグランドノイズを十分に除去できず、検出感度が低下してしまう問題が生じる。

さらに、前記挿入剤と二本鎖核酸間の結合反応が平衡反応であることから、該挿入剤が二本鎖核酸の塩基対間へ挿入される割合が低いため、たとえ前述したバックグラウンドノィズが生じなかったとしても、検出感度が低いという問題があつた。本発明は、前記課題を解決するためになされたものであって、検体試料中の遺伝子を高感度に検出可能な遺伝子検出方法及びその装置を提供することを目的とする。課題を解決するための手段

前記従来の課題を解決するため、本発明の遺伝子検出方法は、検体試料中の特定の配列を有する遺伝子を検出する遺伝子検出方法であって、前記検体試料中の検出すべき遺伝子を一本鎖に変性して遺伝子サンプルを作製する遺伝子サンプル作製工程と、前記検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の核酸プローブを電極に固定化させる固定化工程と、前記一本鎖の遺伝子サンプルを、前記一本鎖の核酸プローブが固定化された電極に添加し、前記核酸プローブと前記遺伝子サンプルとがハイブリダイズした二本鎖核酸を形成する二本鎖核酸形成工程と、前記二本鎖核酸が形成された電極に、電気化学的に活性であり、且つ光照射により前記二本鎖核酸と共有結合する挿入剤を添加する揷入剤添加工程と、光照射を行うことにより、前記二本鎖核酸と前記挿入剤とを共有結合させる光照射工程と、前記二本鎖核酸と未反応の挿入剤を洗浄する洗浄工程と、前記洗浄工程後の、前記二本鎖核酸と共有結合した挿入剤を電気化学的な測定により検出する検出工程、とを含むものである。

これにより、前記遺伝子サンプルと核酸プローブとをハイプリダイズさせた二本鎖核酸と、前記挿入剤とを、不可逆的、且つ強固に結合させることができ、前記検体試料中の遺伝子を高感度に検出することができる。また、前記洗浄工程において、前記二本鎖核酸に結合した挿入剤は解離することがないが、一本鎖の核酸プローブあるいは電極表面に非特異的な吸着をしている挿入剤を除去することができるため、前記検体試料中の遺伝子を高感度に検出することができる。

さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記電気化学的な測定が、前記電極に対して電圧を印加し、前記二本鎖核酸と共有結合した挿入剤による電気化学発光量を測定するものである。

これにより、電極に固定された二本鎖核酸を高感度に検出することができ、この結果、核酸プローブとハイブリゼーシヨン反応させた遺伝子サンプルを、高感度に検出することができる。

さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記挿入剤が、前記二本鎖核酸に特異的に挿入し、かつ光照射により該ニ本鎖核酸と共有結合を形成する二本鎖核酸結合部位と、電気化学活性を有する電気化学活性部位と、前記二本鎖核酸結合部位と前記電気化学活性部位とを連結する連結部位と、を有する化合物からなるものである。

これにより、前記二本鎖核酸と前記挿入剤とを、不可逆的、且つ強固に結合させることができ、この結果、前記二本鎖核酸に挿入される挿入剤の割合が増え、検出すべき遺伝子サンプルを高感度に検出することができる。

さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記二本鎖核酸結合部位が、感光性を持つ挿入剤であるものである。

これにより、前記二本鎖核酸と前記挿入剤とを、光照射することによって、不可逆的、且つ強固に結合させることができる。

さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記感光性を持つ挿入剤が、フロクマリン誘導体であるものである。

さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記フロクマリン誘導体が、ソラレン誘導体であるものである。

さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記酸化還元性を有する化合物が、電気化学発光を示す化合物であるものである。

これにより、前記電極に電圧を印加すると、該電極に固定化された二酸化核酸に結合した挿入剤が酸化還元反応すると共に発光し、該電気化学発光量を測定することで、検出すべき遺伝子サンプルを検出することができる。

さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記電気化学発光を示す化合物が、配位子に複素環系化合物を有する金属錯体、ルブレン、アントラセン、コロネン、ピレン、フルオランテン、クリセン、フエナントレン、ペリレン、ビナフチル、ォクタテトラエンであるものである。

さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記配位子に複素環系化合物を有する金属錯体が、配位子にピリジン部位を有する金属錯体であるものである。

さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記配位子にピリジン部位を有する金属錯体が、金属ビピリジン錯体、金属フエナント口リン錯体であるものである。さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記配位子に複素環系化合物を有する金属錯体の中心金属が、ルテニウム、ォスニゥムであるものである。

これにより、前記電極に電圧を印加した際、より良好な電気化学発光量を得ることができ、前記遺伝子サンプルをより高感度に検出することができる。

また、本発明の遺伝子検出装置は、検体試料中の特定の配列を有する遺伝子を検出する遺伝子検出装置であって、前記検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の核酸プローブを固定化してなる電極と、前記電極に固定化した核酸プローブと、前記検体試料中の前記検出すべき遺伝子を一本鎖に変性した遺伝子サンプルとをハイブリダィズさせて二本鎖核酸を形成する二本鎖核酸形成槽と、電気化学的に活性であり、且つ光照射により前記二本鎖核酸と共有結合する挿入剤を、前記電極に添加して光照射し、前記二本鎖核酸と前記挿入剤とを共有結合させる挿入剤添加槽と、前記二本鎖核酸と未反応の挿入剤を洗浄液により除去する洗浄槽と、前記二本鎖核酸と共有結合した挿入剤を電気化学的な測定により検出する検出槽と、前記電極を、前記二本鎖核酸形成槽、前記揷入剤添加槽、前記洗浄槽、及び前記検出槽の各槽内に、順に移動させる電極移動部と、を備えるものである。

これにより、前記遺伝子サンプルと核酸プローブとをハイブリダィズさせた二本鎖核酸と、不可逆的、且つ強固に結合させた挿入剤を、電気化学的な測定により検出することで、前記検体試料中の遺伝子を高感度に検出できる遺伝子検出装置を提供できる。さらに、前記洗浄槽において、前記二本鎖核酸に結合した挿入剤を解離させることなく、前記一本鎖の核酸プロ一ブあるいは電極表面に非特異的な吸着をしている挿入剤を除去することができるため、前記検体試料中の遺伝子を高感度に検出することができる。

また、本発明の遺伝子検出装置は、検体試料中の特定の配列を有する遺伝子を検出する遺伝子検出装置であって、前記検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の核酸プローブを固定化してなる電極と、前記検出すベき遺伝子を一本鎖に変性して遺伝子サンプルを作製する遺伝子サンプル作製部と、電気化学的に活性であり、且つ光照射により前記二本鎖核酸と共有結合する挿入剤を保持する挿入剤タンクと、前記二本鎖核酸と未反応の挿入剤を除去する洗浄液を保持する洗浄液タンクと、前記二本鎖核酸を共有結合した挿入剤を検出するための電解液を保持する電解液タンクと、前記遺伝子サンプル作製部、挿入剤夕ンク、洗浄液タンク、及び電解液タンクと接続され、前記電極に固定化した核酸プローブと前記遺伝子サンプルとにより二本鎖核酸を形成させ、該ニ本鎖核酸と前記挿入剤を光照射により共有結合させ、前記二本鎖核酸と未反応の挿入剤を前記洗浄液で洗浄し、前記二本鎖核酸に共有結合した挿入剤を電気化学的な測定により検出する処理槽と、を備えるものである。

これにより、前記遺伝子サンプルと核酸プローブとをハイブリダィズさせた二本鎖核酸と、不可逆的、且つ強固に結合させた挿入剤を、電気化学的な測定により検出することで、前記検体試料中の遺伝子を高感度に検出できる遺伝子検出装置を提供でき、また処理槽を一つとしたので、遺伝子検出装置を小型化できる。さらに、前記処理層において、前記二本鎖核酸と未反応の挿入剤を前記洗浄液で洗浄する際、前記二本鎖核酸に結合した挿入剤を解離させることなく、前記一本鎖の核酸プローブあるいは電極表面に非特異的な吸着をしている挿入剤を除去す' ることができ、これにより、前記検体試料中の遺伝子を高感度に検出することのできる小型の遺伝子検出装置を提供できる。発明の効果

本発明の遺伝子検出方法及び装置によれば、特定の配列を有する遺伝子を検出する際に、電気化学的に活性で、且つ光照射により前記二本鎖核酸と共有結合する挿入剤を用いるようにしたので、光照射により、前記二本鎖核酸と前記挿入剤とを共有結合させて、該ニ本鎖核酸と挿入剤とを、不可逆的に、且つ強固に結合させることができ、この結果、前記遺伝子サンプルを高感度に検出することができる。

また、本発明の遺伝子検出方法及び装置によれば、前記光照射により、前記二本鎖核酸と挿入剤とを共有結合させた後、前記一本鎖の核酸プローブや電極表面に非特異的な吸着をしている挿入剤を除去するために洗浄処理を行うようにしたので、前記二本鎖核酸に結合した揷入剤は洗浄液により解離することがないが、前記一本鎖の核酸プローブや電極表面に非特異的な吸着をしている挿入剤を除去することができ、前記検体試料中の遺伝子を高感度に検出することができる。図面の簡単な説明

図 1は本発明の実施の形態 1にかかる遺伝子検出装置の構成を示す図である。図 2は本発明の実施の形態 2にかかる遺伝子検出装置の別の構成を示す図である。

図 3は本発明の実施例 1の工程により得られた、二本鎖核酸が形成された金電極 x、及び二本鎖核酸が形成されていない電極 yそれぞれにおいて検出された最大電気化学発光量を示すものである。

符号の説明

1 遺伝子サンプル作製部

2 電極

3 二本鎖核酸形成槽

4， 1 0 温度コントローラ

5 , 2 5 電極移動部

5 a 電極保持アーム

5 b アーム駆動部

6 遺伝子サンプル洗浄液タンク

7 遺伝子サンプル洗浄槽

8 挿入剤タンク

9 挿入剤反応槽

1 1 UVランプ

1 2 挿入剤洗浄液タンク

1 3 挿入剤洗浄槽

1 4 電解液タンク

1 5 検出槽

1 6 , フォトマル

1 7 ポテンシヨスタツ卜 1 8 制御部

2 3 処理槽

2 7 廃液タンク

1 0 0 , 2 0 0 遺伝子検出装置発明を実施するための最良の形態

以下に、本発明の遺伝子検出方法について詳細に説明する。

なお、以下の実施の形態における遺伝子サンプルとは、例えば、血液、白血球、血清、尿、糞便、精液、唾液、培養細胞、各種臓器細胞のような組織細胞、その他遺伝子を含有する任意の試料から、該試料中の細胞を破壊して二本鎖核酸を遊離させ、熱処理あるいはアルカリ処理によって、一本鎖の核酸に解離させたものである。また、本実施の形態における遺伝子サンプルは、制限酵素で切断して電気泳動による分離等で精製した核酸断片でもよい。

(実施の形態 1 )

以下、実施の形態 1における遺伝子検出方法について説明する。

まず、検査対象となる遺伝子サンプルを作成する。この遺伝子サンプルは、前述したように、任意の試料中の細胞を破壊して二本鎖核酸を遊離させ、熱処理あるいはアルカリ処理によって、一本鎖に変性させる。

このとき、前記試料中の細胞の破壊は、常法により行うことができ、例えば、振とう、超音波等の物理的作用を外部から加えて行うことができる。また、核酸抽出溶液（例えば、 S D S、 T r i t o n— X、 Tw e e n— 2 0等の界面活性剤、又はサポニン、 E D T A、プロテア一ゼ等を含む溶液等）を用いて、細胞から核酸を遊離させることもできる。

次に、検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の核酸プローブを生成する。

この核酸プローブは、生物試料から抽出した核酸を制限酵素で切断し、電気泳動による分離等で精製した核酸あるいは化学合成で得られた一本鎖の核酸を用いることができる。生物試料から抽出した核酸の場合には、熱処理あるいはアル力リ処理によって、一本鎖の核酸に解離させておくことが好ましい。そしてこの後、前述のようにして得られた核酸プロ一ブを電極に固定する。本発明で用いる電極は、電極として使用可能であればどのようなものであってもよく、例えば、金、白金、白金黒、パラジウム、ロジウムのような貴金属電極や、グラフアイト、グラシ一力一ボン、パイロリティックグラフアイ卜、力一ポンペースト、カーボンファイバーのような炭素電極や、酸化チタン、酸化スズ、酸化マンガン、酸化鉛のような酸化物電極や、 S i、 Ge、 ZnO、 CdS、 T i 0、 GaAsのような半導体電極等が挙げられる。これらの電極には、導電性高分子によって被覆しても良く、このように被覆すれば、より安定なプローブ固定化電極を調製することができる。

なお、前記核酸プローブを前記電極に固定化する方法としては、公知の方法が用いられる。一例をあげると、例えば前記電極が金である場合、固定する核酸プローブの 5' —もしくは 3，一末端（好ましくは、 5， -末端) にチオール基を導入し、金とィォゥとの共有結合を介して、前記核酸プローブが該金電極に固定される。この核酸プローブにチオール基を導入する方法は、文献（M. Ma e d a e t a 1., Ch em. Le t t；.， 1805〜 1808 (1994) 及び8. A. Conno l l y, Nu c l e i c Ac i d s Re s., 13, 4484 (1985)) に記載されているものが挙げられる。

即ち、前記方法によって得られたチオール基を有する核酸プローブを、金電極に滴下し、低温下で数時間放置することにより、該核酸プローブが電極に固定され、核酸プローブが作製される。

また別の例をあると、例えば前記電極がグラシ一カーボンである場合、まずグラシ一カーボンを過マンガン酸カリウムで酸化することによって、電極表面にカルボン酸基を導入し、これにより、核酸プローブが、アミド結合によりグラシ一カーボン電極表面に固定される。このグラシ一カーボン電極に核酸プローブを固定する、実際の固定化方法については、文献（K. M. M i 1 1 a n e t a 1., An a l y t i c a l Ch emi s t r y, 65， 2317〜 2323 (1 993)) に詳細が記載されている。

次に、前述の核酸プロ一ブが固定された電極を、前記遺伝子サンプルを含む溶液に接触させる。これにより、前記固定された核酸プローブと相補的な配列を有する遺伝子サンプルがハイブリダィズし、電極に二本鎖核酸が形成される。この核酸プローブと遺伝子サンプルとをハイブリダィズさせる方法は周知であるため、ここでは説明を省略する。

このようにして電極に二本鎖核酸を形成した後、該ニ本鎖核酸が形成された電極に揷入剤を添加し、挿入剤を前記二本鎖核酸に揷入反応させる。なお、この揷入剤の添加は、二本鎖核酸を形成する前、つまりハイブリダィゼーシヨン反応前に、前記検体試料中に添加するものであってもよい。

そしてこの後、挿入剤が添加された二本鎖核酸に対して光照射を行い、二本鎖核酸と挿入剤との間で共有結合を形成させる。

以下、本実施の形態 1の挿入剤について説明する。

本発明では、挿入剤として、前記二本鎖核酸に特異的に挿入し、且つ光照射により二本鎖核酸と共有結合する特徴をもつ物質を用いる。

これにより、前記挿入剤は、二本鎖核酸と、強固且つ不可逆的に結合するため、この後の洗浄工程により、二本鎖核酸と結合した挿入剤が、該ニ本鎖核酸から解離することがなく、洗浄工程では未反応の挿入剤のみを除去できる。

さらに、本発明では、挿入剤として、電気化学的に活性である特徴を持つ物質を用いる。 - これにより、前記二本鎖核酸に特異的に結合した挿入剤由来の電気化学的な信号により、華二本鎖核酸の;^在を高感度に検出できる。

このような 2つの特性を満たす揷入剤は、前記二本鎖核酸に特異的に挿入し、且つ光照射により二本鎖核酸と共有結合する二本鎖核酸結合部位（I ) と、電気化学活性を有する電気化学活性部位（F ) と、前記二本鎖核酸結合部位（I ) と前記電気化学活性部位（F ) とを連結する連結部位（L ) と、を有する化合物である。

例えば、本発明の揷入剤は、下記一般式 (1)で表すことができる。

一般式； F — L — I · · ■ (1)

(式中 Fは電気化学活性基、 Lは連結基、 Iは光照射により二本鎖核酸と架橋する部位を有する二本鎖核酸挿入基を表わす。）

ここで、前記一般式 (1)に示す、二本鎖核酸揷入基 Iとして用いることができる物質としては、二本鎖核酸に特異的に挿入し、且つ光照射により二本鎖核酸と共有結合する物質である、感光性を持つ挿入剤を挙げることができる。

そして、このような感光性を持つ挿入剤としては、例えば、フロクマリン誘導体が挙げられ、特に、ソラレン誘導体が好ましい。このソラレン誘導体は、二本鎖核酸に揷入すると、二本鎖核酸と非共有的相互作用を起こし、さらにこれに長波長紫外線（3 0 0〜4 0 0 n m) を照射すると、二本鎖核酸に挿入したソラレン誘導体部分が、強固に且つ不可逆的に二本鎖核酸と共有結合するようになり、安定な共有結合を形成する。

従って、後述する洗浄工程において、二本鎖核酸を形成しなかった電極表面に固定された一本鎖の核酸プローブや、該電極表面に非特異吸着した挿入剤を洗浄等した際に、二本鎖核酸に結合させた揷入剤が抜け落ちることがなくなり、該洗浄工程において強い洗浄を行って、前記未反応の一本鎖の核酸プローブや、非特異吸着した挿入剤を確実に除去することができる。

このようなソラレン誘導体の具体的な例としては、ゾラレン、メトキシソラレン、トリメチルソラレン等が挙げられる。

次に、前記一般式 (1)に示す、電気化学活性基 Fとして用いることができる物質は、電気化学的に検出可能な物質であればどのようなものでもよく、例えば、可逆な酸化還元反応時に生じる酸化還元電流を測定することで物質の検出が可能な、酸化還元性を有する化合物を挙げることができる。

そして、このような酸化還元性を有する化合物としては、例えば、フエ口セン、カテコールアミン、配位子に複素環系化合物を有する金属錯体、ルブレン、アントラセン、コロネン、ピレン、フルオランテン、クリセン、フエナントレン、ぺリレン、ビナフチル、ォク夕テトラェンもしくはビオローゲン等がある。

さらに、前述酸化還元性を有する化合物の例として挙げた、配位子に複素環系化合物を有する金属錯体、ルブレン、アントラセン、コロネン、ピレン、フルォランテン、クリセン、フエナントレン、ペリレン、ビナフチル、ォクタテトラエンには、酸化還元反応時に電気化学発光を生じるものもあり、その発光を測定することで物質の検出を行うこともできる。

そして、前記配位子に複素環系化合物を有する金属錯体としては、酸素や窒素等を含む複素環系化合物、例えば、ピリジン部位、ピラン部位等を配位子に有する金属錯体があり、特に、ピリジン部位を配位子に有する金属錯体が好ましく、そして該ピリジン部位を配位子に有する金属錯体としては、例えば、金属ピピリジン錯体、金属フエナント口リン錯体等がある。

さらに、前記配位子に複素環系化合物を有する金属錯体の中心金属としては、例えば、ルテニウム、ォスニゥム、亜鉛、コバルト、白金、クロム、モリブデン、タングステン、テクネチウム、レニウム、ロジウム、イリジウム、パラジウム、銅、インジウム、ランタン、プラセオジム、ネオジム、サマリウム等を挙げることができ、そして特に、該中心金属が、ルテニウム、ォスニゥムである錯体は、良好な電気化学発光特性を有し、該良好な電気化学発光特性を有する物質としては、例えば、ルテニウムビビリジン錯体、ルテニウムフエナン卜口リン錯体、ォスニゥムビピリジン錯体、ォスニゥムフエナントロリン錯体等を挙げることがでさる。

そして、前記一般式 (1)において、連結基 Lとして用いることができる基としては、前記電気化学活性基 Fと前記二本鎖核酸掙入基 Iとを連結するものであれば、そのリンカ一配列は特に制限されるものではなく、例えば、アルキル基、一〇一基、一 C O—基、一 NH—基、リン酸基、又はこれらの組み合わせから成る基などを挙げることができる。

このような挿入剤を、前記遺伝子サンプルと前記核酸プローブをハイブリダィズさせる前か後に添加し、光照射により、前記核酸プローブと遺伝子サンプルがハイブリダィズした二本鎖核酸と、前記揷入剤とを共有結合させたのち、電極の洗浄処理を行う。

そしてこの洗浄処理により、電極表面に固定された未反応の一本鎖の核酸プローブや、該電極表面に非特異的に吸着した挿入剤を除去する。

この結果、前記ハイブリダィズした二本鎖核酸には、特異的に共有結合した揷入剤のみが残るようになり、この挿入剤由来の電気化学的な信号を測定することにより、二本鎖核酸の存在を高感度に検出することができる。

前記挿入剤由来の電気化学的な信号は、添加する挿入剤の種類により異なるが、酸化還元電流を生じる挿入剤を用いた場合には、ポテンシヨスタツト、ファンクシヨンジェネレータ等からなる計測系で測定できる。一方、電気化学発光を生じる挿入剤を用いた場合には、フォトマルチプライヤー等を用いて計測が可能である。

以下、本発明にかかる遺伝子検出装置について、図 1を用いて説明する。図 1 は本実施の形態 1にかかる遺伝子検出装置の構成を示す図である。図 1において、遺伝子検出装置 1 0 0は、二本鎖核酸形成槽 3、遺伝子サンプル洗浄槽 7、挿入剤反応槽 9、揷入剤洗浄槽 1 3、検出槽 1 5の 5種類の槽を有している。 1は試料中の細胞より検査対象となる遺伝子サンプルを作製する遺伝子サンプル作製部であり、 2は該検出対象の遺伝子サンプルと相補的配列を有する 1本鎖の核酸プローブが固定された電極である。 5は前記電極 2を保持する電極保持アーム 5 a と、該電極保持アーム 5 aを駆動するアーム駆動部 5 bとからなり、前述した 5 つの槽 3， 7 , 9 , 1 3 , 1 5の内部に、前記電極 2を順に移動させる電極移動部であり、例えば、搬送アームや、ベルトコンベアのようなローダ一が例に挙げられる。

6は電極 2表面の未反応の遺伝子サンプルを洗浄する洗浄液を保持する遺伝子サンプル洗浄液タンクであり、 8は挿入剤を保持する挿入剤タンクであり、 1 2 は電極 2表面の未反応の挿入剤を洗浄する洗浄液を保持する挿入剤洗浄液タンクであり、 1 4は電解液を保持する電解液タンクである。

そして、前記遺伝子サンプル作製部 1は前記二本鎖核酸反応槽 3に、前記遺伝子サンプル洗浄液夕ンク 6は前記遺伝子サンプル洗浄槽 7に、前記挿入剤タンク 8は前記挿入剤反応槽 9に、前記挿入剤洗浄液タンク 1 2は前記挿入剤洗浄槽 1 3に、前記電解液タンク 1 4は前記検出槽 1 5に、それぞれ接続されている。また、前記揷入剤反応槽 9には、電極 2に光を照射する UVランプ 1 1が、前記検出槽 1 5には、電極 2に電圧を印加するポテンシヨス夕ット 1 7と、前記電極 2 の電気化学発光を測定するフォトマル 1 6と、前記電極 2に印加する印加電圧を制御すると共に、前記フォトマル 1 6から測定結果を取得して解析する制御部 1 8と、が設けられている。

また、前記二本鎖核酸形成槽 3、挿入剤反応槽 9は、それぞれ温度コント口一ラ 4， 1 0により嵌合されている。次に、当該装置 1 0 0の動作を説明する。

まず検出しょうとする遺伝子を含む被検査細胞を遺伝子サンプル作製部 1に入れ、検査対象となる遺伝子を一本鎖に変性した遺伝子サンプルを含有する試料溶液を作成する。そして、前記遺伝子サンプルを含有する試料溶液を二本鎖核酸形成槽 3に送り、該ニ本鎖核酸反応槽 3内にセットされた、核酸プローブが固定された電極 2に、前記試料溶液を滴下する。このとき二本鎖核酸形成槽 3では、温度コントローラ 4により、槽内温度を適温に制御しておく。

前記試料溶液が滴下された電極 2表面では、該電極 2に固定された核酸プロ一ブと相補的な配列を有する遺伝子サンプルがハイプリダイズし、二本鎖核酸が形成される。

反応終了後、該電極 2を電極移動部 5により、遺伝子サンプル洗浄槽 7に移動させる。

遺伝子サンプル洗浄槽 7では、前記遺伝子サンプル洗浄液タンク 6に保持された洗浄液を前記電極 2に滴下し、該洗浄液で前記電極 2表面の未反応の遺伝子サンプルを除去する。

洗浄終了後、電極 2を電極移動部 5により、挿入剤反応槽 9に移動させる。挿入剤反応槽 9では、前記挿入剤タンク 8に保持された揷入剤を前記電極 2に滴下し、該揷入剤を前記二本鎖核酸に揷入反応させる。このとき挿入剤反応槽 9 では、温度コントローラ 1 0により、槽内温度を適温に制御しておく。

さらにこの後、前記揷入剤反応槽 9で、前記 U Vランプ 1 1により、前記挿入剤を滴下した電極 2に光照射することで、前記揷入剤と二本鎖核酸を共有結合を形成させる。

反応終了後、該電極 2を電極移動部 5により、挿入剤洗浄槽 1 3に移動させる。挿入剤洗浄槽 1 3では、前記挿入剤洗浄液タンク 1 2に保持された洗浄液を前記電極 2に滴下して、該洗浄液で前記電極 2表面の未反応の挿入剤を除去する。洗浄終了後、電極 2を電極移動部 5により、検出槽 1 5に移動させる。

検出槽 1 5では、前記電極 2をポテンシヨスタツト 1 7に接続し、前記電解液タンク 1 4に保持された電解液を前記電極 2に滴下する。

前記ポテンシヨスタツト 1 7は制御部 1 8の制御の下、電極 2に対して電圧を印加し、電気化学発光させる。そして、前記フォトマル 1 6により、該電気化学発光を測定し、該測定値は制御部 1 8に入力され、解析される。

以上のように、本実施の形態 1によれば、検出対象の遺伝子と相補的な配列を有する核酸プローブとをハイブリダィズして得た二本鎖核酸に挿入する挿入剤として、電気化学的に活性で、且つ光照射により前記二本鎖核酸と共有結合する物質を用いるようにしたので、光照射により、前記二本鎖核酸と前記挿入剤とを共有結合させて、該ニ本鎖核酸と挿入剤とを、不可逆的に、且つ強固に結合させることができ、この結果、高精度な測定結果を得ることができ、特定の配列を有する検出すべき遺伝子を高感度に検出できる。また、本実施の形態 1によれば、電極 2の表面の、未反応の揷入剤を洗浄しても、前記挿入剤と二本鎖核酸とで共有結合を形成させるようにしたので、前記二本鎖核酸に結合した挿入剤は解離することがないが、一本鎖の核酸プローブあるいは電極表面に非特異的な吸着をしてレ ^る挿入剤を除去することができるため、前記検体試料中の遺伝子を高感度に検出することができる。

なお、本実施の形態 1では、洗浄槽として、二本鎖核酸形成工程後の未反応の遺伝子サンプルを洗浄する遺伝子サンプル洗浄槽 7と、揷入剤添加工程後の未反応の揷入剤を洗浄する挿入剤洗浄槽 1 3とを設ける構成としたが、洗浄槽を一つにして、これらの洗浄処理を同一の洗浄槽で行う構成としてもよいし、あるいは、前記 2つの洗浄処理のうち、前記未反応の挿入剤洗浄処理のみを行い、前記未反応の遺伝子サンプル洗浄処理を行わないものとしてもよい。

さらに、前述した遺伝子検出装置 1 0 0では、電極 2に対する処理毎に、その処理をするための槽を設ける構成としたが、全ての処理を一つの槽で実現することも可能である。

(実施の形態 2 )

前記実施の形態 1では、電極 2に対する複数の処理を行う処理槽を複数設け、各処理を異なる処理槽で行う場合を説明したが、本実施の形態 2では、処理槽を一つとし、電極極 2に対する処理を、該 1つの処理槽で行うものである。

図 2は、本実施の形態 2にかかる遺伝子検出装置の構成を示す図である。図 2 において、遺伝子検出装置 2 0 0は、電極 2に対して処理を行う処理槽 2 3を有している。 2 5は前記処理槽 2 3内部で、前記電極を水平方向に移動させる電極移動部であり、例えば、例えばステージを平行移動させる機構などが例に挙げられる。そして、 2 7は前記処理槽 2 3内部にたまった液を排出する廃液タンクである。

前記処理槽 2 3には、槽内部に、核酸プローブが固定された電極 2と、該電極 2を水平方向に移動させる電極移動部 2 5とが設けられ、さらに、槽上部に、前記遺伝子サンプル作製部 1、遺伝子サンプル洗浄液タンク 6、揷入剤タンク 8、挿入剤洗浄液タンク 1 2、電解液タンク 1 4、及び廃液タンク 2 7が接続されている。

また、前記処理槽 2 3には、電極 2に光を照射する UVランプ 1 1と、該電極 2の電気化学発光を測定するフォトマル 1 6とが設けられ、温度コントローラ 4 に嵌合されているものである。

さらに、当該装置 2 0 0には、電極 2に電圧を印加するポテンシヨスタツト 1 7と、前記電極 2に印加する印加電圧を制御すると共に、前記フォトマル 1 6から測定結果を取得して解析する制御部 1 8とが設けられている。

次に、当該装置 2 0 0の動作を説明する。

まず検出しょうとする遺伝子を含む被検査細胞を遺伝子サンプル作製部 1に入れ、検査対象となる一本鎖に変性された遺伝子サンプルを含有する試料溶液を作成する。そして、前記遺伝子サンプルを含有する試料溶液を処理槽 2 3に送り、該処理槽 2 3内にセットされた、核酸プローブが固定された電極 2に、前記試料溶液を滴下する。このとき処理槽 2 3では、温度コントローラ 4により、槽内温度を適温に制御しておく。

• 反応終了後、前記遺伝子サンプル洗浄液タンク 6に保持された洗浄液を前記電極 2に滴下し、該洗浄液で前記電極 2表面の未反応の遺伝子サンプルを除去する。このとき、電極移動部 2 5は、遺伝子サンプル洗浄液タンク 6から送られる洗浄液が前記電極 2に対して適切に滴下されるよう、該電極 2を所定位置に水平方向に移動させる。また、前記電極 2に滴下された洗浄液は、廃液タンク 2 7に回収される。

洗浄終了後、前記揷入剤タンク 8に保持された挿入剤を前記電極 2に滴下して、該挿入剤を前記二本鎖核酸に挿入反応させる。このとき、電極移動部 2 5は、挿入剤タンク 8から送られる挿入剤が前記電極 2に対して適切に滴下されるよう、該電極 2を所定位置に水平方向に移動させる。また、処理槽 2 3では、温度コントローラ 4により、槽内温度を適温に制御しておく。 .

反応終了後、前記挿入剤洗浄液タンク 1 2に保持された洗浄液を前記電極 2に滴下して、該洗浄液で前記電極 2表面の未反応の揷入剤を除去する。このとき、電極移動部 2 5は、挿入剤洗浄液タンク 1 2から送られる洗浄液が前記電極 2に対して適切に滴下されるよう、該電極 2を所定位置に水平方向に移動させる。また、前記電極 2に滴下された洗浄液は、廃液タンク 2 7に回収される。

洗浄終了後、前記電極 2をポテンシヨス夕ット 1 7に接続し、前記電解液タンク 1 4に保持された電解液を前記電極 2に滴下する。このとき、電極移動部 2 5 は、解液タンク 1 4から送られる電解液が前記電極 2に対して適切に滴下されるよう、該電極 2を所定位置に水平方向に移動させる。

前記ポテンシヨスタツト 1 7は制御部 1 8の制御の下、電極 2に対して電圧を印加し、電気化学発光させる。そして、前記フォトマル 1 6により、該電気化学発光を測定し、該測定値は制御部 1 8に入力され解析される。

以上のように、本実施の形態 2によれば、検出対象の遺伝子と相補的な配列を有する核酸プローブとを八イブリダィズして得た二本鎖核酸に挿入する挿入剤として、電気化学的に活性で、且つ光照射により前記二本鎖核酸と共有結合する物質を用いるようにしたので、光照射により、前記二本鎖核酸と前記挿入剤とを共有結合させて、該ニ本鎖核酸と揷入剤とを、不可逆的に、且つ強固に結合させることができ、この結果、高精度な測定結果を得ることができ、特定の配列を有する検出すべき遺伝子を高感度に検出できる。また、本実施の形態 2によれば、電極 2の表面の、未反応の揷入剤を洗浄しても、前記挿入剤と二本鎖核酸とで共有結合を形成させるようにしたので、前記二本鎖核酸に結合した挿入剤は解離することがないが、一本鎖の核酸プローブあるいは電極表面に非特異的な吸着をしている挿入剤を除去することができるため、前記検体試料中の遺伝子を高感度に検出することができる。

なお、本実施の形態 2では、二本鎖核酸形成工程後の未反応の遺伝子サンプルを洗浄する遺伝子サンプル洗浄液タンク 6と、挿入剤添加工程後の未反応の挿入剤を洗浄する挿入剤洗浄液タンク 12とを設ける構成としたが、処理層 23に設ける洗浄液タンクを一つにして、二本鎖核酸形成工程後の未反応の遺伝子サンプルを洗浄する処理と、光照射工程後の未反応の挿入剤を洗浄する処理とを同一の洗浄液を用いて行うようにしてもよいし、前記 2つの洗浄処理のうち、前記揷入剤洗浄処理のみを行い前記遺伝子サンプル洗浄処理は行わないものとしてもよい。実施例 1

以下、本発明の実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。

( 1 ) 金電極表面への核酸プローブの固定化

ガラス基板上にスパッ夕装置（アルバック製 SH— 350) によりチタン 10 nmを下地に金 200 nmを形成し、フォトリソグラフイエ程により電極パターンを形成することで、金電極を準備した。電極表面をピラニア溶液（過酸化水素：濃硫酸 =1 ： 3) で 1分間洗浄し、純水ですすいだ後、窒素ブローで乾燥させた。核酸プローブには、ヒト由来 Cy t o c h r ome P— 450の遺伝子配列の 5' —末端より 629— 668番目に位置する CCCCCTGGAT CCA GATATGC AATAATTTTC C C A C T AT C ATの配列を有する 5' 一末端のリン酸基を介してチオール基を修飾した 40塩基のオリゴデォキシヌクレオチド（夕カラバイオ製）を使用した。そして、該核酸プローブを 10m Mの PBS (pH7. 4のリン酸ナトリウム緩衝液）に溶解させ、 100 /Mに調整した。

この調整した核酸プローブの溶液を前記金電極上に滴下し、飽和湿潤下、室温で 4時間放置することで、チォ一ル基と金とを結合させて、核酸プローブを金電極に固定した。

(2) ハイブリダィゼーシヨン

遺伝子サンプルには、前記核酸プローブと相補的な 5' —末端から ATGAT AGTGG GAAAATTATT GCATATCTGG ATCCAGGG GGの配列を有するオリゴデォキシヌクレオチド（夕カラバイオ製）を使用した。そして、該遺伝子サンプルを、 10mMの PBS、及び 2 XS S Cを混合したハイブリダィゼ一シヨン溶液に溶解させ、 20 Mに調整した。

この調整した、遺伝子サンプルが溶解したハイブリダィゼーシヨン溶液を、前記核酸プローブを固定した金電極上に滴下し、 40°Cの恒温槽内で 4時間反応させ、二本鎖核酸を形成させた。これにより、二本鎖核酸が形成された金電極 Xを得た。一 ·

さらに、本実施例においては、比較対象として、二本鎖核酸が形成されていない金電極 yを作成する。この二本鎖核酸が形成されない金電極 y.は、前記核酸プローブと非相補的な配列を有する遺伝子サンプル' （以下、「比較遺伝子サンプル」と称す。）を使用して、前記二本鎖核酸が形成された金電極 Xを得る時と同様の処理をする。なお、ここでは、前記比較遺伝子サンプルとして、 40me rの Po 1 y-A (夕カラバイオ製）、 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA · A AAAAAAAAA A A A A A A A A A Aの配列を有する遺伝子サンプルを使用した。

(3) 挿入剤の添加

挿入剤には、下記の化 1に示すソラレン修飾ルテニウム錯体を使用した。

(化 1)

ソラレン修飾ルテニウム錯体の合成は、以下の手順により得ることができる。まず、公知の方法（B i o c h emi s t r y, vo l . 16， No 6, 19 77) により合成した 4'一クロロメチル一 4， 5， 8—トリメチルソラレン（ 0. 5 g、 1. 8 lmmo 1) を、水酸化ナトリウム溶解ジメチルホルムアミド（乾燥）に溶かし、 160°Cで撹拌しながら 1,4—ジァミノブタン（0.32 g、 3. 63mmo 1) を滴下し 12時間反応させた。溶媒を留去した後、粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー処理により精製し、生成物 Aを得た（収率 40%)。次に、 THF 60. OmLに溶解させた 4， 4， —ジメチル— 2, 2，ビビリジン 2. 50 g (1. 35 X 10—²mo 1) 溶液を窒素雰囲気の容器に注入した後、リチウムジイソプロピルアミド 2 M溶液 16. 9mL (2. 70 X 10— ²m o 1) を滴下し、冷却しながら 30分撹拌した。一方、同様に窒素気流中で乾燥させた容器に、 1， 2—ジブロモェタン 7. 61 g (4.05 X 10— ²mo 1 ) と THF 1 OmLとを加え、冷却しながら撹拌させた。

この 1, 2 _ジブロモェタンと THFとが挿入された容器に、先程の、 THF に溶解させた 4, 4' —ジメチルー 2, 2 ' ビピリジン溶液とリチウムジィソプ口ピルアミド 2M溶液とを反応させた反応液をゆっくり滴下させ、 2. 5時間反応させた。そして、この反応溶液を、 2 Nの塩酸で中和して、 THFを留去した後、クロ口ホルムで抽出し、さらに、前記溶媒を留去して得た粗生成物をシリカゲルカラムで精製し、生成物 Bを得た（収率 47%)。

そして、前記生成物 A (0. 50 g> 1. 52mmo 1 ) と前記生成物 B (0. 49 g、 1. 68mmo 1 ) とを、水酸化ナトリウム溶解ジメチルホルムアミド (乾燥）に溶かし、 160°Cで 18時間撹拌させた。そして、この攪拌した溶媒を留去した後、粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー処理により精製し、生成物 Cを得た（収率 38%)₀

さらに、塩化ルテニウム（III) (2. 98 g、 0. 01mo l)、及び 2，2，一ビピリジン（3. 44 g、 0. 022mo 1 ) をジメチルホルムアミド（80. OmL) 中で 6時間還流した後、溶媒を留去した。その後、アセトンを加え、一晚冷却することで得られた黒色沈殿物を採取し、エタノール水溶液 17 OmL (ェタノ一ル:水 =1 ： 1) を加え、 1時間加熱還流を行った。ろ過後、塩化リチウムを 20 g加え、エタノールを留去し、さらに一晩冷却した。析出した黒色物質は、吸引ろ過で採取し、生成物 Dを得た（収率 68. 2 )o

そして、前記生成物 C (0. 30 g、 0. 56mmo 1 ) と前記生成物 D (0.· 32 g、 0. 66mmo 1 ) とを、ジメチルホルムアミドに溶かして 6時間還流し、反応後、溶媒を留去させて得た黒紫色の物質に蒸留水を加えて溶解させ、未反応錯体をろ過により除去した後、溶媒を留去した。

得られた粗生成物は、シリカゲルクロマトグラフィー処理により精製し、ゾラレン修飾ルテニウム錯体を得た（収率 68%)。表 1は、前述のようにして得たソラレン修飾ルテニウム錯体のプロトン NMR H-NMR) の結果である。

(表 1)

^-NMR (300MHz、 DMSOd- 6)

σ

1. 4〜 1. 8 (6Η， m)

2. 4〜2. 6 (12Η, m)

2. 74 (2Η, t)

3. 8〜3. 1 (寸6Η， m)

4. 31 (2Η, s)

6. 32 (1H， s)

7. 38 (2H, d)

7. 54 (7H, m)

7. 77 (4H, m)

8. 16

8. 70 (2H, d)

8. 88 (4H, d)

このようにして得られたソラレン修飾ルテニウム錯体を、 1 OmMの PBSで 2 xMに調整した。

この調整した溶液を、前記二本鎖核酸が形成された金電極 x、及び二本鎖核酸が形成されていない金電極 yにそれぞれ添加し、 30分間 4 °Cの冷蔵庫内で暗反 J心を行った。

(4) 二本鎖核酸と挿入剤との共有結合

30分後、前記金電極 X, yそれぞれに、 UVクロスリンカ一（フナコシ製 U VP CL 1000 L型）を用いて波長 365 nm、 5 mW/c m²の紫外線を 10 分間照射し、ゾラレンと二本鎖核酸とを共有結合させた。共有結合後、金電極 X， yそれぞれを 1 OmMの PBSで 10分間揺動洗浄し、未反応の Ru錯体を取り除いた。

(5) 電気化学測定以上の工程の後、前記金電極 x、及び二本鎖核酸が形成されていない金電極 y のそれぞれに、 0 . 1 MのP B S、及び 0 . 1 Mのトリエチルァミンを混合した電解液を滴下した。

その後、それぞれの金電極 X , yに電圧を印加し、この時に生じた挿入剤由来の電気化学発光の測定を行った。

なお、電圧の印加は、 0 Vから 1 . 3 Vまで走査し、 1秒間電気化学測定を行つた。電気化学発光量の測定は、光電子増倍管（浜松ホトニクス製 H 7 3 6 0— 0 1 ) を用いて行い、最大発光量を測定した。

図 3は、本実施例 1の電気化学測定にて得られた結果を示すものである。図 3 から明らかなように、二本鎖核酸が形成された金電極 Xでの発光量は、二本鎖核酸が形成されていない金電極 yでの発光量と比較して著しく高い値となっており、本実施例の揷入剤を用いれば、高感度に二本鎖核酸の検出を行うことが可能であることが分かる。産業上の利用可能性

本発明にかかる遺伝子検出方法は、特定の配列を有する遺伝子を高感度に検出することができ、遺伝子診断、感染症診断、ゲノム創薬等の用途に適用できる。

Claims

請求の範囲

1 . 検体試料中の特定の配列を有する遺伝子を検出する遺伝子検出方法であつて、

前記検体試料中の検出すべき遺伝子を一本鎖に変性して遺伝子サンプルを作製する遺伝子サンプル作製工程と、

前記検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の核酸プローブを電極に固定化させる固定化工程と、

前記一本鎖の遺伝子サンプルを、前記一本鎖の核酸プローブが固定化された電極に添加し、前記核酸プロ一ブと前記遺伝子サンプルとがハィブリダイズした二本鎖核酸を形成する二本鎖核酸形成工程と、

前記二本鎖核酸が形成された電極に、電気化学的に活性であり、且つ光照射により前記二本鎖核酸と共有結合する挿入剤を添加する挿入剤添加工程と、光照射を行うことにより、前記二本鎖核酸と前記挿入剤とを共有結合させる光照射工程と、

前記二本鎖核酸と未反応の挿入剤を洗浄する洗浄工程と、

前記洗浄工程後の、前記二本鎖核酸と共有結合した挿入剤を電気化学的な測定により検出する検出工程、とを含む、

ことを特徴とする遺伝子検出方法。

2 . 請求項 1に記載の遺伝子検出方法において、

前記電気化学的な測定は、前記電極に対して ¾圧を印加し、前記二本鎖核酸と共有結合した挿入剤による電気化学発光量を測定するものである、

ことを特徴とする遺伝子検出方法。

3 . 請求項 1に記載の遺伝子検出方法において、

前記揷入剤は、

前記二本鎖核酸に特異的に挿入し、かつ光照射により該ニ本鎖核酸と共有結合を形成する二本鎖核酸結合部位と、

電気化学活性を有する電気化学活性部位と、

前記二本鎖核酸結合部位と前記電気化学活性部位とを連結する連結部位と、を有する化合物からなる、

ことを特徴とする遺伝子検出方法。

4 . 請求項 3に記載の遺伝子検出方法において、

前記二本鎖核酸結合部位が、感光性を持つ挿入剤である、

ことを特徴とする遺伝子検出方法。

5 . 請求項 4に記載の遺伝子検出方法において、

前記感光性を持つ挿入剤が、フロクマリン誘導体である、

ことを特徴とする遺伝子検出方法。

6 . 請求項 5に記載の遺伝子検出方法において、

前記フロクマリン誘導体が、ソラレン誘導体である、

ことを特徴とする遺伝子検出方法。

7 . 請求項 3に記載の遺伝子検出方法において、

前記電気化学活性部位が、酸化還元性を有する化合物である、

ことを特徴とする遺伝子検出方法。

8 . 請求項 7に記載の遺伝子検出方法において、

前記酸化還元性を有する化合物が、電気化学発光を示す化合物である、ことを特徴とする遺伝子検出方法。

9 . 請求項 8に記載の遺伝子検出方法において、

前記電気化学発光を示す化合物が、配位子に複素環系化合物を有する金属錯体、ルブレン、アントラセン、コロネン、ピレン、フルオランテン、クリセン、フエナン卜レン、ペリレン、ビナフチル、ォクタテトラェンである、

ことを特徴とする遺伝子検出方法。

1 0 . 請求項 9に記載の遺伝子検出方法において、

前記配位子に複素環系化合物を有する金属錯体が、配位子にピリジン部位を有する金属錯体である、

ことを特徴とする遺伝子検出方法。

1 1 . 請求項 1 0に記載の遺伝子検出方法において、

前記配位子にピリジン部位を有する金属錯体が、金属ビピリジン錯体、金属フェナント口リン錯体である、ことを特徴とする遺伝子検出方法。

1 2 . 請求項 9に記載の遺伝子検出方法において、

前記配位子に複素環系化合物を有する金属錯体の中心金属が、ルテニウム、ォスニゥムである、

ことを特徴とする遺伝子検出方法。

1 3 . 検体試料中の特定の配列を有する遺伝子を検出する遺伝子検出装置であつて、

前記検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の核酸プローブを固定化してなる電極と、

前記電極に固定化した核酸プローブと、前記検体試料中の前記検出すべき遺伝子を一本鎖に変性した遺伝子サンプルとをハイブリダィズさせて二本鎖核酸を形成する二本鎖核酸形成槽と、

電気化学的に活性であり、且つ光照射により前記二本鎖核酸と共有結合する揷入剤を、前記電極に添加して光照射し、前記二本鎖核酸と前記挿入剤とを共有結合させる挿入剤添加槽と、

前記二本鎖核酸と未反応の挿入剤を洗浄液により除去する洗浄槽と、前記二本鎖核酸と共有結合した挿入剤を電気化学的な測定により検出する検出槽と、

前記電極を、前記二本鎖核酸形成槽、前記挿入剤添加槽、前記洗浄槽、及び前記検出槽の各槽内に、順に移動させる電極移動部と、を備える、

ことを特徴とする遺伝子検出装置。

1 4 . 検体試料中の特定の配列を有する遺伝子を検出する遺伝子検出装置であつて、

前記検出すべき遺伝子を一本鎖に変性して遺伝子サンプルを作製する遺伝子サンプル作製部と、

電気化学的に活性であり、且つ光照射により前記二本鎖核酸と共有結合する揷入剤を保持する挿入剤タンクと、前記二本鎖核酸と未反応の揷入剤を除去する洗浄液を保持する洗浄液タンクと、前記二本鎖核酸を共有結合した揷入剤を検出するための電解液を保持する電解液タンクと、

前記遺伝子サンプル作製部、前記揷入剤タンク、前記洗浄液タンク、及び前記電解液タンクと接続され、前記電極に固定化した核酸プローブと前記遺伝子サンプルとにより二本鎖核酸を形成させ、該ニ本鎖核酸と前記揷入剤を光照射により共有結合させ、前記二本鎖核酸と未反応の揷入剤を前記洗浄液で洗浄し、前記二本鎖核酸に共有結合した揷入剤を電気化学的な測定により検出する処理槽と、を備える、

ことを特徴とする遺伝子検出装置。